J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Source
Department of Psychiatry, Center for Basic Neuroscience, The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
mythologesch
Den Transkriptiounsfaktor DeltaFosB (och bezeechent als FosB2 oder FosB [kuerz Form]) ass e wichtege Mediateur vun der laangfristeg Plastizitéit induzéiert am Gehir duerch chronesch Belaaschtung fir verschidden Aarte vu psychoaktiven Reizen, och Medikamenter vu Mëssbrauch, Stress, an elektrokonvulsive Krampfungen An. Eng ënnerschiddlech Feature vun DeltaFosB ass datt, eemol induzéiert, se am Gehir fir relativ laang Perioden Zäit bleift an der Verontreiung vu weider Stimulatioun. Déi Mechanismen, déi dës scheinbar Stabilitéit ënnersträichen, sinn awer onbekannt bliwwen. Hei demonstréiere mir datt DeltaFosB e relativ stabile Transkriptiounsfaktor ass, mat enger Hallefdauer vu ronn 10 h an der Zellkultur. Ausserdeem weise mer datt DeltaFosB e Phosphoprotein am Gehir ass an datt Phosphorylatioun vun engem héich konservéierten Serinreschter (Ser27) an DeltaFosB et schützt géint proteasomal Degradatioun. Mir bidde verschidde Beweiser fir ze beweisen datt dës Phosphorylatioun duerch Kasein Kinase 2 mediéiert gëtt. Dës Befindungen stellen den éischte Beweis aus, datt DeltaFosB phosphorylatéiert ass a beweise datt Phosphorylatioun zu senger Stabilitéit bäidréit, wat am Kär vu senger Fäegkeet ass fir laang dauerhafter Adaptatiounen am Gehir ze mediéieren.
Aféierung
Den Transkriptiounsfaktor ΔFosB, och bezeechent FosB2 oder FosB [kuerz Form], ass eng C terminus-ofgeschniddene Spritvariant vum direkt fréiere Gen fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu an Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Wéi FosB mat voll Längt, huet ΔFosB en DNA-bindende Basisdomän an e Leucin Zipper, duerch deen et mat Jun Proteinen dimeriséiert fir Aktivator Protein-1 (AP-1) Transkriptiounsfaktorkomplexe ze bilden, déi den Ausdrock vu ville Genen reguléieren (Morgan an Curran, 1995; Rylski a Kaczmarek, 2004). Trotz fehlendem Deel vum transaktiverende Domain fonnt am C terminus vum FosB, funktionnéiert ΔFosB souwuel als e staarken transkriptiven Aktivator an e Repressor a kultéiert Zellen an am Gehir (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu an Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung an Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB gëtt zu héigen Niveauen an enger Regioun-spezifescher Manéier am Gehir induzéiert nodeems chronesch, awer net akut, Belaaschtung zu enger Vielfalt vu psychoaktiven Reizen, dorënner Stress, gewësse Läsionen, antipsychoteschen an antidepressiva, Medikamenter vu Mëssbrauch, an natierlech Belounungen (Hope et al., 1994b; Hiroi a Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). D'Induktioun vun ΔFosB gouf direkt mat de funktionnellen Effekter vun e puer vun dësen Reizen op dem Gehir verbonnen. D’Persistenz vun ΔFosB och an der Verontreiung vu zousätzlech Stimulatioun ënnerscheet et vun allen anere Fos Famill Transkriptiounsfaktoren, déi séier an Äntwert op akut Stimuli induzéiert sinn, zréckzéien op d'Basisniveauen bannent e puer Stonnen, an allgemeng weisen Desensibiliséierung no chronescher Stimulatioun (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi a Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Dëst mécht ΔFosB en attraktiven Kandidat fir e puer vun de laang dauerhaften Ännerungen am Genausdrock ze bemidelen, déi d'stabil neuronal Adaptatiounen duerch bestëmmte chronesche Reizen ënnersträichen.
Well déi verlängert Präsenz vun ΔFosB geschitt an der Verontreiung vu weider Induktioun vu sengem mRNA (Chen et al., 1995), hu mir spekuléiert datt, am Géigesaz zu der VollBlängt an all aner Fos Famillproteinen, déi amgaang onbestänneg sinn, ΔFosB en ongewéinlech stabile Transkriptiounsfaktor kann sinn (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Desweideren, Immunblotting Analyse vun akut- versus chronesch-stimuléiert Gehirwiss huet virgeschloen datt ΔFosB sech verännert. Mr (molekulare Mass) vun ∼33 kDa am akuten Zoustand bis ∼35 – 37 kDa während chronescher Behandlung (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Well et keng Beweiser fir d'Existenz vu zousätzlech mRNAs ass, déi fir dës verschidden Isoforme koden kéinten, hu mir weider spekuléiert datt ΔFosB posttranslational geännert gëtt an datt dëst zu senger ongewéinlecher Stabilitéit bäidréit. Bis haut goufen awer keng biochemesch Analysen vum Ëmsaz oder posttranslational Modifikatioune vun ΔFosB gemellt. D'Zil vun der aktueller Etude war ze bestëmmen ob ΔFosB e Phosphoprotein ass an ob Phosphorylatioun eng Roll a senger Stabilitéit spillt.
Materialien an Methoden
Mamendéieren Zell Linnen an DNA Konstruktiounen.
PC12 Zellen (Clontech, Mountainview, CA) goufen an héich-Glukos DMEM enthale l-Glutamin (L-Gln) kultivéiert an ergänzt mat 5% fetalt Boverie Serum (FBS), 10% Päerdserum (béid aus Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml Penicillin, an 100 μg / ml Streptomycin (béid vu Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) goufen an héich-Glukos DMEM enthale L-Gln kultéiert an ergänzt mat 10% FBS, Penicillin, a Streptomycin. Béid Zellleitungen goufe bei 37 ° C an enger fiichter 5% CO gehalen2 Atmosphär.
Fir déi transient Transfektioune mat DNA, PC12 oder HeLa Zellen goufen op sechs Wuelplacke gesaat (mat Kollagen I beschicht fir PC12 Zellen) fir den nächsten Dag 90 – 100% Duercherneen z'erreechen a goufen duerno mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfizéiert. An e puer Experimenter (kuckt Figuren. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB gouf transiently ausgedréckt a PC12 Zellen iwwer Infektioun mat rekombinantem Herpes Simplex Virus (HSV).
ΔFosB a FosB cDNAs goufen aus eisen eegene pTetop-Konstrukt kritt (Chen et al., 1997), a subklonéiert an e pcDNA3.1 Vektor (Invitrogen). Dës pcDNA3.1-ΔFosB / FosB Konstrukt goufe fir Ausdrock a Mamendéierenzellen an als Template fir Site-geriicht Mutagenese benotzt. Rekombinant HSV-ΔFosB gouf bereet wéi virdru beschriwwen (Neve et al., 1997), an d'Virbereedung hat eng Titer vun ∼1 × 108 pfu / ml.
Puls-Chase Experimenter.
Ongeféier 24 h no der Infektioun / Transfektioun, goufen Zellen (PC12 oder HeLa) a sechs Wuelplaten zwee bis dräimol mat 2 ml PBS gewascht a mat 37 ° C fir ∼1 h an 2 ml Cys / Met-gratis DMEM incubéiert (Invitrogen) ergänzt mat 5% dialyséiert FBS (Hyclone, Logan, UT) fir intrazellulär Poole vu Met a Cys ze läschen. Um Enn vun dëser "Hongernoutzäit" goufen Drogen (wann d'Zellen solle behandelt ginn) derbäi ginn, an d'Zelle goufen (Puls) mat 12 – 25 μCi vun 35S Protein Etikettéierung Mix (PerkinElmer, Wellesley, MA) fir ∼1 h bei 37 ° C fir all nei synthetiséiert Proteinen ze labeléieren. D'Radiobelbel gouf duerno ewechgeholl duerch d'Zellen zwee bis dräimol mat 2 ml PBS ze wäschen, an de 35S-labeléiert Proteinen goufen duerno gefollegt (duerchsicht) andeems de Medium duerch "kalt" (netradioaktivt) Medium ersat gouf mat 5% FBS ersat an d'Zellen op verschiddene Zäitpunkte gesammelt. Zellbehandlungen goufen am ganzen Zäit gehalen. All Figuren vun dësen Experimenter weisen ähnlech initial Quantitéiten vun de verschiddenen Proteinen fir d'Vergläicher vun hiren Ëmsazraten ze optimiséieren.
Déieren a chronesch elektrokonvulsiv Erfaassungsbehandlung.
Erwuesse Sprague Dawley männlech Ratten (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) goufe eemol all Dag mat elektrokonvulsive Saiselen (ECS) fir 7 – 9 d behandelt. ECS gouf ausgefouert wéi virdru beschriwwen (Hope et al., 1994a) mat engem Ugo Basile (Comerio VA, Italien) ECS Eenheet mat den folgenden Astellungen: Frequenz, 100 Puls / s; pulséiert mat, 0.5 ms; Schockdauer, 1.0 s; an aktuell, 75 mA. Scham Kontroll Déieren goufe parallel behandelt andeems d'Ouerclip Elektroden ugewannt goufen ouni elektresche Stroum.
32 P metaboleschen Etikettéieren.
Fir d'Markéierung vu Gehinsschneiden goufen Ratten entfouert, d'Gehirer séier dissektéiert, an 300 μm frontal kortikale Scheiwen goufen mat engem DSK Mikroslicer virbereet (Ted Pella, Redding, CA). D'Schlitzer goufe bannen an Plastikréier an 2 ml vun phosphateschem künstlechen CSF (ACSF) incubéiert an op 30 ° C ënner konstant sanft Bläschen mat engem O2/ CO2 Mëschung (Hemmings et al., 1989). D'Schliten (zwou Scheiwen pro Röhre) goufen mat 1.3 mCi fir 8 – 10 h gezeechent an der Präsenz oder Feele vu Okadainsäure (100 ng / ml). Um Enn vun dëser Inkubatioun goufen d'Segelen op d'mannst dräimol mat kale ACSF gerannt an duerno duerch sonication an 250 μl vum kale Radioimmunoprecipitatiounsassay (RIPA) Puffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) homogeniséiert ) Igepal, 0.5% (w / v) Natriumdeoxycholat, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] ergänzt virum Gebrauch mat SDS bis 0.6%, Protease-Inhibitor Cocktail fir Mamendéierenzellen (benotzt bei 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), Phosphatase-Inhibitor Cocktailen I an II (benotzt beim 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, an 2% Glycerol. Homogenates goufen dann fir 15 min gekacht an duerch Centrifugatioun op 15,000 × geläscht g fir 15 min. Protein Konzentratioun an de resultéierende Supernatanten gouf mat der BCA Protein Assay (Pierce, Holmdel, NJ) bewäert.
Fir den 32P Etikettéierung vun kultéiert Zellen, ∼24 h no der Infektioun / Transfektioun, goufen d'Zellen zwee bis dräimol mat phosphatfräi Medium gewascht an an dësem Medium fir ∼1 h incubéiert. No dëser Hongerzäit ass 0.2 – 0.3 mCi vun 32PH3PO4 (PerkinElmer) goufen zu all Wuel bäigefüügt, an d'Zellen goufe fir 4 – 12 h gezeechent, ofhängeg vun der Art vum Experiment (kuck Fig. 1 – 7 fir Spezifikatioune). Zellen goufen dunn dräimol mat PBS gewascht an op Äis fir 15 min mat 50 μl vun ergänzten RIPA Puffer geliéiert. Lysate goufen duerch Schrauf gesammelt a goufe 10 Zäiten duerch eng 25 Ga Nadel fir DNA ze schäerfen, fir 10 min gekacht, an um 15,000 rpm fir 15 – 30 min bei 4 ° C centrifugéiert. Déi geléist Lysate (Supernatanten) goufen an en neie Rouer iwwerginn an e BCA Protein Assay (Pierce) gouf ausgefouert. All Figuren vun dësen Experimenter weisen ähnlech Quantitéiten vun Gesamtwild-Typ (WT) a S27A ΔFosB Proteine fir d'Vergläiche vun hire relativen Phosphorylatiounsniveauen ze optimiséieren.
