DeltaFosB kontrolléiert indirekt Cck Promotor Aktivitéit (2010)

Gehir Res. 2010 6. méi; 1329: 10-20.

Online publizéiert 2010. Mäerz 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffmann,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ an Colleen A. McClung^{2, *}

Auteur Informatiounen ► Copyright an Lizenzinformatioun ►

Den Editeur seng lescht geännert Versioun vun dësem Artikel ass verfügbar Brain Res

Kuckt aner Artikelen an PMC dat ze verëffentlechen den publizéierten Artikel.

mythologesch

E puer vun de wichtege biochemeschen, strukturellen a Verhalensverännerungen induzéiert duerch chronesch Belaaschtung fir Drogen vu Mëssbrauch schéngen duerch den héich stabile Transkriptiounsfaktor ΔFosB mediéiert ze ginn. Virdrun Aarbecht huet gewisen datt ΔFosB Iwwerexpressioun bei Mais fir 2 Wochen zu enger Erhéijung vum Ausdrock vu ville Genen am Striatum féiert, déi meescht spéider no 8 Woche vum ΔFosB Ausdrock downreguléiert ginn. Interessanterweis goufen eng grouss Zuel vun dësen Genen och a Mais upreguléiert, déi den Transkriptiounsfaktor CREB iwwerausdrécken. Et war awer net kloer aus dëser Etude ob kuerzfristeg ΔFosB dës Genen iwwer CREB reguléiert. Hei fanne mir datt 2 Woche vun ΔFosB Iwwerexpressioun den CREB Ausdrock am Striatum erhéicht, en Effekt deen sech ëm 8 Wochen opléist. Déi fréi Induktioun ass verbonne mat enger verstäerkter CREB Bindung zu bestëmmten Zilgen Promoteuren an dëser Gehirregioun. Iwwerraschend, ee Gen dat e verdächtegt CREB Zil war baséiert op fréiere Berichter, Cholezystokinin (Cck), gouf net vum CREB am Striatum kontrolléiert. Fir d'Reglementatioun vun weider z'ënnersichen Cck no ΔFosB Iwwerexpressioun hu mir bestätegt datt kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun souwuel erhéicht Cck Promoteur Aktivitéit an Genausdrock. Et erhéicht och bindend Aktivitéit op enger putative CREB Bindungsplaz (CRE) an der Cck Promoteur. Wéi och ëmmer, wärend de CRE Site néideg ass fir normal Basal Ausdrock vun Cck, ass et net erfuerderlech fir ΔFosB Induktioun vun Cck. Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt wärend kuerzfristeg ΔFosB Induktioun CREB Ausdrock an Aktivitéit bei bestëmmte Genpromotoren erhéicht, dëst net deen eenzege Mechanismus ass, duerch deen Genen ënner dëse Bedéngungen upreguléiert ginn.

Schlësselwieder: nucleus accumbens, Transkriptioun, Sucht

dem Wieler

Chronesch Belaaschtung fir Drogen vu Mëssbrauch verursaacht biochemesch a strukturell Verännerungen a verschiddene Gehirregiounen. Dës Ännerungen ginn ugeholl datt d'Verännerungen an de Genausdrockprofile am mesolimbesche System involvéiert sinn. Dëse System besteet aus dopaminergesche Neuronen, déi aus dem ventrale tegmentale Gebitt (VTA) am Midbrain op mëttlere spiny Neuronen am Nucleus accumbens (NAc) (ventral Striatum) projizéieren, souwéi eng Rei aner Gehirregiounen. Ännerungen an der Aktivitéit vun zwee Transkriptiounsfaktoren, cAMP Äntwert Element bindend Protein (CREB) an ΔFosB (e Fos Famill Protein), goufe proposéiert fir vill vun de biochemeschen, strukturellen a Verhalensverännerungen ze vermëttelen, déi mat chronescher Belaaschtung fir Drogen vu Mëssbrauch gesi ginn. iwwerpréift vun Nestler, 2005).

CREB ass en iwwerall ausgedréckt Transkriptiounsfaktor deen e Member vun der CREB / ATF Famill ass. CREB Homodimere binden u Variatiounen vun enger CRE Sequenz (Konsens: TGACGTCA) déi an de Promoteuren vu ville Genen fonnt goufen. Phosphorylatioun vu CREB (haaptsächlech um Serin 133, obwuel aner Siten identifizéiert goufen) kann duerch verschidde Signalkaskaden stimuléiert ginn, dorënner déi downstream vun Dopamin Rezeptoren (Cole et al., 1995). No der Phosphorylatioun bei Serin 133 rekrutéiert CREB de Co-Aktivator CREB Bindeprotein (CBP) oder verwandte Proteine déi zu verstäerkten Genausdrock féieren (iwwerpréift vum Johannessen et al., 2004). Chronesch Belaaschtung fir opiate oder psychostimulant Drogen vu Mëssbrauch induzéiert transient Erhéijung vun der CREB Aktivitéit am Nukleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), eng Adaptatioun geduecht fir d'belountend Eegeschafte vun dësen Drogen ze reduzéieren an zum negativen emotionalen Zoustand vum Drogenentzéiung bäizedroen (Nestler, 2005).

LOngewéinlech dauerhafte Adaptatiounen un Drogen vu Mëssbrauch ginn ugeholl datt se deelweis duerch ΔFosB vermëttelt ginn, eng héich stabil Splitvariant vu FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos Familljemembere dimeriséieren mat Membere vun der Jun Famill fir en Aktivatorprotein 1 (AP-1) Komplex ze bilden. AP-1 Transkriptiounskomplexe binden u Variatiounen vum AP-1 Äntwert Element (Konsens: TGACTCA) fir d'Transkriptioun ze reguléieren (iwwerpréift vum Chinenov and Kerppola, 2001). Wärend akuter Belaaschtung fir Drogen vu Mëssbrauch zu der kuerzlieweger Induktioun (Stonnen) vu Fos-Familljememberen féiert (wéi och erhéicht CREB Aktivitéit), féiert widderholl Drogenbelaaschtung zu der Akkumulation vum héich stabilen ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), den Ausdrock vun deem dauert fir Wochen.

Bi-transgene Mais, déi entweder ΔFosB oder CREB am erwuessene Striatum inducibel iwwerausdrécken, weisen vill vun de biochemeschen a Verhalensphenotypen, déi an Déieren gesi ginn, déi ëmmer erëm u Psychostimulanten oder aner Drogen vu Mëssbrauch ausgesat sinn. ANalyse vun Genausdrock Ännerungen an dësen transgenen Déieren identifizéiert vill Genen upreguléiert duerch kuerzfristeg (2 Wochen) Iwwerexpressioun vun ΔFosB, Ännerungen verbonne mat enger concomitant Ofsenkung vun der Drogenbelounung. D'Verännerungen am Genausdrock a Verhalensreaktioun mat kuerzfristeg ΔFosB waren bemierkenswäert ähnlech wéi déi, déi an Déieren gesi ginn, déi CREB fir 2 oder 8 Wochen iwwerausdrécken (McClung an Nestler, 2003). Am opfälleg Kontrast, laangfristeg Iwwerausdrock (8 Wochen) vun ΔFosB huet den Ausdrock vu ville vun dëse selwechte Genen erofgeholl a féiert zu enger Erhéijung vun der Drogenbelounung (Kelz et al., 1999; McClung an Nestler, 2003).

