(HUMAN) Verhalen a Strukturreformen am chronesche Kokain néideg Fuerderung vun der Feedforward-Involving ΔFosB a Calcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II am Nucleus Accumbens Shell (2013)

Den Transkriptiounsfaktor ΔFosB an d'Gehir-beräichert Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II (CaMKIIα) ginn an der Nukleus accumbens (NAc) induzéiert duerch chronesch Belaaschtung fir Kokain oder aner psychostimulant Medikamenter vu Mëssbrauch, an deenen déi zwee Proteine ​​sensibiliséiert Drogenreaktiounen medizéieren An. Obwuel ΔFosB an CaMKIIα béid reguléieren AMPA Glutamat Rezeptor Ausdrock a Funktioun am NAc, ass dendritesch Wirbelsbildung op NAc mëttelgrousse Neuronen (MSNs), an Lokomotor Sensibiliséierung fir Kokain, bis elo ass keen direkten Link tëscht dëse Molekülle bis elo exploréiert ginn. Hei beweise mir datt ΔFosB phosphoryléiert gëtt vu CaMKIIα am Proteinstabiliséierende Ser27 an datt CaMKII ass noutwendeg fir déi Kokain-mediéiert Akkumulation vun ΔFosB a Rat NAC.

Ëmgekéiert, mir weisen datt ΔFosB souwuel noutwendeg a genuch ass fir Kokain-Induktioun vum CaMKIIα-Genausdrock in vivo, en Effekt selektiv fir D₁-Type MSNs an der NAc Shell Subregioun.

Ausserdeem, Induktioun vun dendritesche Wirbelen op NAc MSNs a verstäerkte Verhale Reaktiounsfäegkeet op Kokain nom NAc Iwwerausdrock vun ΔFosB sinn allebéid CaMKII ofhängeg.

Wichteg, mir demonstréiere fir d'éischte Kéier Induktioun vun ΔFosB an CaMKII am NAc vun mënschlech Kokain Sucht, suggeréiert méiglech Ziler fir zukünfteg therapeutesch Interventioun. Dës Donnéeën etabléiere datt ΔFosB an CaMKII eng Zell-Typ- a Gehirregiounspezifesch positiv feedforward Loop engagéieren als Schlësselmechanismus fir d'Belounungskreeslaf vum Gehir ze regléieren an Äntwert op chronesch Kokain.

Aféierung

D'Erhéijung vun de Beweiser ënnerstëtzt d'Meenung datt Verännerungen am Genausdrock bäidroen fir Mechanismen vun der Drogenofhängeger (Robison an Nestler, 2011). Ee wichtege Vermëttler vun dësen Ännerungen ass ΔFosB, e Fos Famill Transkriptiounsfaktor (Nestler, 2008). Chronesch Verwaltung vu quasi all Medikament vu Mëssbrauch induzéiert déi laang dauerhafter Akkumulation vun ΔFosB an nucleus accumbens (NAc), eng limbesch Regioun wesentlech fir Belounungsverhalen. Such Induktioun schéngt spezifesch fir d'Klass vum NAc mëttelgrousse Neuron (MSN) déi D1 Dopamin Rezeptoren ausdréckt. Indukéierer Iwwerexpressioun vun ΔFosB an dësen D1-Typ NAc MSNs erhéicht de Lokomotor a belount Äntwerten op Kokain a Morphin (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), mat erhéijen Kokain Selbstverwaltung (Colby et al., 2003). Ausserdeem reduzéiert d'genetesch oder viral Blockade vun ΔFosB Transkriptiounsaktivitéit déi belountend Effekter vun dësen Drogen (Zachariou et al., 2006), wat beweist datt dës nohalteg Induktioun vun ΔFosB e kriteschen Mediateur vun den dauerhaften Ännerungen induzéiert an der NAc duerch chronescher Medikamentverwaltung.

Déi ongewéinlech Stabilitéit vun ΔFosB (relativ zu allen anere Fos-Famillproteine) ass souwuel eng intrinsesch Eegeschafte vun der Molekül, wéinst der Ofkierzung vun degron Beräicher präsent a volllängt FosB (Carle et al., 2007), an e geregelte Prozess. ΔFosB ass phosphorylatéiert kënschtlech an an vivo bei Ser27, an dës Reaktioun stabiliséiert weider ΔFosB, ~ 10-Falt, an Zellkultur an NAc an vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Och wa Ser27-ΔFosB als Substrat fir Kasein-Kinase-2 gewisen gouf kënschtlech (Ulery et al., 2006), säi Mechanismus vun an vivo Phosphorylatioun bleift onbekannt.

Kalzium / calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II (CaMKII) ass eng héich ausgedréckt Serin / Threonin Kinase deenen hir α an β Isoformen dodekameresch Homo- an hetero-Holoenzymes bilden an vivo, a si wesentlech fir verschidde Formen vun Neuroplastizitéit (Lisman et al., 2002; Colbran a Braun, 2004). CaMKIIα gëtt selektiv an der NAc Shell duerch chronesch Amphetamin induzéiert (Loweth et al., 2010), an pharmakologesch Blockade vun der CaMKII Aktivitéit an der NAc Shell reduzéiert d'Verhalensempfindlechkeet op Amphetamin (Loweth et al., 2008) a Kokain (Pierce et al., 1998), wärend viral Iwwerexpressioun vu CaMKIIα an dëser NAc Subregioun d'Lomomotor Sensibiliséierung an d'Selbstverwaltung vun Amphetamin verbessert (Loweth et al., 2010). CaMKIIα kann Belounungsverhalen iwwer Modulatioun vun AMPA Glutamat Rezeptor-Ënnerunitéiten beaflossen (Pierce et al., 1998), wéi CaMKIIα Aktivitéit laang mat der AMPA Rezeptor Funktioun an synaptescher Zilgeréierung a verschiddene Formen vun Neuroplastizitéit assoziéiert gouf (Malinow a Malenka, 2002).

Dës Literatur demonstréiert verschidde Parallelen tëscht ΔFosB an CaMKII: béid sinn noutwendeg a genuch fir multiple Verhalenseffekter vun Drogen vu Mëssbrauch, béid upreguléieren dendritesch Wirbelen a verschiddene neuronalen Zellarten an vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), a béid ausüben op d'mannst e puer vun hire Verhalenseffekter duerch Modulatioun vun AMPA Rezeptoren (Kelz et al., 1999; Malinow a Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Trotz dësen Parallelen ass kee funktionnelle Link tëscht ΔFosB an CaMKII bekannt. Hei etabléiere mir géigesäiteg Reguléierung tëscht ΔFosB an CaMKII, a weisen datt déi zwee Proteine ​​eng D1-Typ MSN-spezifesch feed-Forward Loop an der NAc Shell bilden, déi duerch Kokain induzéiert gëtt an eng Reih vu Kokainreaktiounen regléiert. an vivo.

Géi op:

Materialien an Methoden

Experiment 1: iTRAQ Proteom Analyse vun NAc Shell a Kär no Kokainbehandlung (Figur 1A)

Erwuessene (8 Woche) männlech Ratten goufen 20 mg / kg Kokain oder Salzsaier IP eemol pro Dag fir siwe Deeg verwalt. 24 Stonnen no der leschter Injektioun, goufen NAc Shell a Kär microdissected (Figur 1A) a Blëtz gefruer. iTRAQ Analysë goufen wéi virdru beschriwwen (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figure 1

Shell-spezifesch Induktioun vu CaMKII am NAc duerch Kokain

Experiment 2: Quantifizéiere vu Protein Ännerungen am Rat NAc Kär a Shell No Kokainbehandlung (Fig 1B – D)

Erwuessene (8 Woche) männlech Ratten goufen 10 mg / kg Kokain oder Salzsaier IP eemol pro Dag fir siwe Deeg an de Lokomotoresch Opnamenkameren verwalt. Lokomotorreaktiounen op eng eenzeg Injektioun vu Kokain (5 mg / kg IP) goufen an déi Déieren opgeholl, déi virdru mat Kokain behandelt goufen ("chronesch" genannt) an engem Deel vun deene mat Salzlinn behandelt ("akut" genannt), an locomotoresch Äntwerten op Salz Salz alleng an déi verbleiwen chronesch salinbehandelt Déieren opgeholl (sougenannte "Salz"). Lokomotoresch Aktivitéitsassays goufen wéi beschriwwen (Hiroi et al., 1997). Kuerz, erwuesse männlech Ratten goufen an 18 ”× 24” PAS oppene Feld Opnamkëschten (San Diego Instrumenter) fir 30 min gesat fir ze habituéieren, kruten eng eenzeg IP Injektioun vu Salz an iwwerwaacht fir eng zousätzlech 30 min, a kruten eng eenzeg IP Injektioun vu 5 mg / kg Kokain a fir 30 min iwwerwaacht.

24 hr no dëser leschter Injektioun, goufe Ratten ouni Anästhesie entlooss fir Effekter vun der Narkose op neuronal Protein Niveauen a Phospho-Staaten ze vermeiden. Gehirer goufe seriell an enger 1.2 mm Matrix geschnidden (Braintree Scientific) an Zilgewebe gouf a Phosphatgebuffert Salzlinn enthale Protease (Roche) a Phosphatase (Sigma Aldrich) Inhibitoren mat engem 14 Jauge Punch fir NAc Kär an e 12 Jauge Punch vum Rescht Tissue fir NAc Shell (Kuckt Figur 1A) an direkt op dréchen Äis gefruer. Probe goufen homogeniséiert duerch liicht Sonikatioun an modifizéierten RIPA Puffer: 10 mM Tris Basis, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0.1% Natriumdodecylsulfat, 1% Triton X-100, 1% Natriumdeoxycholat, pH 7.4 Inhibitor an wéi hei uewen. Nom Zousatz vum Laemmli Puffer, goufen Proteine ​​getrennt op 4 – 15% Polyacrylamaide Gradient Gele (Critère System, BioRad), a Western blotting gouf mat dem Odyssey System (Li-Cor) no dem Hierstellerprotokoller gemaach.