Chemikalien an Zellkulturbehandlungen.
Okadainsäure (OA; Sigma-Aldrich) gouf an Ethanol opgeléist an an enger final Konzentratioun vu 100 ng / ml benotzt. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) gouf an Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich) opgeléist a benotzt an der Zellkultur bei enger final Konzentratioun vum 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) gouf a Waasser opgeléist an an enger final Konzentratioun vum 200 μm benotzt. Calphostin-C (Biomol) gouf am DMSO opgeléist a bei 0.2 μm benotzt, wärend de phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA; Promega, Madison, WI) an DMSO opgeléist a bei 0.1 μm benotzt gouf. myristoylated-autocamtide-2-betreffend inhibitivt Peptid (m-AIP; Biomol) gouf a Waasser opgeléist an an enger final Konzentratioun vu 1 an 10 μm benotzt. D'Breet-Spektrum Protein Kinase-Inhibitoren H-7 an H-8 (Biomol) goufen a Waasser opgeléist a mat enger final Konzentratioun vu 150 a 200 μm benotzt, respektiv. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) an Epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) goufen allebéid an DMSO opgeléist an an enger final Konzentratioun vu 12.5 a 7.5 μm benotzt, respektiv. An all Experimenter gouf DMSO (Gefier) zu Zellen hinzugefügt wéi néideg fir e konstante Betrag vun DMSO iwwer Behandlungen ze halen. Fir 32P-Etiketter Experimenter, d'Drogen goufen direkt virum Label bäigefüügt a fir déi verbleiwend vun der Etikettperiod gehal. Fir Puls-Chase-Experimenter goufen Drogen zur Zäit vum Cys / Met "Starvation" agebaut, duerch d'Markéierungsperiod gehal, duerno erëm zréck an d'Jachmedium bäigefüügt. D'Proteasome-Inhibitoren goufen all 3 – 4 h duerch d'Spëtzt gespullt fir de séieren Ëmsaz vun dësen Peptiden ze kompenséieren.
ΔFosB Immunoprecipitatioun, Immunblotting, an Autoradiographie.
Fir Immunopfällung, goufen Lysate verdënntem 1: 5 mat Einfache RIPA fir d'SDS Konzentratioun op 0.1% erof ze bréngen ier Dir mat Immunoprecipitatioun (IP) fortgeet. Fir net-spezifesch Bindung ze limitéieren, goufen d'Lyseate fir d'mannst 4 h duerch immunoprecipitéierend mat nonimmune IgG a Protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) geläscht. ΔFosB gouf dunn aus de geläschte Lysaten immunoprecipitéiert mat Hëllef vun engem Geess polyklonalen Antikörper, deen en internen Epitop erkennt a béid FosB an ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) an 0.5 – 1 μg IgG pro 10 μg Lys (50 – 300 μg Gesamtprotein) an engem Gesamtvolumen vun 0.5 ml. IPs goufe sanft gemëscht bei 4 ° C op engem Rotor fir op d'mannst 8 h an dunn 15 μl Protein G-Sepharose gouf derbäi an IPe goufen op d'mannst eng aner 4 h gemëscht. IPe goufe pelletséiert andeems se beim 3000 × gesponnen hunn g fir 3 – 5 min bei 4 ° C, dräimol mat 0.5 ml kale Einfache RIPA gewascht an zwee Mol mat kale PBS mat 0.1% Tween 20. IPs goufen dann an 0.5 ml kale PBS resuspendéiert, transferéiert, an engem neie Rouer gepellelt, an immunoprecipitéiert Proteine goufen dunn mat der Zousatz vun 15 – 25 μl vum 2 × eluéiert vum Laemmli Protein Probe Puffer. Dësen IP Protokoll huet zu der spezifescher an effektiver Ausfällung vu quasi all ΔFosB am Lysat gefouert. Déi immunoprecipitéiert Proteine goufen op SDS-PAGE ënnerworf andeems d'ganz IP op engem 12.5% Tris-HCl Kriteriumgel (Bio-Rad, Hercules, CA) gelueden gouf, an dann op PVDF oder Nitrocellulose transferéiert. Nom Transfert gouf d'Membran loftgedrockt an 32P- an 35S-radiolabeléiert Proteinbands goufen duerch Autoradiografie mat Kodak (Rochester, NY) autoradiografesche Film observéiert, wéi och duerch Phosphorimaging mat Hëllef vun engem Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Total (onphosphorylatéiert an phosphorylatéiert) ΔFosB an Zellelysaten oder Gehirhomogenaten gouf duerch immunoblotting vun entweder en immunoprecipitéierte Protein festgestallt (andeems déi selwescht Membran benotzt gëtt fir 32P-Label Protein), oder vu gläiche Quantitéiten u Lysat / Homogenat Protein ënnergeuerdnet SDS-PAGE an op PVDF oder Nitrocellulose transferéiert. D'Membran gouf als éischt blockéiert andeems se mat 1% (w / v) nonfat trockene Mëllech (Bio-Rad) zu PBS incubéiert mat 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) fir 1 h bei 25 ° C. D'Membran gouf dunn iwwer Nuecht bei 4 ° C immunoblot mat eisem eegene Kanéngchen anti-FosB polyklonalen Antikörper entsteet géint Aminosaieren 1 – 16 vu FosB / ΔFosB (benotzt beim 1: 10,000). No der primärer Inkubatioun goufe Membranen véier Mol fir 5 min mat Blockéierbuffer gewascht, an duerno bei 25 ° C fir ∼1 h mat engem Geess Anti-Kanéngchen IgG konjugéiert an Päerdskierperperoxidase (benotzt bei 1: 5000 am Blockéierbuffer, vu Vector Laboratoiren, Burlingame, CA). Membranen goufen dann dräimol fir 10 min mat Blockéierpuffer gewascht an eng Kéier fir 5 min mat PBS. Total ΔFosB Proteinbands goufen op Kodak MR Film visualiséiert duerch verstäerkte Chemilumineszenz (Pierce) an / oder duerch Detektioun vu Fluoreszenz mat der ECL-Plus Reagenz (Amersham Biosciences) an dem Storm PhosphorImager.
Overexpressioun a Puréierung vu rekombinant ΔFosB aus Insektzellen.
ΔFosB gouf an Sf9 Insektzellen als N terminus hexa-His-tagéierte Protein (N-His (6) ΔFosB) iwwer d'Benotzung vum Bac-to-Bac baculovirus Ausdrockssystem (Invitrogen) gefollegt an no den Instruktioune vum Hiersteller. Kuerz, den ΔFosB cDNA (Reschter 2 – 237) virdru vum Affinitéit N-terminaler Tag MGHHHHHHAG gouf am pFASTBacTM1 Vektor subklonéiert, dee benotzt gouf fir rekombinant Baculovirus ze generéieren. Sf9 Zellen goufen mam rekombinant Virus infizéiert, an N-His (6) ΔFosB gouf aus Zellelysate duerch verschidde chromatografesch Schrëtt abegraff mat Affinitéitschromatographie mat Hëllef vun enger Néckelkolonn (Qiagen, Valencia, CA), anion Austausch mat enger Mono-Q Kolonn (Amersham) Biosciences), a Gréisst Ausgrenzung mat Hëllef vun enger Gel-Filtratiouns Kolonn (Amersham Biosciences).
In vitro Phosphorylatioun Studien.
In vitro Phosphorylatiounsreaktiounen fir Zäitcours an der Stoichiometrie Analyse goufen an engem Volume vun 30 μl mat 10 μm Substrat (N-His (6) ΔFosB oder engem positiven Kontrollsubstrat), 250 μm ATP, an 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, de Puffer vum Kinase Hiersteller geliwwert, an ee vun de folgende Kinasen: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) oder p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Zäitcoursenreaktiounen goufen duerch d'Entfernung vun 5 μl Aliquots aus der Reaktiounsléisung op den designéierte Zäitpunkter duerchgefouert an e gläiche Volumen vum 4 × erofgesat Laemmli Protein Probe Puffer. Michaelis-Menten kinetesch Parameter fir d'CK2 Reaktioun goufen ënner empiresch definéiert linear Steigerungsbedingunge bestëmmt. Dës Reaktiounen goufen fir 15 min an engem Volume vun 10 μl enthale mat 2 ng / μl Enzym, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, an N-His (6) ΔFosB Konzentratioune rangéiert vun 2.5 – 30 μm. All Reaktiounen goufen op 30 ° C an engem Waasserbad ausgefouert. Nom SDS-PAGE a staining vum Gel mat Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), gouf de Gel gedréchent, an 32P-Phosphat Inkorporatioun gouf duerch Phosphorimaging Analyse bewäert (kuckt hei ënnendrënner, Datekwantifizéierung, Berechnungen, a Statistiken).
Zweedimensional Phosphopeptid Kaart an Phosphoamino Sauer Analyse.
Béid vun dësen Analysen goufen ausgefouert wéi beschriwwen Ploegh an Dunn (2000)An. Kuerz, trocken Gel Fragmenter enthalen 32P-Label ΔFosB (entweder vun kënschtlech Reaktiounen oder vun Immunoprecipitaten vu metabolesch markéierte Zellen), goufen ausgeschnidden, rehydréiert, gewascht, a ënnergeuerdnet Tryptik Verdauung. De Supernatant enthale mat den tryptesche Verdauungsprodukter gouf lyophiliséiert an de Lyophilat huet e puer Mol gewascht a resuspendéiert an 10 μl Elektrophorese Puffer, pH 1.9. Probe (3 μl) gouf op enger Cellulose Dënnschichtchromatographie (TLC) Plack (Analtech, Newark, DE) gespaut an an enger Dimensioun duerch Elektrophorese getrennt an déi aner Dimensioun duerch opsteigend TLC. Déi resultéierend Phosphopeptid Kaarten goufen duerch Autoradiographie a Phosphorimaging visualiséiert. Fir Phosphoamino sauer Analyse gouf 2 μl vun den tryptesche Verdauungen, déi an der Elektroforesis-Puffer gesuspend waren, weider duerch HCl Hydrolyse bei 105 ° C fir 25 min an 3 m HCl ënner enger N gespalt2 Atmosphär. D'Reaktioun gouf duerch eng sechsfäeg Verdünnung a Waasser gestoppt, an d'Mëschung gouf lyophiliséiert. De Lyophilat gouf an 5 μl vun der Elektrophorese Puffer, pH 1.9, resuspendéiert an op eng Cellulose TLC Platte zesumme mat Phospho-Ser, -Thr, an -Tyr Standards gespuert. Elektrophoresis gouf iwwer d'Halschent vun der Längt vun der TLC Plack duerch Elektrophorese Puffer, pH 1.9, gemaach an dunn ass d'Plack an de pH 3.5 Puffer iwwerdroe ginn, an Elektrophorese gouf bis ofgeschloss. D'phosphoamino sauer Normen goufe visualiséiert andeems d'TLC Platte mat enger 1% (v / v) Ninhydrin Léisung an Aceton sprayen, 32P-Label Aminosaier Echantillon goufen duerch Autoradiographie a Phosphorimaging visualiséiert.
siRNA-induzéiert CK2α ausgeschloen.