Ee Gen identifizéiert an dëse Studien ass cholecystokinin (Cck), en Neuropeptid produzéiert a verschiddene Gehirregiounen, dorënner de Striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK kann dopaminergesch Transmissioun moduléieren (Vaccarino, 1992), ass an der Drogenbelounung a Verstäerkung involvéiert (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), a gëtt am Striatum duerch chronesch Kokain induzéiert (Ding & Mocchetti, 1992). Zousätzlech de Cck De Promoteur gouf gewisen datt se reagéiert op béid CREB an AP-1 Komplexen (Haun & Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Well vill vun den Genen (inklusiv Cck) déi erhéicht Ausdrock no béid CREB a kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock gewisen hunn, waren bekannt oder verdächtegt CREB Zilgenen (McClung an Nestler, 2003), wollte mir bestëmmen ob kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock zu Reguléierung vun dësen Genen féiert (mat engem Fokus op Cck) duerch d'Reguléierung vum CREB oder duerch méi komplex Mechanismen vun der Genreguléierung.

RESULTATER

ΔFosB Iwwerexpressioun erhéicht transient CREB Niveauen

Mir hunn Western Blotting benotzt fir z'ënnersichen ob ΔFosB Iwwerexpressioun CREB Proteinniveauen am Striatum vu Mais erhéicht. Fir dës Studie hu mir bi-transgene Mais benotzt (Linn 11A) déi souwuel en NSE-tTA Transgen wéi och en TetOp-ΔFosB Transgen droen. An der Verontreiung vun Doxycyclin weisen dës Mais eng robust Erhéijung vum ΔFosB Ausdrock an den Dynorphin positiven Neuronen am Striatum (Kelz et al., 1999). Dës Method fir ΔFosB ze iwwerauszedrécken ass extensiv dokumentéiert an erlaabt eng Regioun spezifesch Iwwerexpressioun, déi parallel mat der ΔFosB Induktioun gesi bei Déieren, déi u chronesche Kokain ausgesat sinn (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Mir hu fonnt datt an 11A Mais, déi ΔFosB iwwerausdrécken, CREB Proteinniveauen wesentlech no 2 Wochen Ausdrock upreguléiert goufen an dës Niveauen zréck op d'Basislinn no 8 Wochen Ausdrock (Figure 1An=8). Fir ze bestëmmen ob d'Verännerunge vun de CREB Niveauen mat kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun an engem anere System replizéiert kënne ginn, hu mir ΔFosB an PC12 Zellen transient iwwerausdréckt a fonnt datt CREB Niveauen wesentlech eropgaange sinn (p<0.05) am Verglach mat Kontrollen (Figure 1B, n=4). Dës Resultater weisen datt kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock CREB Proteinniveauen erhéicht.

CREB Niveauen erhéijen mat ΔFosB Iwwerexpressioun. Western blot Analyse vun lysates aus (A) Maus striata vun 11A Mais aus Dox fir 2 oder 8 Wochen oder (B) PC12 Zellen déi ΔFosB iwwerausdrécken. Daten an A ginn als Prozentsaz Ännerung am Off Dox am Verglach gewisen ...

Béid ΔFosB a CREB binden u Promoteuren vu spezifesche Zilgenen am Striatum no kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun

Mir hunn ChIP (Chromatin Immunoprecipitatioun) Assays vu striatal Tissu benotzt fir ze bestëmmen ob ΔFosB oder CREB Bindung bei bestëmmten Zilgen Promoteuren geschitt ass an ob dës Bindung no kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun erhéicht gouf. Mir analyséiert bindend op der BDNF an Cck Promoteuren, well béid Genen héich upreguléiert sinn no kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun, CREB Iwwerexpressioun oder chronescher Kokainbehandlung (McClung an Nestler, 2003). Mir analyséieren och verbindlech bei der CDK5 Promoteur, well et e bekannt direkt Zil vun ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Schlussendlech hu mir Bindung gemooss bei der prodynorphin Promoteur, well fréier Studien fonnt hunn datt et vu béiden ΔFosB a CREB ënner verschiddene Konditioune gebonnen ka ginn (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP Analyse gouf op Striata vun 11A Mais ausgefouert, déi ΔFosB fir 2 Wochen iwwerausdrécken mat Antikörper déi CREB oder ΔFosB erkennen. Ënner normale Bedéngungen hu mir fonnt datt ΔFosB sech un d' CDK5 an prodynorphin Promoteuren, iwwerdeems et keng erkennbar bindend op der BDNF or Cck Promoteuren (Table 1). Ausserdeem huet ΔFosB Iwwerexpressioun d'Bindung vun ΔFosB am CDK5 Promoteur, awer net bei der prodynorphin Promoteur. Mir gemooss nächste CREB bindend bei dëse Promoteuren a fonnt dass CREB bindet un der CDK5, BDNF an prodynorphin Promoteuren, awer net un de Cck Promoteur, am normale Striatum, an datt ΔFosB Iwwerexpressioun fir 2 Wochen d'CREB Bindung op der BDNF an prodynorphin Promoteuren, awer net de CDK5 Promoteur. Zesummegefaasst weisen dës Resultater datt ΔFosB a CREB souwuel u bestëmmte Genpromotoren kënne binde wéi z. prodynorphin an CDK5CREB Bindung ass awer spezifesch fir aner Promoteuren wéi z BDNF. Ausserdeem féiert ΔFosB Iwwerexpressioun zu Erhéijunge vun der ΔFosB Bindung bei bestëmmte Promoteuren, wéi erwaart ginn, awer och zur CREB Bindung u spezifesche Promoteuren, konsequent mat der ΔFosB-mediéierter CREB Induktioun déi zu dësem Zäitpunkt observéiert gëtt.

Bindung vu putativen Reguléierungsproteine u verschidde Promoteuren bei Mais, déi ΔFosB fir zwou Wochen iwwerausdrécken.

Virdrun Aarbecht huet gewisen datt Ännerungen am Genausdrock induzéiert duerch laangfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun mat Chromatinmodifikatioune verbonne sinn, besonnesch Acetylatioun vum Histon H3, bei spezifesche Genpromotoren (Kumar et al., 2005). Fir ze bestëmmen ob dëst Verännerungen am Genausdrock op méi kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun kéint berechnen, hu mir d'Bindung vun acetyléierten Histon H3 gemooss (eng Histonmodifikatioun assoziéiert mat transkriptional aktive Chromatin), oder e methyléierten Histon H3 (Lys9, eng Histonmodifikatioun assoziéiert mat transkriptional inaktive Chromatin). Mir hunn erausfonnt datt Iwwerexpressioun vun ΔFosB fir 2 Wochen zu keng Verännerungen an der Bindung vun acetyléierten H3 bei engem vun de Genpromotoren studéiert huet (Table 1). Mir hunn eng bedeitend Ofsenkung vun der Bindung vu methyléierten Histon H3 bei der fonnt prodynorphin Promoteur, awer keng verbindlech bei der Cck Promoteur a keng Ännerung am verbindlechen um CDK5 an BDNF Promoteuren, suggeréiert datt dëst keen allgemenge Mechanismus ass, duerch deen ΔFosB, kuerzfristeg, den Genausdrock reguléiert. Mir waren iwwerrascht an interesséiert an der Tatsaach datt mir keng Differenzen an eise ChIP Assays fonnt hunn, déi d'Erhéijung vun Cck mRNA Ausdrock an den 11A Mais no 2 Woche vum ΔFosB Ausdrock an huet decidéiert dëse Mechanismus weider z'ënnersichen.

KuerzfristegΔFosB erhéicht Cck Ausdrock a ville Systemer

Microarray Charakteriséierung vu bi-transgenen 11A Mais, déi ΔFosB am Striatum iwwerausdrécken, hunn fonnt datt Cck Ausdrocksniveauen eropgoen no 2 Woche vun Iwwerexpressioun an da lues a lues erof mat längeren Perioden vum ΔFosB Ausdrock (Figure 2A, n=3). Mir validéiert dësen Effekt fir Cck Echtzäit PCR benotzt op enger separater Grupp vun Déieren op 2 an 8 Wochen a fonnt Resultater op den zwee Zäitpunkte fir ähnlech wéi d'Mikroarray Analyse (Donnéeën net gewisen).