Experiment 3: Quantifizéiere vu Protein Ännerungen am Rat NAc Kär a Shell nom Kokain Réckzuch (Fig 1E)

Erwuessene (8 Woche) männlech Ratten goufen 10 mg / kg Kokain oder Salzsaier IP eemol pro Dag fir siwe Deeg verwalt. 14 Deeg no der definitiver Injektioun kruten d'Déieren, déi mat Salzlinn behandelt goufen eng aner Salzinsprëtzung ("Salins" genannt), an d'Déieren, déi mat Kokain behandelt goufen, kruten eng aner Salzinsprëtzung (genannt 14 Dag Réckzuch oder "14d WD") oder eng eenzeg Injektioun Kokain ( genannt "14d WD Chal" fir Erausfuerderung). Eng Stonn no der definitiver Injektioun goufen d'Déieren ofgeschaaft a Westernblotting goufen ausgefouert wéi an Experiment 2.

Experiment 4: Quantifizéiere vu Protein Ännerungen am Rat NAc Kär a Shell No Kokain Selbstverwaltung (Fig 2A – C)

Ratten goufen trainéiert fir 0.5 mg / kg / Infusioun vu Kokain an engem Stonnen Sessiounen ënner engem fixen Verhältnis 1 Zäitplang fir néng Deeg ze trainéieren. No néng Baseline-Sessiounen goufen d'Rotter an zwou Gruppen opgedeelt, equilibréiert duerch Kokainintake op de leschten zwee Sessiounen. Eng Grupp vu Ratten war erlaabt an Selbstverwaltung Kokain (0.5 mg / kg / Infusioun) an enger Stonn Sessiounen (kuerz Zougang, ShA), während déi aner Grupp vu Ratten selwer verwalt Kokain a sechs-Stonne Sessiounen (laang Zougang, LgA ) fir zéng zousätzlech Deeg (Eskalatiounssessiounen).

Gehir Sektioune goufe fir Immunohistochemie verschafft wéi beschriwwen (Perrotti et al., 2004). Gehirer goufen 18 – 24 h parfuséiert no der leschter Belaaschtung op Medikament, wat zu enger Degradatioun vun all restlechen voll-Längt FosB Protein resultéiert, sou datt all déi reschtlech Immunreaktivitéit reflektéiert ΔFosB. Dës Degradatioun gouf duerch Westernblotting bestätegt, wat kee wesentleche staining mat engem Antikörper gewisen huet, dee géint den C-Endus vu Volllängt FosB geriicht ass, déi ΔFosB net erkennt (Donnéeën net gewisen). Nom Schnëtt an 35 μm Sektiounen, gouf d'Zuel vun ΔFosB immunopositive Zellen vun engem verblinden Observateur an zwou Sektiounen duerch d'N NAc vun all Rat geknäipt, an d'Mëttelwerte pro 40 × Feld goufen dunn duerch Regioun fir all Déier berechent. All Déier gouf als individuell Observatioun fir statistesch Analyse betracht. Interesse Regioune goufe mat Hëllef vu Paxinos a Watson identifizéiert (Paxinos a Watson, 2007).

Quantifizéierung vun CaMKIIα Immunoreaktivitéit gouf mat Hëllef vun engem Licor System gemaach wéi beschriwwen (Covington et al., 2009). Integréiert Intensitéiten vu CaMKII a GAPDH goufen mat Odyssey Software bestëmmt. D'Resultater ginn als integréiert Intensitéitwäerter pro mm presentéiert² a gi presentéiert als Mëttel ± Sem (n = 4 – 10 pro Grupp). Wäerter fir GAPDH goufen als Referenz benotzt fir CaMKII Intensitéit fir Slice Dicke a Konditiounen ze normaliséieren.

Figure 2

Induktioun vu CaMKII an der NAc Shell vu selbstverwalter Ratten a mënschleche Kokain Sucht

Experiment 5: Quantifizéiert Protein Niveauen a Kokain-ofhängeg Mënschen (Fig 2D)

Prozedur

Postmortem mënschlecht Gehirngewebe goufen aus der Québec Suizid Brain Bank kritt (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Québec, Kanada). D'Erhalen vun Tissue ass essentiell fortgaang wéi beschriwwen (Quirion et al., 1987). Kuerz, wann e extrahéiert ass, gëtt de Gehir op naass Äis an enger Styrofoam Këscht geluecht an op Quebec Suicide Brain Bank Ariichtungen gerass. Hemispheres ginn direkt vun engem sagittalem Schnëtt an der Mëtt vum Gehir getrennt, Gehirnsstamm, a Cerebellum. Bluttgefässer, Pineal Drüsen, Choroid Plexus, hallef Cerebellum, an halleft Gehirerstamm ginn typesch aus der lénkser Hemisphär dissektéiert, déi dann koronal a 1 cm décke Scheiwen geschnidde ginn ier se fréieren. Déi leschter Halschent Cerebellum gëtt sagittally an 1cm-décke Scheiwen geschnidden ier se gefriess ginn. Tissues sinn agefruer am 2-Methylbutan bei −40 ° C fir ~ 60 Sek. All gefruerene Tissue gi getrennt a Plastikstutse bei -80 ° C fir laangfristeg Späicher gehalen. Spezifesch Gehirregiounen ginn aus gefruerenen Koronaleschneiden op enger Edelstolsplack mat trockenem Äis disséiert fir d'Temperatur vun der Ëmwelt ze kontrolléieren. Western blotting war wéi am beschriwwen beschriwwen Experiment 2.

Kohort

D'Kohort war aus 37 männlech an 3 weiblech Fächer zesummegesat, déi am Alter tëscht 15 – 66 Joer reegelen. All Sujet stierft op eemol ouni e verlängerten agonale Staat oder laangwiereg medizinesch Krankheet. A jidd Fall war d'Doudesursaach vum Coroner Büro vum Quebec festgestallt ginn, an en toxikologesche Schirm gouf mat Tissueprote gemaach fir Informatiounen iwwer Medikamenter an illegalem Stoffverbrauch zum Doud vum Doud ze kréien. D'Thema Grupp huet aus 20 Eenzelen bestanen déi den SCID-I Critèrë fir Kokainofhängegkeet erfëllen. D'Kontrollgrupp huet aus 20 Sujete bestanen ouni Geschicht vu Kokainofhängegkeet a keng gréisser psychiatresch Diagnos. All Sujet stierft op eemol aus Ursaachen, déi keen direkten Afloss op d'Gehirngewebe haten. D'Gruppe goufe gepost fir mëttleren Themenalter, Kältekäschten, a pH. Fir all Fächer goufen psychologesch Autopsien duerchgefouert wéi virdru beschriwwen (Dumais et al., 2005), wat eis erlaabt Zougang zu detailléierte Fallinformatiounen iwwer psychiatrescher a medizinescher Geschicht ze hunn, wéi och aner relevant klinesch a soziodemografesch Donnéeën. Kuerz gesot, en ausgebilten Interviewer huet de Strukturéiert klinesch Interview fir DSM-IV Psychiatresch Stéierungen (SCID-I) mat engem oder méi Informanten vum verstuerwenen. E Panel vu Kliniker huet SCID-I Bewäertungen iwwerpréift, Fallberichter, Notzer vu Coroner, a medizinesch Dokumenter fir Konsens psychiatresch Diagnosen ze kréien.

Experiment 6: Chromatin Immunoprecipitatioun fir Rat NAc (Fig 3A – C)

Erwuessene (8 Woche) männlech Ratten goufen 10 mg / kg Kokain oder Salzsaier IP eemol pro Dag fir siwe Deeg verwalt. 24 hr no der leschter Injektioun, goufen NAc Shell a Kär microdissected. Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP) gouf ausgefouert bilateral NAc Stämme vu Schuel oder Kär vu siwe Ratten pro Grupp an 14 Gesamtgruppen (98 Déieren am Ganzen, 7 Kokain Poolen, 7 Salins Pool). Tissues goufe vernetzt, gewascht, a bei −80 ° C gelagert bis Chromatin Verschäerfung duerch d'Sonikatioun. Geschäerft Chromatin gouf Nuecht mat Antikörper, déi virdru mat magnetesche Perlen gebonne waren, incubéiert (Dynabeads M-280, Invitrogen). Net-Immun IgG gouf als Kontroll benotzt. Nom Réckkreesverbindung an DNA Puréierung gouf qPCR benotzt fir d'Niveaue vum CaMKIIα Promoteur DNA ze moossen. Primers goufen entwéckelt fir eng Regioun ze amplifizéieren mat enger AP-1 Konsenssequenz lokaliséiert ~ 450 bp virum Transkriptiouns Start Site (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figure 3

Zell Typ- a Regioun-spezifesch ΔFosB Induktioun vu CaMKIIα an vivo

Experiment 7: Messen vum CaMKII Transkript a Protein Ausdrock mat Zell-Typ-Spezifesch ΔFosB Iwwerausdrock (Fig 3D)

Männlech bitransgenic Mais ofgeleet vun NSE-tTA (Linn A) × TetOp-ΔfosB (Linn 11) an NSE-tTA (Linn B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (Linn 11) Mais (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) goufe verworf an op 100 µg / ml Doxycyclin opgehuewen, fir ΔFosB Ausdrock während der Entwécklung ze verdrängen. Littermates goufen am Schäffen agedeelt: d'Halschent bliwwen op Doxycycline an d'Halschent goufen op Waasser gewiesselt, an d'Déiere goufe benotzt 8 op 11 Woche méi spéit wann transkriptiounseffekter vun ΔFosB maximal sinn (Kelz et al., 1999; McClung an Nestler, 2003). Fir transkriptiounsanalysen goufen d'Mais séier entfouert, a Gehir goufen ewechgeholl an op d'Äis geluecht. Dissektioune vum NAc goufen mat engem 14-Jauge Nadelpunkt gemaach a séier op dréchen Äis gefruer bis RNA extrahéiert gouf. RNA Isolatioun, qPCR, an Datenanalyse goufen wéi virdru beschriwwen (LaPlant et al., 2009). Kuerz gesot, war d'RNA mat TriZol reagent (Invitrogen) isoléiert, weider mat dem RNAeasy Mikro Kit aus Qiagen gereinegt, a fir Qualitéit mam Agilent's Bioanalyzer gepréift. Reverse Transkriptioun gouf mat iScript (BioRad) gemaach. qPCR gouf mat engem Applied Biosystems 7900HT RT PCR System mat de folgenden Zyklusparameter duerchgefouert: 10 min bei 95 ° C; 40 Zyklen vun 95 ° C fir 1 min, 60 ° C fir 30 sec, 72 ° C fir 30 sec; graded Heizung op 95 ° C fir Dissoziatiounskurven ze generéieren fir d'Bestätegung vun eenzel PCR Produkter. Immunohistochemesch Analysë vun ΔFosB a CaMKIIα Protein Ausdrock goufen ausgefouert wéi beschriwwen Experiment 4.