Mir hunn eng RNA-Interferenzmethod benotzt fir selektiv d'Niveauen vun CK2 ze schloen (Di Maira et al., 2005). PC12 Zellen goufen op collagen I-Beschichtete sechs-Well Placke gesaat fir ∼70 – 80% Duerchmusterung den nächsten Dag ze erreechen, wa se transient transfektéiert goufen mat 20 nm (Schlusskonzentratioun) vun entweder netargeting siRNA oder siRNA Richtung mRNA vun der katalytescher α Ënnerunitéit vum Rat CK2, andeems 5 μl vum Transfektiounsmëttel SilentFectin (Bio-Rad) benotzt a folgend d'Instruktioune vum Hiersteller. Ongeféier 24 h méi spéit goufen Zellen transient transfected mat ΔFosB Plasmid, wéi hei uewen uginn. Ongeféier 24 h méi spéit (∼48 h no siRNA Transfektioun), goufen Zellen zu entweder ofginn 32P metaboleschen Etiketten oder Puls-Chase Analyse wéi uewen beschriwwen. 2'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU5 ", 3'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU5", 3'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU5 ", 3'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU5" (Dharmacon, sech auswiesselen, CO): de folgende véier CK3α siRNAs sech mat ähnleche Resultater benotzt. Als negativ Kontroll hu mir benotzt Silencer negativ Kontroll #3 siRNA vun Ambion (Austin, TX). Den Ausmooss vum CK2 Knockdown gouf duerch Immunblotting iwwerwaacht andeems en Anti-CK2 Polyklonal Antikörper (Katalog # 06-873 vun Upstate) iwwer Nuecht op enger 1: 1000 Verdünnung benotzt gouf. ß-Tubulin gouf als Luedkontrolle benotzt an huet mat engem monoklonalen Antikörper (Katalog # 05-661 vun Upstate) iwwer Nuecht bei enger 1: 20,000 Verdünnung festgestallt.
Site-geréiert Mutagenese.
Mutatioun vu Ser27 zu Ala oder zu Asp gouf duerch e Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) gemaach an no den Instruktioune vum Hiersteller. Fir d'Ser27 Mutatiounen an der Maus ΔFosB Protein anzeféieren, goufen déi folgend Mutagenese Primer benotzt. Ser27 zu Ala: (Réckgang Primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 zu Asp (Forward Primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Déi mutéiert Basen si fett, an de Ser27 Codon ass kursiv geschriwwen.
Bioinformatik.
Potenziell Phosphorylatiounsplazen a Kinasen fir ΔFosB goufen gesicht andeems d'Maus Protein Sequenz op spezialiséiert Datenbanken ofgëtt ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), an NetPhosK (Blom et al., 2004).
Donnéeën Quantification, Berechnungen, a Statistiken.
De Betrag vu Protein, deen an der PVDF oder der Nitrocellulosemembran präsent war, gouf mat enger Storm PhosphorImager an der Begleedung ImageQuant Software (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) quantifizéiert. An der Zellkultur a Gehirn Slice Phosphorylatiounstudien hunn d'Wäerter, déi fir de 32P-Label Protein goufen dann duerch d'Wäerter, déi fir gesamt ΔFosB kritt goufen, opgedeelt an als Verhältnis ausgedréckt. An kënschtlech Phosphorylatiounstudien, de Betrag vun 32P-Label ΔFosB pro mol vun ΔFosB (stoichiometry) war berechent wéi virdru beschriwwen (Sahin et al., 2004). All Miessunge goufen am Linearity Beräich vun der benotzt Instrument geholl. Kinetesch Parameter goufe mat dem Michaelis-Menten Modell berechent, wiem V = VMax[S] / ([S]+KM) an VMax = k2[EGanzen]. D'Hallefzäit (t1/2) vun ΔFosB a FosB goufen aus de Puls-Chase Plots geschätzt (andeems Dir déi netlinear Regressioun benotzt, déi am beschten d'Datapunkte gepasst huet) an entsprécht der Zäit zu där d'Quantitéit vum restleche Protein 50% vum Original ass. An all Zuelen sinn d'Resultater gewisen representativ vun op d'mannst zwee bis dräi onofhängeg Experimenter. An all Grafike sinn d'Donnéeën ugewisen Duerchschnëtter ± SEMs (3 ≤ n ≤16). D'statistesch Bedeitung vun den Differenzen gouf mat Hëllef vun engem ongespaartte bewäert t testen, korrigéiert fir multiple Vergläicher, an d'Asterisken weisen p ≤ 0.05.
Resultater
ΔFosB ass en ongewéinlech stabilen Transkriptiounsfaktor
Och wa mir virdru spekuléiert hunn datt ΔFosB e relativ stabilen Transkriptiounsfaktor ass (Nestler et al., 2001), eng direkt Analyse vum Ëmsazsprofil vum Protein ass bis elo net ausgefouert ginn. Fir dës Fro unzegoen, hu mir Puls-Chase-Experimenter mat PC12 Zellen gemaach, déi extensiv als neuronähnlech Zellline benotzt goufen, an där osFosB transient ausgedréckt war iwwer Infektioun mat engem rekombinantem Herpes Simplex Virus (HSV-ΔFosB). Nei synthetiséiert Proteine goufen metabolesch matgezeechent 35S-Met / Cys, an den Degradatiounsmuster vun 35S-Label ΔFosB (35S-ΔFosB) gouf iwwerwaacht andeems se immunoprecipitéiert goufen vun Zellelysaten, déi op verschiddene Zäitpunkten no der Entfernung vun den radiomärzten Aminosaier kritt goufen. Analyse vun den Immunoprecipitaten duerch SDS-PAGE an Autoradiografie huet gewisen datt d'Hallefzäit vun ΔFosB an PC12 Zellen ∼10 h ass (Figebam. 1). Dës Befindunge weisen datt d'Hallefzäit vun ΔFosB méi héich ass wéi déi vun de meescht induzéierbare Transkriptiounsfaktoren (kuck Diskussioun), inklusiv volllängt FosB, deenen hir Hallefdauer an der Zellkultur gemellt gouf ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Ausserdeem ass et ze bemierken datt d'Degradatioun vun ΔFosB net en éischten-Grad exponentielle Zerfallkurve passt, awer éischter et ass zweiwelhaft, ugefaang mat engem méi luesen Degradatiounsgrad. Dëst léisst un d'Existenz vu méi wéi eng ΔFosB Spezies an / oder méi wéi eng Degradatiounswee suggeréieren.
Méi grouss Versioun:
Figure 1.
ΔFosB ass en ongewéinlech stabilen Transkriptiounsfaktor. D'Hallefzäit vum ΔFosB ass ∼10 h an der Zellkultur. ΔFosB gouf a PC12 Zellen ausgedréckt duerch entweder Infektioun mat HSV-ΔFosB oder Iwwergangs Transfektioun mat ΔFosB-enthale Plasmid, an d'Zellen goufen e Puls-Chase Experimenter ënnerworf wéi an Materialien a Methoden beschriwwen. Äquivalent Resultater goufen onofhängeg vun der Method benotzt fir exFosB z'expresséieren. D'Figur weist den Zäitcours (a representativen Autoradiogramm) vun der ΔFosB Degradatioun. D'Donnéeën geplot sinn den Duerchschnëtt ± SEM vun op d'mannst 15 eenzel Datepunkte kritt aus op d'mannst fënnef onofhängeg Experimenter. Zum Verglach ass d'gemellt Hallefdauer vu Volllängt FosB gezeechent.
ΔFosB ass e Phosphoprotein am Gehir
Mir hunn hypothese datt posttranslational Modifikatioun vun ΔFosB zu senger scheinbarer Stabilitéit bäidroe kann. Well Phosphorylatioun gouf gewisen datt d'Aktivitéit vun Transkriptiounsfaktoren op ville Weeër moduléiert, och hir Stabilitéit (fir Iwwerpréiwung, kuckt Desterro et al., 2000; Whitmarsh an Davis, 2000), hu mir ënnersicht ob ΔFosB e Phosphoprotein ass. Zu dësem Zweck gouf ΔFosB Ausdrock a Ratten Gehir induzéiert mat chronescher ECS, eng Behandlung bekannt fir héich Niveaue vun ΔFosB ze induzéieren, besonnesch an der frontaler Cortex (Hope et al., 1994a). Een Dag no der leschter ECS Behandlung, wann ΔFosB Niveaue héich bleiwen, goufen dënn frontal cortikal Schnëtt virbereet a metabolesch mam Label mat 32P-Orthophosphat. Eng parallel Satz geschnidden gouf net radiolabeléiert, an dës goufe benotzt fir total ΔFosB Niveauen z'entdecken. Nom Immunoprecipitatioun mat engem spezifeschen Anti-FosB / ΔFosB Antikörper an der Trennung vun den immunoprecipitéierte Proteinen duerch SDS-PAGE, phosphoryléiert 32P-Label ΔFosB gouf duerch Autoradiographie festgestallt, wärend total ΔFosB duerch Immunblotting festgestallt gouf. Dës Analyse huet gezeechent datt ΔFosB am Gehir phosphoryléiert gëtt, wéi aus enger spezifescher Beweislechkeet nogewise gëtt 32P-Labelte Band vun ∼35 kDa präsent an de chronesch behandelte Gehirersampelen, awer ass quasi net detektéierbar an de scham behandelte Kontrollen (Figebam. 2A). Dëst ass konsequent mat der Tatsaach, datt an der Verontreiung vu chronescher Stimulatioun d'Basisniveauen vun ΔFosB ganz niddereg sinn. D'Besonderheet vun der Immunopfällungsreaktioun gëtt illustréiert duerch de Mangel u Signal am netimmunen IgG Nidderschlag.
Méi grouss Versioun:
Figure 2.
ΔFosB ass e Phosphoprotein am Gehir. AΔFosB ass a Gehir fosforyléiert. Endogen ΔFosB gouf a Ratengehir duerch chronesch ECS Behandlung induzéiert wéi an Materialien a Methoden beschriwwen. Frontal cortikal Scheiwen goufen metabolically mat Label mat 32PH3PO4 fir e puer Stonnen. No Homogeniséierung vun de Stécker gouf ΔFosB immunoprecipitéiert, a phosphorylatéiert ΔFosB (32P-ΔFosB) gouf duerch Autoradiografie (Top Panel) festgestallt. Total ΔFosB an nonradioactive immunoprecipitates war vun immunoblotting (ënnen Panel) festgestallt. Als negativ Kontrollen gëtt d'Immunoprecipitat vun engem verschmutzten Déier an nonimmun IgG gewisen. B, Kandidatphosforylatiounsplazen a Kinasen mat entspriechend Prognostikscorë fir d'Maus ΔFosB Protein Sequenz goufen duerch bioinformatesch Analyse kritt. D'Kandidateplaze mat de méi héije Cepheidsscorë ginn an der Proteinsequenz beliicht an an der Tabell opgezielt. Den DNA-bindende (Basis) Domän an de Leucin Zipper si fett an der Protein Sequenz. C, D, ΔFosB Phosphorylatioun gëtt duerch de Ser / Thr Phosphatase-Inhibitor OA erhéicht. C, 32P-ΔFosB Niveauen an Immunoprecipitater vu frontal cortikale Scheiwen, déi an der Verontreiung (Ctr) oder Präsenz vun 100 ng / ml OA (Grafik an Top Panel) bezeechent goufen, goufen duerch Autoradiographie festgestallt. Den ënneschten Panel weist total ΔFosB festgestallt an Immunoprecipitaten aus ongeschriwwene Scheiwen duerch Immunblotting. D, PC12 Zellen goufe mat HSV-ΔFosB oder HSV-LacZ (Vektor) infizéiert a metabolesch mam Label 32PH3PO4 an der Fehlen (Ctr) oder Präsenz vun 100 ng / ml OA. 32P-ΔFosB Niveauen an Immunoprecipitaten goufen duerch Autoradiographie festgestallt (Grafik, Top Panel). Déi ënnescht Panel weist total ΔFosB an Zelllysate festgestallt duerch Immunblotting.