Kuerzfristeg Iwwerausdrock vun ΔFosB erhéicht Cck Gen Ausdrock. (A) Cck mRNA Ausdrock am Striatum no ΔFosB Iwwerexpressioun an 11A Mais fir 1, 2, 4 oder 8 Wochen. Microarray Analyse war op striatal Echantillon gesuergt an Cck Niveau ...

Fir d'Fäegkeet vum ΔFosB weider z'ënnersichen fir ze regléieren Cck Ausdrock, benotzt mir PC12 Zellen transiently transfected mat engem Cck-luciferase Reporter Plasmid an entweder en ΔFosB Ausdrocksplasmid oder eng gläich Quantitéit u pCDNA. Béid zwee (n=5-9) an dräi (n=11-13) Deeg vun der ΔFosB Iwwerexpressioun hunn zu enger bedeitender Erhéijung vun Cck- luciferase Ausdrock. Zousätzlech hunn dräi Deeg vun ΔFosB Iwwerexpressioun wesentlech méi gefouert Cck-Luciferase Induktioun am Verglach zu zwee Deeg vun Iwwerexpressioun (Figure 2B). Iwwerexpressioun vun ΔFosB huet den Ausdrock vun engem Promoteurlose Luciferasekonstrukt net induzéiert (Donnéeën net gewisen). Ënner keng Behandlungsbedéngungen war eng Reduktioun an Cck-luciferase Aktivitéit scheinbar. Dës Resultater weisen datt kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock d'Aktivitéit vun der Cck Promoteur, a léisst de Mechanismus onbeäntwert, duerch deen laangfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun ënnerdréckt Cck Ausdrock.

ΔFosB Iwwerexpressioun erhéicht d'Bindung op enger putativer CREB Bindungsplaz an der Cck Promoter

Eis Analysen hunn dat fonnt Cck Ausdrock gëtt no kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock erhéicht, awer eis ChIP Assays hu festgestallt datt weder CREB nach ΔFosB un den Cck Promoteur. Fir festzestellen, ob et Ännerungen an der Proteinbindung bei der Cck Promoteur no ΔFosB Iwwerexpressioun, hu mir elektrophoretesch Mobilitéitsverschiebung Assays (EMSA) benotzt mat enger Sonde déi de putativen CRE-ähnlechen Site enthält, präsent an der Cck Promoteur. Mat Nuklearextrakter aus Striata vun 11A Mais, déi ΔFosB fir 2 Wochen iwwerausdrécken, hu mir eng Erhéijung vun der Bindung un de putative CRE Site an der Cck Promoteur (Bild 3 A,C, n=4). Interessanterweis iwwerausdrécken 11A Mais ΔFosB fir 8 Wochen, déi eng Ofsenkung vun Cck Ausdrock, huet och erhéicht Bindung op dësem Site gewisen (Bild 3B,C, n=4). Als Verglach hu mir d'Bindung un e Konsens CRE Site an de Mais ënnersicht, déi ΔFosB fir 2 Wochen iwwerausdrécken a robust CRE Bindung a striatal Extrakten fonnt hunn, awer keng Erhéijung vun der Bindung no ΔFosB Induktioun (Figure 3F, n=4). Also, trotz enger ΔFosB-induzéierter Erhéijung vun de Gesamt CREB Niveauen, déi zu dësem Zäitpunkt gesi ginn, sinn dës Resultater am Aklang mat eise ChIP Assays, déi feststellen datt eng verstäerkte CREB Bindung bei Promoteuren no ΔFosB Iwwerexpressioun spezifesch ass fir nëmme bestëmmte Genen an net e globalt Phänomen ass. . Fir ze bestëmmen ob CREB un de gebonnen ass Cck Promoteur an eiser EMSA Analyse, mir gemaach supershift assays mat engem CREB spezifesch antibody. Am Accord mat eise ChIP Assays hu mir keng Bindung vu CREB zu engem fonnt Cck Sonde déi de putativen CRE Site an EMSA Assays enthält, wärend CREB e Konsens CRE Site wesentlech gebonnen a supershift huet (Figur 3D, E, n=4). D'DNA bindend Aktivitéit am Cck De Promoteur war och net vun engem Antikörper op ΔFosB beaflosst (Daten net gewisen), ënner Bedéngungen, déi a verschiddene fréiere Studien gewisen goufen, fir ΔFosB Bindung zu bona fide AP-1 Siten ze blockéieren (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Mir hunn och ChIP Assays op Striata vun 11A Déieren gemaach no 8 Woche vum ΔFosB Ausdrock a fannen nach ëmmer keng Bindung vu CREB oder ΔFosB am Cck Promoteur (Donnéeën net gewisen). Also féiert ΔFosB Ausdrock zu enger Erhéijung vun der Proteinbindung am Cck Promoteur no souwuel 2 an 8 Wochen Ausdrock; awer, d'Identitéit vun dëse Facteure bleift onbekannt.

Proteinbindung an der Cck Promoteur. (A, B) Electrophoretic Mobilitéit Verréckelung Assay benotzt der Cck CRE-ähnleche Site mat Striatalgewebe vun Déieren, déi ΔFosB iwwerausdrécken fir 2 Wochen (A) oder 8 Wochen (B). An (A), Konkurrenz mat iwwerschësseg unlabeled Konkurrenten ...

De putative CRE Site am Cck Promoteur ass net verantwortlech fir erhéicht Promoteur Aktivitéit

Zënter datt mir eng Erhéijung vun der Proteinbindung fonnt hunn e Fragment vun der Cck Promoteur, deen de putative CRE Site enthält, no ΔFosB Iwwerexpressioun, wollte mir bestëmmen ob dëse Site noutwendeg ass fir erhéicht Cck Ausdrock no ΔFosB Iwwerexpressioun. Fir dës Méiglechkeet ze testen, hu mir PC12 Zellen mat engem Cck-luciferase Plasmid mat sengem intakt CRE-ähnlechen Site oder een deen eng Mutatioun am Site enthält, déi all Interaktioun mat CREB ofschafen. Interessanterweis huet d'Mutatioun vum CRE-ähnlechen Site basal erofgaang Cck Promoteur Aktivitéit ëm 32% (Figure 4A, n = 9), awer huet net den Afloss Cck Promoteur Induktioun duerch ΔFosB Iwwerexpressioun (Figure 4B, n=11-13). Dëst hindeit datt, obwuel de Cck Promoteur erfuerdert en intakt CRE-ähnleche Site fir voll basal Aktivitéit, déi verstäerkte Promoteur Aktivitéit induzéiert duerch ΔFosB Iwwerexpressioun erfuerdert net déi CRE-ähnlech Sequenz.

d' Cck-like CRE Site ass net néideg fir Cck Induktioun duerch ΔFosB. (A) Cck-luciferase Aktivitéit war 2 Deeg no transfection mat entweder normal gemooss Cck-luciferase oder een an deem de CRE-ähnlechen Site mutéiert gouf. *p<0.05 (B) Cck- luciferase ...

cFos bindt un de Cck Promoter

Virdrun Studien hunn dat fonnt cFos mRNA erhéicht mat kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock, awer no längerer ΔFosB Ausdrock ass d'Fäegkeet vun der Kokainbehandlung fir cFos am Striatum ze induzéieren reduzéiert (McClung an Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Dofir ass et méiglech datt cFos zu der Erhéijung vun Cck Ausdrock no kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock. Mir hunn ChIP Assays mat engem Antikörper spezifesch fir cFos gemaach a gemooss cFos bindend bei der Cck Promoteur mat an ouni kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock. Wärend mir fonnt hunn datt cFos sech un d' Cck Promoteur, dës Bindung ass net wesentlech eropgaang no ΔFosB Iwwerexpressioun (Figure 5, n=5). Dëst hindeit datt zënter cFos den Cck Promoteur, et kann zu der allgemeng Regulatioun vun bäidroen Cck Ausdrock, mä et ass wahrscheinlech net an der Regulatioun vun der involvéiert Cck Promoteur vum ΔFosB.

cFos bindt un de Cck Promoteur. Chromatin Immunoprecipitatiounsassays goufen mat engem spezifesche Antikörper fir cFos duerchgefouert mat Striatal Tissue vun ΔFosB iwwerausdréckende Mais entweder op Dox, oder no 2 Wochen Dox Entfernung. Echtzäit PCR Analyse war ...