Experiment 8: Effekter vun Intra-NAc D1 an D2 Dopamin Rezeptor Antagonisten op Kokain-Mediéiert Protein Ännerungen (Fig 3H)

Erwuessene (8 Wochen) männlech Ratten goufen 10 mg / kg Kokain oder Salzsaier ("Gefier" Grupp) IP eemol pro Dag fir siwe Deeg verwalt. 30 min virun all Kokaininjektioun goufe Ratten IP entweder den D1 Rezeptor Antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" Grupp) verwalt, respektiv den D2 Rezeptor Antagonist Eticloprid (0.5 mg / kg, "D2 Ant" Grupp) , oder eng Salins Kontrollinjektioun ("Kokain" Grupp). 24 h no der definitiver Injektioun, goufen Déieren entfouert a Proteine ​​quantifizéiert duerch Westernblotting als pro Experiment 2.

Experiment 9: Effekter vun AAV-Mediéiert ΔFosB Iwwerexpression op Proteinausdrock (Fig 4 A – C)

Stereotaxesch Chirurgie gouf op erwuessene männleche Ratten (8 Wochen) ausgefouert fir AAV-GFP (gréng fluoreszent Protein) oder AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). 33 Jauge Nadelen (Hamilton) goufen fir all Operatiounen agesat, wärend der 0.5 µl vu gereinigten High-Titer Virus bilateral infuséiert gouf iwwer eng 5 min Zäitperiod, gefollegt vun engem zousätzleche 5 min Post-Infusioun Reschtperiod. All Distanze gi relativ zu Bregma gemooss: 10 ° Wénkel, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 Deeg no der Chirurgie goufen d'Déieren eng eenzeg IP Injektioun vun 10 mg / kg Kokain an der Lokomotoresch Iwwerwaachungskammer kritt fir d'Behuelen Effekter vun der overFosB Iwwerexpressioun ze bewäerten. 24 Stonnen no dëser leschter Injektioun, goufe Ratten entfouert wéi per Experiment 2an, Tissu-Mikrodissektioun gouf ënner fluoreszenze mikroskopesch Leedung gemaach fir GFP-Positiv NAc Tissu ze kréien. Western blotting war dann als per gemaach Experiment 2.

Figure 4

ΔFosB ass souwuel noutwendeg wéi genuch fir Kokain-mediéiert D1 Rezeptor-ofhängeg CaMKIIα Induktioun an der NAc Shell

Experiment 10: Effekter vun AAV-Mediéierten ΔJunD Iwwerexpressioun op Kokain-ofhängeg Proteinausdrock (Fig 4 D – F)

Stereotaxesch Injektioun vun AAV-GFP oder AAV-GFP-ΔJunD gouf ausgefouert pr. Experiment 8. 14 Deeg no der Chirurgie goufen d'Déieren 10 mg / kg Kokain oder Salzsaier-IP eemol pro Dag fir siwe Deeg an de Lokomotoresch Opnamenkammer verwalt. Lokomotorreaktiounen op eng eenzeg Injektioun vu Kokain (5 mg / kg IP) oder Salz Salz gouf opgeholl. 24 h no dëser leschter Injektioun, goufe Ratten entfouert, Tissue gesammelt, a Western Blots goufen wéi an Experiment 9.

Experiment 11: Am Vitro Protein Kinase Assays (Fig 5A – D)

Rekombinant CaMKIIα an ΔFosB goufe aus Insektzellen gereinegt (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), a Proteinkinase Assays goufen duerchgefouert (Colbran, 1993), wéi virdru beschriwwen. Kuerz gesot, CaMKII war virukaubéiert op Äis mat 2.5 µM ​​(oder gezeechent Konzentratioun) vun ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​calmodulin, an 200 mM HEPES pH 7.5. Phosphorylatioun gouf duerch Zousatz vun 200 µM ​​ATP initiéiert mat oder ouni [γ-³²P] ATP an huet erlaabt fir 10 min bei Raumtemperatur weiderzekommen (Lalumi 5A & B) oder 2 min op d'Äis (Lalumi 5C & D.). Produkter goufen duerch Western blotting geléist (Lalumi 5A & B) oder per Autoradiogramm a Scintillatiounszuel (Fig. B – D).

Figure 5

ΔFosB ass e potenziellt Substrat fir CaMKIIα

Experiment 12: Identifikatioun vun Ser27 ΔFosB Phosphorylatioun (Fig 5E)

In vitro kinase Assays goufen als per ausgefouert Experiment 11, Proteine ​​goufe vun SDS-PAGE getrennt, a Bänner, déi mat ΔFosB entspriechen, goufen ausgeschnidden a mat enger Tandem Mass Spektrometrie ënnerworf. D'm / z Uerderen vun den entspriechende Ionfragmenter an all de Brieder ginn uewen op den Ionpeaks gezeechent. Net all Brochstécker Ion gi wéinst Raumbegrenzungen etikettéiert. Allgemeng ass den Text fir d'Fragment Ion Etiketten schwaarz faarweg, ausser wann se direkt d'Präsenz vun de Phosphorylatiounsplazen vun Interesse bestätegen oder bäizefügen, an dësem Fall si rout rout. Beweiser fir Réckebrochfragmentatiounsprodukter ginn an der Sequenz Liesung vum Phosphopeptid mat dem erwëschtene Site vun der Phosphorylatiounsreschter presentéiert a rout mat engem eenzelen Aminosaier Bréif Bezeechnung. Déi numeresch Beschreiwung vun de beobachten Fragmentionen sinn och op der Peptid Sequenz als b an Y Ie gezeechent. Zoomzoustand fir d'Sektioune vun der m / z Achs fir déi ënnescht Intensitéit Fragmentionen ze weisen sinn uewen op all Fragmentsmassespektre gezeechent. De Brochstéck Ionen, déi an der Panel H gewisen ginn, bestätegt d'Präsenz vun Ser27 phosphorylerte Isoform, awer a bannent enger Mëschung aus aner phosphorylerte Isoformen op Site Ser28, Ser31, Ser34, an Thr37. D'Präsenz vu pa5, pa5-P, pb5, a pb5-P-Ion bestätegt d'phosphorylatioun vum Ser27-Rescht.

Experiment 13: Quantifizéierung vun der Ser27 Phosphorylatioun (Fig 5F)

Standard Peptide goufen entwéckelt fir Phospho an Net-Phospho Formen vu Ser27 ΔFosB ze mimikéieren. No Synthese a Puréierung gouf all "schwéier" idiotypescht Peptid opgeléist an engem 50 / 50 Acetonitril / Waasserbuffer a geschéckt fir Aminosaier Analyse fir eng absolut Konzentratioun op der synthetescher Peptid-Bestandsoplossung ze bestëmmen. All "schwéier" Peptid gouf dunn direkt an den 4000 QTRAP Massespektrometer (MS) infuséiert fir déi bescht Kollisiounsenergie fir MS / MS Fragmentatioun an zwee bis véier MRM Iwwergäng ze bestëmmen. Als nächst waren déi ordentlech “schwéier” Peptide LCMS op der 4000 QTRAP ënnerworf fir Peptidtrennung ze garantéieren. D'Instrument gouf am Triple Quadrupole Modus lafen, mat Q1 op de spezifesche Virgänger m / z Wäert gesat (Q1 ass net scannen), an Q3 op de spezifesche m / z Wäert gesat deen entsprécht engem spezifesche Fragment vun deem Peptid. Am MRM Modus goufen eng Serie vun eenzelen Reaktiounen (Virgänger / Fragment Ion Iwwergäng, wou d'Kollisiounsergie ofgestëmmt ass fir d'Intensitéit vun de Fragmenter Ionen vun Interesse ze optimiséieren) nofolgend gemooss, an den Zyklus (typesch 1 – 2 sec) gouf duerchlaang déi ganz Zäit vun der HPLC Trennung. MRM Iwwergäng goufen aus de MS / MS Spektre vun de existente Peptiden bestëmmt. Zwee Iwwergäng pro Peptid, entspriechend mat héijer Intensitéit Fragmentionen, goufen dunn ausgewielt an d'Kollisiounsergie optimiséiert fir d'Signalstäerkt vu MRM Iwwergäng ze maximiséieren mat Hëllef vun Automatiséierungssoftware. Peaks resultéierend aus Standard Peptiden an ΔFosB Proben, déi dem CaMKII oder der Kontroll ausgesat waren, goufen duerno verglach fir den absolute Heefegkeet vun all Peptidform an der Reaktioun ze bestëmmen. Donnéeën Analyse op LC-MRM Donnée gëtt mat AB Multiquant 1.1 Software gemaach.

Experiment 14: Induktioun vun ΔFosB an CaMKII Overexpressing Mais (Lalumi 5G & H)

Transgenic Mais iwwerexpresséieren T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) a wild Type Littermatcher goufen an der Verontreiung vu Doxycycline opgeworf fir transgene Expression z'erméiglechen. Erwuessene Mais goufe 20 mg / kg Kokain oder Salz Salz IP eemol Dag fir 14 Deeg. 24 Stonnen no der definitiver Injektioun, goufen d'Déieren ofgeschaaft an d'immunohistochemistry an d'Quantifizéierung vum ΔFosB Ausdrock war gemaach wéi an Experiment 4.

Experiment 15: Effekter vun HSV-Mediéiert ΔFosB Iwwerexpression an CaMKII Inhibitioun op NAc Dendritic Spines (Figgen 6A – E)

Erwuesse männlech Mais (8 Wochen) goufe stereotaxesch an NAc mat HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB injizéiert (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, oder HSV-GFPAC3I-ΔFosB. An dëse Konstruktiounen ass den AC3I, e peptidbaséierten Inhibitor vun der CaMKII Aktivitéit, mam C-Uschloss vun der GFP verschmolzelt. GFPAC3I gouf vum PCR gekloonter andeems de pMM400-Vektor enthale GFPAC3I als Schabloun mat de folgenden Primer: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). De resultéierende PCR Produkt gouf an d'P1005 + an p1005 + -Δ FosB Vectors mat NheI a BspEI Site agebaut. De Konstrukt gouf duerch Sequenzen validéiert. Stereotaxesch Koordinaten waren: 10 ° Wénkel, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusioun a Gehirnssektioun war wéi per ausgefouert Experiment 4.

