Drogen Experienz Epigenetesch Primen Fusb Gen Inducibilitéit an Ruttenkären Accumbens (2012)

mythologesch

Aféierung

Drogenofhängeger ass charakteriséiert duerch compulsive Drogen sichen an huelen trotz schwéieren negativ Konsequenzen (Kalivas et al., 2005; Hyman et al., 2006). Chronesch Drogenbelaaschtung verursaacht persistent Ännerungen am Genausdrock am ventralen Striatum (oder Nucleus accumbens; NAc) an dorsalen Striatum (oder caudate putamen; CPu), striatal Strukturen, déi an der Drogenbelounung an der Sucht implizéiert sinn. (Freeman et al., 2001; Robinson a Kolb, 2004; Shaham and Hope, 2005; Maze & Nestler, 2011). ΔFosB, e truncéiert a stabilt Protein kodéiert vum direkt-fréi Gen, Fosb, ass e gutt charakteriséierte Transkriptiounsfaktor, deen am NAc a CPu induzéiert gëtt duerch chronesch Belaaschtung fir praktesch all Drogen vu Mëssbrauch, wou et sensibiliséiert Verhalensreaktiounen op widderholl Drogenverwaltung vermëttelt. (Nestler, 2008). Wéi och ëmmer, ob virdru chronesch Belaaschtung vun engem Medikament vu Mëssbrauch déi spéider Induktioun vun ΔFosB ännert bleift onbekannt.

Mir hu viru kuerzem hypothetiséiert datt Chromatinmodifikatiounen als Äntwert op chronescher Medikamentbelaaschtung d'Induzibilitéit vu spezifesche Genen an Zil-Gehirregiounen ännerenRobison an Nestler, 2011). Steigerend Beweiser hu gewisen datt Drogen vu Mëssbrauch no chronescher Administratioun d'Struktur an d'transkriptional Accessibilitéit vum Chromatin änneren duerch vill Aarte vu Modifikatioune, dorënner Phosphorylatioun, Acetylatioun a Methylatioun vun Histonschwänz. Méi rezent Aarbecht an Zellkultursystemer huet sech op d'Rekrutéierung vun RNA Polymerase II (Pol II) op de Promoteur vun "inducible" Genen virun hirem Ausdrock konzentréiert, mat Pol II persistent un proximal Promoteur Regiounen a ronderëm d'Transkriptiounsstartplaz (TSS gebonnen) ) an engem "gestoppt" Zoustand (Core & Lis, 2008; Nechaev and Adelman, 2008). D'Aktivatioun vum gestoppte Pol II gëtt dann als verantwortlech fir seng Flucht aus Promoteur an TSS Regiounen a seng Transkriptioun vun dësen "priméierte" Genen geduecht (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille et al., 2012).

Hei weisen mir datt virdru chronesch Belaaschtung fir Kokain, gefollegt vun enger verlängerter Réckzuchszäit, d'Induzibilitéit vun der Fosb Gen fir spéider Kokainverwaltung, mat NAc fir Induktioun priméiert wärend CPu net ass. Mir identifizéieren dann ënnerscheed Chromatin Ënnerschrëften um Fosb Gen Promoteur an NAc an CPu déi mat esou aberrant Induktibilitéit vun der verbonne sinn Fosb Gen, dorënner de Rekrutement vun stallt Pol II bei der Fosb proximal Promoteur am NAc nëmmen wéi och Ännerungen a verschiddenen aktivéierend oder repressiven Histonmodifikatiounen a béide Gehirregiounen. Dës Resultater bidden en neien Abléck an d'Chromatin Dynamik am Fosb Gen Promoteur an uginn fir d'éischte Kéier e Mechanismus duerch déi stalling vun Pol II Primen Fosb fir eng gréisser Aktivatioun am NAc bei der neier Belaaschtung vu Kokain.

