PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
mythologesch
Kokain-induzéiert Verännerungen am Genausdrock verursaache Verännerungen an der neuronaler Morphologie a Verhalen déi Kokain Sucht kënnen ënnersträichen. Mir identifizéiert eng wesentlech Roll fir Histone 3 Lysin 9 (H3K9) Dimethylation an der Lysin-Dimethyltransferase G9a an der Kokain-induzéierter struktureller a Verhalensplastizitéit. Widderholl Kokainverwaltung reduzéiert weltwäit Niveauen vun H3K9 Dimethylatioun an den nucleus accumbens. Tseng Reduktioun vun der Histone Methylatioun gouf duerch d'Repressioun vu G9a an dëser Gehirregioun meditéiert, déi duerch de Kokain-induzéierte Transkriptiounsfaktor ΔFosB geregelt gouf. Mat Bedingungsmutagenese a viral-mediéierten Genentransfer, hu mir fonnt datt G9a Downregulatioun erhéicht dendritesch Wirbelsplastizitéit vun Nukleus accumbens Neuronen an eng verstäerkte Präferenz fir Kokain, an domat eng entscheedend Roll fir Histone-Methylatioun an der laangfristeg Aktiounen vu Kokain etabléiert.
Aféierung
Widderhuelend Kokain Expositioun zeechent sech duerch persistent Ännerungen am Genausdrock an verännerter neuronaler Morphologie bannent der nucleus accumbens (NAc), e Schlësselkomponent vun der Gehir Belounungskreeslaf (1-2). Chromatin Remodeling ass wichteg bei aberrant Transkriptiouns Verännerungen an dëser Gehirregioun déi Aspekter vun der Kokain Sucht ënnerläit. (3-9). Kokainreguléierung vun der Chromatin-Struktur an der NAc ergëtt sech, zum Deel, aus direkter Kokain-induzéierter Ännerunge vun der chromatin enzymatescher Maschinn, wat zu Ännerungen an der Histonacetyléierung an der Phosphorylatioun féiert (4, 7-9); awer, Rollen fir Enzymer déi Histone Methylatioun kontrolléieren sinn nach net ënnersicht.
Eng rezent Genom-breet Promoteur Analyse mat Hëllef vu Chromatin Immunoprecipitatioun gekoppelt mat Mikroarrays (ChIP-Chip) identifizéiert verännert Mustere vu repressive Histon H3 Lysin 9 (H3K9) an 27 (H3K27) Methyléierung bei spezifesche Gen Promoteuren an der NAc Behandlung c6). Mir hunn dofir vill Lysin-Methyltransferasen (KMTs) an Demethylasen (KDMs) profiléiert, déi bekannt sinn H3K9 oder H3K27 Methyléierung ze kontrolléieren (Figur 1A). Nëmmen zwee Enzymen, G9a an GLP, hunn persistent transkriptiouns Reguléierung 24 Stonnen no widderholl Kokainverwaltung ugewisen, wann den Ausdrock vu béide Genen wesentlech downreguléiert war. Well G9a an GLP speziell d'Dimethyléierung vun H3K9 (H3K9me2) katalyséieren, ass hir Downregulatioun duerch Kokain konsequent mat verréngerten globalen Niveauen vun euchromateschen H3K9me2 observéiert op dësem Zäitpunkt (Fig. 1B). Am Géigesaz, sinn global Niveaue vun heterochromatescher H3K27 Methylatioun onverännert duerch widderholl Kokain Expositioun (Fig. S1 fir Online-Material z'ënnerstëtzen). Wéinst senge héigen Niveauen vu katalytescher Aktivitéit souwuel kënschtlech an an vivo (10), hu mir ugefaang fir d'funktionell Bedeitung vun der G9a Repressioun no widderholl Kokain Expositioun am NAc weider z'ënnersichen. Niveauen vum G9a Protein, wéi d'Niveaue vu sengem mRNA, goufe wesentlech 24 Stonnen no widderholl Kokainverwaltung reduzéiert (Fig. S2). Obwuel G9a mRNA Ausdrock vun 35% am NAc reduzéiert gouf, huet d'immunohistochemesch Analyse eng méi bescheiden 15% Reduktioun am G9a Protein Niveauen opgedeckt, konsequent mat der observéierter 21% Ofsenkung vun H3K9me2 no widderholl Kokainadministratioun (Fig. 1B). G9a mRNA Ausdrock war och an dëser Gehirregioun vun 20% nei reglementéiert Selbstverwaltung vu Kokain ()Fig. S3).
Fir z'identifizéieren ob Verännerungen an euchromateschen H3K9me2 mat genome breet Verännerungen am Genausdrock am NAc korreléieren, hu mir Microarray Analysë benotzt fir d'Genausdrocksprofile ze induzéieren, déi duerch eng Erausfuerderungsdosis Kokain induzéiert goufen an Déieren mat oder ouni eng Geschicht vu virdru Kokainekspositioun (kuckt Zousaz genen Lëschten an Dëscher S1 – S3). Déieren, déi widderholl Kokain kritt haten, hunn dramatesch erhéicht Genausdrock 1 Stonn no enger Kokainentwécklung am Verglach zu akut behandelt Déieren (Abb. 1C). Dëse verstäerkten Genexpressioun ass nach ëmmer an der Äntwert op eng Kokainentfuerderung nom 1 Woch vum Réckzuch vu widderholl Kokain geschitt. Konsequent mat fréiere Berichter, huet e klenge Prozentsaz vun de Genen (~ 10%) u desensibiliséiert Transkriptiounsreaktiounen no widderholl Kokainadministratioun gewisen (Abb. 1C;; gesinn Table S1) (5). Fir direkt d'Roll vun der G9a Downregulatioun an der verstäerkter Genexpressioun z'observéieren, no widderholl Kokain observéiert, kruten d'Mais intra-NAc Injektiounen vum Herpes Simplex Virus (HSV) Vektoren, déi entweder GFP oder G9a ausdrécken a goufe mat Salz oder widderholl Kokain behandelt fir ze bestëmmen ob G9a Iwwerexpressioun war genuch fir déi wiederhuelend Kokain-induzéiert Erweiderung vum Genausdrock ze blockéieren. Aus engem Set vun 12 zoufälleg ausgewielten Genen déi erhéicht Ausdrockniveauen no widderholl Kokain, observéiert mir datt G9a de verstäerkten Ausdrock vun 50% vun dësen Genen wesentlech reduzéiert huet (Table S4).