Wierm Analyse gouf wéi beschriwwen (Christoffel et al., 2011). Kuerz gesot, dendritesch Segmenter 50 – 150 um ewech vun der Soma goufen zoufälleg aus HSV-infizéiert Zellen gewielt, déi GFP ausdrécken. Biller goufe op engem confokale LSM 710 (Carl Zeiss) fir morphologesch Analyse mat NeuronStudio mam Rayburst Algorithmus opkaf. NeuronStudio klassifizéiert Schwäin als dënn, Champignon oder Stubby baséiert op de folgende Wäerter: (1) Aspekt Verhältnis, (2) Kapp bis Hals Verhältnis, an (3) Kapp Duerchmiesser. Schwäizer mat engem Hals kënnen als entweder dënn oder Champignon klasséiert ginn, an déi ouni e bedeitende Hals ginn als déck klasséiert. Wirbelen mat engem Hals ginn als dënn oder Champignon baséiert op de Kappenduerchmiesser.

Figure 6

Blockade vun der CaMKII Aktivitéit verhënnert d'morphologesch a Verhalenseffekter vun ΔFosB am NAc

Experiment 16: Effekter vun HSV-Mediéierten ΔFosB Iwwerexpression an CaMKII Inhibitioun op Kokainreaktiounen (Fig 6F)

Erwuesse männlech Méis goufe mat Virussen injizéiert wéi per Experiment 15, a Lokomotor Äntwerte op eng eenzeg 5 mg / kg Injektioun vu Kokain gouf gemooss wéi Experiment 9. Lokomotor Donnéeën ginn ausgedréckt als Gesamtstrahlbrems iwwer 30 min no Kokaininjektioun.

zousätzlech Informatiounen

Déiereschutz

Männlech Sprague Dawley Ratten (250 – 275 g; Charles River Laboratories) goufe gepaart. Aacht Woche-aler C57BL / 6J männlech Mais (The Jackson Laboratory) goufen gruppéiert mat maximal fënnef Déieren pro Käfeg. All Déieren goufen op d'Dierfacilitéit fir ≥1 Woch virum experimentellen Manipulatiounen gewunnt an an klimatekontrolléierte Raim (23 – 25 ° C) op engem 12 h Liicht / donkel Zyklus (Luuchten op 7: 00 AM) mat Zougang zum Iessen gewunnt a Waasser ad libitumAn. Experimenter goufen am Aklang mat de Richtlinne vun der Society for Neuroscience an dem institutionellen Déiereschutz- a Benotzungscomité (IACUC) um Mount Sinai gehaal.

Drogen

Medikamenter goufen IP verwalt an opgeléist a steril Salzsaier, dorënner Kokain (5 – 20 mg / kg pro 10 µl fir Mais, pro 1 ml fir Ratten, NIDA) a SCH 23390 oder eticloprid Hydrochlorid (0.5 mg / kg pro 1 ml, Tocris) An. Fir stereotaxesch Chirurgie goufe Méis mat engem „Cocktail“ vu Ketamin (100 mg / kg) an Xylazin (10 mg / kg) (Henry Schein) an sterilem Salz gesënnegt.

Antikörper

CaMKIIα (Gesamt): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII Phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (am Ganzen): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB Phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (Gesamt): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 Phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 Phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistesch Analysen

All statistesch Analysë goufen mat dem Prism 6 Software Package (GraphPad) gemaach. Student's T-Tester goufen fir all Pair-weise Vergläicher benotzt (an de Resultater ugewisen wou den T-Wäert uginn ass), an een-Manéier ANOVAs goufen fir all Multiple Vergläicher benotzt (an de Resultater Sektioun ugewisen wou F Wäert uginn ass).

Géi op:

Resultater

Chronesch Kokain induzéiert CaMKII an der NAc Shell

Vill Studien hunn uginn datt MSNs an der NAc Shell a Kär verschidde biochemesch a physiologesch Äntwerte fir chronesch Belaaschtung fir Drogen vu Mëssbrauch hunn (Kourrich an Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) an datt déi zwou Subregiounen differentiell Drogen-Sich Verhalen reguléieren (Ito et al., 2004). Fir d'Differenziell Auswierkunge vu Kokain op de Proteinbestanddeeler vun der NAc Schuel ze bestëmmen vs. Kär, hu mir Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) an Tandem Mass Spektroskopie (MS / MS) benotzt. Erwuesse männlech Ratten goufen IP mat Kokain (20 mg / kg) oder mat Salz Salz fir 7 Deeg injizéiert; 24 Stonnen no der leschter Injektioun, goufen NAc Shell a Kär microdissected (Figur 1A) a Blëtz gefruer. Proteinen an dëse Echantillon goufen dann mat iTRAQ quantifizéiert. All véier CaMKII Isoformen weisen grouss Erhéigunge vun Ausdrock no Kokainbehandlung déi spezifesch fir NAc Shell am Verglach zum Kär waren. Verschidde Proteinphosphatasen, dorënner PP1 katalytesch a regulatoresch Ënnerunitéiten an PP2A, déi virdru mat verschiddene CaMKII Substrater an anere Systemer verbonne sinn (Colbran, 2004), huet e ähnlecht Muster gefollegt. Dës Resultater hunn novollzéibar, onbezuelbar Beweiser datt de CaMKII Signaléierungswee prominent duerch Kokain am NAc op eng Shell-spezifesch Manéier geregelt gëtt.

Fir dës Sich méi quantitativ ze validéieren, hu mir Ratten wéi uewen mat Kokain behandelt (a variabelen Dosen) oder Salzléisung a gemoossene Lokomotorreaktiounen op eng Kokain (5 mg / kg) oder eng Salz Salzdosis. Wiederholte Belaaschtung fir 10 mg / kg Kokain huet zum typesche Muster vun der Lokomotorsensibiliséierung gefouert (Figur 1B). Weider Studien mat dësem Doséierungsregime hunn duerch d'Benotzung vu Westernblotting opgedeckt, datt widderholl Kokain CaMKIIα selektiv an der NAc Shell 24 h nach d'Final Injektioun vu Kokain induzéiert (Fig 1C an D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Zousätzlech war Phosphorylatioun vum kanonesche CaMKII Substrat Ser831 vum GluA1 Ënnerdeelung vum AMPA Rezeptor wesentlech an der NAc Shell erop an net Kär (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), während CaMKIIα Thr286 Autophosphorylatioun eng staark awer net bedeitend Trend zu Induktioun nëmmen an der Shell (Fig 1D). Puer aner Glutamat Rezeptoren goufen net beaflosst. Am Géigesaz zu dëse Moossname vum CaMKII hunn déiselwecht Tissueproben ugewisen Induktioun vun ΔFosB a béid Shell (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) an de Kär (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) vum NAc (Fig 1C an D), konsequent mat fréiere Resultater (Perrotti et al., 2008).

Zënter e puer fréier Studien iwwer Kokainreguléierung vun AMPA Rezeptoren analyséiert Déieren no ~ 14 Deeg Réckzuch vu chronesche Kokain (kuck Diskussioun), widderhuelen mir dës biochemesch Analysen zu dësem Zäitpunkt. Mir hunn erausfonnt datt 14 Deeg no der definitiver Injektioun vu Kokain, ΔFosB bleift an NAc erhéicht (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), wärend weder CaMKII nach Phosphorylatioun vu GluA1 Ser831 bleift erop (Fig 1E). Wéi och ëmmer, 1 hr no enger eenzeger 10 mg / kg Challenge Dosis Kokain, Niveauen vun der Gesamt CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) a vu GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) Phosphorylatioun gëtt souwuel zu engem Grad ähnlech wéi deen nom initial chronescher Kokainekspositioun fonnt (Fig 1E). Dës Donnéeë weisen datt NAc Shell Neuronen priméiert sinn fir CaMKII Induktioun während verlängert Perioden vun Abstinenz, vläicht iwwer direkt Priming vum CaMKII Gen Promoteur (kuck Diskussioun). Ausserdeem, de Fakt datt ΔFosB Induktioun méi persistent ass wéi CaMKII Induktioun suggeréiert d'Existenz vu zousätzlech Mechanismen, egal ob chromatin-baséiert oder soss, déi eng "Brems" ausüben op der CaMKII Reguléierung, sou wéi et an der Diskussioun iwwerdeckt gëtt.

Fir dës Observatiounen nach weider ze verstäerken, hu mir Modeller vu Kokain Selbstverwaltung exploréiert, déi volitional Drogeninnons involvéiert hunn. Erwuesse männlech Ratten kruten entweder kuerz oder laang Zougang zu Kokain; wéi erwaart (Ahmed a Koob, 1998), nëmmen laang Zougangsbedéngunge féieren zu eskaléierend Selbstverwaltung vum Medikament (Figur 2A). ΔFosB gouf méi grouss duerch laang induzéiert vs. kuerzen Zougang zu Kokain a béid NAc Shell (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) a Kär (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Am Géigesaz, gouf CaMKIIα an der NAc Shell induzéiert nëmme mat laangen Zougang zu Kokain (Fig 2B a C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Et ass interessant fir déi duerchschnëttlech deeglech Kokainzufuhr iwwer kuerz Zougang Déieren (~ 12 mg / kg IV), laang Zougang Déieren (~ 70 mg / kg IV), an Experimenter-verwalteten Déieren (10 mg / kg) ze vergläichen, an froen firwat déi lescht e robust Induktioun vun ΔFosB an CaMKII ergräift wär kuerz Zougang net. Dës Diskrepanz ass méiglecherweis wéinst Differenzen an de peak Kokainniveauen (Experimenter-verwalt Kokain gëtt als eenzeg Bolus IP uginn, wärend selbstverwaltte Kokain iwwer verschidde IV Dosen geliwwert gëtt), oder duerch Differenzen an der Längt vun der Medikamentbelaaschtung (7 Deeg fir Experimenter Administratioun, 19 Deeg fir Selbstverwaltung).