Als een éischte Schrëtt fir ze erkläre wéi eng Kinase (en) a Site (en) an der ΔFosB Phosphorylatioun involvéiert sinn, hunn mir seng Aminosauer Sequenz verschidde bioinformatesch Analysë ënnerworf. Dëst huet gewisen datt, obwuel ΔFosB keng Tyr Phosphorylatiounskandidateplazen enthält, awer e puer Ser / Thr Kinase Konsenszäite enthält, dorënner dräi CaMKII Site, dräi CK2 Site, an zwee PKC Site mat ganz héije Phosphorylatioun Prognosen Scoren (Figebam. 2B). Wann, wéi virausgesot duerch Bioinformatik, ΔFosB nëmmen phosphoréiert gëtt op Ser oder Thr Reschter, da soll seng Phosphorylatioun bedeitend moduléiert ginn duerch d'Aktivitéit vu Ser / Thr Phosphatasen. Fir dës Hypothese ze testen, hu mir frontal cortikal Scheiwen matgezeechent 32P-Orthophosphat a Präsenz oder Fehlen vun OA, e Ser / Thr Proteinphosphatase-Inhibitor. Wéi an Figure 2C, OA verursaacht eng grouss (∼2.5-flach) Erhéijung an 32P-ΔFosB. Et huet och eng kleng Steigerung vun den gesamt ΔFosB Niveauen verursaacht, wat konsequent mat fréiere Berichter ass, déi carcinogen Effekter vun OA mat senger Fähegkeet verknëppelt fir e puer direkt fréi Genen ze induzéieren dorënner Fos Proteinen (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). D'Netzresultat ass eng bedeitend Gesamtstäerkung (∼60%) a phosphorylatéiert ΔFosB Niveauen.
Mir hunn dunn ënnersicht ob PC12 Zellen, déi méi empfänglech sinn fir experimentell Manipulatioun, ΔFosB e Phosphorylatiounsmuster huet ähnlech wéi dat am Gehir gesinn. Mir ausgedréckt ΔFosB an PC12 Zellen iwwer Infektioun mat HSV-ΔFosB a metabolesch d'Zellen mat 32P-Orthophosphat an der Präsenz oder Fehlen vun OA. Déi erfollegräich Ausdrock an Immunoprecipitatioun vum Protein aus HSV-ΔFosB-infizéiert Zellen gëtt vun der Präsenz souwuel an der Immunblot gewisen (Figebam. 2D, ënnen Panel) an den Autoradiograf (Top Panel) vun enger ∼35 kDa Band, fehlt an de vectorinfizéiert Zellen. Wéi am Gehir observéiert, verursaacht OA eng kleng Erhéijung vun den gesamt ΔFosB Niveauen awer e vill méi héich (ongeféier zweemol) Erhéijung vun 32P-ΔFosB, wat zu enger däitlecher (∼50%) Nettoerhéigung vun der ΔFosB Phosphorylatioun resultéiert. Weider, konsequent mat de bioinformatesche Prognosen, huet d'Behandlung vu PC12 Zellen mat engem Tyr Phosphatase Inhibitor net zu wesentlechen Ännerungen an 32P-ΔFosB Niveauen (Donnéeën net gewise). Zesummen hunn dës Befindungen nogewisen datt ΔFosB phosphoréiert gëtt op Ser an / oder Thr Reschter am Gehir an a PC12 Zellen a bestätegt dat lescht als e gudden Zellkultur System an deem d'Fosforylatioun an d'Degradatiounsprofiler vun ΔFosB weider studéiere kënnen.
CK2 awer net PKC oder CaMKII Phosphorylaten ΔFosB kënschtlech
Wéi uewen beschriwwen, huet d'Analyse vun ΔFosB Aminosaier Sequenz héich Prediktiounsscorë fir CK2, PKC, a CaMKII Phosphorylatiounsplazen opgedeckt. Fir ze bestëmmen wéi eng vun dësen Kinasen Phosphorylat ateFosB ka féieren, hu mir eng Serie gemaach kënschtlech phosphorylationsreaktiounen mat purifizéiertem kinasen a purifizéiert rekombinant ΔFosB. Wéi an Figure 3A, vun den dräi Kandidatekinasen, nëmmen CK2 phosphorylatéiert ΔFosB op eng wesentlech Manéier. Ausserdeem goufen e puer aner Kinasen getest (z. B. GSK3 a p70S6K) awer hunn net signifikant phosphorylatéiert ΔFosB (Donnéeën net gewisen). Zousätzlech Charakteriséierung vun der CK2 Reaktioun duerch Zäitkursanalyse huet gewisen datt dës Kinase d'Korporatioun vun ∼0.5 Mol Phosphat pro Mol vun ΔFosB katalyséiere kann.Figebam. 3B). De Fakt datt CK2 kann phosphorylate ΔFosB kënschtlech op eng bedeitend Stoichiometrie (∼50%) suggeréiert fir eng physiologesch relevant Reaktioun. Mir hunn dunn d'Kinetik vun dëser Reaktioun studéiert andeems CK2 an der Präsenz vun ëmmer méi héije Quantitéiten u gereinegt ΔFosB incubéiert, a mir hu festgestallt datt CK2 Phosphorylaten ΔFosB mat engem Vmax vun 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 vum Enzym, a KM vum 18.4 μm, an a kcat vun 0.2 / s (Figebam. 3C). D'Wäerter, déi fir dës kinetesch Parameteren kritt goufen, ënnerstëtzen weider déi physiologesch Relevanz vun dëser Reaktioun. Zum Beispill, de KM vun CK2 fir DARPP32, ee vu senge bescht bekannte Substrater, ass 3.4 μm, an de kcat ass ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); der KM fir ATP rangéiert vun ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), an dat fir Kasein rangéiert vun ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Zesummen weisen dës Donnéeën datt ΔFosB e bona fide Substrat fir CK2 ass kënschtlech.
Méi grouss Versioun:
Figure 3.
CK2 awer net PKC oder CaMKII Phosphorylaten ΔFosB kënschtlechAn. Den Autoradiograf (Uewerpanel) weist d'phosphorylatéiert Produkt, an de Coomassie-flekéierte Gel (ënnen Panel) weist total ΔFosB präsent an der Reaktioun. A, Purifizéiert rekombinant ΔFosB gouf ënnerworf kënschtlech Phosphorylatioun vu verschiddene Kandidatekinasen (vun deenen der dräi ugewise ginn). B, Zäitcours an stoichiometresch Analysen weisen datt CK2 Phosphorylat ΔFosB kann kënschtlech mat enger stoichiometrie vun ∼50%. C, Kinetesch Analyse vun der CK2 Reaktioun huet gewisen datt ΔFosB e Bona fide ass kënschtlech Substrat. D'Linnearizéierung vun der Reaktioun gëtt an enger duebeler Reziprokplott gewisen (ënnen), awer déi kinetesch Parameter goufen ofgeleet aus der Michaelis-Menten Kromme (uewen).
CK2 moduléiert d'Phosphorylatioun a Stabilitéit vun ΔFosB a intakt Zellen
Fir déi physiologesch Relevanz vu CK2-mediéiert Phosphorylatioun vun ΔFosB ze bewäerten, hu mir vergläichend Phosphopeptid Kartéierung mat Hëllef kënschtlech phosphorylatéiert an PC12-Zell-phosphorylatéiert ΔFosB. Nom SDS-PAGE a Geleluering vun 32P-ΔFosB (vum kënschtlech Reaktiounen oder aus der Immunopfällung vu 32P-Label Zellen), gouf de Protein mat Trypsin verdaut, an déi resultéierend Phosphopeptide goufen zu zweedimensional Trennung ënnerworf. Dës Analyse huet gewisen datt d'Haaptphosphopeptid aus der CK2 Reaktioun mat engem vun zwee groussen Phosphopeptiden aus ΔFosB an PC12 Zellen (Figebam. 4A), wärend d'Phosphopeptiden déi aus der PKC oder CaMKII (Donnéeën net gewisen) Reaktioun gemaach hunn. Et war eng zweet ΔFosB Phosphopeptid präsent op der Kaart aus PC12 Zellen, awer wéinst der Onméiglechkeet vu jidderengem Kinasen hu mir getest en ähnlecht Phosphopeptid ze generéieren kënschtlech, mir wëssen de Moment net ob dëst zweet Phosphopeptid e Phosphorylatiouns Site enthält anescht wéi dat anert Phosphopeptid oder ob et en ausdrockent tryptescht Peptid enthält mat deem selwechte Phosforylatiounsplaz.
Méi grouss Versioun:
Figure 4.
CK2 moduléiert d'Phosphorylatioun a Stabilitéit vun ΔFosB a intakt Zellen. A, CK2 awer net PKC schéngt ΔFosB an Zellen ze phosphoryléieren. Zweedimensional Phosphopeptid Kaarten vun ΔFosB phosphorylated vu CK2 oder PKC kënschtlech oder duerch intakt PC12 Zellen. D'Pfeile weisen d'Komigratioun vum CK2-phosphorylerte Peptid awer net de PKC-phosphorylerte mat engem vun den ΔFosB Phosphopeptide kritt aus PC12 Zellen. B, ΔFosB Phosphorylatioun an PC12 Zellen gëtt erhéicht duerch d'Behandlung vun Zellen mat der potenter CK2 Aktivator Spermine (SP) a gëtt erofgeholl mat der Behandlung mam CK2 Inhibitor DRB. Am Géigesaz, war ΔFosB Phosphorylatioun an PC12 Zellen net vun der Behandlung betraff mat entweder e PKC Aktivator (PMA) oder mam PKC-spezifeschen Inhibitor Calphostin-C (Calph). E representativen Autoradiogramm (Top Panel) an Immunblot (Bottom Panel) ginn ugewisen. C – F, Effekt vun der CK2 Aktivitéit op ΔFosB Stabilitéit. D'Zuele weisen den Zäitcours (a representativen Autoradiogramm) vun der ΔFosB Degradatioun. PC12 Zellen transient ausdrécklech ΔFosB goufe mat Impulsreferatsexperimenter ënnerworf an der Fehlen oder Präsenz vum CK2 Inhibitor DRB (C), de CK2 Aktivator Spermine (D), oder de breede Spektrum Kinaseinhibitor H-8 (E), wat benotzt gouf fir d'nonspezifesch Effekter vum DRB ze kontrolléieren. F, Effekt vum ofkloppen vun der katalytescher Ënnerunit vu CK2 op ΔFosB Stabilitéit. PC12 Zellen goufe mat entweder engem netargeting siRNA (Ctr) oder siRNA geziilte Ratten CK2α an 24 h méi spéit transfizéiert mat engem ΔFosB Plasmid. Déi iewescht Panel weist immunoblots vu ganz Zell-Lysate vum Effekt vum CK2 siRNA op CK2 an ΔFosB Protein Niveauen. Déi entspriechend Immunblot fir ß-Tubulin gëtt als Luedkontroll gewisen.
Fir d'physiologesch Relevanz vun CK2 als eng ΔFosB Kinase weiderzeginn, hu mir ΔFosB-expressiver PC12 Zellen mat zwee Medikamenter behandelt, déi CK2 Aktivitéit moduléieren. Wéi an Figure 4B, ΔFosB Phosphorylatioun gouf duerch d'Behandlung vu PC12 Zellen mam Zell-permeablen CK2 Inhibitor DRB erofgehollMeggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), a verstäerkt duerch d'Behandlung mat der Polyamin Spermien, bekannt als e staarken CK2 Aktivator (Cochet a Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Am Géigesaz, ass d'Behandlung vu PC12 Zellen mam PKC Inhibitor Calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) oder de PKC Aktivator PMA (Schmidt an Hecker, 1975; Beh et al., 1989) hunn keng bedeitend Ännerunge vun der phosphFosB Phosphorylatioun gemaach. Am Fall vun PMA ass déi liicht (an net bedeitend) Erhéijung an 32P-ΔFosB konnt berechent ginn duerch eng Erhéijung vun den gesamt ΔFosB Niveauen, déi vun dësem Medikament verursaacht goufen; tatsächlech gouf et bericht datt phorbol Esteren Ausdrock vun e puer Fos-Famillproteine induzéieren, dorënner FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Ausserdeem, Behandlung vun Zellen mat dem spezifeschen Zell-permeablen CaMKII Inhibitor m-AIP (Ishida a Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) huet och net zu enger Ofsenkung vun ΔFosB Phosphorylatioun (Donnéeën net gewisen). Zesummen sinn dës Resultater konsequent mat eisem kënschtlech fannen a weisen datt intakt Zellen ΔFosB méiglecherweis phosphoryléiert gëtt vu CK2 awer net PKC oder CaMKII. De Fakt datt CK2 Hemmung net komplett verhënnert preventFosB Phosphorylatioun weist op d'Existenz vu zousätzlech Phosphorylatiounsplazen am Protein.