Fir Upstream transkriptionell Veranstaltungen ze identifizéieren déi déi widderhuelend Kokain-induzéiert Repressioun vum G9a Ausdrock mediéieren, hu mir eng méiglech Roll fir ΔFosB ënnersicht, e ganz stabile Spritprodukt vum direkt fréiere Gen fosBAn. ΔFosB accumuléiert am NAc no widderholl Belaaschtung fir Kokain, wou et mat enger verstäerkter Kokain Belounung verbonne war (11). ΔFosB kann als entweder en transkriptiouns Aktivator oder Repressor handelen jee no dem involvéierten Zilgen (3, 5, 6, 12). Benotzt bitransgenic NSE-tTA × tetOP-ΔFosB Mais, wou ΔFosB Ausdrock selektiv am NAc an dorsal Striatum vun erwuessene Déieren induzéiert ka ginn (13), hu mir den Impakt vun ΔFosB Ausdrock op Kokainreguléierung vun H3K9me2 an KMTs am NAc iwwerpréift. ΔFosB Iwwerexpressioun war genuch fir Niveauen vu béiden H3K9me2 ze reduzéieren (Fig. 1D) an G9a Ausdrock (Fig. 1E), an domat d'Effekter vu wiederholte Kokain mimikéieren. Am Géigesaz huet ΔFosB den GLP Ausdrock an dëser Gehirregioun net reduzéiert, an hat keen Effekt op SUV39H1 an EZH2, déi Haapttrimethyléierend Enzyme fir H3K9 an H3K27, respektiv (Fig. S4). Fir dës Donnéeën mat engem eegestännegen ΔFosB Iwwerexpressiounssystem ze bestätegen, hunn wildtype erwuessene Musse bilaterale Intra-NAc Injektiounen vun Adeno-assoziéierten Virus (AAV) Vektore kritt, déi entweder GFP oder ΔFosB ausdrécken. Viral-mediéiert Iwwerausdrock vun ΔFosB ofgeholl Niveauen vun G9a Ausdrock an dëser Gehirregioun (Fig. 1E).
Esou ausgesprochen a spezifesch Reguléierung vu G9a huet eis gefrot fir z'ënnersichen ob G9a Ausdrock spezifesch an NAc Neuronen ze änneren reguléiert Verhalensreaktiounen op Kokain. Wildtype-Méis kruten intra-NAc Injektiounen vun HSV-Vecteuren, déi GFP oder G9a ausdrécken, a goufen duerno mat engem onbestännegen Kokain bedingte Plazepräferenzparadigm analyséiert, wat en indirekten Mooss vun der Drogebelounung gëtt. Viral Iwwerexpressioun vu G9a an NAc Neuronen gouf bestätegt no Verhalungstestungen (Figur 2A). G9a Iwwerexpressioun wesentlech manner Präferenz fir Kokain am Verglach mat Déieren, déi GFP iwwerexpresséieren (Fig. 2B), an erhéicht H3K9me2 Niveauen am NAc (Abb. 2C). Iwwerexpressioun vun engem katalytesch doudege Mutant vu G9a (G9aH1093K) (14) beaflosst Kokain-Präferenz (Fig. 2B) an hat hat keen Afloss op H3K9me2 Niveauen an dëser Gehirregioun (Abb. 2C).
Fir weider d'Roll vu G9a an de Verhalenseffekter vu Kokain ze studéieren, a méi spezifesch fir d'Widderhuelung vu Kokain-induzéierter Repressioun vum G9a Ausdrock am NAc ze mimiéieren, erwuesse G9afl / fl Mais (14) kréien intra-NAc Injektiounen vun AAV-Vektoren, déi Cre-Rekombinase oder GFP ausdrécken als Kontroll. AAV-Cre knockdown vum G9a am NAc, wat immunohistochemesch bestätegt gouf (Fig. S5), wesentlech d'Effekter vu Kokain an Plazkonditionéierungsexperimenter erhéicht an H3K9me2 Niveauen am NAc erofgeholl (Fig. 2D, E). E kommerziell verfügbare pharmakologeschen Inhibitor vu G9a a GLP, BIX01294 (15-16), gouf benotzt fir erauszefannen ob Enzyminhibitioun ähnlech Verhalensreaktiounen op Kokain beaflosst. Tatsächlech huet d'pharmakologesch Hemmung vu G9a an GLP wesentlech méi Präferenz fir Kokain an erofgaang H3K9me2 an der NAc (Fig. 2F, G).
Widderhuelte Verwaltung vu Kokain erhéicht d'Densitéit vun dendritesche Wirbels op NAc mëttelgrousse Neuronen (17), e Prozess verbonne mat funktionnelle Verännerungen bei excitatoreschen glutamatergesche Synapsen op dës Neuronen (18-19) a sensibiliséiert Verhalensreaktiounen op dat Medikament (17, 20). Mir hunn also hypothese datt d'Donreguléierung vun der G9a Aktivitéit am NAc duerch wiederholte Kokain d'Muecht vu Kokain mediéiert fir d'dendritesch Wirbelsdicht vun NAc Neuronen ze reguléieren. Mat Hëllef vu Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP) mat engem Anti-G9a Antikörper, hu mir verschidden putative G9a Genziler am NAc identifizéiert, jidderee vun deem virdru mat Kokain-induzéierter dendritescher Plastizitéit implizéiert gouf (Figur 3A) (20-26). Mir hu festgestallt, datt widderholl Kokainadministratioun bedeitend G9a Bindung ofgeholl huet, wéi och Niveaue vun H3K9me2, bei dësen Gen Promoteuren (Fig. 3B). Am Géigesaz, akut Kokainadministratioun huet séier G9a an e puer vun dësen selwechten Gen Promoteure rekrutéiert, konsequent mat verstäerkten G9a Ausdrock observéiert an der NAc 1 Stonn no enger akuter Dosis Kokain (Fig. S6). Och wann G9a Bindung bei spezifesche Gen Promoteuren korreléiert mat Verännerungen a sengem Ausdrock, bleift et onkloer ob esou Eventer duerch verännert global Niveaue vu G9a am NAc an / oder duerch Differenzen an der G9a Rekrutéierung nom Akut vs. widderholl Kokainadministratioun.
