Proc Natl Acad Sci US 2005 Februar 1; 102(5): 1737-1742.
mythologesch
Kokain, e Medikament vu Mëssbrauch, erhéicht synaptesch Dopaminniveauen am Striatum andeems d'Dopaminheropnahmung bei Axonterminalen blockéiert. Cyclin-ofhängeg Kinase 5 (Cdk5) a säin Aktivator p35, Proteinen, déi an der Phosphorylatioun vun Substrate bei der postmitotescher Neuron involvéiert sinn, goufen no chronescher Belaaschtung fir Kokain upreguléiert. Fir d'Effekter vun der Cdk5 an der p35 Induktioun op striatal Dopamin Signaliséierung weider ze iwwerpréifen, generéiere mir zwee onofhängeg transgen Mauslinnen, an deenen Cdk5 oder p35 speziell an Neuronen ausgedréckt gouf. Mir berichten hei datt Cdk5 Aktivitéit erhéicht huet, als Resultat vun p35 awer net vun der Cdk5 Iwwerexpressioun, féiert zu Dämpfung vu Kokain-mediéierten Dopamin Signalisatioun. Vergréissert Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun Dopamin a cAMP-reguléiert Phosphoprotein, molekulär Mass 32 kDa (DARPP-32) an Thr-75, gouf begleet vun ofgehollter Phosphorylatioun vun DARPP-32 bei Thr-34. Vergréissert Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun extrazellularer signalreguléierter Kinase Kinase 1 op Thr-286 gouf begleet vun ofgeholl Aktivéierung vun extrazellularer signalreguléierter Kinase 1 / 2. Dës Effekter bäigedroen zur Dämpfung vu Kokain-induzéierter Phosphorylatioun vum cAMP-Äntwert Element-bindende Protein souwéi eng manner Induktioun vu c-Fos am Striatum. Dës Resultater ënnerstëtzen d'Iddi datt Cdk5 Aktivitéit am verännerte Genausdrock involvéiert ass no chronescher Belaaschtung fir Kokain an doduerch beaflosst déi laang dauerhafter Ännerungen an der neuronaler Funktioun ënner Kokain Sucht.
Kokain erhéicht synaptesch Dopaminniveauen am Striatum a verännert d'Genausdrock an den dopaminoceptive Neuronen andeems d'intrellulär Weeër aktivéiert ginn, déi den initialen Signal aus dem Dopamin D1 Rezeptor an de Kär propagéieren.1). Chronesch Belaaschtung fir Kokain upreguléiert verschidde Transkriptiounsfaktoren, wat zu de laang dauerhafte Ännerungen am Genausdrock entstinn, déi geduecht ginn als neuronal Adaptatiounen an der Kokain Sucht ze baséieren (2). ΔFosB, identifizéiert als sou en Transkriptiounsfaktor (3), gouf gewisen fir de Verhale Reaktiounsfäegkeet vun Déieren op Kokain ze verbesseren (4, 5). Dofir gëtt d'Identifikatioun vun den Zilergenen, déi vun der ctionFosB Induktioun geregelt sinn, erwaart fir e bessert Verständnis vum molekulare Mechanismus ënner Kokain Sucht bäidroen. Viru kuerzem gouf gewisen datt chronesch Behandlung vun Déieren mat Kokain den Ausdrock vun der cyclin-ofhängeger Kinase 5 (Cdk5) a sengem Aktivator p35 am Striatum duerch Induktioun vun ΔFosB upreguléiert (6, 7).