Mir hunn duerno iwwerpréift ob CK2 eng Roll am Ëmsaz vun ΔFosB spillt an domat a senger Stabilitéit. Zu dësem Zweck hu mir Puls-Chase Experimenter duerchgefouert ΔFosB-ausdrécklech PC12 Zellen, déi mat entweder den CK2 Inhibitor oder den CK2 Aktivator benotzt goufen an der Phosphorylatiounstudie. Wéi an Figure 4C, d'Behandlung vun Zellen mam CK2-Inhibitor DRB hat e wesentlechen Effekt op den Ëmsaz Taux vun ΔFosB, bewisen duerch d'Verännerung vun der Form vu senger Degradatiounskurve, vu bifasesch bis op eng Kéim déi méi no ass wéi eng exponentiell Zerfall. Ëmgekéiert huet d'Präsenz vun der CK2 Aktivator Spermine e wesentleche Réckgang am Degradatiounsquote vun ΔFosB verursaacht, wat zu der Akkumulation vum Protein an den éischten Stonnen vum Chase gefouert huet (Figebam. 4D).
Wéi de Fall mat ville Kinase Aktivatoren an Inhibitoren, kann Spermien an DRB metabolesch Effekter ausserhalb vun der Modulatioun vun der CK2 Aktivitéit hunn. Tatsächlech gouf DRB gewisen fir den Transkriptiounsfaktor IIH (TFIIH) -assoziéierten Kinase ze inhibit (Yankulov et al., 1995), wat zu enger Inhibitioun vun der RNA Polymerase II-mediéiert Transkriptioun resultéiert. Well dësen Effekt denkbar kann d'Stabilitéit vun ΔFosB beaflossen, analyséiere mir den Effekt vum breede Spektrum Kinaseinhibitor H-8 (Hidaka a Kobayashi, 1992) op ΔFosB Ëmsaz bei enger Konzentratioun (200 μm) bekannt fir TFIIH-assoziéiert Kinase ze hemmen awer net CK2 (Yankulov et al., 1995). Wéi gesitt Figure 4E, Behandlung mat H-8 beaflosst den Ëmsaz Taux vun ΔFosB. Ähnlech Resultater goufe mat H-7 kritt, en anere breede Spektrum Kinase-Inhibitor, benotzt bei enger Konzentratioun, déi TFIIH-assoziéiert Kinase hemmt awer net CK2 (Donnéeën net gewisen). Dës Donnéeën ënnerstëtzen weider d'Interpretatioun datt d'Reduktioun vun der ΔFosB Stabilitéit verursaacht duerch DRB héchstwahrscheinlech zum Inhibitioun vu CK2 ass.
Fir d'Roll vum CK2 am ΔFosB Ëmsaz weider ze etabléieren, hu mir d'Konsequenze vum CK2 iwwer siRNA ofgeschloen. Mir hunn dës Experimenter mat PC12 Zellen gemaach, déi fir d'éischt mat Kontroll (net getargeting) siRNA transfected goufen oder eng siRNA, déi d'MRNA vun der katalytescher Ënnerunit vu Rott CK2 (CK2α) zielt an 24 h méi spéit mat ΔFosB transfizéiert. Wéi an Figure 4F, Transfektioun mat der CK2α siRNA effizient a speziell erofgeschloen CK2α Protein Niveauen ouni Afloss op ΔFosB Niveauen (Top Panel). Puls-Chase Analyse huet gewisen datt d'KK2 ofgeschloen huet eng bedeitend Erhéijung vun der ΔFosB Ëmsaz Taux wéi bewisen duerch déi méi séier Degradatioun vum Protein. D'Tatsaach datt d'Inhibitioun vun der CK2 Aktivitéit (ob via DRB Behandlung oder siRNA) den Ëmsaz vun ΔFosB erhéicht an d'Resultat vun der Verschwanne vun der luesen Tempo Komponent vun der bifasescher Kurve, wärend d'CK2 Aktivéierung de luesen Phase vun der Kurve verbessert, stellt staark Ënnerstëtzung fir d'Iddi datt CK2 eng Roll spillt bei der Reguléierung vun ΔFosB Stabilitéit.
CK2 Phosphorylaten ΔFosB op Ser27
Fir unzefänken de Site (n) op ΔFosB phosphorylated vun CK2 ze identifizéieren, hu mir Phospho-Aminosaier Analyse vun rekombinant ΔFosB phosphorylated vun CK2 kënschtlech a vun ΔFosB phosphoryléiert an PC12 Zellen. Dës Experimenter hunn opgedeckt datt a béide Fäll déi eenzeg Phospho-Aminosaier, déi festgestallt gouf, Phospho-Ser war (Figebam. 5A). Dës Fonnt, zesumme mat der stoichiometrie kritt fir de CK2 kënschtlech Phosphorylatiounsreaktioun (∼50%) (Figebam. 3B) an d'Präsenz vun enger eenzeger bedeitender Plaz op der CK2 Phosphopeptid Kaart (Figebam. 4A), proposéiert datt CK2 Phosphorylatioun vun ΔFosB méiglecherweis limitéiert ass op eng eenzeg serinesch Reschter. Dës Konklusioun ass konsequent mat der Analyse vum Phosphorylatiounskonsensus Site (Figebam. 2B), deen nëmmen ee Kandidat serine, dat heescht Ser27, fir CK2 virausgesot huet. Taxonomesch Analyse huet gewisen datt Ser27 héich duerch Evolutioun ënner Fos Familljemembere konservéiert ass (Figebam. 5B), suggeréiert datt et eng wichteg physiologesch Funktioun kann droen.
Méi grouss Versioun:
Figure 5.
CK2 Phosphorylaten ΔFosB op Ser27. A, Phosphoamino sauer Analyse vun CK2-phosphoryléiert (kënschtlech) an PC12 Zell-phosphoryléiert ΔFosB a weist datt, a béide Fäll, den Haaptreste phosphorylatéiert ass Serin. B, Cross-Spezies Analyse vu FosB / ΔFosB Aminosaier Sequenz huet héich Konservatioun vu Ser27 ënner Fos Familljemembere vu Mënsch zu Zebrafish (donkelen Highlight) verroden. Wéi och ëmmer, de sauer Rescht op der Positioun + 3, wat fir de CK2 Konsens Site néideg ass, gëtt net konservéiert (Liicht Highlight). C, HeLa Zellen goufe transfected mat entweder Wëldtyp ΔFosB (WT) oder ΔFosB mat enger Punktmutatioun fir Ersatz Ser27 mat Ala (S27A) ze ersetzen. Zellen goufen metabolically mam Label mat 32PH3PO4 a mat Gefier oder mat Spermien (SP) behandelt gi fir CK2 ze aktivéieren. E representativen Autoradiogramm (Top Panel) an Immunblot (ënnen Panel) vun den erzielten ΔFosB Immunoprecipitaten ginn gewisen. Den Immunoprecipitat vu mocken-transfekterten Zellen (Vektor) gëtt gewisen.
Fir ze bestëmmen ob Ser27 an ΔFosB phosphoryléiert gëtt, hu mir dëst Rescht zu Ala mutéiert, an d'Konsequenzen op de Phosphorylatiounsstatus vum Protein analyséiert. Zu dësem Zweck hu mir HeLa Zellen (déi mat méi héijer Effizienz transfizéiert kënne ginn) transient ausgedréckt entweder WT oder S27A mutant ΔFosB. Ongeféier 24 h no Transfektioun, goufen d'Zellen metabolesch matgezeechent 32P-Orthophosphat, a ganz Zell Lysate goufen ausgeschafft. Nom Immunoprecipitatioun an SDS-PAGE, 32P-ΔFosB gouf duerch Autoradiographie festgestallt an total ΔFosB duerch Immunblotting. Wéi an Figure 5C (ënnen Panel), ΔFosB gouf net an de vektortranfekteréierten Zellen festgestallt, wärend d'Zellen transfizéiert mat entweder WT oder S27A Mutant ΔFosB erfollegräich de Protein ausgedréckt. Mir hu fonnt datt d'S27A Mutatioun eng bedeitend (∼30%) Reduktioun verursaacht huet 32P-ΔFosB Niveauen (Figebam. 5C, Top Panel a Grafik), wat beweist datt a liewegen Zellen ΔFosB op Ser27 phosphoryléiert gëtt. An engem Effort fir festzestellen, ob an Zellen Ser27 tatsächlech phosphoryléiert vu CK2 ass, vergläicht mir d'Fäegkeet vun der CK2 Aktivator Spermine fir d'Phosphorylatioun vu WT a S27A ΔFosB ze moduléieren. Wéi mir virdru an PC12 Zellen observéiert haten (Figebam. 4B), d'Behandlung vun HeLa Zellen mat Spermien wesentlech erhéicht Phosphorylatioun vum WT Protein. D'Tatsaach datt dësen Effekt wesentlech vun der S27A Mutatioun erofgeholl gouf (Figebam. 5C) ënnerstëtzt d'Interpretatioun datt Ser27 an ΔFosB e physiologescht Substrat fir CK2 ass.
Phosphorylatioun vu Ser27 reguléiert d'Stabilitéit vun ΔFosB
Erëm etabléiert datt d'Stabilitéit vun ΔFosB ofgeholl gëtt wann CK2 hemmt a verstäerkt gëtt wann CK2 ageschalt ass (Figebam. 4), an datt CK2 Phosphorylaten ΔFosB op Ser27 (Figebam. 5), hu mir virausgesot datt d'Verhënnerung vu Phosphorylatioun vun dësem Site de Protein sollt destabiliséieren. Pulse-chase Experimenter duerchgefouert mat HeLa Zellen transient ausdrécklech entweder WT oder S27A Mutant ΔFosB huet gewisen datt, wéi virausgesot, d'S27A Mutatioun zu enger däitlecher Erhéijung vun der Degradatiounsquote vun ΔFosB gefouert huet, an eng concomitant Ofsenkung vun der Halbzäit vum Protein (Figebam. 6A). Mir hunn dunn ënnersicht ob dësen Regulatiounsmechanismus och an der méi neuronähnlecher PC12 Zellline optriede kënnt. Dës Experimenter weisen datt, wéi mir an HeLa Zellen observéiert hunn, d'S27A Punktmutatioun eng dramatesch Ofsenkung vun der Hallefdauer vun lifeFosB an PC12 Zellen verursaacht (vun ∼11 bis ∼4 h) (Figebam. 6B). De Fakt datt dës Destabiliséierung ähnlech wéi déi vun der CK2 Hemmung oder ausgeschloe verursaacht gëtt (Figebam. 4) bitt weider Ënnerstëtzung fir d'Iddi datt CK2-mediéiert Phosphorylatioun vu Ser27 d'Stabilitéit vun ΔFosB reguléiert. Zousätzlech Beweiser fir d'reguléierend Roll vun Ser27 Phosphorylatioun op ΔFosB Protein Ëmsaz gouf mat Hëllef vun enger phosphomimetescher Ser27 zu Asp Mutatioun (S27D) kritt. D'S27D Mutatioun gëtt als phosphomimetesch ugesinn, well se eng grouss negativ gelueden (Carboxyl) Grupp op Aminosaier 27 plazéiert an doduerch deelweis der Phosphorylatioun vu Ser27 mimifizéiert. Wéi an Figure 6C, huet d'S27D Mutatioun de Géigendeel Effekt vun der S27A Mutatioun verursaacht an huet e Protein wesentlech méi stabil wéi de WT Protein resultéiert. Ähnlech zum Effekt kritt nom CK2 Aktivéierung (Figebam. 4D), huet d'S27D Mutatioun zu der Akkumulation resultéiert an doduerch ΔFosB Niveauen an den éischten Stonnen vum Chase erhéicht.