Baséierend op G9a Reguléierung vu ville Plastizitéit-verbonne Genen am NAc, hu mir direkt iwwerpréift ob d'Erhaalung vum G9a Ausdrock an dëser Gehirregioun no widderholl Kokainbehandlung genuch war fir Kokain-induzéierter dendritescher Wirbelsbildung ze blockéieren. Mat Hëllef vun engem Kokain Behandlungsprotokoll virdru bewisen dendritesch Wirbelsäduktioun am NAc ze förderen20), hu mir d'Wirbelsäitegkeet an Déieren iwwerpréift mat entweder HSV-GFP oder HSV-G9a. Am Aklang mat fréiere Befunde, hu mir eng däitlech Erhéijung vun der dendritescher Wirbelsätheicht an der NAc beobachtet no Kokainbehandlung, en Effekt dee komplett vun der G9a Iwwerausdrock blockéiert gouf (Abb. 3C). G9a Iwwerausdrock eleng war net genuch fir d 'NAc dendritesch Wirbelsätheit ze reduzéieren an der Verontreiung vu Kokain. Fir dës Donnéeën ergänzen, G9afl / fl Mais hunn intra-NAc Injektiounen vun HSV-Cre kritt a Wierbelsdicht gouf quantifizéiert a verglach mat Déieren, déi HSV-GFP an der Verontreiung vu Kokain kréien. Knockdown vum G9a Ausdrock wesentlech erhéicht Wirbelsätheet op NAc mëttelgrousse Neuronen (Abb. 3C).
Nom Beweis datt d'G9a Downregulatioun am NAc nom wiederholte Kokain duerch ΔFosB mediéiert gouf, hu mer duerno iwwerpréift ob dësen Transkriptiounsfaktor och an der Reguléierung vun NAc dendritesche Spines involvéiert ass. Och wann ΔFosB net virdru kausalesch mat sou dendritescher Plastizitéit verbonne war, sinn e puer vu sengen Ziler, ënner anerem Cdk5 an NFκB Subunits, sou implizéiert (20-23), an ΔFosB de persistent Ausdrock an NAc Neuronen korreléiert mat verstäerkter dendritescher Wirbelsäthe no widderholl Kokainbehandlung (27). Als éischt hu mir dës Induktioun vun ΔFosB bei bitransgenen Mais fonnt an der Verontreiung vu Kokain, déi G9a an den H3K9me2 Ausdrock (Fig. 1D, E), ofgeholl G9a bindend zu ville Plastizitéit-verbonne Genen, vill vun deenen och gewisen hunn als direkt Ziler vun ΔFosB selwer (Fig. 3D) (3, 6). Mir hunn nieft gewisen datt viral Iwwerexpressioun vun ΔFosB am NAc wesentlech erhéicht dendritesch Wirbelsäthet ënner Basal Bedéngungen, ähnlech wéi déi no widderholl Kokainadministratioun (Fig. 3E). Ëmgekéiert huet d'Iwwerexpressioun an der NAc vun ΔJunD, en dominanten negativen mutanten Protein dat ΔFosB transkriptionell Aktivitéit antagoniséiert, d'Fäegkeet vu wiederholte Kokain fir eng Erhéijung vun der dendritescher Wirbelsail am NAc blockéiert (Abb. 3C).
Eis Observatioun datt ΔFosB de G9a Ausdrock an der NAc reguléiert, an datt ΔFosB an G9a e puer vun deemselwechten Zilgenen reguléieren, hunn eis aner Interaktioune tëscht ΔFosB an G9a ënnersicht. No akuter Kokain, wann G9a Niveauen eropgaange sinn, bindend vu G9a un den fosB gene gouf erhéicht, wärend nach widderholl Kokain, wann G9a Ausdrock verdréckt war, G9a verbindlech un de fosB Gen ofgehollFigur 3A). Esou erofgaang G9a Bindung no widderholl Kokain gouf net observéiert c-fos, wou G9a Bindung duerch wiederholte Kokain erhéicht gëtt (Fig. S7). Dëst ass konsequent mam Fakt datt, anescht wéi fosB, c-fos gëtt represséiert, net induzéiert, duerch chronesch psychostimulant Belaaschtung (5). ΔFosB Iwwerexpression bei bitransgenen Mais war genuch fir däitlech G9a Bindung zu der fosb der Gent (Fig. 3D). Ausserdeem war d'G9a Iwwerexpressioun genuch fir de verstäerkten ΔFosB Ausdrock ze reduzéieren no widderholl Kokainadministratioun (Table S4). Dës Donnéeën suggeréieren en autoreguléierende Loop, wouduerch G9a am Ufank Induktioun vun ofFosB duerch akuter Kokainverwaltung limitéiert huet. Wéi awer ΔFosB sech mat widderholl Drogenbelaaschtung accumuléiert, represséiert se G9a an doduerch potentéiert seng eege weider Induktioun.
Als Konklusioun hu mir bewisen datt Histon Lysin Methyléierung am NAc kritesch involvéiert ass fir d'neuronal Genausdrock an der Äntwert op Kokain ze reguléieren. Repressioun vu G9a an H3K9me2 no widderholl Kokainverwaltung fördert Präferenz fir Kokain, deelweis duerch déi transkriptiouns Aktivéierung vu ville Genen, bekannt fir aberrant Formen vun der dendritescher Plastizitéit ze regelen. E bessert Verständnis vun de Genen ze kréien, déi duerch sou Mechanismen geregelt ginn, verbessert eist Wëssen iwwer déi komplex biologesch Basis vun der Drogenubannung a konnt an der Entwécklung vu méi effektive Behandlungen vu Suchtfeelerung hëllefen.