Cdk5 ass e Member vun der Cdk Famill vu Serin / Threonin Kinasen. Am Géigesaz zu anere Cdks déi haaptsächlech Reguléierer vun der Zellzyklusprogresioun sinn, ass Cdk5 haaptsächlech un der Phosphorylatioun vu Substrate bei postmitoteschen Neuronen involvéiert (8). D'neuronal Spezifizitéit vu Cdk5 Aktivitéit gëtt duerch d'Associatioun mat sengen Aktivatoren erreecht, entweder p35 oder p39, déi haaptsächlech an postmitoteschen Neuronen ausgedréckt ginn (8). Zousätzlech zu der wesentlecher Roll vum Cdk5 an der Entwécklung vum Gehir (9, 10), echt ass och bei dopaminergescher Iwwerdroung am postnatal Gehir agebonne ginn (11, 12). Inhibitioun vun der Cdk5 Aktivitéit resultéiert an eng erhéicht Dopamin Fräiloossung am Striatum, wat eng presynaptesch Funktioun vun der Cdk5 weist wéi en negativen Reguléierer vun der Dopamin Verëffentlechung (11). Ausserdeem moduléiert Cdk5 d'Effizienz vun postsynaptesche Dopamin Signaliséierung duerch Phosphoryléiere vun Dopamin- a cAMP-geregelte Phosphoprotein, molekulare Mass 32 kDa (DARPP-32) an Thr-75, wat d'DARPP-32 konvertéiert an en ofhängege KinAM (PAM) (12).
Dës Observatioune suggeréieren datt Cdk5 a p35 downstream Reguléierer vun der längerer Aktivatioun vun Dopamin Signaliséierung no chronescher Belaaschtung fir Kokain an doduercher Kokain Sucht sinn. Fir d'Roll vum Cdk5 op der striatal Dopamin Signaliséierung weider ze adresséieren, generéiere mir zwee transgen Mauslinnen, an deenen entweder Cdk5 oder p35 speziell an Neuronen ausgedréckt goufen ënner der Kontroll vum p35 Promoteur. Eis Resultater hu gezeechent datt Cdk5 Aktivitéit upreguléiert war mat erhéigen Niveaue vum p35 Protein awer net Cdk5 Protein, wat suggeréiert datt den Niveau vum p35 Protein Tauxbegrenzung fir Cdk5 Aktivitéit ass. Mir bidden hei an vivo Beweiser datt d'Cdk5 Aktivitéit erhéicht huet, als Resultat vun der p35 Iwwerausdrock, féiert zu Dämpfung vu Kokain-mediéierten Dopamin Signaliséierung zum Kär duerch eng Hemmung vun der PKA an extrazellularer signalreguléierter Kinase (ERK) Kaskaden.
Materialien an Methoden
Antikörper. Polyklonal Antikörper zu Cdk5 (C-8) an p35 (C-19) goufen aus Santa Cruz Biotechnologie kaaft. D'phosphorylatiouns-ofhängeg an -onofhängeg Antikörper zu ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, an cAMP-Äntwert Element-verbindlech Protein (CREB) goufen aus Zell Signaliséierungstechnologie (Beverly, MA) kritt. Déi Antikörper géint Phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), Phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), Gesamt DARPP-32 (12), an c-Fos (14) goufe benotzt wéi beschriwwen. En Antikörper fir Aktin gouf vum Sigma kaaft.
Experimentell Déieren. Mir hu fréier d'Maus p35 Gen gekloonéiert Cdk5r1, dat p35 Protein kodéiert, a seng genomesch Struktur charakteriséiert (15). Fir déi transgen Maus mat neuronaler Iwwerausdrock vu p35 (Tgp35) ze generéieren, huet den 6-kb ECHORI-ECHORI Fragment mat dem 1.2-kb Promoteur Regioun gouf an e pGEM9Z (-) Plasmid subklonéiert, an en 45-bp Tag ofgeleet vu SV40 gouf an de KpnEch Site downstream vum Poly (A+) Signal (Figebam. 1A). De Tag enthale e SpeEch Site fir Genotypen vun den Déieren. Den 6-kb Fragment ass aus dem Plasmid ausgeschnidden a gereinegt, gefollegt vun der pronuklärer Injektioun vum Transgen fir déi transgen Méis ze generéieren. Fir den Ausdrocksprofil vum Transgene z'ënnersichen ënner der regulativer Kontroll vum 1.2-kb p35 Promoter an vivo, eng duebel transgen Maus (Tgp35; p35 - / -) gouf weider generéiert mat Hëllef vun enger zweestufeger Zuchtstrategie, duerch déi d'Tgp35 Maus an engem endogene p35-null Hannergrond regeneréiert gouf. Déi aner Maus Modeller déi an dëser Etude benotzt goufen p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, an eng transgen Maus mat neuronaler Iwwerexpressioun vu Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypen vun dëse Mais goufe bestëmmt andeems entweder Südblot Analyse oder PCR op genomesch DNA ausgefouert goufen aus de Schwanzbiopsien. Mais goufen ënner engem 12-h Liicht / 12-h däischteren Zyklus gehuisst. All Betreiung gouf am Aklang mat den National Instituter vun de Gesondheets Richtlinnen iwwer d'Betreiung an d'Benotzung vun Laboratoiren an experimentellen Déieren kritt.