Diskussioun

Dës Studie bestätegt an erweidert op fréier Erkenntnisser, déi weisen datt ΔFosB den Genausdrock am Striatum reguléiert a mir fannen datt et dat duerch verschidde Mechanismen nom kuerzfristeg Ausdrock mécht. Mir weisen datt no 2 Wochen Iwwerexpressioun ΔFosB direkt un d'Promotoren a bestëmmte Genen bindt, déi zu Verännerungen am Ausdrock féieren (dh. CDK5). Ausserdeem erhéicht et CREB Proteinniveauen, en Effekt observéiert a kultivéierten Zellen souwéi am Striatum, wat zu enger verstäerkter CREB Bindung bei anere Genpromotoren féiert (dh. Dynorphin an BDNF). An enger fréierer Etude hu mir festgestallt datt kuerzfristeg Iwwerausdrock vun ΔFosB am Striatum zu villen vun de selwechte Genausdrock Ännerungen féiert, déi fonnt ginn wann CREB iwwerausgedréckt ass, a féiert zu ähnlechen Verhalensreaktiounen a Moossname vu Kokain Präferenz (McClung an Nestler, 2003). Also, déi aktuell Erkenntnes datt ΔFosB zu enger Induktioun vu CREB féiert, souwéi Bindung vu CREB u bestëmmte Genpromotoren, hëlleft z'erklären firwat sou vill vun den Genausdrock Ännerungen vun dësen zwee Transkriptiounsfaktoren gedeelt goufen.

D'Induktioun vu CREB duerch ΔFosB ass interessant, well et gouf gewisen datt Drogen vu Mëssbrauch Verännerungen am serin 133-phosphoryléierte CREB Niveauen induzéieren (Mattson et al., 2005) a CRE-mediéiert Transkriptioun erhéijen (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), ouni d'Gesamtniveau vum CREB z'änneren. Et ass méiglech datt Ännerungen am CREB Niveauen transient sinn, an dofir liicht an aner Studien verpasst ginn. An eisen Hänn hu mir Kokain-induzéiert Erhéijunge vun CREB mRNA a besonnesch Experimenter gesinn, awer dësen Effekt ass héich variabel (net publizéiert Observatioun). Zënter béid 11A transgene Mais wéi och PC-12 Zellen CREB Induktioun no kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun weisen, suggeréiert dëst datt CREB wierklech duerch ΔFosB induzéiert ass (oder en Zil vun ΔFosB), e weidere Mechanismus ubitt fir Drogen-induzéiert Ännerungen am Gen z'erklären. Ausdrock.

Iwwerraschend hu mir fonnt datt weder CREB nach ΔFosB sech un d' Cck Promoteur obwuel Cck Ausdrock ass kloer upreguléiert no kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock. Cck ass e reichend Neuropeptid ausgedréckt a béid VTA an NAc (Hokfelt et al., 1980) an ass méiglecherweis an Verhalensreaktiounen op Drogen vu Mëssbrauch involvéiert (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Bei Zellkulturassays gëtt de Cck Promoteur gouf extensiv charakteriséiert a gouf gewisen als reaktiounsfäeger op CREB an AP-1 Familljememberen (iwwerpréift vum Hansen, 2001). Haun and Dixon (1990) gewisen, datt AP-1 Komplexe kënnen un de Cck CRE-ähnlechen Site kënschtlech, an et gouf spéider gewisen, mat SK-N-MC Neuroblastomzellen, datt d'Mutatioun vum CRE-ähnleche Site d'Promotorreaktiounsfäegkeet op iwwerexpriméiert cFos/cJun reduzéiert huet (Rourke et al., 1999). Tatsächlech fanne mir och erhéicht Cck Promoteur Aktivitéit (Figure 2) a Bindung um oder ronderëm de CRE-ähnlechen Element (Figure 3) bei Iwwerexpressioun vun ΔFosB, en aneren AP-1 Familljemember, awer mir fanne keng direkt Bindung vun ΔFosB un den Cck Promoter an vivo or kënschtlech, och op seng Iwwerausdrock.

Vill Aarbecht huet eng Roll fir CREB an der Regulatioun vun Cck Promoteur Aktivitéit. Déi Cck CRE-ähnlech Site ass iwwer Wirbeldéieren konservéiert (Hansen, 2001) an, an e puer Zellkultur Assays, béid CREB an AP-1 Komplexe binden op dës Säit a si noutwendeg fir Cck Promoteur Aktivitéit (Haun & Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Zousätzlech, verschidde bekannt activators vun Cck Ausdrock (inklusiv bFGF, PACAP, Peptonen, an Depolariséierung) gouf gewisen iwwer CREB ze handelen (Hansen et al., 1999; Deavall et al., 2000; Bernhard et al., 2001; Gevrey et al., 2002; Hansen et al., 2004). Eis Cck-luciferase reporter Gendaten Ënnerstëtzung eng wesentlech Roll fir de CRE-wëll Site zu Regulatioun vun Cck Promoteur Aktivitéit, zënter Mutatioun vun dësem Site reduzéiert basal Cck Promoteur Aktivitéit an Cck-luciferase Ausdrock induzéiert vum VP16-CREB, eng konstitutiv aktiv Form vu CREB, ass verluer wann dëse Site mutéiert ass (net publizéiert Observatioun). Mir waren also iwwerrascht ze fannen, datt CREB sech net un d' Cck Promoteur a striatalen Extrakten entweder op der Basis oder op kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun wann CREB Niveauen eropgesat ginn. Dëst argumentéiert datt Niveauen vun CREB u sech sinn net den eenzege Faktor bei der Bestëmmung vum Betrag vun der Bindung op dësem Site, an dëst gëtt vun der Aarbecht vun aneren ënnerstëtzt (Cha-Molstad et al., 2004). Zanter der Promoteuren vun aneren, virdrun identifizéiert CREB Zil Genen, wéi BDNF an prodynorphin, huet CREB gebonnen, mir sinn zouversiichtlech an eiser Entdeckung datt CREB net verbindlech ass mat der Cck Promoteur an striatal Nuklearextrakter. Ausserdeem ass d'Induktioun vun Cck-Luciferase Aktivitéit vun ΔFosB war net ofhängeg vun der intakt CRE-ähnlecher Säit, suggeréiert datt ΔFosB net reguléiert Cck Ausdrock duerch Reguléierung vun der direkter Bindung vum CREB un de Cck Promoteur.