Materialien an Methoden
Déieren a Behandlungen
Wann net anescht uginn, goufen d'Mais véier bis fënnef pro Käfeg an enger Kolonie mat engem 12 Stonn Liicht / donkelen Zyklus (Luuchten un vun 7: 00 AM bis 7: 00 PM) mat konstanter Temperatur (23 ° C) mat ageriicht. ad libitum Zougang zu Waasser a Liewensmëttel. All Déierprotokoller goufe vun IACUC a béid UT Südweste Medical Center a Mount Sinai School of Medicine guttgeheescht.
Fir Kokain Experimenter [Immunohistochemitry, westlech blotting, quantitativ PCR (qPCR), Mikroarray Analyse a Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP)], 8- bis 10-Woch-aler männlech C57BL / 6J Mais goufen benotzt. Déieren kruten deeglech Injektiounen vun entweder 'Salins' (7 Behandlungen Salins, ip), 'akut' Kokain (6 Behandlungen Salins + eng Behandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) oder 'widderholl' Kokain (7 Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip). Mais goufe entweder 1 Stonn oder 24 Stonnen no der definitiver Behandlung geaffert. Fir Mikroarray Studien goufen Déieren all Dag mat entweder 'Salins' (15 Behandlungen Salins, ip), 'akuten' Kokain (14 Behandlungen Salins + 1 Behandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip), 'widderholl + akut' Kokain ( 7 Behandlungen Salz + 8 Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) oder ‘widderholl Réckzuch + akut’ Kokain (7 Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl + 7 Behandlungen Salz + 1 Challenge Behandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) a goufe 1 Stonn no der definitiver Behandlung geaffert. Bei Verhalensexperimenter goufen d'Mais eenzeg nom Agrëff gehost a goufe mat 10 mg / kg Kokain-HCl behandelt, ip wéi hei ënnendrënner beschriwwe ginn. Fir dendritesch Wirbelsanalyse a Mikroarray Validatioun no HSV-GFP an HSV-G9a-GFP Infektioun, goufen d'Mais mat 'Salins' (5 Behandlungen Salins, ip) oder 'wiederholte Kokain' (5 Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) behandelt ) am Laaf vun 3 Deeg, wéi dësen Injektiounsprotokoll virdru bewisen gouf datt d'Wirbelsdicht op Nukleus Accumbens (NAc) Neuronen an der Zäitframe vum Herpes Simplex Virus (HSV) Transgen Ausdrock erhéicht (Zousaz Ref S1). Musse fir dendritesch Wirbelsanalyse benotzt goufen ofgerappt 4 Stonnen no der leschter Behandlung.
Fir d'lokal Läsche vum G9a Transkript ze beschränken, limitéiert op NAc Neuronen, hu mir mutant Musse homozygot fir eng floxed G9a Allel benotzt, déi am Detail soss anzwëschen beschriwwe goufen (S2). Cre-induzéiert Rekombinatioun produzéiert Exon 22 an 25 ausserhalb vun der Rumm Splicing, déi zu onseit-mediéierten Zerfall vum mutéierte Transkript féiert. Mir hunn G9a floxéiert Méis benotzt déi voll op C57BL / 6J Musse gekräizegt goufen. Mais goufen sterotaxesch injektéiert an den NAc mat Adeno-assoziéierten Virus (AAV) Vektore (Serotyp 2) ausdrécken GFP oder Cre-GFP tëscht dem Alter vun 7 an 10 Wochen. Immunohistochemesch Analyse gouf benotzt fir d'Effizienz vun der Cre-mediéierter Rekombinatioun z'iwwerpréiwen (kuckt Zousaz Fig. S5). Mir hunn AAV injektéiert Déieren 21 Deeg no der Chirurgie benotzt, well d'Rekombinatioun an G9a floxedem Mais war stabil a maximal op dësem Zäitpunkt, konsequent mat verëffentlechte Berichter (S3-S4). G9a an ΔJunD Iwwerexpressiounsexperimenter goufen ähnlech duerchgefouert mat HSV Virusvektoren, déi entweder GFP, wildtype G9a-GFP ausdrécken, katalytesch dout G9aH1093K-GFP oder ΔJunD-GFP (kuckt S2 fir Detailer betreffend d'Entwécklung vu G9a Konstruktiounen). HSV iwwerexpresséierend Mais goufen 3 Deeg Post-Chirurgie benotzt zënter Iwwerexpressioun war maximal zu dësem Zäitpunkt, wéi iwwer Immunohistochemie observéiert. Wéinst der transienter Natur vun HSV Ausdrock, an der wesentlech méi stabiler Natur vun AAV Ausdrock, goufen HSV Vectors an Experimenter benotzt déi séier, kuerzfristeg Transgene Ausdrock erfuerderen, wärend AAV Vectors an Experimenter benotzt goufen, déi verlängert Perioden vun Transgenausdrock erfuerderen. Béid Vecteure goufen gewisen, a extensivem fréiere Studien, nëmmen neuronal Zellkierper an der injizéierter Gehirnregioun ze infizéieren, ouni Infektioun vun afferenten oder efferenten Neuronen.
Fir Verhalensexperimenter mat dem pharmakologeschen G9a / GLP-Inhibitor, BIX01294 (25 ng / μl), goufen d'Mais sterotaxesch mat zwee subkutane Mini-Pompelen, souwéi bilaterale Guidekanulae, an den NAc implantéiert. Mini-Pumpe goufen 12 Stonnen viru der Implantatioun ageschalt, déi kontinuéierlech Liwwerung (0.25 μl / Stonn) vun entweder Gefier (5 Hydroxypropyl ß-Cyclodextrin) oder Medikament fir 14 Deeg initiéiert, wärend der Zäit Verhalensevaluatioune goufen ausgefouert.