Südblot Analyse. Genomic DNA aus Schwanzbiopsien extrahéiert gouf mat verdaut ECHORI an SpeEch, elektrophoréiert op engem 0.9% Agarosegel, an op eng Nylon Membran transferéiert. D'Membran gouf mat engem zoufälleg priméierten hybridiséiert 32P-Label Sonde bei 42 ° C Iwwernuechtung. D'485-bp Sondage fir Genotypen vun p35 knockout (p35 - / -) an Tgp35 Mais goufen duerch PCR generéiert andeems se folgend Primer waren: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ an 5′-CCACTGTAAAAGN. D'hybridiséiert Membran gouf zweemol am 3 × SSC / 2% SDS bei 0.1 ° C fir 42 min gewascht, an zwee Mol an 10 × SSC / 0.1% SDS bei 0.1 ° C fir 65 min, an op Röntgenfilm ausgesat.
Drogenbehandlung. Kokain (Sigma) gouf a steril Salzléisung opgeléist. Déieren goufen ip-Injektéiert mat Kokain (15 mg / kg) oder e gläiche Volumen Salzlinn am Alter vun 3 Méint a gi mat Entféierung op verschiddene Zäitpunkten (15, 30, 60, an 120 min) no der Injektioun ëmbruecht. Hirne goufe séier ewechgeholl an an Äiskalte PBS gekillt. D'Stréider goufen dann och erausgestallt an ënner enger Northern oder Western blot Analyse ënnerworf. Fir immunohistochemesch Analyse goufen striatal Sektioune vu Mais 2 h no der Injektioun kritt.
Nërdlech Blot Analyse. Total RNA gouf aus de Striata mat TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) extrahéiert an eng Northern blot Analyse ënnerworf wéi beschriwwen (18). Fir Detektioun vun c-fos mRNA gouf en 189-bp Fragment vun der Maus c-fos cDNA als Sonde benotzt wéi beschriwwen (19). D'Niveaue vun c-fos mRNA goufen quantifizéiert andeems d'optesch Dicht vun der spezifescher Band gemooss gëtt andeems e Bildanalysesystem mat nih Bildsoftware, Versioun 1.62 benotzt.
Western Blot Analyse. Striatal Tissuë goufen am 1% SDS sonikéiert a fir 10 min gekacht. D'Protein Konzentratioun an all Probe gouf duerch BCA Protein Assay (Pierce) bestëmmt. Gläich Mengen Protein goufe vun SDS / PAGE getrennt ier se op eng Nitrocellulosemembran transferéiert goufen. D'Membranen goufen an 1 × PBS blockéiert enthalen mat 5% Schuelemëllech an 0.05% Tween 20 a mat primäre Antikörper iwwer Nuecht bei 4 ° C incubéiert. Inkubatioun mat peroxidase-konjugéierten Anti-Maus oder Kanéngchen IgG (Sigma) gouf bei Raumtemperatur fir 60 min gemaach. E Signal gouf duerch verstäerkte Chemilumineszenz (Pierce) festgestallt, an d'optesch Dicht vun de Bands goufen quantifizéiert wéi uewen beschriwwen.