Méi grouss Versioun:
Figure 6.
Phosphorylatioun vu Ser27 reguléiert d'Stabilitéit vun ΔFosB. A, C, Pulse-Chase Analyse, déi den Effekt vun Ser27 Phosphorylatioun op den Ëmsaz Taux vun ΔFosB weist. Den Degradatiounsprofil an de geschätzte Hallefliewen vun der Wëldtype ΔFosB (WT), de Ser27 zu Ala mutant (S27A), an de phosphomimetesche Ser27 zu Asp mutant (S27D) ginn ugewisen. Déi selwescht Befunde goufen an HeLa Zellen kritt (A) an PC12 Zellen (B, C).
Ser27 Phosphorylatioun stabiliséiert ΔFosB andeems hien seng proteasomal Degradatioun verhënnert
Fir unzefänken de Mechanismus ze eliminéieren, mat deem Phosphorylatioun vu Ser27 stabiliséiert ΔFosB, hu mir d'Fäegkeet vun de Proteasome-Inhibitoren MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) an Epoxomizin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) fir de Degradatiounsgrad vu WT a S27A Mutant ΔFosB ze moduléieren. Pulse-Chase Experimenter goufen duerch PC12 Zellen infizéiert mat engem rekombinanten HSV ausgedréckt entweder WT oder S27A ΔFosB a mat entweder DMSO oder mat engem vun den zwee Proteasome Inhibitoren behandelt. Dës Experimenter hunn opgedeckt datt obwuel den Degradatiounsgrad vum WT Protein relativ onsensibel ass fir d'Präsenz vun entweder vun den zwee Proteasome InhibitorenFigebam. 7A), dee vum S27A Mutant ass empfindlech fir dës Drogen (Figebam. 7B). Dëst weist datt am Géigesaz zum WT Protein de S27A Mutant en Zil vun der proteasomaler Degradatioun ass. Tatsächlech huet d'Behandlung vun Zellen mat entweder MG132 oder Epoxomicin den Effekt vun der S27A Mutatioun op d'Regradatiounsquote vun ΔFosB ganz ëmgedréit, beweist duerch eng Erhéijung vun der Hallefzäit vum S27A Mutant vun ∼4 op ∼9 h fir MG132 an op ∼ 12 h fir epoxomicin (Figebam. 7B). Zesummen hunn dës Befindungen uginn datt Phosphorylatioun vun ΔFosB op Ser27 de Protein vu proteasomale Degradatioun schützt an dofir onbedéngt fir hir ongewéinlech Stabilitéit ass.
Méi grouss Versioun:
Figure 7.
Phosphorylatioun vu Ser27 stabiliséiert ΔFosB andeems hien seng proteasomal Degradatioun verhënnert. A, B, Pulse-Chase Analyse mat HSV-infizéierte PC12 Zellen, déi den Degradatiounsprofil an de geschätzten Hallefdauer vun der Wëldtype ΔFosB weisen (A) oder S27A ΔFosB (B) an der Fehlen oder Präsenz vun entweder vun zwee Proteasome Inhibitoren [MG132 an Epoxomicin (Epoxo)]. Notéiert d'Tatsaach datt weder Medikamenter e wesentlechen Effekt op den Ëmsaz vu wildtyp ΔFosB huet, wärend d'Behandlung vun Zellen mat entweder Proteasominhibitor zu der Stabiliséierung vu S27A ΔFosB gefouert huet. C, E Modell fir d'Roll vun der Ser27 Phosphorylatioun an der Fäegkeet vun ΔFosB fir laangfristeg Gehireplastizitéit ze mediéieren. Eemol induzéiert ass en Deel vun ΔFosB a Gehir stabiliséiert duerch déi CK2-mediéiert Phosphorylatioun vu S27. Dëst resultéiert an hir Akkumulation, wat zu enger dauerhafter Ännerung am Genausdrock resultéiert. Dës stabil Verännerungen am Genausdrock bäidroe fir stabil Verhalensadaptatiounen. Ëmgekéiert resultéiert d'Defosforylatioun vu S27 duerch de Ser / Thr Phosphatases PP1 an / oder PP2A zu der Destabiliséierung vum Protein a senger Veraarbechtung duerch d'Proteasomalmaschinn.
Diskussioun
An der aktueller Etude weise mer datt ΔFosB eng Hallefdauer vun ∼10 h an der Zellkultur huet, wat et stabil mécht am Verglach mat FosB mat voll Längt an déi meescht aner induzéierbar Transkriptiounsfaktoren, deenen hir Hallefdauer an der Zellkultur esou kuerz kënne sinn sou e puer Minutten a selten méi wéi 3 h (Hann an Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts a Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Ausserdeem fanne mir datt ΔFosB am Gehir phosphoryléiert ass an datt hir Phosphorylatioun empfindlech ass fir d'PP1 / PP2A Inhibitor Okadainsäure. Eis Zellkulturstudien beweisen datt d'Stabilitéit vun ΔFosB duerch CK2 moduléiert gëtt, mat méi héijer CK2 Aktivitéit de Protein stabiliséiert. Schlussendlech hunn eis Resultater fonnt datt CK2 Phosphorylate ΔFosB op engem héich konservéierten N terminus serine (S27) beweise a beweisen datt Phosphorylatioun vu S27 den ΔFosB vu proteasomal Degradatioun schützt. Mir proposéieren dofir e Modell wouduerch Phosphorylatioun vun ΔFosB op S27 vum CK2 e kriteschen regulatoresche Mechanismus vum Ëmsaz vun ΔFosB assFigebam. 7C). Eng esou Phosphorylatiouns-mediéiert Stabiliséierung vun ΔFosB ass funktionell wichteg, well erhéicht Niveauen vun ΔFosB a besonnesch Gehirregiounen hu gewisen datt verschidden neuronal Genen direkt reguléieren an vivo a fir potenziell Verhalenseffekter an Déierenmodeller vu verschidden neuropsychiatresche Stéierungen auszeüben (kuckt Introduktioun).
Och wann Phosphorylatioun e séieren a reversibele Wee ass fir d'transkriptional Aktivitéit vu bestëmmte Transkriptiounsfaktoren ze regléieren, wéi CREB (cAMP Äntwert Element bindend Protein) (Bohmann, 1990), d'Modulatioun vun der Degradatioun vun Transkriptiounsfaktoren liwwert eng nach méi staark (manner liicht reversibel) Form vu Reguléierung (Desterro et al., 2000). Transkriptiounsfaktoren deenen hir funktionell Aktivitéit um Niveau vun hirer Degradatioun geregelt ass NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), an c-Fos (Ferrara et al., 2003), ënner anerem. A ville Fäll ass Phosphorylatioun e Schlësselregulator vun der Stabilitéit vun engem Transkriptiounsfaktor, wéi et fir c-Fos gewise gouf (Okazaki a Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-verbonne Antigen-1 (Fra-1) (Fläsch a Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), an p53 (Buschmann et al., 2001). Eis Studien addéieren also ΔFosB op dës Lëscht vun Transkriptiounsfaktoren deenen hir funktionell Aktivitéit duerch seng phosphorylatéiert ofhängeg Stabilitéit geregelt gëtt.
CK2 ass eng iwwerall an konstitutiv aktiv Ser / Thr Kinase déi> 300 virgeworf Substrate bis elo identifizéiert huet an a méi biologesche Prozesser implizéiert ass, inklusive Zell Doud an Iwwerliewe (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), cellulär Stressreaktiounen (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), an DNA Reparatur a Chromatin Remodeling (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Méi wéi en Drëttel vun de putative Substrate vu CK2 si Proteine bedeelegt an der Reguléierung vum Genexpressioun (Meggio a Pinna, 2003). Tatsächlech gouf CK2 gewisen wéi eng prominent nuklear Kinase (Krek et al., 1992) (fir ze kucken, kuckt Yu et al., 2001) an ze interagéieren mat de bZIP Beräicher vu verschiddenen Transkriptiounsfaktoren (Yamaguchi et al., 1998). CK2-mediéiert Phosphorylatioun gouf och gewisen fir d'Degradatioun ze moduléieren (entweder ze verbesseren oder ze reduzéieren) vu ville Proteinen, dorënner IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres a Pulido, 2001), Lënsen Connexin (Yin et al., 2000), Chromatin-assoziéierten Protein HMG1 (Wisniewski et al., 1999), a verschidde Transkriptiounsfaktoren wéi HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), an c-Myc (Channavajhala a Seldin, 2002). CK2 ass am Heefegsten am Gehir (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), a seng Aktivitéit gouf a ville Aspekter vun der Gehirfunktioun implizéiert, dorënner neuronal Iwwerliewe (Boehning et al., 2003), Differenzéierung (Nuthall et al., 2004), ionkanal Funktioun (Jones a Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), a laangfristeg Potenzéierung an neuronal Plastizitéit (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman a Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Trotz dësem wuessende Beweis fir d'Roll vum CK2 bei der Reguléierung vun der neuronaler Funktioun, ass wéineg bekannt iwwer wat seng Aktivitéit kontrolléiert. CK2 gëtt geduecht fir konstitutiv aktiv ze sinn, mat Reguléierung vu senger Fäegkeet fir spezifesch Substrater ze phosphoryléieren, déi meeschtens op Verännerungen a senger intrazellularer Lokaliséierung vertrauen (z. B. Cytosol vs Kär) (Ahmed an Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Dës Informatioun werft eng wichteg Fro betreffend wat Signaler noutwendeg sinn fir ΔFosB Akkumulation am Gehir no chronescher Stimulatioun ze induzéieren (Figebam. 7C). Eng Fuerderung ass widderholl Aktivéierung vun der fosB Gen an Induktioun vun ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Eis Donnéeën weisen datt CK2 Phosphorylatioun vun ΔFosB kritesch ass fir hir Stabilitéit, wat suggeréiert datt en zweet Signal fir déi laangfristeg Effekter vun ΔFosB op Genexpressioun néideg ass, nämlech e Signal dat d'Phosphorylatioun vum Protein duerch CK2 stimuléiert. Dëst kéint d'Aktivatioun vu CK2 mat engem onbekannte Mechanismus oder senger Translokatioun zum Kär involvéieren. Alternativ kann CK2 Phosphorylatioun vun ΔFosB konstitutiv sinn, sou datt als ΔFosB Protein als Äntwert op all Reiz iwwersat gëtt, en Deel dovun gëtt phosphoryléiert an doduerch stabiliséiert, sou datt mat wiederhuelende Stimulatioun et zu héijen Niveauen an de betraffene Neuronen accumuléiert gëtt.
Eis Resultater weisen datt CK2 an S27 wahrscheinlech net déi eenzeg Kinase an de Site verantwortlech fir ΔFosB Phosphorylatioun sinn, well weder Hemmung vun CK2 nach d'S27A Mutatioun fäeg war ΔFosB Phosphorylatioun komplett ze verhënneren. Duerch déiselwecht Token, de Fakt datt d'S27A Mutatioun zu enger 30% Reduktioun vu Phospho-ΔFosB resultéiert, argumentéiert datt S27 e wichtege Phosphorylatiounsplaz am Protein ass. Mir ënnersichen trotzdem aner putative Kinasen a Phosphorylatiounsplazen op ΔFosB. Schlussendlech wäert et wichteg sinn och d'Phosforylatioun vu S27 an all aner Phosphorylatiounsplazen an ΔFosB am Gehir ze analyséieren an vivo no verschiddenen Aarte vu chronescher Stimulatioun, zum Beispill duerch d'Benotzung vu Massespektrometrie oder fosfospezifesch Antikörper.