Trotz der grousser Literatur iwwer ΔFosB an CaMKII a Kokainaktioun, ginn et keng Studien iwwer dës Proteine ​​bei mënschleche Kokain Benotzer. Hei presentéiere mir déi éischt Beweiser datt d'Niveaue vu béide ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) an CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) an NAc vu Kokain-ofhängeg Mënschen erhéicht ginnFig 2D, Table 1). Dës Donnéeën weisen datt eis Untersuchung vun ΔFosB a CaMKII Induktioun duerch Kokain an Nager NAc klinesch relevant ass fir mënschlech Kokain Sucht.

Table 1

Charakteriséierung vu Proben aus mënschleche Kokain Sucht an passenden Kontrollgrupp

ΔFosB Reegelt CaMKII Transkriptioun selektiv an D1-Type MSNs vun NAc Shell

D'Erfindung datt souwuel CaMKII an ΔFosB duerch Kokain am Gnager NAc upreguléiert goufen, hu mir festzestellen ob ΔFosB Transkriptioun vum CaMKII Gen reguléiere kann. Mir hu virdru CaMKIIα als méiglech Zil fir ΔFosB an enger onbestëmmter Mikroarray Analyse vum NAc gemellt (McClung an Nestler, 2003), awer dës Sich gouf net weider an där Etude validéiert. Mir hunn als éischt d'Quantitativ ChIP (qChIP-ChIP gefollegt vum quantitativen PCR) benotzt fir ze bestëmmen ob ΔFosB sech mam CaMKIIα-Genpromotor am NAc vun erwuessene männlechen Ratten bindet, a fonnt opfälleg datt dës Bindung bedeitend eropgeet, duerch chronesch Kokainadministratioun, an der Schuel ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), awer net de Kär, d'Subregioun (Figur 3A). Fir d'Mechanisme méi ze verstoen am Zesummenhang mat dësem Subregiounspezifeschen Ënnerscheed an ΔFosB Bindung zum CaMKIIα Promoteur, hu mir qChIP benotzt fir den Zoustand vun de Histon Modfikatiounen an dëser genomescher Regioun ze charakteriséieren. Virdrun Studien bewisen Kokain-Induktioun vun H3 Acetylatioun am CaMKIIα Promoteur am Gesamt Maus NAc (Wang et al., 2010). Am Géigesaz, hu mir fonnt datt Kokain den H3 Acetylatioun am CaMKIIα Promoteur selektiv am NAc-Kär reduzéiert (Figur 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), ouni Ännerung anscheinend an der Shell, konsequent mat subregion-spezifesch Chromatin-Verännerungen doriwwer eraus ΔFosB Bindung. qChIP fir dat repressivt Mark, dimethyléiert H3 Lysin 9 (H3K9me2), huet Trends fir Ofsenkungen a béid Shell a Kär Subregiounen opgedeckt (Figur 3C).

Fir erauszefannen ob ΔFosB d'CMMIIII Transkriptioun regléiert an vivo, hu mir zwou bitransgen Mausleitungen benotzt déi induzéierbar iwwerexpresséieren ΔFosB speziell an D1 vs. D2-Typ MSNs op eng Manéier déi vu Doxycyclin Administratioun am Drénkwaasser kontrolléiert gëtt (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Erwuesse männlech Mais iwwerexpresséieren ΔFosB eleng an D1-Typ MSNs haten wesentlech eropgaang Niveauen vu CaMKIIα mRNA am NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), en Effekt deen net bei Musse gesi gouf ΔFosB haaptsächlech an D2-Typ MSN (Fig 3D). D'Erhéijung vum CaMKIIα mRNA, induzéiert duerch ΔFosB Ausdrock an D1-Typ MSNs, gouf vun enger concomitéierender Erhéijung vum CaMKIIα Protein a béide NAc Schuel begleet (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) a Kär (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Figgen 3E a F). Dës Donnéeën weisen datt ΔFosB fähig ass CaMKIIα-Genausdrock an D1-Typ MSNs a béide Subregiounen ze féieren, obwuel Figure 3B proposéiert datt Kokain-mediéiert Chromatin Ännerungen am CaMKIIα Promoteur (z. B. reduzéiert Acetylatioun) verhënnert datt ΔFosB CaMKII an der Kärregioun nom Kokain upreguléiert.

Well eis transgen Mausdaten uginn datt ΔFosB Induktioun vu CaMKII Genausdrock spezifesch fir D1-Typ MSNs an NAc ass, hu mir duerno gesicht fir festzestellen ob Kokain-ofhängeg Upregulatioun vu CaMKII Aktivatioun vum D1 Dopamin Rezeptor erfuerdert. Erwuesse männlech Ratten goufen chronesch Kokain oder Salzléis wéi virdrun, awer 30 Minutte virun all Injektioun, Ratten an der Kokaingruppe kruten IP Injektioun vu Salz, den D1 Antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg), oder den D2 Rezeptor Antagonist Eticloprid (0.5 mg / kg). Déieren goufen 24 hr no der leschter Injektioun vu Kokain analyséiert. Western Blotting huet verroden datt den D1, awer net den D2, Antagonist d'kokain vermittelten Erhéijung vun ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) blockéiert huet, wéi virdru bericht (Nye et al., 1995), sou wéi och an CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G an H). Dës Donnéeën ënnerstëtzen d'Hypothese datt Kokain eng ΔFosB-mediéiert Erhéijung vun der CaMKII Genexpressioun engagéiert an D1-Typ MSNs vun der NAc Shell. Et wär wichteg an zukünfteg Studien direkt dës Zell-Typ spezifesch Effekt vu Kokain op CaMKII Ausdrock bannent dëser Gehirregioun ze weisen.

ΔFosB ass souwuel noutwendeg a genuch fir Kokain Induktioun vu CaMKII an der NAc Shell

Fir d'Benotzung vu bitransgenen Mais z'ergänzen, hu mir d'nächst Kéier d'Roll vun ΔFosB bei der Mediatioun vun Kokain-Induktioun vu CaMKIIα studéiert mat der Hëllef vu viral-mediéierten Genentransfer bei Ratten. Mir hu bilateral Injektiounsoziéiert viral (AAV) Partikelen an NAc Shell vun erwuessene männlechen Ratten (wou Shell selektiv gezielt ka ginn) fir ΔFosB plus GFP oder GFP eleng ze iwwerdribblen. D'Déieren kruten dunn eng eenzeg IP Injektioun vu 10 mg / kg Kokain. D'Déieren iwwerexpresséieren ΔFosB / GFP weisen eng erhéicht Lokomotorreaktioun par rapport zu Déieren, déi GFP eleng iwwerexpriméieren (Figur 4A). 24 h no der eenzeger Kokaininjektioun gouf GFP-positiven NAc Tissu vun dësen Déieren duerch Dissektion ënner enger fluoreszéierender Liichtquell ausgeschnidden. Western blotting vun dësem Tissu (Fig 4B a C) weist e staarkt ΔFosB Iwwerexpression souwéi eng bedeitend Erhéijung vun der Gesamt CaMKIIα Protein am Verglach mat GFP Déieren (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), ähnlech wéi d'Induktioun mat chronescher Kokainverwaltung gesi ginn. Ausserdeem gouf CaMKIIα autophosphorylatioun bei Thr286 (indikativ fir Enzymaktivéierung) erhéicht duerch ΔFosB Iwwerexpression (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), sou wéi Phosphorylatioun vum CaMKII Substrat, Ser831 vun GluA1; p = XUMX 0.0540; df = 2.012), nach eng Kéier mimikéieren d'Aktioune vu chronescher Kokain (Fig 1C an D). Taken zesummen, dës Donnéeën bidden weider Beweiser datt ΔFosB Ausdrock an der NAc Shell genuch ass fir locomotor Sensibiliséierung fir Kokain a fir CaMKII Induktioun an Aktivéierung an dëser Ënnerregioun.

Mir hunn eng ähnlech Approche benotzt fir ze bestëmmen ob osFosB och noutwendeg ass fir Kokain-mediéiert Induktioun vu CaMKIIα an der NAc Shell. AAV gouf benotzt fir en ofgeschniddene JunD Protein, bezeechent ΔJunD, wat en negativen Reguléierer vun regulFosB Transkriptiouns Aktivéierung (Winstanley et al., 2007) plus GFP oder GFP eleng. Zwee Woche méi spéit, wann transgene Ausdrock maximal ass, goufen Déieren Kokain (10 mg / kg) oder Salz Salz fir 7 Deeg kritt, a getest fir locomotoresch Äntwerten op eng Kokainentfuerderung (5 mg / kg) 24 Stonnen no der leschter chronescher Injektioun (Fig 4D). ΔJunD Iwwerexpressioun huet d'lokomotoresch Sensibiliséierung vu Kokain verhënnert an huet och CaMKIIα Induktioun an Aktivéierung an der NAc Shell verhënnert (Fig 4E a F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), wat beweist datt ΔFosB transkriptionell Aktivitéit noutwendeg ass fir Kokain-mediéiert Induktioun vu CaMKIIα an dëser Subregioun. Interessanterweis hu mir fonnt datt ΔJunD Niveauen vun ΔFosB reduzéiert huet ënner béid Salz- a Kokain-behandelte Konditioune (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), déi nei Méiglechkeet erhéijen datt ΔFosB ofhängeg vun der AP-1 Aktivitéit fir seng eegen Ausdrockniveauen.