Cdk5 Kinase Assay. Striatal Lysate goufe mat engem Lysis-Puffer virbereet, bestehend aus 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorin / XUMX / XUM ml Leupeptin / Phosphatase Inhibitoren (Phosphatase Inhibitor Mëschung I an II, Sigma). D'Lysate goufen immunoprecipitéiert mat entweder Anti-Cdk1 (C-1) oder Anti-p5 (C-8) Antikörper. D'Cdk35 Immunoprecipitaten goufen duerch Inkubatioun vum 19 μl vum Lysat (entspriechend mam 5 μg Protein) mat Anti-Cdk300 Antikörper (300 μg) iwwer Nuecht op 5 ° C gefollegt vu weider Inkubatioun mat 3 μl vu Protein A-XUMA % Schlaffer am Lysisbuffer; Santa Cruz Biotechnologie) fir 4 h bei 25 ° C. Fir d'Virbereedung vu p50 Immunoprecipitaten gouf 3 μl vum Lysat (entspriechend mam 4 mg Protein) mat Anti-p35 Antikörper (500 μg) incubéiert wéi uewe beschriwwen. D'immunoprecipitate goufe zweemol mam Lysis-Puffer gewascht an zweemol mat engem Kinase-Puffer bestehend aus 1 mM Tris · HCl, pH 35 / 3 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendéiert an 60 μl vum Kinase Puffer. Kinase Aktivitéit gouf gemooss andeems Histone H1 als Substrat (18).
Immunhistochemie. Méis goufen duerch ip Injektiounen vun Avertin (250 mg / kg, Fluka) anästheséiert an transkardiell mat 0.1 M Natriumphosphatbuffer, pH 7.4 gefollegt, gefollegt vu Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), en net-verknäpplecht Fixativ. Dissected Brains goufen weider am selwechte Fixativ iwwer Nuecht bei 37 ° C fixéiert. Duerno goufe Braine a Paraffin agebonnen, an 5-μm-décke koronale Sektioune geschnidden an ënner Immunohistochemie ënnerworf mat Avidin-Biotin-Peroxidase Komplex Technik (Vector Laboratoiren) mat Diaminobenzidin als Substrat. D'Sektioune goufe mat engem Affinitéitssuiberte polyklonalen Antikörper géint c-Fos iwwer Nuecht bei 4 ° C incubéiert. D'Bildungsspezifizitéit gouf duerch Ofdreiwung vum primäre Antikörper bewäert.
Resultater
Generatioun vun transgenen Méis mat Neuronal Iwwerausdrock vun p35. Den Transgene benotzt fir erhéicht neuronal Ausdrock vun p35 z'erreechen enthält den 6-kb Fragment vum gekloonten Maus p35 Gen deen den 1.2-kb Promoteur an déi ganz kodéierend Sequenz vun p35 enthält (Figebam. 1 A). D'Genotypen vu Mais goufe mat der Southern blot Analyse mat Hëllef vun enger Sond festgeluecht déi entwéckelt war fir p35 - / - an Tgp35 Mais aus Wild-Typ Mais z'ënnerscheeden (Figebam. 1 A an B)An. Fir den transgenen Ausdrock ënner der Kontroll vum 1.2-kb p35 Promoteur ze iwwerpréiwen, generéiere mir duebel transgenen Mais (Tgp35; p35 - / -) an deem p35 Ausdrock nëmmen aus dem Transgene gedriwwen gouf. De p35 Ausdrock an Tgp35; p35 - / - Mais goufen nëmme am Gehir observéiert (Figebam. 1C), woubäi dat raimlecht Ausdrockmuster ähnlech wéi dee vun wëldaartegen Mais war (Figebam. 1D). Mangel u p35 gouf gewisen an enger anormaler Schichtstruktur an der cerebral cortex an der Hippocampus vun de Mais resultéieren (10). Wéi och ëmmer, d'Tgp35; p35 - / - Mais weisen eng komplett Rettung vun der p35 - / - Gehirphenotyp (Figebam. 1E). Dës Donnéeën hunn uginn datt den 1.2-kb p35 Promoter den Ausdrock vun der Transgene mat engem ähnlechen Ausdrockprofil wéi deen vum p35 vum endogene p35 Gen kontrolléiert.