Eis Onméiglechkeet CREB z'entdecken interagéieren mat der Cck Promoteur gëtt ënnerstëtzt vun Renthal et al. (2009), déi eng ChIP-Chip Approche benotzt huet fir weltwäit Ännerungen am phosphoryléierten CREB (pCREB) an ΔFosB Bindung am Striatum no chronescher Kokainbelaaschtung ze kucken. An dësen Experimenter goufen DNA-Protein-Komplexe mat ΔFosB oder pCREB Antikörper immunoprecipitéiert an déi ausgefällt DNA, no der Etikettéierung, gouf zu engem Promoteur-Mikroarray hybridiséiert. Wärend vill virdru charakteriséiert CREB Zilgenen mat dëser Approche identifizéiert goufen (z. BDNF, prodynorphin), Cck gouf net identifizéiert. Zousätzlech ass et bewisen ginn datt d'Bindung vu CREB zu engem Konsens CRE Site staark variéiert tëscht kultivéierten Zelllinnen (Cha-Molstad et al., 2004). All déi fréier Studien déi CREB Interaktioune mat der fonnt hunn Cck Promoteur goufen an Zellkultur duerchgefouert (net Gehir, aus deem eis EMSA a ChIP Proben ofgeleet goufen) a benotzt Gel Verréckelung Assays fir Protein-DNA Interaktiounen z'ënnersichen. Wärend eng EMSA d'Potenzial vun engem Faktor beurteelen fir un eng DNA Sequenz ze binden, bidden ChIP Assays en neie Bléck op dës Interaktiounen an vivo. Ausserdeem, vill vun den Donnéeën weisen entweder Induktioun vun Cck Promoteur Aktivitéit oder CREB verbindlech zu der Cck Promoteur goufen aus Zellen kritt, déi duerch Faktore stimuléiert goufen wéi Peptonen (Bernard et al., 2001), Depolariséierung (Hansen et al., 2004), oder eng Vielfalt vun Aktivatoren vun intrazelluläre Signalkaskaden, dorënner cAMP an ERK (Hansen et al., 1999). An eisen Experimenter war deen eenzegen "Stimulatioun" benotzt d'Iwwerexpressioun vun ΔFosB, wat genuch ass fir ze induzéieren Cck Ausdrock. Zesummegefaasst seet dëst datt d'Fäegkeet vum CREB sech un (a potenziell regléieren) den Cck Promoteur ass héich ofhängeg vun der Zelltyp an der Aktivatioun vu bestëmmte Signalweeër. Zousätzlech, de Cck CRE-ähnlech Promoteur Element (op d'mannst an oninduzéierten PC12 Zellen an a Mausstriatum) ass keen direkten Zil vu weder CREB oder ΔFosB. Spannen, d'Regulatioun vun FosB Ausdrock vum CREB ass och spezifesch fir Zelltyp an der Aart vun der Stimulatioun. Eng Etude vum Andersson et al. fonnt datt d'Injektioun vu CREB Antisense Oligonukleotiden an d'Mausstriatum deelweis d'Induktioun vun FosB no Kokain Administratioun (Andersson et al., 2001). Wéi och ëmmer, si hunn och fonnt datt d'Fäegkeet vu L-Dopa ze induzéieren FosB Ausdrock am 6-OHDA-lesionéierte Striatum war net beaflosst vun der Präsenz vu CREB Antisense Oligonukleotiden.

Zënter CREB an ΔFosB schéngen indirekt d' Cck Promoteur, an Ännerungen an der Chromatinstruktur goufen dokumentéiert an Äntwert op eng Vielfalt vu Reizen déi ΔFosB induzéieren (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), hu mir gemengt datt ΔFosB indirekt d'Promotoraktivitéit moduléiere kann andeems d'Chromatinstruktur geännert gëtt. Wéi och ëmmer, bei Mais, déi ΔFosB fir 2 Wochen iwwerausdrécken, gouf et keng Ännerung vun der Histon H3 Acetylatioun bei der Cck Promoteur (Table 1). Dëst gëtt ënnerstëtzt vun den Chip-Chip-Daten vun Renthal et al. (2009), déi gemellt keng Ännerung vun acetylated H3 bindend op der Cck Promoteur bei Mais, déi u chronesche Kokain ausgesat sinn. Zënter dem Cck Promoteur ass aktiv am Striatum, keng repressiv methyléiert Histon H3 Bindung gouf erwaart oder observéiert. Interessanterweis hu mir och keng Ännerung gesinn wéinst ΔFosB Iwwerexpressioun an acetyléierter H3 Bindung am BDNF Promoteur (deen huet Erhéijung CREB bindend gewisen) oder bei der CDK5 an prodynorphin Promoteuren (déi erhéicht ΔFosB Bindung gewisen hunn). Zënter datt et eng Onmass vun Histonmodifikatioune mat Ännerungen an der Promoteuraktivitéit assoziéiert (iwwerpréift vum Rando and Chang, 2009), ginn et méiglecherweis aner Chromatinmodifikatiounen déi mat Induktioun vun dësen Genen associéieren. All eenzel Chromatin Modifikatioun, obwuel dacks prévisibel vum Niveau vun der Promoteur Aktivitéit, kann net während der Aktivatioun vun engem bestëmmte Gen änneren. An zukünfteg Aarbecht wier et interessant aner potenziell Ännerungen an der Chromatinstruktur ronderëm d' Cck Promoteur no ΔFosB Iwwerexpressioun. Interessanterweis ass chronesch Kokain (wahrscheinlech via ΔFosB Induktioun) gouf gewisen fir Ausdrock vu Sirtuin 1 an 2, Klass III Histon Deacetylasen ze induzéieren, déi anscheinend neuronal Physiologie, ERK Signaliséierung a Verhalensreaktiounen op Kokain änneren (Renthal et al., 2009). Induktioun vun enger Histon Deacetylase hätt d'Fäegkeet fir gläichzäiteg den Ausdrock vun enger grousser Zuel vu Genen ze reguléieren via global Ännerungen an der Chromatin Struktur.

Ee méigleche Kandidat involvéiert Cck Regulatioun no ΔFosB Iwwerexpressioun war den AP-1 Familljemember cFos. Ausdrock vu cFos gëtt vum CREB geregelt (Scheng et al., 1990; Impey et al., 2004), an d'cFos Iwwerexpressioun (konkordant mat Iwwerexpressioun vu sengem bindende Partner cJun) erhéicht Cck Promoteur Aktivitéit (Rourke et al., 1999). Dofir, erhéicht CREB Niveauen wéinst kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun kéinten cFos Niveauen erhéijen an zu enger verstäerkter Bindung zu der Cck CRE-ähnlechen Site. cfos mRNA gëtt a Mais induzéiert no zwou Woche vun ΔFosB Iwwerexpressioun (McClung an Nestler, 2003) a reduzéiert bei Mais, déi u chronesche Kokain oder laangfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun ausgesat waren (Renthal et al., 2008). Hei fanne mir datt cFos direkt un d' Cck Promoteur am striatal Tissu, awer, ΔFosB Iwwerexpressioun erhéicht d'Bindung net wesentlech. Dëst hindeit datt wärend cFos Reguléierung involvéiert kënne sinn Cck Ausdrock am Allgemengen, eng Ännerung vun der Bindung vu cFos eleng ass net wahrscheinlech de Mechanismus duerch deen ΔFosB reguléiert Cck Ausdrock. Et ass awer méiglech datt ΔFosB entweder post-translational Verännerungen an cFos induzéieren (zB verännert Phosphorylatioun) oder den Ausdrock vun engem bindende Partner (wéi cJun) oder Co-Aktivatorprotein induzéieren. Wéi och ëmmer, well den intakt CRE-ähnlechen Site (déi virdru gewisen gouf als Bindungsplaz fir AP-1 Komplexen, kuckt Haun & Dixon, 1990) ass net erfuerderlech fir d'Erhéijung Cck Promoteur Aktivitéit gesi mat ΔFosB Iwwerexpressioun (wéi an eise Reporter Gen Experimenter bewäert), ass et e Grond datt aner transaktive Faktoren och vun ΔFosB geregelt ginn.

d' Cck Promoteur Fragment an eisem Luciferase Reporter Gen Experimenter benotzt enthält eng konservéiert Sp1 bindend Site an eng E-Box (iwwerpréift vum Hansen, 2002). Besonnesch, E-Box Sequenzen goufen gewisen fir vill Transkriptiounsfaktoren ze binden (iwwerpréift vum Forrest & McNamara, 2004). Mat PC12 Zellen hu mir gesinn datt d'Mutatioun vun der E-Box erofgeet Cck Promoter Aktivitéit, awer ännert net d'Äntwert vum Promoteur op ΔFosB (Donnéeën net gewisen). Interessant ass, a Cck-luciferase Reporter mat Mutatiounen souwuel op der CRE Site an der E-Box huet keng detektéierbar Basalaktivitéit an ass net reagéiert op ΔFosB Iwwerexpressioun (net publizéiert Observatioun). En anere potenzielle Mediateur vun der ΔFosB Aktioun op der Cck Promoteur sinn ATFs, verschidde Forme vun deenen bekannt sinn am Striatum duerch chronesch psychostimulant Belaaschtung induzéiert ze ginn (Green et al., 2008). Wéi och ëmmer, mir hu keng Beweiser fir ΔFosB Induktioun vun dësen ATFs fonnt (Daten net gewisen), an ATFs géifen net erwaart ginn un de mutéierte CRE-ähnlechen Site op der Cck Promoteur.