CaMKII Phosphorylate ΔFosB an Ser27

benotzt kënschtlech Protein Kinase Assays, hu mir festgestallt datt gereinegt ΔFosB e robustt Substrat fir CaMKIIα ass. Inkubatioun vu Sengem₆-ΔFosB mat CaMKIIα an ATP verursaacht eng Upward Verréckelung vun der elektrophoretescher Mobilitéit vun ΔFosB (Figur 5A); déi verschidde resultéierend Bands hunn op verschidde Sitee vun der Phosphorylatioun proposéiert. Ähnlech kënschtlech kinase assays mat Hëllef vun [γ-³²P] ATP huet Abezéiung vu radiomärchte Phosphat an déi verréckelt ΔFosB Bands gewisen (Figur 5B), beweist eng direkt Phosphorylatioun vum Protein. Mir generéieren e Phosphospezifescht Antikörper zu der virdru charakteriséierter Ser27 vun ΔFosB (Ulery et al., 2006). Wärend dësen Antikörper net e Signal géint Gehirenextrakter produzéiert déi Ser27-phosphoryléiert ΔFosB (Donnéeën net gewisen) enthalen, konnte mer Ser27 Phosphorylatioun am kënschtlech kinase assay mat CaMKII benotzt (Figur 5B). Kinetesch Analysen vun der CaMKII Phosphorylatioun vun ΔFosB weisen datt et e potenziellt Substrat fir d'Kinase ass (Figur 5C), mat engem scheinbar K_M vun 5.7 ± 2.0µM a K_CAT vun 2.3 ± 0.3min^-1An. Dës Resultater si vergläichbar mat ville gutt charakteriséiert an vivo Substrate vum CaMKII (Colbran a Braun, 2004). Zousätzlech hu mir festgestallt datt CaMKII Phosphorylaten ΔFosB mat enger Stoichiometrie vun 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), wat beweist datt et op d'mannst dräi Site vu CaMKII Phosphorylatioun bannent der His sinn₆-ΔFosB Protein, am Accord mat Figur 5A.

Fir eenzel Websäiten vun der Phosphorylatioun z'ënnersichen, benotze mir MS Analyse vun Proben aus eiser kënschtlech kinase assays. Fig 5E weist ΔFosB Phosphorylatioun op der virdru charakteriséierter Ser27 an op e puer zousätzlech Site (Donnéeën net gewisen). Virausgesat déi virdru funktionell Charakteriséierung vu Ser27, hu mir eis op dësem Site konzentréiert andeems mir etikettéiert synthetesch Peptiden generéiere wéi d'Phospho- an d'Nonphospho-Staate vu Ser27 simuléieren, benotze mir dann bekannt Quantitéite vun dësen Peptiden als Normen an MRM Analysen vun ΔFosB virun an no kënschtlech phosphorylation vun CaMKII. Spéider Quantitéit (Fig 5F) bestätegt datt Ser27 e potente Substrat fir CaMKII ass. Dës Resultater weisen datt, ënner multiple phosforylerte Reschter bannent ΔFosB, Ser27 e besonnescht effektivt Substrat fir CaMKII.

CaMKII Mediéiert Kokainakkumulatioun vun ΔFosB an der NAc Shell

Wëll CaMKII kann oryFosB phosphoréieren kënschtlech op engem Site dee seng Stabilitéit dramatesch verbessert kënschtlech an an vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), hu mir festgestallt ob CaMKII Aktivitéit ΔFosB Niveauen am NAc kontrolléiert an vivoAn. Fir dës Fro ze beäntweren, benotze mir als éischt eng Mauslinn déi e Kalziumonofhängegen Mutant vu CaMKIIα (T286D) a ville Gehirregiounen abegraff huet NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Mir hunn Altersmatch Erwuessene männlechen Mutant a wildtype Littermatcher mat 20 mg / kg Kokain oder Salz Salz eemol am Dag fir 14 Deeg injizéiert, duerno analyséieren d'Déieren een Dag no der definitiver Injektioun. Mir hu fonnt, datt d'Basisniveauen vun ΔFosB an de mutanten Déieren an der NAc Shell erhéicht goufen (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), awer net Kär (Fig 5G an H). Iwwerraschend ass Kokain-ofhängeg Induktioun vun ΔFosB an de mutanten Déieren a béid Shell a Kär blockéiert, wat suggeréiert datt, obwuel CaMKII direkt ΔFosB Stabilitéit an der NAc Shell reguléiere kann, et kann och upstream vun ΔFosB a Kokain-aktivéiert Weeër a béide NAc-Subregiounen leien. An.

CaMKII Aktivitéit ass erfuerderlech fir ΔFosB-Mediéiert Strukturell a Verhalensplastizitéit

Kokain Induktioun vun dendritesche Wirbelen op NAc MSNs ass eng vun de beschten etabléierten Drogen-induzéierter Upassung an dëser Gehirregioun, an sou Wirbelsäduktioun gouf mat sensibiliséierter Verhalensreaktiounen op d'Drogen korreléiert.Robinson a Kolb, 2004; Russo et al., 2010) a gemellt selektiv fir D1-Typ MSNs (Lee et al., 2006). Mir hunn viru kuerzem bewisen datt Kokain-Induktioun vun dendritesche Wirbelsäiten an der NAc ofhängeg ass vun ΔFosB a sengem downstream transkriptiouns Programm (Maze et al., 2010). Och wann et eng extensiv Literatur gëtt iwwer d'Bedeelegung vu CaMKII an der dendritescher Wirbelsail Morphologie an Induktioun an anere Gehirregiounen an experimentellen Systemer (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), huet seng Roll an der NAc MSN Wirbelsetzung net studéiert. Dofir hu mir festzestellen ob CaMKII Aktivitéit fir ΔFosB-mediéiert Induktioun vu MSN dendritesche Wirbelen noutwendeg ass andeems HSV-mediéiert Iwwerausdrock vun der CaMKII Inhibitor Peptid AC3I gefusst mat GFP benotzt gouf, e Konzept dat virdru gewisen huet CaMKII Aktivitéit ze inhibitéieren an vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Viral Iwwerexpression vun ΔFosB an NAc Schuel vun erwuessene Mais induzéiert eng bedeitend Erhéijung vun der MSN dendritescher Wirbelsdicht (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A a B) wéi virdru bericht (Maze et al., 2010), an dës Erhéijung gouf haaptsächlech duerch dënn (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) an déck (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) Wirbelsaarten (allebéid geduecht als onwuesse Sträiche) (Fig 6C – E). Keen Effekt gouf op méi reife, Pilzefërmege Pickelen gesinn. Wéi GFP-AC3I awer coexpresséiert gouf, war ΔFosB Induktioun vu Pickelen komplett ofgebrach (Figgen 6A – E), wat beweist datt CaMKII Aktivitéit fir ΔFosB Induktioun vun dendritesche Wirbels an der NAc Schuel erfuerderlech ass.

Mir hunn duerno d'selwescht virale Tools benotzt fir ze bestëmmen ob CaMKII Aktivitéit fir ΔFosB Effekter op Verhalensempfindlechkeet op Kokain néideg ass. 72 hr no viraler Injektioun an NAc Shell, goufen d'Déieren eng eenzeg Injektioun vun 5 mg / kg Kokain kritt an hir Lokomotor Aktivitéit gouf opgeholl. Wéi virdru mat méi verlängerten AAV Iwwerausdrock vun ΔFosB gewisen (Figur 4A), HSV-mediéiert Iwwerausdrock vun ΔFosB erhéicht Lokomotorempfindlechkeet op Kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Wéi mat Induktioun vun dendritesche Wirbels, huet d'Inhibitioun vun der CaMKII Aktivitéit duerch Coexpressioun vu GFP-AC3I komplett d'ΔFosB-mediéiert Erhéijung vun der Kokainempfindlechkeet blockéiert, wat beweist datt CaMKII Aktivitéit fir ΔFosB-induzéiert Verännerungen an der Kokain Verhalenseffekter verlaangt gëtt.

Géi op:

Diskussioun

Déi aktuell Etude definéiert en neie Feed-Forward Mechanismus wou Kokain ΔFosB am NAc induzéiert, wat Transkriptioun vum CaMKIIα-Gen selektiv an der NAc Shell upreguléiert. Duerno phosphorylates CaMKIIα a stabiliséiert osFosB wat zu enger méi grousser accumFosB Akkumulatioun féiert an weider CaMKIIα Induktioun (weider)Fig 6G). D'co-eskaléierend Niveauen vun den zwee Proteinen wärend der chronescher Belaaschtung fir Kokain droen dann op wesentlech Weeër zu sensibiliséierte Verhalensreaktiounen op d'Droge. Dëst ass eng besonnesch attraktiv Hypothese well souwuel ΔFosB wéi och CaMKII goufen all virdru bewisen, datt se fir verstäerkte Verhalensreaktiounen op Kokain néideg sinn. (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), a mir replizéieren dës Sich fir ΔFosB an der NAc Shell speziell mat enger viraler Approche (Figuren 4 an And66).

Och wa transgen ΔFosB Iwwerexpressioun an D1-Typ MSNs ka CaMKII Induktioun a béid NAc Shell a Kär vu Kokain-naiv Déieren féieren, am Kontext vu Kokain, Akkumulation vun endogene ΔFosB, déi a béide Subregioune geschitt, dréckt Induktioun vu CaMKII speziell an NAc Shell An. Dësen Ënnerscheed konnt op déi méi héich Niveaue vun ΔFosB an eisem bitransgenesche Modell induzéieren, awer et kann och d'Fäegkeet vu Kokain reflektéieren de CaMKIIα Promoteur an der Shell anescht ze änneren vs. core MSNs fir entweder ΔFosB Bindung an der fréierer ze promoten oder et an der letzter Subregioun auszeschléissen. Tatsächlech ënnerstëtzen eis ChIP Daten, déi eng Kokain-mediéiert Descetylatioun vun Histonen am CaMKIIα-Gen-Promoteur am NAc-Kär nëmmen ënnerstëtzen, déi méiglech Engagement vun engem Chromatin-Mechanismus. Am Aklang mat dëser Hypothese, war ΔFosB Iwwerexpressioun an D1-Typ MSNs fäeg CaMKIIα Induktioun am NAc Kär an der Verontreiung vu Kokain ze féieren (Fig 3F), suggeréiert datt et aktiv Ännerunge vum CaMKIIα Promoteur ginn, déi dës Induktioun wärend chronescher Kokainekspositioun verhënneren. Reguléierung vun der Chromatin Landschaft am CaMKII Promoteur kann och erklären firwat CaMKII duerch eng Erausfuerderungsdosis Kokain an der NAc Shell vun chronesche Kokain-entzuchten Ratten induzéiert gëtt (Fig 1E) awer net vun Drogen naiv Déieren (Fig 1D). Dëst kann en epigeneteschen "Gen priming" Effekt vun ΔFosB representéieren (Robison an Nestler, 2011), a kéint also ee molekulare Mechanismus vun der Inkubatioun vu Kokainverlaangen sinn (Pickens et al., 2011). Wéi och ëmmer, fir dës Chromatin-Verännerung causal mat der Inkubatioun vum Verlaangen ze sinn, misst et mat der Zäit eropgoen. Et wäert interessant sinn ze bestëmmen ob dëst de Fall ass, an ze studéieren ob aner Genen ΔFosB-ofhängeg, subregiounspezifesch Reguléierung vu Kokain weisen. Et ass och wichteg ze beuechten datt d'Futter-Forward Loop, déi mir beschreiwen, net zu enger onendlecher Akkumulation vu CaMKII oder ΔFosB féiert (Fig 1E); D'Molekuläre "Brems" z'aktivéieren ass verantwortlech fir dëst ass en wichtegt Zil fir zukünfteg Studien.