Wéi uewen erwähnt, ass S27 an ΔFosB héich duerch Evolutioun konservéiert an ënner anerem Fos Famill Proteinen. De Konsens Site fir CK2 ass awer net: wéi gewisen Figure 5B, nëmmen FosB / ΔFosB (an den Zebrafësch Xenolog), awer net c-Fos oder Fra-2, besëtzen eng sauer Rescht bei + 3, e Schlëssel determinant vun der CK2 Phosphorylatioun (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Also, de Mangel u CK2 Phosphorylatioun op S27 kann erkläre firwat aner Fos-Famillproteine net sou stabil sinn wéi ΔFosB. Dëst erkläert awer net firwat Volllängt FosB, deen deeselwechten CK2 Konsensite als ΔFosB huet, net ähnlech stabiliséiert ass. Mir wëssen net ob Volllängt FosB Phosphorylatéiert gëtt vu CK2 op dësem konservéierten Iwwerreschter. Déi eenzeg Rapporte vu FosB (Skinner et al., 1997) an c-Fos (Okazaki a Sagata, 1995; Chen et al., 1996) Phosphorylatioun beschreift Siten an der C-terminaler Regioun vun dësen Proteinen, wat an ΔFosB fehlt. Déi potenziell Phosphorylatioun vu Volllängt FosB an aner Fos-Famillproteine vu CK2 erfuerdert direkt Ënnersichung. Wéi och ëmmer, wann se phosphoryleréiert sinn, sinn déi aner Fos-Famillproteine bekannt datt se Motiver op hir C-Termini enthalen, déi d'Proteine fir eng schnell Degradatioun zielen (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Zum Beispill gouf gewisen datt eng Streck vun ∼21 Reschter am C-Uschloss vun all Fos-Famillproteine present sinn, awer fehlend an ΔFosB, funktionéiert als e destabiliséierend Domain fir c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Mir hu fonnt, datt obwuel dës Sequenz FosB an der Längt ähnlech destabiliséiert (Carle et al., 2004), ass de Fehlen vun dësem Domain an ΔFosB net voll fir seng Stabiliséierung. Ëmgedréit, d'Kombinatioun vun der Verontreiung vun dësem C terminus Domain an Ser27 Phosphorylatioun schéngt voll ze berechnen fir den ongeféier fënneffäegen Ënnerscheed an der Stabilitéit tëscht ΔFosB a FosB.
Och wann d'Degradatioun vu Fos Famillproteine komplex ass an net voll verstan ass, schéngt proteasomal Degradatioun déi wichtegst Bunn involvéiert ze sinn (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). D'Donnéeën déi hei virgestallt goufen, an deenen proteasomal Inhibitoren net méi den Taux vun der ΔFosB Degradatioun änneren, streiden datt, am Géigesaz zu anere Fos Famillproteine, ΔFosB den 26S Proteasome evitéiert, an dëst spillt eng zentral Roll a senger Stabiliséierung. Mir proposéieren dofir e Schema, wouduerch déi verstäerkte Stabilitéit vun ΔFosB der Kombinatioun vun zwee Haaptfaktoren zougeschriwwe gëtt: (1) d'Feele vun engem C-terminaler Destabiliséierungsdomän an (2) der Phosphorylatioun vu S27 vun CK2.
Zesummegefaasst, déi heiteg Etude gëtt mechanistesch Abléck iwwer firwat ΔFosB, e Produkt vum direkt fréiere Gen fosB, ass, anescht wéi all aner Fos Familljememberen, e relativ laangliewege Protein. Och wa aner Fos-Famillproteine geduecht ginn, awer séier awer transient Stimulatiouns-Transkriptiouns-Kupplung ze vermëttelen (Morgan an Curran, 1995), d'relativ Stabilitéit vun ΔFosB vermëttelt d'Fäegkeet fir méi laang dauerhafter transkriptiouns Ännerungen ze induzéieren, déi duerch chronesch Stimulatioun induzéiert ginn. Dëst ënnerstëtzt d'Vue datt ΔFosB als nohaltege molekulare Schalter am Gehir funktionnéiert, graduell akut Äntwerte a chronesch Adaptatioune konvertéieren. Identifikatioun vun der Ser27 Phosphorylatioun als en zentrale Mechanismus fir d'Stabilitéit vun ΔFosB mécht nei Weeër fir d'Entwécklung vu Mëttelen op fir d'Funktioun vun ΔFosB ze reguléieren an doduerch seng laangfristeg Effekter op neural a behuelen Plastizitéit ze moduléieren.
Noten
- Kritt November 21, 2005.
- Versioun huet de Februar 21, 2006 kritt.
- Akzeptéiert Abrëll 2, 2006.
- Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vun enger National Alliance fir Fuerschung iwwer Schizophrenia an Depressioun Young Enquêteur Award un PGU, engem National Institut fir Drogenmëssbrauch (NIDA) National Research Service Award un PGU, a Stipendien vum National Institute of Mental Health an NIDA zu EJN We merci dem Dr James Bibb fir seng Hëllef beim kënschtlech Phosphorylatiounsanalysen, den Dr Ming-Hu Han fir seng Hëllef mat der Virbereedung vu Gehinsschneiden, déi fir metabolesch Etikettéierung benotzt goufen, an den Dr Rachael Neve fir hir Hëllef mat der Verpackung vun de rekombinanten HSVs.
- Dem G. Rudenko seng aktuell Adress: Life Sciences Institute a Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korrespondenz soll un den Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070 adresséiert ginn. Email: [Email geschützt]
Referenze
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikatioun vun engem C-terminalen Tripeptidemotiv involvéiert an der Kontroll vun der rapider proteasomaler Degradatioun vun c-Fos prototoonkoprotein wärend der G (0) -S-S Phase Iwwergang. oncogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Multiple Degradatiounsweeër fir Fos Famill Proteinen. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mechanismus vun der intrazellulärer Reguléierung vun Proteinkinase CK2: Roll vun stimulus-mediated subnuclear Associatioun. Zell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Eng verbessert Reinigungsprozedur an Eegeschafte vu Kasein Kinase II aus Gehir. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Zäitcours vu striatal DeltaFosB-ähnlecher Immunoreaktivitéit a prodynorphin mRNA Niveauen no Stéierung vun chronescher dopaminomimetescher Behandlung. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genome-breet Ausdrock Schiirme weisen eng global Roll fir Protein Kinase CK2 bei der Chromatin Remodeling. J Cell Sci 116:1563-1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Zwee Isozymes vu PKC, déi an HL-60 Zellen fonnt goufen, weisen en Ënnerscheed an der Aktivatioun duerch de phorbolester TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinase CK2 gëtt mat klengen Leedung Ca (2 +) zesummegeluecht - aktivéiert K + Channels a reguléiert d'Kanaliséierung. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Laangfristeg Ausdrock vu Fos-verbonne Antigen a transiente Ausdrock vun Delta FosB assoziéiert mat Anfallen an der Rat Hippocampus a Striatum. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) D’Prognose vun der post-translationeller Glycosyléierung an der Phosphorylatioun vu Proteinen aus der Aminosauer Sequenz. Proteomics 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Kuelemonoxid Neurotransmissioun aktivéiert duerch CK2 Phosphorylatioun vun Heme Oxygenase-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Transkriptiounsfaktor Phosphorylatioun: e Link tëscht Signaltransduktioun an der Reguléierung vum Genexpressioun. Kriibs Zellen 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminale kinase Phosphorylatioun vu p53 op Thr-81 ass wichteg fir p53 Stabiliséierung an transkriptionell Aktivitéiten an Äntwert op Stress. Mol Zell Biol 21:2743-2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Absenz vun engem konservéierten Fos Famill C-Terminal Domain dréit zur DeltaFosB eenzegaarteger Stabilitéit bäi. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funktionell Interaktioun vu Proteinkinase CK2 a c-Myc an der Lymphomagenese. oncogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Reguléierung vun Delta FosB a FosB-ähnlech Proteinen duerch elektrokonvulsiv Erfaassung a Kokainbehandlungen. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronesch Fos-ähnlech Antigene: Stabile Varianten vun ΔFosB, déi am Gehir vum chronesche Behandlungen induzéiert ginn. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Phosphorylatioun vu c-Fos am C-Uschloss verbessert seng Transformatiounsaktivitéit. oncogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) De Proteinphosphatase 1 / 2A-Inhibitor Okadainsäure erhéicht d'CREB an Elk-1 Phosphorylatioun an c-Fos Ausdrock am Rat Ratstriatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyamin-mediéiert Proteinphosphorylatioune: e méiglecht Zil fir intrazellulär Polyamine Handlung. Mol Zell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytesch a molekulär Eegeschafte vun enger héich purifizéierter G-Typ Kaseinkinase aus Boverie Lungengewebe. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Selbst DW (2003) Striatal Zell-spezifesch Iwwerausdrock vun DeltaFosB verbessert Ureiz fir Kokain. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokain Selbstverwaltung erhéicht de preprodynorphin, awer net c-fos, mRNA am Ratstreatum. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Reguléierung vun Transkriptiounsfaktoren duerch Protein Degradatioun. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Erhéigung vun der zytoplasmescher Kaseinkinase II-Typ Aktivitéit begleet Neurit-Entworf no der DNA Synthese Inhibitioun an NIA-103 Neuroblastoma Zellen. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinase CK2 Phosphorylaten a Upregulatioun Akt / PKB. Zell Doud Differ 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Béid Produkter vum FosB-Gen, FosB a senger kuerzer Form, FosB / SF, sinn transkriptiouns Aktivatoren a Fibroblasts. Mol Zell Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Déi strukturell Determinanten déi verantwortlech si fir c-Fos Protein Proteasomal Degradatioun ënnerscheede sech no de Konditioune vun der Ausdrock. oncogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Phosphorylatiouns-ofhängeg Zielung vun c-Jun Ubiquitinatioun duerch Jun N-Kinase. oncogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminale Kinasen zielen d'Ubeiquitinatioun vun hiren assoziéierten Transkriptiounsfaktoren. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) D'Stabilitéit vum ATF2 Transkriptiounsfaktor gëtt duerch Phosphorylatioun an Déphosforylatioun geregelt. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Phosphorylatioun vun DARPP-32, en Dopamin- a cAMP-geregelte Phosphoprotein, vum Kasein Kinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Charakteriséierung am mammalesche Gehir vun enger DARPP-32 Serin Kinase identesch mat Kasein Kinase II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, en neit Antitumor Agent vu mikrobieller Hierkonft. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteinen, déi vum mënschleche c-myc oncogene kodéiert sinn: Differentialausdrock an neoplastesche Zellen. Mol Zell Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, e zyklesch AMP-geregelte Phosphoprotein (Mr = 21,000) beräichert an dopamin-innervéierten Gehirregiounen. Aminosaier Sequenz vum Site phosphoryléiert duerch zyklesch AMP a intakt Zellen a kinetesch Studien vu senger Phosphorylatioun in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Pharmakologie vu Proteinkinaseinhibitoren Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Instabilitéit vum Hes7 Protein ass entscheedend fir déi somitesch Segmentéierungs Auer. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypesch an typesch neuroleptesch Behandlungen induzéiere verschidde Programmer vum Transkriptiouns Faktor Ausdrock am Striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Hoffen B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Reguléierung vum direkten fréie Genekspressioun an AP-1 Bindung am Rattenzellum accumbens vu chronesche Kokain. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Hoffen BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Chronesch elektrokonvulsiv Erfaassung (ECS) Behandlung resultéiert am Ausdrock vun engem laang dauerhaften AP-1 Komplex am Gehir mat verännerter Zesummesetzung a Charakteristiken. J Neurosci 14:4318-4328.