De p35 Protein Niveau ass Sätzbegrenzend fir d'Up-Reguléierung vun der Cdk5 Aktivitéit. Mir hunn d'Gen-Doséierungseffekter vun den Genen, déi p35 an Cdk5 kodéieren op Proteinausdrock a striataler Extrakten aus p35 - / -, p35 +/–, Wëldaart, Tgp35, Cdk5 +/–, an TgCdk5 Mais am Alter vun XN ënnersicht. D'Niveaue vum p3 an Cdk35 Protein korreléiert gutt mat der Gendoséierung, respektiv (Figebam. 2 A an B). Tgp35 Mais weisen eng ≈1.6-fach Erhéijung vun p35 Protein Niveau am Verglach mat Wild-Typ Mais, wärend Cdk5 Protein Niveauen net beaflosst goufen vun de verschiddenen Niveauen vum p35 Protein. TgCdk5 Mais weisen eng ≈1.9-fach Erhéijung vun Cdk5 Protein Niveau am Verglach mat Wëldtypem Mais, wärend p35 Proteinniveauen net beaflosst goufen vun de verschiddenen Niveauen vum Cdk5 Protein. Fir d'Effekter vu verschiddenen Quantitéiten un p35 Protein op Cdk5 Aktivitéit z'ënnersichen, war Cdk5 immunoprecipitéiert vu striataler Extrakten mat Anti-Cdk5 Antikörper a Kinase Aktivitéit gouf gemooss. Genee, fir d'Effekter vu verschiddenen Quantitéiten vum Cdk5 Protein op kinase Aktivitéit z'ënnersichen, war p35 immunoprecipitéiert aus striataler Extrakten mat Anti-p35 Antikörper, an d'Kinase Aktivitéit gouf gemooss. Cdk5 Aktivitéit korreléiert gutt mat dem Niveau vum p35 Protein awer net mat dem Niveau vum Cdk5 Protein (Figebam. 2 C an D). Dës Resultater hunn ugewisen datt de Betrag u p35 Protein e rate-limitéierende Faktor fir Cdk5 Aktivitéit ass. Mir hunn dofir Tgp35 Mais benotzt fir d'Auswierkunge vun enger erhéiter Cdk5 Aktivitéit op striatal Dopamin Signalisatioun z'ënnersichen.
Kokain-induzéiert Phosphorylatioun vun DARPP-32 an Thr-34 Ass Attentéiert an Tgp35 Mice. D'Funktioun vun DARPP-32 hänkt vu sengem Phosphorylatiounsstaat op verschidde Site of (20). PKA Phosphorylaten DARPP-32 am Thr-34, wärend Cdk5 Phosphorylaten DARPP-32 bei Thr-75. Sou hunn mir de Phosphorylatiounszoustand vun DARPP-32 a striatal Extrakten aus Wild-Typ an Tgp35-Méis ënnersicht. Den Niveau vu Phospho-Thr-75 DARPP-32 war méi héich bei Tgp35 Mais (Figebam. 3A; 1.6 ± 0.2-falt iwwer dem Wäert vun de Wëld-Typ-Mais). Mir hunn nächst d'Auswierkunge vun der erhéiter Cdk5 Aktivitéit op striatal Dopamin Signalisatioun bewäert. Mir hunn d'Kokain-induzéiert PKA Aktivéierung bei Tgp35 Musse ënnersicht andeems de Phosphorylatiounszoustand vun DARPP-32 bei Thr-34 analyséiert gouf. Den Niveau vu Phospho-Thr-34 DARPP-32 gouf an Wëldaart Méis 15 min no der Kokaininjektioun erhéicht (Figebam. 3B; 1.8 ± 0.2-falt iwwer dem Basalniveau). Wéi och ëmmer, gouf den Effekt vu Kokain op Thr-34 Phosphorylatioun vun DARPP-32 bei Tgp35 Musten (1.2 ± 0.3-falt iwwer dem Basalniveau) gedämpft. Dës Resultater hunn ugewisen datt eng Erhéijung vun der Cdk5 Aktivitéit d'kokain-induzéierter PKA-Aktivéierung gedämpft méiglecherweis duerch d'DARPP-32 Phosphorylatioun bei Thr-75 (6, 12). Et ass och méiglech datt eng Erhéijung vun der presynaptescher Cdk5 Aktivitéit zu enger erofgaangter Dopamin Verëffentlechung féiert an datt dëst zu der reduzéierter Effekt vu Kokain bäidréit. Notamment beaflosst eng eenzeg Injektioun vu Kokain d'Niveaue vum p35 an Cdk5 Protein souwéi d'Kinase Aktivitéit (Figebam. 3 C an D). Dëst ass am Géigesaz zu enger viregter Studie, an där chronescher Belaaschtung fir Kokain gewisen gouf den Ausdrock vun p35 an Cdk5 upreguléieren (6).