Déi bekannt Funktiounen vun ΔFosB an CaMKII a verschiddenen experimentellen Systemer a Gehirregiounen konvergéiere op ville Niveauen (Fig 6F). Béid Molekülle sinn intim verbonnen mam dendritesche Wirbelsäilwachstum: CaMKII interagéiert mat dem Aktin Zytoskeletton (Okamoto et al., 2009), regléiert d'Gréisst vun der Wirbelsäit (Matsuzaki et al., 2004), an ass souwuel noutwendeg a genuch fir Plastizitéit-induzéiert Erhéigunge vun der Filopodia a Synaps Zuel an hippocampal organotypesche Slice Kulturen (Jourdain et al., 2003), while ΔFosB ass souwuel noutwendeg wéi genuch fir d'Kokain-induzéiert dendritesch Wirbelsailung an NAc MSNs (Maze et al., 2010). Zousätzlech si béid Molekülle mat der Reguléierung vun AMPA Glutamat Rezeptoren verbonne ginn. CaMKII reguléiert net déi total Niveaue vun AMPA Rezeptor-Ënnerunitéiten, awer dréckt d'Insertioun vun AMPA Rezeptoren an Synapses an erhéicht d'AMPA Kanalleitung duerch phosphoryléiere GluA1 bei Ser831 an hippocampal pyramidale Neuronen an der Kultur an an vivo (gekuckt an (Malinow a Malenka, 2002; Colbran a Braun, 2004)). Esou verstäerkte Verkéier vu GluA1 zur Synapse ass och a chronesch Kokainaktioun agebonne ginn (Boudreau a Wolf, 2005). Ausserdeem, Verhalensreaktiounen op AMPA Rezeptor Aktivatioun am NAc ginn duerch CaMKIIα Iwwerexpressioun op enger D1 Dopamin Rezeptor ofhängeg Manéier verbessert (Singer et al., 2010). Langfristeg D1-spezifesch Iwwerausdrock vun ΔFosB gouf gewisen fir GluA2 Transkriptioun am NAc ze induzéieren (Kelz et al., 1999), déi AMPA Äntwerte verdämpt mediéiert iwwer GluA1, wärend mir weisen hei datt méi kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpression - souwéi méi kuerzfristeg Kokainbelaaschtung - keen Effekt op dësem Ënnerunit hunn (Figur 1). Trotzdem hu mir viru kuerzem festgestallt datt kuerzfristeg ΔFosB Iwwerexpressioun trotzdem AMPA Äntwerte an D1-Typ MSNs am NAc reduzéiertGrueter et al., 2013). Dës Donnéeë proposéiere fir temporär ënnerschiddlech Mechanismen déi eng zäitlech ofhängeg Serie vun Neuroadaptatiounen u Kokain entstoe kënnen, déi ënnerschiddlech Aspekter vun der Suchtprogresioun ënnersträichen, déi nach net gutt verstan ass. Um Verhalensniveau si béid CaMKII an ΔFosB fir locomotor Sensibiliséierung fir Kokain néideg (kuckt hei uewen), a béid sinn erfuerderlech fir nohalteg Kokain Selbstverwaltung bei Nager (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), suggeréiert datt déi zwee Proteine ​​wichteg sinn fir béid kuerz- a laangfristeg Verhalensanpassungen un der Medikamentbelaaschtung, och wann et deelweis ënnerscheet ënnersträicht Mechanismen ass. Viraussiichtlech reguléieren ΔFosB an CaMKII sou komplexe Verhalensadaptatiounen duerch Verännerungen an der NAc synaptescher Funktioun, obwuel vill weider Aarbecht gebraucht gëtt fir direkt synaptesch Phenomener mat Verhalensverännerung ze verbannen.

De CaMKII Holoenzyme interagéiert gläichzäiteg mat verschiddene Synapse-assoziéierten Proteinen (Robison et al., 2005) déi geduecht sinn hir Zielung op d'postsynaptesch Dicht (PSD) ze regléieren, e Phänomen dat virgeschloen ass wichteg fir synaptesch Plastizitéit. Besonnesch d'Interaktioun vum CaMKII mat der GluN2B Ënnerdeelung vum NMDA-Typ Glutamat Rezeptor gouf viru kuerzem gewisen datt souwuel synaptesch Plastizitéit a Léiere regelen (Halt et al., 2012). Wärend den AC3I Peptid miméiert den autoinhibitoreschen Domain vu CaMKII, an doduerch enzym katalytesch Aktivitéit hemmt, blockéiert och Multiple Protein-Protein Interaktiounen (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Also, déi behuelen a morphologesch Effekter vun HSV-GFP-AC3I, déi hei gemellt goufen, kéinten duerch reduzéiert Phosphorylatioun vu CaMKII Zilproteine ​​geschéien, Ännerungen am CaMKII Zilgeriicht oder eng Verännerung vun der CaMKII proposéierter struktureller Roll bei Synapses (Lisman et al., 2002).

D'Restriktioun vun der proposéierter osFosB-CaMKII Schleif zu der NAc Shell ass vu spezieller Notiz, well déi rezent Aarbecht huet e puer physiologesch Differenzen tëscht der NAc Shell a Kär gewisen an Äntwert op d'Kokainadministratioun, eng Notioun bestätegt vun eiser onbezuelter iTRAQ (Table S1) Daten An. MSNs an der NAc Shell weisen eng Depressioun an der Feierkapazitéit no chronescher Kokain déi fir Wochen nohalteg ass, während Kär MSNs vun deemselwechten Déieren eng transient (1 – 3 Dag) Erhéijung vun der Brennkapazitéit hunn, déi zréck an de Basalniveauen bannent 2 Wochen (Kourrich an Thomas, 2009). Zousätzlech si vill synaptesch Proteine ​​differenziell an der NAc Shell geregelt vs. Kär vun Déieren ausgesat fir chronesch Kokain, dorënner GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Als chronesch Amphetamin induzéiert CaMKIIα speziell an der NAc Schuel (Loweth et al., 2010), et ass net iwwerrascht datt mir en ähnlechen Effekt mat Kokain fannen. Wéi och ëmmer ΔFosB a souwuel d'NAc Shell a Kär induzéiert gëtt duerch chronesch Kokain (Perrotti et al., 2008), a well mir weisen datt CaMKIIα-Induktioun an der Shell ΔFosB-ofhängeg ass, stellen eis Resultater nei Beweiser fir ënnerschiddlech Transkriptiounsmechanismen am CaMKIIα Promoteur tëscht dësen zwou Subregiounen, déi verantwortlech sinn fir déi selektiv Induktioun vu CaMKIIα an der Schuel.

E groussen Deel vun de rezenten Aarbechten huet sech op d'Ënnerscheeder vun Differenzen tëscht D1- an D2-Typ NAc MSNs konzentréiert. Och wa béid D1 an D2 Rezeptoren an de belountende Effekter vu Kokain involvéiert sinn (Self, 2010), rezent Aarbecht weist datt optogenetesch Aktivéierung vun D1-Typ MSNs Verhale-Äntwerte géint Kokain eropgeet, während D2-Typ MSN Aktivéierung de Géigendeel Effekt huet (Lobo et al., 2010). Am Aklang mat dësen Erkenntnisser, sinn D1-Rezeptor Nouterie Mauser Mangel u Kaf vu Selbstverwaltung Kokain (Caine et al., 2007), wärend D2 knockouts net sinn (Caine et al., 2002). D1 Agonistverwaltung direkt an NAc ausléist Kokain-sichen Verhalen bei Reinstatementsparadigmen (Self, 2010). Interessanterweis erfuerdert dësen Effekt D1-Rezeptor-ofhängeg Erhéigunge vun der CaMKII Aktivitéit an der NAc Shell, awer net Kär (Anderson et al., 2008), e Resultat dat gutt passt mat der D1- a Shell-spezifescher ΔFosB-CaMKII Loop hei proposéiert.

Mir hu virdru bericht datt Ser27 an ΔFosB kann duerch Kasein Kinase-2 phosphoryléiert ginn (Ulery et al., 2006) awer, etabléiere mir hei datt CaMKII Phosphorylate ΔFosB op dësem an anere Site mat wäit méi grousser Kinetik a Stoichiometrie a kënnen déi méi héich anscheinend M replizéieren_r observéiert fir ΔFosB (Figur 5A) mat Kokain Expositioun an vivo (Nestler, 2008). Mir wëssen scho datt Ser27 Phosphorylatioun ΔFosB Stabilitéit an Transkriptiouns Aktivitéit erhéicht (Ulery et al., 2006; Ulery an Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Zukünfteg Aarbecht wäert sech elo op d'Identifikatioun an déi funktionell Konsequenze vun neie Site vun ΔFosB Phosphorylatioun uginn déi vun der aktueller Etude uginn.

Déi hei virgeschriwwe Feed-Loop bitt en plausibele neie Mechanismus duerch deen widderholl Verwaltung vu Kokain progressiv Anomalien am NAc dréckt. Esou kann dëse biochemesche Wee e wichtegt Zil fir zukünfteg therapeutesch Interventioun bei Suchtkrankheeten ubidden. Well CaMKII ubelaangt ass a fir vill basal neuronal a Verhalensfunktiounen erfuerderlech ass, gouf d'direkt Benotzung vu CaMKII Inhibitoren als Suchtbehandlung vermeit. Eis Daten suggeréieren datt méi subtil Zielung vum Mechanismus vun der CaMKII Induktioun, déi spezifesch ass fir eng individuell Zell Type an der Ënnerregioun vum Belounungskreeslaf vum Gehir, en therapeutescht Ziel liwwere kéint, déi d'Komplikatioune vu systemescher CaMKII Inhibitioun vermeit.