Materialien an Methoden

Resultater

Grouss Fosb Induzibilitéit an NAc, awer net CPu, vu Kokain-erfuerene Ratten

Fir den Afloss vun engem fréiere chronesche Kurs vu Kokain z'ënnersichen, gefollegt vun enger längerer Period vum Réckzuch, op d'Induzibilitéit vun der Fosb Gen an Äntwert op eng spéider Kokain Erausfuerderung, Ratten, déi virdru ip zweemol am Dag mat Salins oder Kokain (15 mg / kg) fir 10 Deeg injizéiert goufen, kruten Challenge Dosen vum Medikament no 28 Deeg vum Réckzuch (Figur 1A). Mir hunn als éischt Lokomotorreaktiounen an enger Grupp vun Déieren gemooss fir d'Induktioun vun der Lokomotor Sensibiliséierung duerch fréier Kokainbelaaschtung ze bestätegen, eng erwaart dauerhaft Konsequenz vun der Drogenverwaltung. Kokain-erfueren an -naiv Ratten hunn gläichwäerteg Baseline-Lokomotoraktivitéit gewisen, mat enger Kokain-Erausfuerderung fir Drogen-naiv Déieren déi hir Beweegung erhéijen (Figur 1B. Widderholl Moossnamen zwee-Wee ANOVA, Behandlung: F_1,66 =30.42, p<0.0001; Kokain Challenge: F_2,66=58.39, p<0.0001; Behandlung x Kokain Challenge: F_2,66=8.56, p=0.0005, Bonferroni Post-Tester ^{^}p<0.001). Dës Kokain Erausfuerderung induzéiert wesentlech méi grouss Lokomotoraktivitéit, dh Sensibiliséierung, bei Kokain-erfuerene Ratten (Bonferroni Post-Tester *p<0.001).

  

Figure 1

Effekt vun der viregter chronescher Kokain Belaaschtung op Lokomotoraktivitéit a Fosb Induktioun an NAc a CPu bei der neier Belaaschtung vum Medikament

Fir d'Effekter vun dësem Kokain-Virbehandlungsregime op ΔFosB Ausdrock an NAc a CPu ze evaluéieren, hu mir ΔFosB Protein mat immunhistochemesche Methoden gemooss 24 Stonnen nodeems Kokain-naiv a Kokain-erfuerene Déieren mat 0, 1, 3 oder 6 deegleche Kokain behandelt goufen Injektiounen (15 mg / kg; kuckt Figur 1A). Wéi virdru festgestallt (Nye et al., 1995), 3 Kokaininjektiounen ware genuch fir ΔFosB Protein an NAc a CPu vun Drogen-naiven Déieren wesentlech ze induzéieren a seng Akkumulation blouf bedeitend no 6 Deeg Kokaininjektiounen (Figur 1C. Widderholl Moossnamen zwee-Wee ANOVA, NAc Kär, Behandlung: F_1,28=23.5, p<0.0001; Kokain Challenge: F_3,28=49.16, p<0.0001; Behandlung x Kokain Challenge: F_3,28=6.83, p=0.0014; NAc Shell, Behandlung: F_1,28=18.69, p<0.0001; Kokain Challenge: F_3,28=31.52, p<0.0001; Behandlung x Kokain Challenge: F_3,28=3.21, p<0.05; CPU, Behandlung: F_1,28=9.47, p<0.001; Kokain Challenge: F_3,28=19.74, p<0.0001; Behandlung x Kokain Challenge: F_3,28=0.94, p>0.05. Am NAc Kär, Shell, a CPu, Bonferroni Post-Tester ^{^}p<0.05). Bei Kokain-erfuerene Déieren gouf et keng Beweiser fir bestänneg ΔFosB Induktioun an NAc oder CPu no 28 Deeg vum Réckzuch, konsequent mat fréiere Berichter datt d'ΔFosB Signal komplett op dësem Zäitpunkt verschwënnt (Nye et al., 1995), de Grond datt dësen Zäitpunkt an dëser Etude benotzt gouf. Opfälleg awer, Kokain erfuerene Ratten, déi 3 oder 6 Kokain Erausfuerderung Injektiounen kruten, hunn wesentlech méi grouss ΔFosB Protein Induktioun an NAc gewisen, en Effekt scheinbar a béid Kär a Shell Ënnerregiounen (Figur 1C. Bonferroni Post-Tester *p<0.05). Am Géigesaz, gouf keng sou grouss Induktioun vum ΔFosB Protein am CPu observéiert; amplaz, gläichwäerteg ΔFosB Induktioun gouf an dëser Regioun no 3 oder 6 Deeg Kokain Erausfuerderung Injektiounen a Kokain-naiv an -erfuerene Ratten gesi (Figur 1C).