Up-Reguléierung vun Cdk5 Aktivitéit Attenuéiert Kokain-induzéiert Aktivéierung vun ERK1 / 2. Rezent Beweiser weisen datt d'Dopamin Rezeptor Aktivéierung am Striatum och aner Signaliséierungskaskaden aktivéiert, dorënner den ERK Wee (21, 22), déi eng wichteg Roll an der Verhalensreaktioun op Kokain huet (23). Mir hunn dowéinst iwwerpréift ob Cdk5 Aktivitéit op der Kokain-induzéierter Aktivatioun vun der ERK Wee kéint beaflossen. Aktivéierung vum ERK Wee gouf no Kokaininjektioun a striatal Extrakten aus Wild-Typ Musse observéiert, wéi evident duerch verstäerkte Phosphorylatioun vu MEK1 / 2 bei Ser-217 a Ser-221 (1.5 ± 0.2-falt iwwer dem Basalniveau) a vum ERK1 / 2 an Thr-202 an Tyr-204 (ERK2 Phosphorylatioun: 1.5 ± 0.2-falt iwwer dem Basalniveau) (Figebam. 4 A an B). Wéi och ëmmer, déi Kokain-induzéiert Aktivéierung vu MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-falt iwwer de Basalniveau) a vun ERK1 / 2 (ERK2 Phosphorylatioun: 1.2 ± 0.2-falt iwwer de Basalniveau) war am Tgp35 m attenuatedFigebam. 4 A an B). Ausserdeem waren d'Basalniveauen vu Phospho-ERK1 / 2 niddereg an Tgp35 Mais (0.8 ± 0.2-falen ënner dem Wäert vun de Wëld-Typ-Mais), wär dësen Trend net statistesch bedeitend war. Dëst lescht Resultat kann zu Cdk5-ofhängeg Phosphorylatioun vu MEK1 bei Thr-286 attribuéiert ginn, wat zu enger Ofsenkung vun der katalytescher Aktivitéit resultéiert (24). Fir dës Méiglechkeet ze bewäerten, hu mir de Phosphorylatiounszoustand vu MEK1 am Thr-286 ënnersicht a festgestallt datt méi héich Niveauen vu Phospho-Thr-286 MEK1 an der stataler Extrakten aus Tgp35 Musse present waren (Figebam. 4C; 1.3 ± 0.1-falt iwwer dem Wäert vun de Wëld-Typ-Mais). Weider war de Phosphorylatiounszoustand vu MEK1 am Thr-286 net vun enger eenzeger Injektioun vu Kokain geännert ginn, konsequent mat der Sich datt Cdk5 Aktivitéit net vun der Behandlung beaflosst war (Figebam. 3D).
Propagatioun vun Dopamin Signaliséierung zum Nukleus gëtt entzündegt duerch verstäerkter Cdk5 Aktivitéit. Kokain-induzéiert Aktivéierung vu multiple Signalisatiounskaskaden involvéiert PKA an ERK féiert zur spéiderer Aktivatioun vum Transkriptiounsfaktor CREB am Kär duerch seng Phosphorylatioun am Ser-133 (22, 25). Fir z'ënnersichen ob den Cdk5-mediéierten hemmende Effekter op PKA an ERK Aktivéierungskaskaden iwwer CREB Phosphorylatioun am Käre konvergéieren, hu mir de Phosphorylatiounszoustand vun CREB bei Ser-133 a striatal Extrakten aus Wild-Typ an Tgp35-Mice ënnersicht. De Basalniveau vu Phospho-CREB war niddereg an Tgp35 Mais (0.7 ± 0.1-Falt vum Wäert vun de Wëld-Typ-Mais) (Figebam. 5). Als Äntwert op d'Injektioun vu Kokain, ass den Niveau vu Phospho-CREB am Striatum vun de Wëldtypem Mais eropgaang (1.5 ± 0.1-falt iwwer dem Basalniveau), awer dës Äntwert op Kokain gouf an Tgp35-Méis (1.2 ± 0.1-) gedämpft. sech iwwer d'Basisniveau falen)Figebam. 5).