Een Opgepasst vun dëser Etude ass datt mir e bi-transgene System benotze fir ΔFosB ze iwwerauszedrécken an dofir muss ee konservativ sinn fir Paradigmen tëscht dësem Paradigma an der Verwaltung vu chronesche Kokain ze zéien. Wéi och ëmmer, déi 11A transgen Mais leeschten déi eenzegaarteg Geleeënheet fir déi spezifesch Effekter vum ΔFosB am Striatum ze kucken, well Iwwerexpressioun ass limitéiert op dës Gehirregioun (Chen et al., 1998), während d'Verwaltung vu Kokain Verännerungen an enger grousser Villfalt vun anere Gehirregiounen induzéiert, déi dann indirekt de Striatum beaflosse kënnen. Ausserdeem hunn verschidde Studien ähnlech Verhalens- a molekulare Phänotypen an den 11A Mais dokumentéiert am Verglach mat net-transgenen Déieren, déi mat chronesche Kokain behandelt ginn (Kelz et al., 1999; McClung an Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Zousätzlech Bibb et al. (2001) gemellt ähnlechen Niveaue vu Striatal Cdk5 mRNA a Protein Induktioun an dësem selwechten 11A Stamm am Verglach mat Kokain-behandelt, net-transgene Littermates, souwéi ähnlech Ännerungen an den CDK5 Ziler, p35 an DARPP-32.

Als Conclusioun fanne mir datt kuerzfristeg ΔFosB Ausdrock zu der Induktioun vun Genen am Striatum duerch verschidde Mechanismen féiert. Dozou gehéiert direkt Promoteur Bindung, Induktioun vum CREB Protein an Aktivitéit, Chromatin Modifikatioun, zousätzlech zu Weeër, déi nach net bestëmmen.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Déieren

Männlech bi-transgen 11A Déieren (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) goufen an dëser Studie benotzt a si charakteriséiert Kelz et al., 1999. Fir ΔFosB ze iwwerzeegen, goufen d'Mais aus Doxycyclin tëscht 3 a 6 Wochen Alter geläscht, während d'Kontrollmais op Doxycyclin gehale goufen. All Mais goufen am Grupp ënnerbruecht an op engem 12:12 Liicht/Däischter Zyklus gehal, d'Luuchten um 7 Auer un an d'Luuchten um 7 Auer aus, mat ad lib Zougang zu Iessen a Waasser. All Mausexperimenter waren am Aklang mat de Protokoller guttgeheescht vum Déierefleeg- a Gebrauchskomitee vun der University of Texas Southwestern Medical Center zu Dallas.

Reporter an Ausdrock plasmids

Wildtype (WT) Cck Promoteur-Luciferase-Reporter gouf virbereet andeems en ongeféier 200 BP PCR-Fragment an de pGL3-luc Vecteure (Promega) setzt. Dëst Fragment gouf aus Maus genomic DNA kritt (primers: 5' TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' Upstream, an 5' TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' Downstream) an am Ufank an pGEM-T Easy Vecteure agebaut (Promega, #A1360). De Promoteur Fragment war dann an der Kpn1 /Xho1 Restriktioun Enzym Siten vun pGL3-luc gekloont.

Ze schafen der CRE Punkt Mutatioun am Cck Promoteur, e mutagenesche Primer riicht géint e virdru gemellt CRE-ähnlechen Site (Sënnprimer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3', Antisense Primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') gouf a Kombinatioun mat der Change IIperage-Fabrikatioun benotzt . Dëst konvertéiert de gemellt CRE-ähnlechen Site (ACTGCGTCAGC) op ACTGAGCTCC. All reporter plasmids sech duerch DNA sequencing bestätegt. Den ΔFosB Ausdrocksplasmid enthält eng voll Längt ΔFosB Sequenz, déi an d'Multiple Kloningsplaz vu pCDNA 3.1 agebaut gouf a gouf virdru beschriwwen (Ulery an Nestler, 2007).

Zellkultur an DNA Transfektiounen

Rat Pheochromocytoma (PC12) Zellen goufen am Dulbecco's modifizéierten Eagle's Medium F-12 erhale gelooss, ergänzt mat 10% Päerdsserum, 5% Fetal Bovine Serum, an 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C a 5% COXNUMX₂. Zellen sech duerch electroporation mat engem BTX 360 electroporator transfected (350V, 0 ohms, an 850 μF) an 800 μL Dulbecco d'phosphate gebuffert Salins an 4 mm Spalt cuvettes mat 10 μg vun der reporter a 5 μg vun der Ausdrock. Eidel Vecteure Plasmid (pCDNA) gouf benotzt total Quantitéiten vun DNA ze normaliséieren. No der Transfektioun goufen d'Zellen op 35 mm Kollagen-beschichtete Platen fir déi uginn Zäit ugebaut.

Luciferase Assays

Zwee oder dräi Deeg no der Transfektioun goufen d'Zellen 3 Mol an Dulbecco's phosphatgebufferter Salins gewäsch, geléist (mat 25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), gesammelt a geläscht iwwer Zentrifugéierung. 30 μL Lysat gouf mat 140 μL Luciferase Assay-Puffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO) kombinéiert₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM Kaliumphosphat, 1 mM Coenzym A, pH 7.8). Lumineszenz Aktivitéit gouf mat engem FLx-800 microplate fluorescence Lieser gemooss no enger automatiséiert Sprëtz vun 40 μL 1 mM luciferin pro gutt. D'Luziferase Aktivitéit gouf normaliséiert op de Gesamtproteingehalt wéi duerch e BioRad Proteinassay bestëmmt.

Elektrophoretesch Mobilitéitsverschiebungsanalyse

Nuklear Extrakter aus bilaterale Scheiwen vum Striatum vu bi-transgenen 11A Mais (déi op oder aus Doxycyclin fir 2 oder 8 Wochen erhale bleiwen) (McClung an Nestler, 2003) goufen no virbereet Huang & Walters (1996). ³²P-labeléiert duebel-stranded Oligonukleotid Sonden goufen mat der Promega Gel Verréckelung Assay System Protokoll (# E3300) virbereet a Sonde sech mat Roche Quick Spin Kolonnen gereinegt. D'Konsens CRE an AP-1 Sonde Sequenzen ware vu Promega (#E328A respektiv E320B) an den Cck CRE Sequenzen waren (Cck-CRE Sënn: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE Antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bindungsreaktiounen an Elektrophorese goufen duerch Modifikatioune vun der Promega Gel Shift Assay System Prozedur (#E3300) gemaach. 50,000 CPM vun markéierter Sonde gouf mat 10 μg striatal nuklearen Extrait kombinéiert. Kale Konkurrent DNA oder Antikörper goufen derbäigesat ier d'Aféierung vun de radiolabeléierte Sonden. Fir Supershift Experimenter gouf 2 μg CREB Antikörper (Upstate Biotechnologie #06-083) benotzt. D'Reaktiounen goufen op 4% Polyacrylamidgelen elektrophoreséiert, gedréchent an op de Film ausgesat (mat Verstäerkungsbildschirmer fir 1 Stonn bis 2 Deeg).