Fir Abléck an d'Transkriptiounsännerungen ze kréien, déi an NAc a CPu optrieden als Äntwert op eng Kokain Erausfuerderung, hu mir den Zäitkurs (45, 90, an 180 min) vun der Induktibilitéit vun ΔFosB a FosB mRNA Transkriptiounen op enger eenzeger Kokain oder Salzinjektioun studéiert. fir Kokain-naiv an erfuerene Ratten no 28 Deeg vum Réckzuch (kuckt Figur 1A). Relativ zu enger Salins Erausfuerderung, eng Kokain Erausfuerderung induzéiert eng séier Erhéijung vun ΔFosB a FosB mRNA Niveauen op allen dräi Zäitpunkten a béid NAc a CPu vu Kokain-naiven Déieren (Fig 1D. Widderholl Moossnamen ee Wee ANOVA pro Zäitpunkt; Bonferroni Post-Tester ^{^}p<0.05). Am NAc hu mir méi grouss ΔFosB a FosB mRNA Induktioun bei Kokain-erfuerene Déieren observéiert am Verglach mat Kokain-naiv Déieren no der Kokain Erausfuerderung, den Effekt ass bedeitend bei 90 min, während am Géigesaz d'Induzibilitéit vun ΔFosB a FosB mRNA am CPu bedeitend war. ofgeholl bei Kokain-erfuerene Déieren (Fig 1D. Bonferroni Post-Tester ^%p=0.08, *p<0.05).

Charakteriséierung vun Upstream Signalweeër an NAc a CPu vu Kokain erfuerene Ratten

Eng méiglech Erklärung fir déi verännert Induzibilitéit vun der Fosb Gen an NAc a CPu no engem virege chronesche Kurs vu Kokain ass datt eng Ferngeschicht vu Kokainbelaaschtung dauerhaft Verännerungen an de Signalweeër induzéieren, déi upstream sinn Fosb Geninduktioun sou datt eng Kokain Erausfuerderung dann d'Gen zu engem aberrantem Grad induzéiert. Fir dës Hypothese ze studéieren, hu mir déi zwee Transkriptiounsfaktoren, SRF a CREB analyséiert, déi viru kuerzem gewise gi fir Kokaininduktioun vun ΔFosB an dëse Gehirregiounen (Vialou et al., 2012) zesumme mat Upstream Proteinkinasen, ERK an AKT, och an der Kokainaktioun implizéiert (Valjent et al., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Mir konnten keng Verännerungen am Gesamt- oder phosphoryléierten Niveau vun dëse verschiddene Proteinen z'entdecken, déi d'verännert Induzibilitéit vun Fosb observéiert, inklusiv keng Ännerungen am SRF, CREB oder AKT (Bild 2B, C). De Mangel u Ännerung am pSRF an pCREB am NAc als Äntwert op eng Kokain Erausfuerderung ass konsequent mat engem rezente Bericht, dee béid wesentlech nëmme vu chronesche Kokain induzéiert fonnt huet (Vialou et al., 2012).

  

Figure 2

Effekt vun der viregter chronescher Kokainbelaaschtung op Upstream molekulare Signaliséierungskaskaden an NAc a CPu

An NAc a CPu vun Drogen-naiven Déieren, 20 min no enger initialer Drogenbelaaschtung (Figur 2A), eng eenzeg Kokain Erausfuerderung huet d'Niveaue vu pERK42/44 erofgeholl (Bild 2B, C. Zwee Schwänz Student T-Test: *p<0.05). Et gi fréier Berichter iwwer erhéicht pERK Niveauen an dëse Regiounen no akuter Kokainverwaltung (Valjent et al., 2000). Dëst ass schwéier ze vergläichen mat anere Pabeieren déi d'ERK Phosphorylatioun an NAc ënnersicht wärend dem Réckzuch vu widderholl Kokaininjektiounen (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), wéi an eiser Etude pERK gouf no 28 Deeg vum Réckzuch an no enger Kokain- oder Salinserausfuerderung quantifizéiert. Relativ zu Drogen-naiv Déieren, déi Kokain fir d'éischte Kéier erliewen, huet d'Wiederbelaaschtung vu Kokain a Kokain-erfuerene Ratten, no 28 Deeg vum Réckzuch, eng bedeitend Erhéijung vun de pERK42/44 Niveauen am CPu verursaacht (Bild 2B, C. Zwee Schwäif Student T-Test: *p<0.05).