Phosforylatioun vu CREB bei Ser-133 augmentéiert seng transkriptionell Aktivitéit iwwer e cAMP Äntwert Element an der Promoteur Regioun vu bestëmmte Genen, dorënner de c-Fos Gen (26). Mir hunn dofir d'Induktioun vu c-fos am Striatum vun der Wëldtyp an der Tgp35 Mäis no der Kokaininjektioun ënnersicht. Bei wëldaartem Mais huet den Niveau vum c-fos mRNA zu engem Spëtzewäert eropgesat (1.8 ± 0.2-falt iwwer dem Basalniveau) 30 min no der Injektioun vu Kokain, a spéider zréck op de Basalniveau duerch 120 min no der Injektioun (Figebam. 6 A an B). Wéi och ëmmer, waren d'Niveaue vun c-fos mRNA ≈30% manner an Tgp35 Mais wéi an Wild-Typ Mais bis 30 min no der Injektioun (Figebam. 6 A an B). Déi manner Induktioun vu c-Fos an Tgp35 Mais gouf weider vun der immunohistochemistry bekräftegt (Figebam. 6 C-F). Kokainadministratioun huet c-Fos Immunoreaktivitéit erhéicht, staark an der dorsomedial – dorsozentraler Deeler vum Striatum a schwaach an de lateralen Deeler, a béid Wëldtypen an Tgp35 Mais. Wéi och ëmmer, d'Kokain-induzéiert Erhéijung vun der Zuel vun den c-fos-immunopositiven Zellen war notamment am Striatum vun Tgp35 Mäusen ofgeschwächt (Figebam. 6G). Gemeinsam hunn dës Resultater ugewisen datt Kokain-mediéiert Verbesserung vu striatal Dopamin Signaliséierung zum Kärel war an Tgp35 Mäusen hemmt, e wahrscheinlech Resultat vun enger verstäerkter Cdk5 Aktivitéit.
Diskussioun
Cdk5 a säin Aktivator p35 goufen als Zilgenen identifizéiert déi duerch chronesch Belaaschtung fir Kokain upreguléiert sinn. (6). Mir bericht hei Beweiser datt erhéicht Cdk5 Aktivitéit, als Resultat vun p35 Up-Reguléierung anstatt Cdk5 Up-Reguléierung, féiert zu Dämpfung vu Kokain-mediéierten Dopamin Signaliséierung bei striatal Neuronen. Fir d'Konsequenze vum upreguléierte Ausdrock vun entweder Cdk5 oder p35 op striatal Dopamin Signalatioun ze ënnersichen, goufen zwee transgen Mausleitungen, TgCdk5 an Tgp35 Mais analyséiert. Mir hu festgestallt, datt Cdk5 Aktivitéit upreguléiert war a Proportioun zu engem erhéicht Niveau vum p35 Protein awer war net vun engem verstäerkten Niveau vum Cdk5 Protein beaflosst. Eise viregte Bericht huet och bewisen datt Cdk5 Aktivitéit an TgCdk5 Maus Gehir méi niddereg war wéi an Wild-Typ Maus Gehir wann d'Aktivitéit gemooss gouf andeems Cdk5 Immunoprecipitaten (17), suggeréiert datt Cdk5 Iwwerausdrock resultéiert an e verstäerkten Niveau vu monomeresche Cdk5 wann p35 Niveau net eropgeet. Dës Resultater hunn ugewisen datt den Niveau vum p35 Protein e rate-limitéierende Faktor fir Cdk5 Aktivitéit ass.
Tgp35 Mais weisen eng manner Induktioun vu béide CREB Phosphorylatioun an c-Fos am Striatum no akuter Injektioun vu Kokain, wat suggeréiert datt d'striatal Äntwert op Kokain duerch verstäerkte Cdk5 Aktivitéit hemmt gouf. D'Dämpfung vu Kokain-mediéiertem Dopamin-Signaliséierung bei Tgp35 Mais war méiglecherweis duerch den Cdk5-mediéierten Inhibitioun vu multiple Signaliséierungskaskaden, mat DARPP-32, PKA, an ERK. Kokainverwaltung huet d'PKA Phosphorylatioun vun DARPP-32 bei Thr-34 bei Wëldaartermais erhéicht, wärend dës Äntwert an Tgp35-Mauere gedämpft gouf. PKA Phosphorylatioun vun DARPP-32 am Thr-34 gouf gewisen fir d'Aktivitéit vu Proteinphosphatase 1 (PP1) ze hemmen, dat Enzym dat verantwortlech ass fir d'Defosforylatioun vun Ser-133 vum CREB (27). Sou gëtt PP1 Aktivitéit net iwwer den DARPP-32 / PP1 Wee an Tgp35 Weeër antagoniséiert.