Immunblotting

Fir PC12 Zellen, goufen 35 mm Placke vun transfected Zellen an äiskal Dulbecco d'phosphate-gefiermt Salins gewäsch an lysates sech an äiskal RIPA lysis Prellbock (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1) virbereet. % Triton X-100, 0.1% Natriumdodecylsulfat) enthält Protease-Inhibitoren. No Sonication, Clearing, a Bradford Protein Assay, goufen d'Lysate komplett denaturéiert a 50 μg vun all Probe gouf op 10% SDS Polyacrylamidgelen elektrophoreséiert. Proteine goufen op PVDF Membran transferéiert, blockéiert fir 1 Stonn an 3% net-fetter trockener Mëllech an Tris-gebufferter Salins mat 0.1% Tween-20 (TBS-T Mëllech), an iwwer Nuecht bei 4 ° C mat primären Antikörper (CREB-) gepréift. Upstate Biotechnologie #06-083, benotzt bei 1:1,000; GAPDH-Sigma #G8795, benotzt bei 1:80,000) verdënntem an TBS-T Mëllech. No multiple Wäschen am TBS-T goufen Blots fir eng Stonn bei Raumtemperatur ënnersicht mat alkalesche Phosphatase-konjugéierten sekundären Antikörper (Sigma) verdünnt 1: 5,000 an TBS-T Mëllech. No multiple Wäschen an Tris-gebufferter Salzlinn, gouf d'Faarfreaktioun no de BioRad (#170-6432) Instruktioune gemaach. Membrane goufen iwwer Nuecht gedréchent, op engem flatbed Scanner gescannt an Densitometrie mat ImageJ gemaach (kuckt hei ënnen).

Fir striatal Extrakter goufen Western Blot Assays duerchgefouert wéi virdru publizéiert (Hope et al., 1994). Tissue gouf aus dekapitéierte Mais geläscht, op Äis gesat an op enger Gehirmatrix mat enger Dicke vun 1 mm gedeelt. Tissue Punches goufen duerno geholl a bei -80 ° C gefruer bis se benotzt ginn. Tissue gouf sonicated op Äis an engem modifizéierten Detergent baséiert Puffer mat souwuel phosphatase an protease inhibitors (Roche, Sigma). No sonication, Echantillon waren an kochendem Waasser denaturéiert an centrifuged bei 15,000xg fir 15 Minutten; Supernatant gouf duerno gesammelt a veraarbecht; Protein Konzentratioun Quantitéiten goufen dann mat engem Bradford Assay (Bio-Rad) quantifizéiert. Echantillon waren op engem 10% acrylamide /bisacrylamide gelies lafen, op eng PVDF Membran transferéiert, an 5% Mëllech blockéiert a mat Primärschoul antibodies incubated (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blots goufen duerno mat engem Chemilumineszenzsystem (Pierce) visualiséiert. All Echantillon waren zu GAPDH normaliséiert (Fitzgerald, Concord, MA). Standard Kéiren goufen gelaf fir sécherzestellen datt mir an der linearer Gamme vum Assay sinn.

Densitometrie Analyse

Fir PC12 immunoblots, Densitometrie Analyse war mat ImageJ mat Rodbard Eechung gesuergt. Duerchschnëtt Hannergrond Signal war vun all Miessung subtracted an d'Verhältnis vun CREB zu GAPDH Signal war fir all Prouf berechent. Fir striatal Immunoblots an EMSA Analyse gouf Scion Image 1.62c mat Hannergrond subtraktioun benotzt.

Chromatin Immunopfällung (ChIP)

ChIP assays sech no de Methode vun gesuergt Tsankova et al. (2004) an Kumar et al. (2005). Kuerz gesot, bilateral striatal Proben aus 11A Mais, déi op oder aus Doxycyclin gehale goufen, goufen mat 1% Formaldehyd vernetzt an d'Vernetzung gouf mat Glycin gestoppt (endlech Konzentratioun vun 0.125 M). Dës Proben ware vu ganze Gehireschnäppchen, déi um Niveau vum Nukleus accumbens mat der Cortex ewechgeholl goufen. Chromatin gouf op ongeféier 0.2 bis 1 kb Fragmenter iwwer Sonikatioun geschäerft, geläscht mat Protein G Perlen (Thermo Scientific #22852), an Input Echantillon gefruer bei -80 ° C. Tëscht 60 an 100 μg Chromatin gouf fir all Nidderschlag benotzt. 5-10 μg vun all primären Antikörper gouf benotzt (CREB: Upstate Biotechnology #06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology #SC-48x, acetyléiert H3: Upstate Biotechnology #06-599, methyléiert H3 (LYS9): Zell Signaltechnologie, cFos: Santa Cruz Biotechnologie #SC-7202x). Antikörper-Chromatin-Komplexe goufen immunoprecipitéiert mat Protein G plus Perlen no den Instruktioune vun der Fabrikatioun (Thermo Scientific #22852). No ëmgedréint Crosslinking vun Input a precipitéierte Proben, gouf all Probe quantitativ PCR (qPCR) ënnerworf. D'Benotzung vun all dësen Antikörper fir ChIP gouf extensiv validéiert (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Niveau vun Protein bindend op all Gen Promoteur vun Interessi sech duerch Mooss de Montant vun assoziéiert DNA vun qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) bestëmmt. Input oder total DNA (nonimmunoprecipitated) an immunoprecipitated DNA goufen an triplicate an der Präsenz vun SYBR Green (Applied Biosystems, CA) amplified. Ct Wäerter vun all Prouf goufen mat der Sequence Detector 1.1 Software kritt. Relativ Quantifikatioun vun der Schabloun DNA gouf mat der ΔΔCt Method duerchgefouert (Tsankova et al., 2004). Primer benotzt: BDNF Promoteur 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 Promoteur: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck Promoteur: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin Promoteur: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistesch Analyse

All Daten ginn als Mëttel ± Standardfehler vun der Moyenne presentéiert. Statistesch Differenz war vun Student d'zwee tailed t-Test (p VerfÜgung & Si besteet; 0.05). Wann verschidde Vergläicher gemaach goufen, goufen p-Wäerter mat Bonferroni Korrektur ugepasst.

Dankbarkeet

Mir soen dem Will Renthal an dem Arvind Kumar Merci fir hëllefräich Diskussiounen. Mir wëllen och dem NIDA Merci soen fir dës Experimenter ze finanzéieren.

Noten

Verzichterklärung vum Verlag: Dëst ass eng PDF-Datei vun engem net verworfene Manuskript deen fir d'Publikatioun akzeptéiert gouf. Als Service fir eis Cliente këmmeren mir dës fréie Versioun vum Manuskript. De Manuskript wäert d'Kopieveraarbechtung, d'Setzgarantie an d'Iwwerpréiwung vum entstinnende Beweis ënnerwerfen, ier se an der Final citat Form publizéiert gëtt. Maacht weg datt während dem Produktiounsfehler eventuell Décisiounen entdeckt kënne ginn, déi d'Inhalter beaflosse kënnen, an all gesetzlech Verännerungen, déi op d'Zäitschrëft gelidden sinn.