Chromatin Landschaft an der Fosb Gen Promoteur am NAc a CPu vu Kokain erfuerene Ratten

Mir hunn als nächst ënnersicht ob Ännerungen an Fosb Geninduzibilitéit si mat Verännerungen a senger Chromatinstruktur assoziéiert. ChIP gouf op NAc a CPu duerchgefouert mat Antikörper, déi géint dräi gutt charakteriséiert Forme vun Histonmodifikatioune geriicht goufen: Trimethylatioun vu Lys4 vum Histon H3 (H3K4me3) assoziéiert mat der Genaktivéierung, an H3K27me3 an H3K9me2 verbonne mat Genrepressioun. Mir analyséieren Kokain-naiv an erfuerene Ratten no 28 Deeg vum Réckzuch entweder ouni oder mat enger Erausfuerderungsinjektioun vu Kokain, mat Déieren déi 1 Stonn méi spéit ënnersicht goufen (Figur 3A). Am NAc hu mir keng bedeitend Ännerungen an der Bindung vun enger vun dësen dräi Histonmodifikatioune fonnt Fosb Gen Promoteur an der Verontreiung vun enger Kokain Erausfuerderung, obwuel et en Trend war fir reduzéiert Niveauen vun H3K9me2 (Abb. 3B-D. Zwee tailed Student T-Test. ^#p = 0.2 am Verglach mat jeeweilegen Drogennaiv Kontrollen). Dësen Effekt gouf bedeitend no enger Kokain Erausfuerderung a war spezifesch fir déi proximal Promoteurregioun vum Gen (Figur 3C. *p<0.05). Iwwerdeems Niveau vun H3K9me2 op e puer Genen ganz niddereg sinn, der Fosb Gen Promoteur weist bemierkenswäert Niveauen vun dëser Mark an NAc ënner Kontrollbedéngungen (Maze et al., 2010, Daten net gewisen). Am Géigesaz, am CPu hu mir kleng awer bedeitend Ofsenkungen an der H3K4me3 Bindung fonnt, a Erhéijunge vun der H3K27me3 Bindung, bei der Fosb Promoteur an der Verontreiung vun enger Kokain Erausfuerderung, Effekter verluer no der Erausfuerderung (Fig 3D. *p<0.05).

  

Figure 3

Effekt vun der viregter chronescher Kokainbelaaschtung op epigenetesch Primen vun der Fosb Gen an NAc an CPu

Mir ënnersicht nächst Pol II bindend zu der Fosb Gen, baséiert op rezent Erkenntnisser an der Zellkultur datt d'Stalling vum Pol II bei TSSs, déi duerch seng Phosphorylatioun bei Ser 5 a senger CTD Widderhuelregioun charakteriséiert ass, ass mat der Priming vun Genen assoziéiert (kuckt Aféierung). Mir analyséiert also Pol II-pSer5 bindend zu Fosb op véier verschidde Regioune vum Gen (Figur 3B). Dës Analyse verroden eng bedeitend Beräicherung vun Pol II-pSer5 op der Fosb Gen a senger proximaler Promoteurregioun a ronderëm seng TSS am NAc vu Kokain-erfuerene Déieren, no längerer Réckzuch, an der Verontreiung vun enger Kokain-Erausfuerderung am Verglach mat Kontrollen (Fig 3E. *p<0.05). Dës Beräicherung war net offensichtlech op zwee Gen Kierper Regiounen vun Fosb, konsequent mat Pol II stalling an méi einfach experimentell Systemer beschriwwen. Interessanterweis huet no enger Kokain-Challenge de Pol II-pSer5 Bindung nach ëmmer Zeeche vu Beräicherung gewisen, awer net méi bedeitend, am Fosb proximal Promoteur Regioun (Fig 3E. ^%p = 0.1), awer zréck op Kontrollniveauen am TSS. Conclusiounen am CPu ware méi variabel, ouni kloer Muster vu Pol II-pSer5 bindend observéiert.