Kokain-induzéiert Aktivéierung vun ERK1 / 2 war och ofgeschwächt an Tgp35 Mais. Et gi verschidde verschidde Mechanismen, duerch déi d'Cdk5 déi Kokain-induzéiert Aktivéierung vun ERK1 / 2 kéint inhibitéieren. Als éischt konnt Cdk5-ofhängeg Phosphorylatioun vun DARPP-32 bei Thr-75 PKA inhibitéieren, wat zu spéider Hemmung vun all PKA-mediéierten MEK1 / 2 Aktivéierung féiert, déi fir ERK1 / 2 Aktivéierung noutwendeg ass. Eng rezent Etude huet och fonnt datt Phosphorylatioun vun DARPP-32 bei Thr-34 fir Kokain-mediéiert Aktivéierung vun ERK1 / 2 erfuerderlech ass duerch verschidde Weeër déi indirekt Reguléierung vun der MEK Aktivéierung involvéiert souwéi d'Reguléierung vun der striatal-beräichert Phosphatase, eng Tyrosin Phosphatase déi wierkt direkt op ERK1 / 2 (28). Ënnerstëtzung fir dës Méiglechkeet gëtt proposéiert mat der Sich datt Kokain-induzéiert Phosphorylatioun vu MEK1 / 2 bei Ser-217 a Ser-221 an Tgp35 Mais ofgeschaaft goufen. En anere méigleche Wee ass iwwer Cdk5-ofhängeg Phosphorylatioun vu MEK1 bei Thr-286, wat zu enger Ofsenkung vu senger katalytescher Aktivitéit géif féieren an zu enger Inhibitioun vun der ERK1 / 2 Aktivitéit féieren (24).
Inhibitioun vun der Cdk5 Aktivitéit am Striatum gouf gewisen fir Verhalenseffekter vu chronescher Kokainbehandlung bei Déieren ze potenzéieren (6). Konsequent mat der Hypothese datt Up-Reguléierung vun der Cdk5 Aktivitéit kann zur neuronaler Upassung bäidroe fir d'Effekter vun der wiederholter Kokainverwaltung entgéintzewierken. (6), hu mir festgestallt datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DARPP-32 a MEK1 zu der Dämpfung vu Kokain-induzéierter Aktivéierung vun ERK1 / 2 bäigedroen huet, wat zu enger manner Induktioun vu CREB Phosphorylatioun a c-Fos am Striatum gefouert huet. Eis Befindunge ënnerstëtzen d'Iddi datt Cdk5 Aktivitéit erhéicht huet, als Resultat vun p35 Up-Reguléierung, kann d'Genausdrock am Striatum änneren no chronescher Belaaschtung fir Kokain. Dëst kann duerch Verännerunge vun den Aktivitéite vun den Transkriptiounsfaktoren wéi CREB a c-fos optrieden. Sou kann den Cdk5 Aktivator p35, duerch seng rate-limitéierend Auswierkungen op Cdk5 Aktivitéit bäidroe fir laang dauerhafter Ännerungen an der Neuronal Funktioun ënner Basis Kokain Sucht.
Arbeschterlidder
Mir soen dem Drs Merci. D'Mary Jo Danton, de Philip Grant, an de Sashi Kesavapany fir kritesch Liesung vum Manuskript. Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vun National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (zu ABK), US Public Health Service Grant DA10044, a Stipendien aus der Simons Foundation, der Peter J. Sharp Foundation, an der Picower Foundation (un PG).
Notes
Ofkierzungen: Cdk5, Cyclin-ofhängeg Kinase 5; ERK, extrazellulär signalreguléiert Kinase; DARPP-32, Dopamin a cAMP-reguléiert Phosphoprotein, Molekulare Mass 32 kDa; PKA, cAMP-ofhängeg Kinase; MEK, ERK kinase; CREB, cAMP-Äntwert Element-verbindlecht Protein.
Referenze
;