Fir ΔFosB Iwwerexpressiounsexperimenter [westlech Blotting, qPCR, an ChIP], männlech bitransgenesch NSE-tTA × tetOP-ΔFosB Musse goufe benotzt (10 Woch al), wouduerch an der Verontreiung vun der tetracyclin derivat Doxycyclin (8 Wochen off doxycycline), Déiere gewisen hunn robust striatal beschränkt konstitutive Ausdrock vun ΔFosB (S5). ΔFosB Iwwerausdrock bei dëse Mais gouf iwwer qPCR bestätegt. Fir Befunde mat NSE ze bestätegentTA × tetOP-ΔFosB Mais, wildtype 8-Woch al C57BL / 6J männlech Mais goufe sterotaxesch injektéiert intra-NAc mat AAV-Vektore, déi entweder GFP oder ΔFosB-GFP ausdrécken. AAV-Vecteure goufe benotzt, an dësem Fall, fir maximal ΔFosB Ausdrock bei 8 Wochen no der Chirurgie ze garantéieren, wat en direkten Verglach tëscht viral infizéiert a bitransgenic ΔFosB iwwerausdrockend Mais suergt. Viral Iwwerexpressioun gouf mat QPCR bei 8 Wochen no der Chirurgie bestätegt (15-Jauge NAc Punch goufen ënner der Injektiounsplaz dissektéiert). AAV-GFP an AAV-ΔFosB-GFP Iwwerexpresséiere Mais, déi net fir qPCR benotzt goufen, goufen mat Salzlinn behandelt (14 Behandlungen Salins, ip) oder widderholl Kokain (14 Behandlungen 30 mg / kg Kokain-HCl, ip) ugefaang bei 6 Wochen Post- Agrëff. 4 Deeg no der definitiver Behandlung goufen d'Gehirer mat 4% paraformaldehyd fixéiert, op e vibratome gesnitt an fir dendritesch Wirbelsanalyse benotzt.
Western blot Analyse
14-Jauge NAc-Stämme goufen aus 1 mm Koronal Sektioune kritt mat Hëllef vun enger Edelstol Maus Gehirmatrix a goufe sonéiert an 1 M HEPES Lysis-Puffer (1% SDS) enthale Protease- a Phosphatase-Inhibitoren. 10-30 μg Proben vum Gesamtprotein goufen op 18% SDS Gele elektrophoréiert. Proteine goufen op PVDF Membranen iwwerdroen an mat entweder Anti-H3K9me2 (Maus monoklonal, 1: 500), Anti-ß-Tubulin (Maus monoklonal, 1: 60,000), Anti-total Histon H3 (Kanéngchen polyklonal, 1: 5,000), Anti-ß-Tubulin (Kanéng polyklonal, NN) transferéiert anti-GFP (benotzt fir d'Verifizéierung vum gläichen viralen Ausdrock am gestoppte Tissu) (Kanéngchen polyklonal, 1: 1000), Anti-H3K27me3 (Kaninchen polyklonal, 1: 500) oder Anti-Aktin Antikierper (Maus Monoklonal, 1: XUM) 60,000 ° C (all Membranen goufen an 4% Mëllech oder 5% Boverie Serum Albumin blockéiert). Membranen goufen duerno mat peroxidase-labeléierte sekundären Antikörper incubéiert (5: 1-1: 60,000 ofhängeg vum primäre Antikörper benotzt) a Bänner goufen visualiséiert mat SuperSignal West Dura Substrat. Bands goufe mat NIH Image J Software quantifizéiert an H3K9me2 Bands goufen normaliséiert fir entweder Aktin oder ß-Tubulin an zu totale Histon H3 fir eng Kontroll fir de gläiche Belaaschtung. Widderholl Kokain hat keen Effekt op Niveauen vun Aktin (Fig. S8) oder total Histon 3 (Fig. S1) am NAc. Ausserdeem, HSV-G9a-GFP an HSV-G9aH1093K-GFP Infektioun haten keen Effekt op Gesamtniveauen vun ß-Tubulin am NAc (Fig. S8).
Immunhistochemie
Mais goufe mat enger fataler Dosis Chlorhydrat gesedert an mat 4% paraformaldehyd perfuséiert ier se duerch eenzel oder duebel Immunohistochemie analyséiert goufen wéi virdrun beschriwwen (S6). Kuerz, post-fixéiert Brains goufe bei Raumtemperatur Iwwernuechtung an 30% sucrose incubéiert ier se op 35 μm gesektioun goufen (Brains, déi fir dendritesch Wirbelsanalyse benotzt goufen, goufen op enger vibratome bei 100 μm Sektiounen an der Fehlen vun 30% sucrose). Fräi-schwiewend NAc Sektioune goufe mat 1X PBS gewascht, blockéiert (3% normal Donkesserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) a spéider mat In-GFP (Poulet polyclonal, 1: 8000) an / oder Anti-G9a (Kanéngchen polyklonal) incubéiert , 1: 500) Antikörper an der Blockéierungsléisung. Sektiounen analyséiert fir dendritesch Pickelen goufe mat engem Kanéngchen polyklonal anti-GFP Antikörper op 1: 200 incubéiert. No Iwwernuechtung Inkubatioun goufen NAc Sektiounen 3 Mol fir 10 Minutte mat 1X PBS gespullt, gefollegt vu Inkubatioun mat Cy2 an / oder Cy3 fluoreszent gekoppelte sekundär Antikörper an 1X PBS Blockéierungsléisung fir 2 Stonnen. Sektioune fir Morphologiestudien benotzt goufen an e sekundären Antikörper Nuecht bei Raumtemperatur incubéiert. Nuklear Co-staining gouf erreecht andeems Sektiounen an 1X PBS mat DAPI (1: 50,000) fir 10 Minutten inkubéieren. Sektiounen goufen nach eemol gewascht, gefollegt vun Ethanol Dehydratioun a Montéierung mat DPX. All Sektioune goufen mat konfokaler Mikroskopie gemaach.
RNA Isolatioun a qPCR
Bilateral 14-gauge NAc Punches goufen an Trizol homogeniséiert a veraarbecht no den Instruktioune vum Hiersteller. RNA gouf mat RNAesy Micro Säulen gereinegt a Spektroskopie bestätegt datt d'RNA 260/280 an 260/230 Ratioune> 1.8 waren. RNA gouf duerno mat engem Bio-Rad iScript Kit ëmgeschriwwen. cDNA war vun qPCR mat SYBR Green laachen. All Reaktioun gouf am Duplikat oder Triplikat lafen an no der ΔΔCt Method analyséiert wéi virdru beschriwwe Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) als Normaliséierungskontroll (S7). Kuckt zousätzlecht Table S5 fir mRNA Primersequenzen.