Diskussioun

Déi heiteg Etude gëtt nei Asiicht an der nohalteg Regulatioun vun Fosb Wochen no der Stopp vun der widderholl Expositioun fir Kokain. Mir weisen datt virdru chronesch Kokainverwaltung den Fosb Gen méi inducibel am NAc, wat zu enger méi séier Akkumulation vun ΔFosB bei der neier Belaaschtung vum Medikament resultéiert. Gitt d'Iwwerhand vu Beweiser datt ΔFosB Induktioun an NAc sensibiliséiert Verhalensreaktiounen op Kokain vermëttelt (Nestler, 2008), eis Erkenntnisser weisen en neie Mechanismus fir déi méi séier Erhuelung vun esou sensibiliséierte Äntwerten no längerer Réckzuch.

Mir weisen datt déi verstäerkte Induktioun vun ΔFosB am NAc mat Chromatin Ännerungen am Fosb Gen dat erwaart gëtt et fir méi grouss Induktioun ze priméieren. Also weisen mir eng verstäerkte Pol II Bindung un de proximale Promoteur an TSS Regiounen vum Gen, déi no 4 Woche vum Réckzuch vun der fréierer chronescher Kokainverwaltung präsent sinn. Esou Pol II Beräicherung bei der TSS gëtt séier op Kokain Erausfuerderung verluer an Fosb Induktioun, konsequent mat engem Modell an der Zellkultur, déi Pol II gestoppt huet, gëtt vun TSSs op Genaktivéierung verëffentlecht (kuckt Aféierung). Eng Kokain Erausfuerderung induzéiert och e séieren Ofsenkung vun der Bindung vun H3K9me2 - e Mark vun der Genrepressioun - un de Fosb Promoteur. Am Géigesaz hu mir keng dauerhaft Induktioun vu verschiddenen Transkriptiounsfaktoren festgestallt, oder vun hiren Upstream-Kinasen, déi bekannt sinn ze vermëttelen Fosb Induktioun duerch Kokain. Dës Resultater ënnerstëtzen eis Hypothese datt déi verstäerkte Induktioun vun ΔFosB am NAc iwwer epigenetesch Primen vun der Fosb Gen an net iwwer Upreguléierung vun Upstream Eventer.

Ganz ënnerschiddlech Resultater goufen fir CPu kritt. Et gouf keng Beweiser fir Pol II stalling bei Fosb a Kokain erfuerene Ratten virun enger Kokain Erausfuerderung, obwuel et kleng awer bedeitend Histonmodifikatioune konsequent mat Genrepressioun waren: erhéicht H3K27me3 Bindung a reduzéiert H3K4me3 Bindung. Et war och keng Ännerung vun upstream Transkriptiouns Faktoren oder kinases konsequent mat reduzéiert Fosb Aféierung. Dës Erkenntnisser suggeréieren datt no chronescher Kokainverwaltung, epigenetesch Modifikatiounen déngen ze dampen Fosb Geninduzibilitéit am CPu, am Géigesaz zu der Priming, déi am NAc gesi gëtt. Wéi och ëmmer, wärend dës Effekter ΔFosB mRNA Induktioun ënnerdrécken bei der neier Belaaschtung fir Kokain, gëtt et kee Verloscht bei der Akkumulation vum ΔFosB Protein. De Mechanismus deen dëse Paradox ënnersträicht erfuerdert elo weider Enquête.

Méi allgemeng ënnerstëtzen eis Resultater e Modell wou Ännerungen an der Chromatinlandschaft bei spezifesche Genen als Äntwert op chronesch Kokainverwaltung déngen fir dës Genen ze priméieren oder ze stompen fir eng spéider Induktioun bei der neier Belaaschtung vum Medikament. Esou Chromatin Ännerungen, déi als "epigenetesch Narben" ugesi kënne ginn, géifen an Analysen vu steady-state mRNA Niveauen vun Genen verpasst ginn. Op dës Manéier versprécht d'Charakteriséierung vum Epigenom vun der Sucht frësch Informatioun iwwer d'molekulare Pathogenese vun der Stéierung z'entdecken, déi fir d'Entwécklung vun neie Behandlungen ofgebaut ka ginn.

Dankbarkeet

Referenze