Géi op:

Dankbarkeet

Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vu Stipendien vum National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR an EJN), an Hartwell Foundation (AJR). D'Auteuren soen dem Gabby Rundenko Merci fir de generéise Kaddo vu gereinigte ΔFosB an dem Roger Colbran fir de generéise Kaddo vu gereinigte CaMKIIα.

Géi op:

Referenze

1. Ahmed SH, Koob GF. Iwwergang vu moderne bis iwwerdrohend Drogeproblemer: Ännerung am hedonesche Sollwert. Wëssenschaft. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Berühmte KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: eng biochemesch Bréck déi Accumbens Dopamin a Glutamatsystemer a Kokain sichen. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Verhalensempfindlech Sensibiliséierung fir Kokain ass verbonne mat verstäerkte AMPA Rezeptor Uewerfläch Ausdrock an den nucleus accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ausdrock a Charakteriséierung vun der Alpha-Ënnerunit vum Ca2 + / calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II mat Hëllef vum Baculovirus Ausdrock System. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Roll vun Dopamin D2-ähnlech Rezeptoren an der Kokain Selbstverwaltung: Studien mat D2 Rezeptor Mutante Musen a Roman D2 Rezeptor antagonists. J Neurosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Mangel un Selbstverwaltung vu Kokain an Dopamin D1 Rezeptor knock-out Mais. J Neurosci. 2007; 27: 13140 – 13150. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasome-ofhängeg an onofhängeg Mechanismen fir FosB Destabiliséierung: Identifikatioun vu FosB Degron Beräicher an Implikatioune fir DeltaFosB Stabilitéit. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgen Déieren mat induzéierbar, geziilten Genausdrock am Gehir. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase reguléiert sozial Néierlag Stress-induzéiert synaptesch a Verhalensplastizitéit. J Neurosci. 2011; 31: 314 – 321. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivéierung vu Ca2 + / calmodulin-ofhängeg Proteinkinase II duerch Basal Autophosphorylatioun. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteinphosphatasen a Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II-ofhängeg synaptesch Plastizitéit. J Neurosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalzium / calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II a synaptesch Plastizitéit. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal Zell Typ-spezifesch Iwwereraxpression vun DeltaFosB erhéijen d'Incentive fir Kokain. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepressant Aktiounen vun Histone deacetylase Inhibitoren. J Neurosci. 2009; 29: 11451 – 11460. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kwantitativ Proteomik vu Caveolin-1-reguléiert Proteine: Charakteriséierung vun der Polymerase i an dem Transkript-Release-Faktor / CAVIN-1 IN Endothelzellen. Mol Zell Proteomik. 2010; 9: 2109 – 2124. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Risikofaktoren fir Suizidfäerdegung bei der Major Depressioun: eng Fallkontrollstudie vun impulsive an aggressiver Verhalen an Männer. Am J Psychiatrie. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB moduléiert ënnerscheet Nukleus Accumbens direkt an indirekt Wee Funktioun. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 an der Press. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII verbindlech mat GluN2B ass kritesch während der Erënnerungskonsolidéierung. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutant Mais: Verloscht vun chronescher Kokaininduktioun vu Fos-bezunnene Proteinen a verstäerkter Sensibilitéit fir Kokain's psychomotoresch a belounend Effekter. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397-10402. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. D'Differentialkontrolle vum Kokain-Verhale vum Verhalen duerch den Nukleus accumbens core a Shell. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimeriséierung an DNA-verbindende Eegeschafte vum Transkriptiounsfaktor DeltaFosB. Biochemie. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalzium / calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II dréit zur Aktivitéit-ofhängeg Filopodia Wuesstum a Wirbelsail. J Neurosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor deltaFosB am Gehir kontrolléiert d'Sensibilitéit fir Kokain. Natur. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetesch Inhibitioun vu CaMKII an Dorsal Striatal Medium Spiny Neuronen reduzéiert funktionell excitatory Synapses a verbessert d'intrinsesch Excitabilitéit. PLoS Ee. 2012; 7: e45323. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Ausstierwen Training no Kokain Selbstverwaltung induzéiert glutamatergic Plastizitéit fir Kokain ze sichen. J Neurosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Ähnlech Neuronen, vis-à-vis Adaptatiounen: Psychostimulant erlieft differenzéiert Äert Eegeschafte bei Accumbens Kär versus Schuel. J Neurosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-onofhängeg Effekt vun Striatal alphaCaMKII Fërdert d'Sensibiliséierung vum Kokain Belounung. J Neurosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ An. Roll vun Nuklearfaktor kappaB an ovareschen Hormon-mediéiertem Stresempfindlechkeet bei weibleche Mais. Biol Psychiatrie. 2009; 65: 874 – 880. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokain-induzéierter dendritescher Wirbelsailerformatioun an D1 an D2 Dopamin Rezeptor-enthale mëttleresch stompegen Neuronen an nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Déi molekulär Basis vu CaMKII funktionnéiert am synaptesche a Verhalensgeheugen. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Cell Type-spezifesche Verloscht vu BDNF Signaliséierung mimics optogenetesch Kontroll vu Kokain Belounung. Wëssenschaft. 2010; 330: 385 – 390. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibitioun vu CaMKII an der nucleus accumbens Schuel reduzéiert eng verstäerkte Amphetamin-Intake bei sensibiliséierte Ratten. Neurosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Iwwergangsiwwerdrock vun Alpha-Ca2 + / calmodulin-ofhängeg Proteinkinase II an der Nukleus accumbens Schuel verbessert d'Verhalensreaktioun op Amphetamin. J Neurosci. 2010; 30: 939 – 949. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA Rezeptorhandel a synaptesch Plastizitéit. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturell Basis vu laangfristegem Potenzéierung an eenzel dendritesche Pickelen. Natur. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontroll vun der Memory Erënnerung duerch reguléiert Ausdrock vun engem CaMKII Transgene. Wëssenschaft. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Wesentlech Roll vun der Histon Methyltransferase G9a an der Kokain-induzéierter Plastizitéit. Wëssenschaft. 2010; 327: 213 – 216. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Reguléierung vum Genexpressioun a Kokain Belounung duerch CREB an DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Iwwerpréiwung. Transkriptiouns Mechanismen vun der Sucht: Roll vun DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Pharmakologesch Studien iwwer d'Reguléierung vun chronescher FOS-bezogenen Antigen-Induktioun vum Kokain am Striatum an dem Nukleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. D'Rollë vum CaMKII a F-Aktin an der struktureller Plastizitéit vun dendritesche Wirbelen: eng potenziell molekulär Identitéit vun engem synaptesche Tag? Physiologie (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB am Nukleus accumbens regelt Nahrung verstärkt Instrumental Verhalen a Motivatioun. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. De Ratratt an stereotaxesche Koordinaten. 6th Editioun. Amsterdam; Boston: Akademesch Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Indukbar, Gehirregiounspezifesch Ausdrock vun engem dominanten negativen Mutant vun c-Jun bei transgenen Mais verringt d'Sensibilitéit fir Kokain. Gehir Res. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergent CaMK a RacGEF Signaler kontrolléieren dendritesch Struktur a Funktioun. Trends Zell Biol. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induktioun vun DeltaFosB a Belounungsgerelterte Gehir Strukturen nom chronesche Stress. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinct Mustere vun DeltaFosB Induktioun am Gehir duerch Drogen vu Mëssbrauch. Synapse. 2008; 62: 358 – 369. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hoffnung BT, Shaham Y. Neurobiologie vun der Inkubatioun vum Drogenverlaf. Trends Neurosci. 2011; 34: 411 – 420. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalzium-mediéiert zweet Bote moduléieren den Ausdrock vu Verhalensensibiliséierung vu Kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Mënschleche Gehirreceptor Autoradiografie mat Hëllef vu ganze Hemisphär-Sektiounen: eng allgemeng Method déi Otemschwieregkeeten miniméiert. Synapse. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturell Plastizitéit, déi mat der Belaaschtung vun Drogen vu Mëssbrauch ass. Neuropharmacologie. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkriptiouns an epigenetesch Mechanismen vun der Sucht. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 – 637. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalent Interaktioune vu Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II mat de postsynapteschen Dichtproteine ​​NR2B, Densin-180, an Alpha-Aktinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multiplexéiert Proteinquantitatioun an Saccharomyces cerevisiae mat Hëllef vu Amin-reaktive isobaresche Tagungsreagen. Mol Zell Proteomik. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Dee süchteg Synapse: Mechanismen vun synaptescher a struktureller Plastizitéit am Nukleus accumbens. Trends Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
56. Selwer DW. In: D'Dopamine Rezeptoren. Neve KA, Editeur. New York: Humana Press; 2010. pp. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Transient viral-mediated overexpression of alpha-calcium / calmodulin -ependent protein kinase II in the nucleus accumbens shell féiert zu laang dauerhafter funktionell Upreguléierung vun Alpha-Amino-3-Hydroxyl-5 -methyl-4-Isoxazol-Propionat Rezeptoren: Dopamin Type-1 Rezeptor a Proteinkinase A Ofhängegkeet. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mechanismus a Reguléierung vu Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II geziilt zum NR2B Ënnerdeelung vum N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Phosphorylatioun vun DeltaFosB vermittelt seng Stabilitéit in vivo. Neurowëssenschaft. 2009; 158: 369 – 372. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Reguléierung vun DeltaFosB Transkriptiouns Aktivitéit duerch Ser27 Phosphorylatioun. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Reguléierung vun DeltaFosB Stabilitéit duerch Phosphorylatioun. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB a Gehir Belounungskreesser vermittelt d'Widderstandsfäegkeet géint Stress an Antidepressiva Äntwerte. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Chronesch Kokain-induzéiert H3 Acetylatioun an transkriptionell Aktivéierung vu CaMKIIalpha am Kärbeamten ass kritesch fir Motivatioun fir Medikamentsverstäerkung. Neuropsychopharmakologie. 2010; 35: 913 – 928. [PMC gratis Artikel] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguléiert d'Radfahrt. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB Induktioun an orbitofrontale Cortex vermittelt Toleranz géint Kokain-induzéiert kognitiv Dysfunktioun. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Eng wesentlech Roll fir DeltaFosB am Kär accumbens bei Morphinaktioun. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Präis EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulin Kinase II Inhibitioun schützt géint strukturell Häerzkrankheeten. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]