DNA Microarray Analyse
Véier Gruppen (3 onofhängeg biologesch Replikatiounen pro Grupp) goufen fir d'Microarray Studie benotzt, am Ganzen 12 Microarrays. 1 Stonn no der leschter Kokaininjektioun goufen d'Déieren séier entfouert an Hirne goufen ewechgeholl an op d'Äis geluecht. Dissektioune vum NAc goufen mat engem 15-Jauge-Nolschoss geholl a goufe séier op dréchen Äis gefruer bis d'RNA extrahéiert gouf. Bilateral Schlässer goufe vu véier Déieren pro Replikat gesammelt, am Ganzen 12 Mais pro Grupp. RNA Isolatioun, Microarray Veraarbechtung, an Datenanalyse goufen wéi virdru beschriwwen (S8). Kuerz war RNA isoléiert a gereinegt wéi et hei uewe beschriwwe gouf a gouf mat Agilent's Bioanalyzer fir Qualitéit kontrolléiert. Ëmgekéierte Transkriptioun, Verstäerkung, Etikettéieren an Hybridiséierung zu Illumina MouseWG-6 v2.0 Arrays goufen duerch Standardprozedure vum UT Southwestern sengem Microarray Kär gemaach. Raw Date goufen Hannergrond ofgezunn a quantiliséiert normaliséiert mat Beadstudio Software. Normaliséiert Date goufen analyséiert mat GeneSpring Software an Geneliste goufe generéiert mat Bedeitungscritèren vun engem 1.3-fache Changement-Ofschnëtt gekoppelt mat engem net-strenge p-Wäert-Ofschneiden vu p <0.05.
Mir behalen e héije Grad vu Vertrauen an dësen Daten aus verschiddene Grënn. Als éischt goufen all Déieren gläichzäiteg, ënner de selwechte Bedingunge gehandhabt, behandelt an ëmbruecht. Wéi och all d'RNA an d'Array Veraarbechtung gouf zur selwechter Zäit duerchgefouert. Zweet, hu mir triplicate Arrays ausgefouert a multiple Déieren pro Array-Probe poolt, an doduerch Differenzen miniméiert wéinst der individueller Variabilitéit an erhéijen statistesch Kraaft (S9). Drëttens, d'Datenanalysekriterien, déi fir eis Studie benotzt goufen, ginn vum MicroArray Qualitéits Kontroll Projet recommandéiert, well dës Kritären validéiert goufen fir en héije Grad vun der intersite Reproduséierbarkeet an der Inter- an Intraplatform Reproducibilitéit ze bidden (S10-S11).
Bau vu virale Vektore
Wéinst virale Vecteure Insertiounsgréisst Aschränkungen, codéierend Sequenzen fir entweder wildtype G9a (G9a) oder katalytesch dout G9a (G9aH1093K) goufen an de bicistronic p1005 + HSV plasmid ausdrécklech ausgedréckt GFP ënner der Kontroll vum mënschleche direkt fréie CytXegal Insertiounsgréisst war ~ 9 kb, wat déi maximal Insertiounsgréisst fir AAV-3.96 Vektore iwwerschreift). Den IE2 / 4 Promoteur dréckt G5a Ausdrock. Fragmenter goufen an de bicistronic p9 + HSV Plasmid iwwer stump Endend ligations mat Klenow behandelt PmeI an EcoRI verdaut G1005a (vum pcDNA9) a CIP behandelt p3.1 + no der EcoRI Verdauung subklonéiert. Fir Produktioun vun HSV-ΔJunD-GFP, gouf d'Kodéierungssequenz vun ΔJunD geflunn duerch EcoRI Restriktiounsplazen duerch PCR generéiert andeems primer Oligonucleotiden enthale mat dem EcoRI Site. De PCR Produkt gouf dunn op den EcoRI Site vum p1005 + Vector geligert. Lokalen Ausdrock vu Cre-Rekombinase an NAc Neuronen gouf duerch viral-mediéiert Gen-Liwwerung erreecht mat Hëllef vun engem AAV-Vektor wéi beschriwwen (S12). GFP oder eng N-terminal Fusioun vu GFP zu Cre gouf an eng rekombinant AAV-2 Vektor subklonéiert mat engem CMV Promoteur mat enger Splécker Donor acceptor Sequenz a Polyadenyleringssignal. All Vecteure-Insektioune goufe vun Dideoxy Sequenzen bestätegt. Viral Vektore goufe mat enger Triple-Transfection, helleffräi Method produzéiert, wéi virdru beschriwwen (S13). Purifizéiert Virus gouf bei −80 ° C gelagert. Viral Qualitéit gouf vun infektiivtem Titer an HEK293 Zellen bewäert. AAV-ΔFosB-GFP Virussen goufen ähnlech virbereet. Fir HSV-Cre gouf Cre Ausdrock vun engem IRES Promoteur ugedriwwen, am Géigesaz zum IE4 / 5 Promoteur, fir Cre Ausdrock ze minimiséieren an neuronal Toxizitéit ze vermeiden (kuckt S14 fir viral Konstruktioun). An alle Fäll, viral Iwwerausdrock war validéiert, béid kënschtlech an vivo, iwwer qPCR, a Virussen goufen immunohistochemically bestätegt fir NAc-ageschränkt Ausdrock no der Chirurgie ze weisen.
Stereotaxesch OP
Ënner Ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) Anästhesie goufen d'Mais an engem klengt Déier stereotaxescht Instrument positionéiert, an d'kranial Uewerfläch gouf ausgesat. Drësseg-Dräi Jauge Sprëtzen Nadelen goufen benotzt fir 0.5 μl Virus bilateralt ze infuséieren an den NAc mat engem WNNXX ° Winkel (AP + 10; ML + 1.6; DV - 1.5) mat engem Taux vun 4.4 μl / min. Déieren, déi HSV Injektioune kréien, dierfen sech fir 0.1 Deeg no der Chirurgie erëmkréien, wärend Méis fir Verhalungstestung, déi AAV-Vektore benotzt goufen, dierfen sech fir 2 Deeg erëmkréien ier se op enger Plazbedéngung ënnerworf goufen. Dës Zäite si konsequent mat de Perioden vu maximalen viral-mediéierten Transgene Ausdrock fir déi zwee Vektoren. Fir BIX20 Infusiounen goufen all zwou Mini-Pumpe subkutant um Réck vun der Maus positionéiert. Cannulae Placementer goufen erreecht duerch Buerungen vun zwee klenge kranial Lächer iwwer dem NAc, an duerch d'Liwwerung vun der Kanul aus Bregma (AP + 01294; ML + 1.5; DV - 1.0). Mais goufe erlaabt vun der Chirurgie fir 5.4 bis 4 Deeg ze recuperéieren ier se d'Plazkonditionéierungsprozedur fir Kokain ufänken wéi hei ënnendrënner beschriwwe ginn.