Klassifikatioun Begrëffer:

Sektioun: #1 Zellular a Molekulare Biologie vun Nervensystemer

Referenze

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP Äntwert Element-bindende Protein ass erfuerderlech fir dopamin-ofhängeg Genausdrock am intakt awer net am dopamin-denervéierten Striatum. J Neurosci. 2001;21:9930–43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB Aktivitéit an der Nukleus accumbens Shell kontrolléiert d'Gate vu Verhalensreaktiounen op emotional Reizen. Proc Natl Acad Sci US A. 2002;99:11435–40. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokainbehandlung erhéicht extrazellulär Cholezystokinin (CCK) an der Nukleus accumbens Schuel vun erwächt, fräi bewegende Ratten, en Effekt dee verstäerkt gëtt bei Ratten, déi Verhalenssensibiliséierung fir Kokain sinn. J Neurochem. 2002;81:1021–7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Endokrinologie. 2001;142:721–9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Effekter vun chronescher Belaaschtung fir Kokain gi geregelt vum neuronale Protein Cdk5. Natur. 2001; 410: 376 – 80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Zell-Typ-spezifesch Bindung vum Transkriptiounsfaktor CREB zum cAMP-Äntwert Element. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101:13572–7. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Reguléierung vun Delta FosB a FosB-ähnleche Proteine duerch elektrokonvulsive Krampfadern a Kokainbehandlungen. Mol Pharmacol. 1995;48:880–9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgen Déieren mat induzéierbar, geziilten Genausdrock am Gehir. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Induktioun vu Cyclin-ofhängeger Kinase 5 am Hippocampus duerch chronesch elektrokonvulsiv Anfäll: Roll vun ΔFosB. J Neurosci. 2000;20:8965–71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Zoumaache vu villen Aarte: Fos-Jun Interaktiounen déi Transkriptiounsreguléierungsspezifizitéit vermëttelen. Onkogen. 2001;20:2438–52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronal Adaptatioun fir Amphetamin an Dopamin: Molekulare Mechanismen vun der Prodynorphin-Genregulatioun am Rat-Striatum. Neuron. 1995;14:813–23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontroll vun der CCK Gen Transkriptioun duerch PACAP an STC-1 Zellen. Am J Physiol Gastrointest Liewer Physiol. 2000;279:G605–12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergesch Reguléierung vum Cholecystokinin mRNA Inhalt am Ratstriatum. Gehir Res Mol Gehir Res. 1992;12:77–83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id Famill vun Transkriptiounsfaktoren a vaskulärer Läsionbildung. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:2014–20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. J Biol Chem. 2002;277:22407–13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Induktioun vun aktivéierend Transkriptiounsfaktoren (ATFs) ATF2, ATF3, an ATF4 am Nukleus accumbens an hir Reguléierung vum emotionalen Verhalen. J Neurosci. 2008;28:2025–32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Iwwerschwemmung vun Dopamin a Cholezystokinin am Ratten Nucleus accumbens als Äntwert op akuter Drogenverwaltung. Synaps. 2000;38:238–42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogen-aktivéiert Proteinkinase a Proteinkinase A Signalweeër stimuléieren Cholecystokinin Transkriptioun iwwer Aktivatioun vum zyklesche Adenosin 3',5'-Monophosphat Äntwert Element-bindende Protein. Mol Endocrinol. 1999;13:466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Reguléierung vun neuronal Cholecystokinin Gen Transkriptioun. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001;234:61–7. [PubMed]
Hansen TV. Cholecystokinin Gen Transkriptioun: Promoteur Elementer, Transkriptiounsfaktoren a Signalweeër. Peptiden. 2001;22:1201–11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl a Forskolin synergistesch upreguléieren Cholecystokinin Genausdrock iwwer Koordinataktivéierung vu CREB an dem Co-Aktivator CBP. J Neurochem. 2004;89:15–23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. En transkriptionalen Enhancer wesentlech fir den Ausdrock vum Ratten Cholecystokinin Gen enthält eng Sequenz identesch mam -296 Element vum mënschleche c-fos Gen. J Biol Chem. 1990;265:15455–63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Wesentlech Roll vum FosB-Gen a molekulare, celluläre a Verhalensaktioune vu chroneschen elektrokonvulsive Krampelen. J Neurosci 1998. 1998;18:6952–62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Natur. 1980;285:476–8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Chronesch elektrokonvulsiv Krampfung (ECS) Behandlung resultéiert am Ausdrock vun engem laang dauerhafte AP-1 Komplex am Gehir mat verännerter Zesummesetzung a Charakteristiken. J Neurosci. 1994;14:4318–28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Induktioun vun engem langfristeg AP-1 Komplex aus geännerten Fos-ähnlechen Proteinen am Gehir vum chroneschen Kokain an aner chronesch Behandlungen. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergesch Reguléierung vun AP-1 Transkriptiounsfaktor DNA bindend Aktivitéit am Rat Striatum. Neurowëssenschaften. 1996;75:757–75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. De CREB Regulon definéieren: eng genombreet Analyse vun Transkriptiounsfaktor Reguléierungsregiounen. Zell. 2004;119:1041–54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. What turns CREB on? Zell Signal. 2004;16:1211–27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Opposéiere Effekter vu CCK(A) a CCK(B) Antagonisten op d'Entwécklung vu bedingte Aktivitéit bei Ratten. Behav Pharmacol. 1996;7:505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Beweiser fir CCK (A) Rezeptor Engagement an der Acquisitioun vun bedingten Aktivitéit produzéiert vu Kokain bei Ratten. Gehir Res. 1997;763:93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor deltaFosB am Gehir kontrolléiert d'Sensibilitéit fir Kokain. Natur. 1999; 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatin Remodeling ass e Schlësselmechanismus deen ënner Kokain-induzéierter Plastizitéit am Striatum ass. Neuron. 2005; 48: 303 – 14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokain-induzéiert CREB-Phosphorylatioun an Nukleus accumbens vu Kokain-sensibiliséierte Ratten ass aktivéiert duerch eng verstäerkte Aktivatioun vun extrazellulärer Signalbezunnen Kinase, awer net Proteinkinase AJ Neurochem. 2005;95:1481–94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Reguléierung vum Genexpressioun a Kokain Belounung duerch CREB an DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V., Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: en molekulare Schalter fir eng laang Adaptatioun am Gehir. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: E molekulare Vermëttler vu laangfristeg neural a Verhalensplastizitéit. Gehir Res. 1999;835:10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Gëtt et e gemeinsame molekulare Wee fir Sucht? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkriptiounsmechanismus vun der Sucht: Roll vun DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:3245–55. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinct Mustere vun DeltaFosB Induktioun am Gehir duerch Drogen vu Mëssbrauch. Synapse. 2008; 62: 358 – 69. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Genome-breet Meenung vun der Chromatinstruktur. Annu Rev Biochem. 2009;78:245–71. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd, Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB vermëttelt epigenetesch Desensibiliséierung vum c-fos Gen no chronescher Amphetamin Belaaschtung. J Neurosci. 2008;28:7344–9. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genome-breet Analyse vu Chromatinreguléierung duerch Kokain enthält eng Roll fir Sirtuinen. Neuron. 2009; 62: 335 – 48. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin Modulatioun vu mesolimbescher Dopaminfunktioun: Reguléierung vum motivéierte Verhalen. Pharmacol Toxicol. 2002;91:404–13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativ Kooperativitéit tëscht niewentene E-Box a cAMP / TPA reaktiounsfäeger Elementer am Cholecystokinin Gen Promoteur. FEBS Lett. 1999;448:15–8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regional a cellulär Mapping vun CRE-mediéierten Transkriptioun wärend Naltrexon-ausgefällt Morphin-Entzug. J Neurosci. 2002;22:3663–3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Reguléierung vun CRE-mediéierten Transkriptioun am Mausgehir duerch Amphetamin. Synaps. 2003;48:10–7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membran Depolariséierung a Kalzium induzéiere c-fos Transkriptioun iwwer Phosphorylatioun vum Transkriptiounsfaktor CREB. Neuron. 1990;4:571–82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histone Modifikatioune bei Genpromoterregiounen am Ratten Hippocampus no akuten a chroneschen elektrokonvulsive Krampelen. J Neurosci. 2004;24:5603–10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Reguléierung vun DeltaFosB Transkriptiouns Aktivitéit duerch Ser27 Phosphorylatioun. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens Dopamin-CCK Interaktiounen an psychostimulant Belounung a verbonne Verhalen. Neurosci Biobehav Rev. 1992;18:207-14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Eng wesentlech Roll fir ΔFosB am Nukleus accumbens an der Morphinaktioun. Natur Neurosci. 2006;9:205–11. [PubMed]