Hoffen BT, Nye HE, Kelz MB, Selbst DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induktioun vun engem laang dauerhaften AP-1 Komplex besteet aus verännerte Fos-ähnlechen Proteinen am Gehir duerch chronesch Kokain an aner chronesch Behandlungen. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabiliséierung vum kalmodulin-abhängige Proteinkinase II duerch den autoinhibitoreschen Domain. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplex Mechanismen fir C-Fos a C-Jun Degradatioun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Casein Kinase ii (Protein Kinase ck2) reguléiert Serotonin 5-ht (3) Rezeptor Kanal Funktioun an ng108 – 15 Zellen. Neurologie 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 ass eng C-terminal IkappaB Kinase verantwortlech fir NF-kappaB Aktivéierung während der UV Äntwert. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ausdrock vum Transkriptiounsfaktor deltaFosB am Gehir kontrolléiert d'Sensibilitéit fir Kokain. Natur 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasominhibitioun duerch déi natierlech Produkter Epoxomicin an Dihydroeponemycin: Abléck iwwer Spezifizitéit a Potenz. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), eng nei mikrobial Verbindung, ass en héich potent a spezifeschen Inhibitor vu Proteinkinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Casein Kinase II ass e haaptsächlech nuklearen Enzym. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Protein kinase CK2 Phosphorylatéiert den héije Mobilitéitsgrupp Domain Protein SSRP1, induzéier d'Unerkennung vun UV-beschiedegt DNA. J Biol Chem 278:12710-12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatin Remodeling ass e Schlësselmechanismus deen ënner Kokain-induzéierter Plastizitéit am Striatum ass. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Casein Kinase-II reguléiert NMDA Kanal Funktioun an hippocampal Neuronen. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinase CK2: Struktur, Reguléierung a Roll bei celluläre Entscheedunge vu Liewen an Doud. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradatioun vum c-Fos Protein ausgedréckt duerch N-Methyl-d-aspartic sauerem an nuklear Fraktiounen vun murine Hippocampus. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Absence vun enger persistent erhéijen 37 kDa fos-relatéierten Antigen an AP-1-ähnlech DNA-verbindlech Aktivitéit an de Gehirer vu kaininsäure-behandelte fosB Null-Mais. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Site Spezifizitéit vu Kasein Kinase-2 (TS) vu Ratliewer Zytosol. Eng Etude mat Model Peptidsubstrater. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Reguléierung vum Genexpressioun a Kokain Belounung duerch CREB an DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: e molekulare Schalter fir laangfristeg Adaptatioun am Gehir. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Een-Dausend-an-Een Substrat vu Proteinkinase CK2? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Phosphoryléierung vu Kasein Fraktiounen duerch Rottelever 'Phosvitin Kinase.'. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autophosphorylatioun vum Typ 2 casein kinase TS a béid seng Alpha- a Beta-Ënnerunitéiten. Afloss vun verschidden Effekter. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-Benzimidazol Derivate als Inhibitoren vu Kasein Kinase-2 a Kasein Kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substrat Spezifizitéit vu Proteinkinase CK2. Zell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkriptiouns Induktioun vum Cyclooxygenase-2 Gen duerch okadaic Sauerinhibitioun vun der Phosphatase Aktivitéit bei mënschleche Chondrozyten: Co-Stimulatioun vun AP-1 a CRE nuklear bindende Proteinen. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Netzwierksniveau Ännerungen am Ausdrock vun induzéierbaren Fos-Jun Proteinen am Striatum wärend chronescher Kokainbehandlung a Réckzuch. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Direkt fréi Genen: zéng Joer op. Trends Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Eng natierlech optrieden ofgeschniddene Form vu FosB déi Fos / Jun transkriptionell Aktivitéit hemmt. Zell 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Selwer DW (2001) Delta FosB: e nohaltege molekulare Schalter fir Sucht. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Aféierung vum Glutamat Rezeptor Ënnerdeelung 1 a Motorneuronen in vitro an in vivo mat Hëllef vun engem rekombinantem Herpes Simplex Virus. Neurologie 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Phosphorylatioun vu serin 239 vu Groucho / TLE1 duerch Proteinkinase CK2 ass wichteg fir d'Inhibitioun vun der neuronaler Differenzéierung. Mol Zell Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) De Mos / MAP Kinase Wee stabiliséiert c-Fos duerch Phosphorylatioun a verstäerkt seng transformerend Aktivitéit an NIH 3T3 Zellen. EMBO J. 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Den ubiquitin-proteasome Wee ass erfuerderlech fir d'Veraarbechtung vum NF-kappa B1 Virgängerprotein an d'Aktivéierung vun NF-kappa B. Zell 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Gezielt Degradatioun vu c-Fos, awer net v-Fos, duerch e Phosphorylatiounsofhängegen Signal op c-Jun. Science 258:1941-1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Indukéierbar, Gehirregiounspezifesch Ausdrock vun engem dominanten negativen Mutant vun c-Jun bei transgenen Mais verréngert d'Sensibilitéit fir Kokain. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induktioun vun DeltaFosB a belount-verbonne Gehir Strukturen nom chronesche Stress. J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Brain Transkriptiouns Faktor Ausdrock: Effekter vun akuter a chronescher Amphetamin a Injektiounsstress. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-Iwwersetzungsännerung: Phosphorylatioun a Phosphatasen. In: Aktuell Protokoller an der Proteinwëssenschaft (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01–13.02. New York: Wiley a Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytesch a molekulär Eegeschafte vun héich gereinegt Phosvitin / Kasein Kinase Typ II vu mënschlechen Epithelzellen a Kultur (HeLa) a Relatioun zu Ekto Protein Kinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Zoustand vum "Protein Kinase CK2-HMG14" System an Alter-verbonne Amnesie bei Ratten. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradatioun vun der Basis Helix-Loop-Helix / Per-ARNT-Sim Homologie Domain Dioxin Rezeptor iwwer den Ubiquitin / Proteasome Wee. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) De PredictProtein Server. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.
Rylski M, Kaczmarek L. (2004) Ap-1 zielt am Gehir. Front Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA. (2004) Molekulär Karakteriséierung vun der rekombinant Maus Adenosin Kinase an Evaluatioun als Zil fir Proteinphosphorylatioun. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M. (1999) Ginn et verschidde proteolytesch Weeër déi bäidroe fir c-Fos, c-Jun an p53 Protein Degradatioun in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E. (1975) Autoxidatioun vu phorbol Ester ënner normalen Späicheren. Cancer Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstitutiv Phosphorylatioun vun IkappaBalpha duerch Kasein Kinase II trëfft léiwer bei serine 293: Noutwendegkeete fir Degradatioun vu fräi IkappaBalpha. Mol Zell Biol 16:3554-3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras verbessert Myc Proteinstabilitéit. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Zyklesch Nukleotid-onofhängeg Phosphorylatioun vu Vitellin duerch Kasein Kinase II gereinegt vu Rhodnius prolixus oocytes. Insekt Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wäisheet R (1997) Transkriptiouns Aktivéierung an Transformatioun mam FosB Protein erfuerdert Phosphorylatioun vum Carboxyl-terminaler Aktivéierungsdomän. Mol Zell Biol 17:2372-2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kinase CK2 differentiell phosphorylatéiert Mais chromosomal héich Mobilitéit Grupp B (HMGB) Proteinen déi hir Stabilitéit an DNA Interaktioune moduléieren. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J. (1999) Identifikatioun vum cyk, engem Cyclin B2 Kinase, als e Roman Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II a seng Roll während der Xenopus laevis oocyte Reifung. Exp Zell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Reguléierung vun c-fos a c-jun Gen Ausdrock duerch Lipopolysaccharid an Zytokine a primär kultivéiert Astrozyten: Effekt vu PKA a PKC Weeër. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differenziell Phosphorylatioun vu Ribosomal sauer Proteine aus Hefenzelle vun zwee endogene Proteinkinasen: Kasein Kinase-2 an 60S Kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) a calphostin verbonne Verbindungen, eng nei Klass vu spezifeschen a potente Inhibitoren vu Proteinkinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R. (2001) Den Tumor-Suppressor PTEN gëtt phosphoryléiert vun der Protein Kinase CK2 op sengem C-Uschloss. Implikatioune fir PTEN Stabilitéit fir proteasome-mediéiert Degradatioun. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differenziell Inhibitioun vu Calpain a Proteasome Aktivitéite vu Peptidylaldehyden vun Di-Leucine an Tri-Leucine. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N. (1995) Degradatioun vun c-Fos vum 26S Proteasome gëtt beschleunegt vu c-Jun a multiple Proteinkinasen. Mol Zell Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K. (2004) Protein kinase CK2 als Reguléierer vum Zell Iwwerliewe: Implikatioune fir Kriibstherapie. Curr Kriibs Drogen Ziler 4:77-84.
Fläsch E, Marshall CJ (2003) Erhiewt ERK-MAP Kinase Aktivitéit schützt de FOS Familljemember FRA-1 géint proteasomal Degradatioun an Darmkarszinomzellen. J Cell Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguléiert de Radfuerer. J Neurosci 22:8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Reguléierung vun Transkriptiounsfaktor funktionéiert duerch Phosphorylatioun. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Wanter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Zwee putative Proteinkinase CK2 Phosphorylatiounsplaze si wichteg fir Myf-5 Aktivitéit. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitutive Phosphorylatioun vun de saierleche Schwänzele vun der héijer Mobilitéit Grupp 1 Proteinen duerch Kasein Kinase II ännert hir Konformatioun, Stabilitéit, an DNA-Bindespesifizitéit. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Casein Kinase II interagéiert mat de bZIP Beräicher vu verschiddenen Transkriptiounsfaktoren. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Phosphorylatioun vum A170 Stressprotein duerch Kasein Kinase II-ähnlech Aktivitéit an de Makrophagen. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Den transkriptionelle Verlängerungsinhibitor 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazol hemmt Transkriptiounsfaktor IIH-assoziéiert Proteinkinase. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Wäisheet RM, Tratner I, Verma IM (1991) Eng alternativ splicéiert Form vu FosB ass en negativen Reguléierer vun der transkriptioneller Aktivatioun an der Transformatioun duerch Fos Proteinen. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Casein Kinase II Phosphorylatéiert d'Lensekonnexin 45.6 an ass a senger Degradatioun involvéiert. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induktioun vu AP-1 Transkriptiounsfaktorkomponenten wärend T-Zell Aktivatioun duerch Interleukin 1 a Phorbol Ester. Zell Wuesstem Ënnerscheed 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Konsequenze vu CK2 Signaliséierung zu der Nuklearmatrix. Mol Zell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Differenziell Zielung vun Proteinkinase CK2 an der Nuklearmatrix no transienter Iwwersiichtsausféierung vu sengen Ënnerunitéiten. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: eng wesentlech Roll fir ΔFosB am Kär accumbens bei der Morphinaktioun. Nat Neurosci 9:205-211.
Artikelen vun dësem Artikel
- Verhalensstrukturell a strukturell Äntwerten op chronesch Kokain erfuerderlech e Feedforward Loop involvéiert {Delta} FosB a Kalzium / Calmodulin-ofhängeg Protein Kinase II an der Nucleus Accumbens Shell Journal of Neurologie, 6 Mäerz 2013, 33(10):4295-4307
- Striatal Iwwerausdréck vu {Delta} FosB reproduzéiert chronesch Levodopa-induzéiert ongewollte Bewegungen Journal of Neurologie, 26 Mee 2010, 30(21):7335-7343
- mythologesch
- Komplette Text
- Komplett Text (PDF)
- mythologesch
- Komplette Text
- Komplett Text (PDF)
- mythologesch
- Komplette Text
- Komplett Text (PDF)
- mythologesch
- Komplette Text
- Komplett Text (PDF)
- Transkriptional Mechanismen vu Sucht: Rôle vun {Delta} FosB Philosophesch Transaktioune vun der Royal Society B: Biologesch Wëssenschaften, 12 Oktober 2008, 363(1507):3245-3255
- D'Verlängerung vu Schwieregkeeten fir d'Wiederhuelung vum Methamphetaminsusverhalen am glialen Zellzeil vun der neurotrophen Faktore mutéiert Mais De FASEB Journal, 1 Juli 2007, 21(9):1994-2004
- Den Activator Protein-1 Transkriptiouns Faktor an der Atmung Epithel Karzinogenese Molekulare Kreesforschung, 1 Februar 2007, 5(2):109-120
;