Bedingung Betriber
D'Plazbedingungsprozedur gouf wéi virdru beschriwwen, mat de folgende Ännerungen (S7). Kuerz, 3 Deeg no intra-NAc Infusiounen vun HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP oder HSV-GFP, goufen d'Mais an d'Konditiounskammer gesat, déi aus dräi ënnerschiddlechen Ëmfeld bestinn. Mais déi bedeitend Präferenz fir eng vun den zwou Konditiounskamere gewisen hunn, goufen aus der Studie ausgeschloss (<10% vun allen Déieren). Conditionnéierungsgruppe goufen dunn ausgeglach fir sech fir all Kammerviraussetzung unzepassen déi et nach ëmmer gëtt. Op pafolgende Deeg goufen Déieren mat Salzinjektioun injizéiert an am Nomëtteg 30 Minutten an eng Kammer agespaart an duerno mat Kokain injizéiert (10 mg / kg, ip) a fir 30 Minutten an déi aner Chamber owes fir 2 Deeg agespaart (zwee Salzléisung an zwee Kokainpaarungen). Um Dag vum Test goufen d'Mais an den Apparat ouni Behandlung fir 20 Minutte plazéiert a getest fir ze evaluéieren wéi eng Säit se bevorzugt hunn. Bewegungsreaktiounen op Kokain goufen iwwer Stralepausen an de Kokain-gepaarte Kammerer bewäert fir d'Effektivitéit vun der Drogenbehandlung ze garantéieren. Fir AAV an BIX01294 CPP Experimenter gouf e liicht modifizéierte Protokoll agestallt. Déieren goufen erëm entweder mat Salz oder Kokain (10 mg / kg, ip) injizéiert a fir 30 Minutte Sessiounen op spezifesch Kummeren agespaart, awer amplaz waren nëmmen eemol den Dag fir 4 Deeg bedingt, gefollegt vum Test um Dag 5 (Déieren ware bedingt Owes a Konditiounsbehandlunge goufen ofgewiesselt). Fir all Gruppen, gouf d'Baseline Bewegung als Reaktioun op Salzléisung beurteelt fir sécherzestellen, datt Bewegung net vu viraler oder Inhibitor Behandlung beaflosst gouf.
Intravenös Kokain Selbstverwaltung
Männlech erwuessent Long-Evans Ratten, déi 230 – 250 g geweit hunn am Ufank vum Experiment. Si goufen an enger Loftfiichtegkeet a temperaturkontrolléierter Ëmfeld op engem ëmgedréchent 12 Stonn Liicht / donkel Zyklus gehait (Luuchten ofgeschloss op 9: 00 am) mat ad libitum Zougang zu Iessen a Waasser. Ratten hu sech erlaabt an hiert neit Ëmfeld ze acclimatiséieren a goufe all Dag fir 1 Woch virum Ufank vum Experiment behandelt. All Prozedure goufen am Aklang mam National Institut fir Gesondheetshandbuch fir d'Betreiung an d'Benotzung vun Laboratoire Déieren gehaal a goufe vum Mount Sinai Déiereschutz- a Benotzungscomité genehmegt. D'Selbstverwaltungsausrüstung gouf mat Infraroutstrahlen ausgestatt fir d'Lokomotorescht Verhalen ze moossen. Selbstverwaltung gouf duerchgefouert wéi virdru beschriwwen (S15-S16) mat Katheteren an déi riets Halswéi ënner Isofluran (2.4-2.7%) Anästhesie implantéiert. Katheter goufen mat 0.1 ml vun enger Salzléisung mat 10 U Heparin an Ampicillin (50 mg / kg) gespullt. No enger Woch Erhuelung vun der Operatioun huet d'Selbstverwaltungstraining während der däischterer Phase vum Liicht / Däischteren Zyklus ugefaang. Déieren goufen 3-Stonne deeglech Zougang zu Kokain (0.75 mg / kg / Infusioun) ënner engem fixe Verhältnis-1 (FR1) Verstäerkungsplang erlaabt, wou 1 aktiv Hiewelpress zu enger eenzeger Infusioun vun Drogen resultéiert. Ratten hunn hir Kokainzufuhr no 6 Deeg stabiliséiert (<15% Variatioun an der Äntwertquote iwwer 3 hannereneen Deeg, mat op d'mannst 75% op de verstäerkten Hiewel). 24 Stonnen no der leschter Selbstverwaltungssessioun goufen Ratten séier ofgekapelt, Gehirer séier ewechgeholl a veraarbecht fir d'RNS Isolatioun a qPCR.
Chromatin Immunopfällung (ChIP)
Frësch NAc Punch goufen formaldehyd verknëppelt a virbereet fir ChIP wéi virdru beschriwwen (S17-S18) mat klengen Ännerungen. Kuerz, goufen 4 14-Jauge NAc-Stämme pro Déier (5 Déieren pro Probe gesammelt) gesammelt, mat 1% Formaldehyd verknallt a mat 2 M Glycine ofgeschoss ier se bei −80 ° C gefruer goufen. 1 Dag virum Proben Sonikatioun, Schafe Anti-Kanéngchen / Maus (ofhängeg vum Ausfäll Antikörper) IgG magnetesch Perlen goufen virbereet andeems se passend magnetesch Perlen mat entweder Anti-G9a (Kanin polyklonal ChIP Grad) oder Anti-H3K9me2 (Maus monoklonal ChIP Grad) inkubéieren antibodies Iwwernuechtung bei 4 ° C ënner konstanter Rotatioun a Blockléisung. Tissue sonication an chromatin Schéier goufen duerchgefouert wéi virdru beschriwwen (S17). No der Sonikatioun goufen d'selwecht Konzentratioune vu Chromatin an nei Réier transferéiert an ~ 5% vun den endgültege Produkter goufe gerett fir als 'Input' Kontrollen ze déngen. No grëndlecher Wäschung a Resuspensioun vun de konjugéierte Perlen / Antikörpermëschungen goufen d'selwecht Volumen vun Antikörper / Perlesch Mëschungen (~ 7.5 μg Antikörper / Probe) zu all Chromatin Probe bäigebaut an fir ~ 16 Stonnen ënner konstant Rotatioun bei 4 ° C incubéiert. Probe goufe weider gewascht an ëmgedréint vernetzt bei 65 ° C iwwer Nuecht virun DNA Purification mat engem PCR Purification Kit. No der DNA Puréierung goufe Proben fir qPCR ënnerworf a sech op hir passend 'Input' Kontrollen normaliséiert wéi virdru beschriwwen (S17). Normaler Maus IgG Immunoprecipitatioune mat Hëllef vun enger Maus polyklonaler Anti-IgG Antikörper goufen och duerchgefouert fir eng entspriechend Beräicherung vun der Signalvergréisserung ze kontrolléieren. Adenin Phosphoribosyltransferase (APRT) gouf als negativ Kontroll fir Kokain an ΔFosB Iwwerexpressiounsexperimenter benotzt. Kuckt Zousaz Tabelle S5 fir Promoteur Primer Sequenzen.
Dendritesch Wirbelsäits Analyse
Fir d'Roll vun G9a an der Reguléierung vun der neuronaler Morphologie in vivo ze studéieren, benotze mir Methoden déi virdru mat de folgende Ännerunge beschriwwe goufen (S1). Dräi Deeg no Injektioun vun HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (all Virussen goufen an wildtype C57Bl / 6J Mais benotzt), oder HSV-Cre-GFP (a G9a benotztfl / fl Mais), wa viral Ausdrock maximal war, goufe Mais perfektionéiert, Gehirer goufen kryoprotéiert a spéider mat 100 μm op engem Vibratome gesnitt. Sektiounen goufen dunn immunostained mat engem antibody géint GFP wéi uewen beschriwwen (kuckt Immunohistochemistry). Fir d'Auswierkunge vun der G9a Iwwerexpressioun an der Ausdauerung vun der Wirbelszuel ze beurteelen, souwéi den Effekt vun der unJunD Iwwerexpressioun, hu mir d'Zuel vun de Wirbelen op ongeféier 1 – 2 Neuritte pro Neuron gemooss, wat op d'mannst 299 μm vu sekundäre Dendriten aus GFP-expressiver NAc Medium entsprécht stänneg Neuronen (MSNs). Virausgesat datt MSNs morphologesch ënnerscheet vun aneren neuronale Populatiounen am NAc sinn, souwéi fréier Berichter, déi weisen datt HSV primär DARPP-32 infizéiert Neuronen ausdrécken an dëser Gehirregioun (S19), mir sinn zouversiichtlech datt MSNs exklusiv an dëse Studie bewäert goufen. Fir all Déier hu mir ~ 6 – 8 Neuronen an 3 – 4 Déieren pro Grupp (7 Gruppen) iwwerpréift, duerno ass en duerchschnëttleche Wäert fir all Déier fir statistesch Analyse kritt. Experimenter entworf d'Effekter vun ΔFosB Iwwersiichterheet op NAc Wirbelsätheit ze beuechten waren ähnlech wéi déi hei uewe beschriwwen, mat Ausnam datt AAV Vektoren benotzt goufen fir GFP oder ΔFosB-GFP fir verlängert Zäitperioden (8 Wochen) ze expresséieren. All HSV Biller goufe mat engem confokalem Mikroskop mat engem 100X Ueleg-Taubeldirektiv festgeholl (AAV-Biller goufe mat engem 63X Ueleg-Immersiouns-Zil ageholl). Biller goufe mat der Pinhole gesat op 1 arbiträr Eenheet an enger 1024 × 1024 Frame Gréisst. Dendritesch Längt gouf mat NIH Image J Software gemooss, a Wierbelszuelen goufen blann vum primäre Experimenter gezielt, well Rutschen goufe virum experimentellen Scannen kodéiert. D'Duerchschnëttszuel vu Pickelen pro 10 μm Dendrit gouf berechent.
Statistesch Analyse
Een- an zweesäiteg ANOVAs goufen ausgefouert fir d'Bedeitung fir bedingte Plazpréferenz an dendritescher Wirbelsanalyse mat méi wéi zwee Gruppen ze bestëmmen. Student's T Tester goufen fir aner Vergläicher benotzt qPCR, westlech blotting, dendritesch Wirbelsäitsanalyse vergläichen HSV-GFP mat HSV-Cre an G9afl / fl Mais, Microarray Analysen (kuckt hei uewen) a Chromatin Immunoprecipitation Experimenter. Geplangte Student's T-Tester goufen no zweeweeër ANOVA Analyse vun der dendritescher Wirbeldicht no ΔFosB Iwwerexpression mat Bestätegung vu wesentlechen Haaptwierkunge vun der Drogenbehandlung a Virus benotzt. All Wäerter an der Figur Legenden abegraff representéieren heeschen ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detailléiert statistesch Analysë fir Figuren. 1-3 an den Haapttext gi sinn an: Detailléiert Figure Legends Inclusive Statistics.
Noten
Ech zertifiéieren datt kee vun de Materialien déi an der Handschrëft abegraff sinn Wesentlech Roll vun der Histone Methyltransferase G9a an Kokain-induzéierter Plastizitéit goufen fréier verëffentlecht oder gi soss anzwuesch bezuelt, och um Internet.
All Aarbecht, déi d'Benotzung vun Déieren involvéiert huet, gouf am Aklang mat institutionellen an IACUC Richtlinnen op béid The University of Texas Southwestern Medical Center a Mount Sinai School of Medicine gemaach.
Referenzen an Notizen
;
