Cdk5 Phosphorylate Dopamin D2 Rezeptor a Attenuates Downstream Signaling (2013)

Zitat: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylaten Dopamin D2 Receptor an Attenuates Downstream Signaling. PLoS NËMMEN 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editeur: James Porter, Universitéit vun North Dakota, Vereenegt Staate vun Amerika

Received: Mee 20, 2013; Akzeptéiert: November 14, 2013; Verëffentlecht: Dezember 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dëst ass en Open-Access Artikel verdeelt ënner de Bedingunge vun der Creative Commons Attribution License, wat en uneegente Gebrauch, Verdeelung a Reproduktioun an iergendeng Medium erbréngt, wann de ursprénglechen Auteur a Quell wäert uginn.

Finanzéierung: Dës Aarbecht gouf ënnerstëtzt vun de Stipendien (NRF-2012R1A2A2A01012923 an NRF-2012R1A4A1028200) vun der koreanescher Regierung (MSIP) an huet och ënnerstëtzt am Kader vum internationale Kooperatiounsprogramm geréiert vum NRF vun Korea (2012K2A1 KBNIN) Basis Fuerschungsprogramm vu MSIP (2033117-2031). SKP war e Empfänger vun der 415 an 2004 National Alliance fir Fuerschung iwwer Schizophrenia an Depressioun (NARSAD) Young Investigator Awards. De Finanzéierer hat keng Roll am Studie-Design, Datensammlung an Analyse, Entscheedung ze verëffentlechen oder d'Virbereedung vum Manuskript.

Interessante Concerten: D'Autoren hu deklaréiert datt keng konkret Interessen existéieren.

Aféierung

Dopamin Signalisatioun ass a verschidde Gehirfunktiounen involvéiert mat Motorkoordinatioun, Stëmmungskontroll a Belounungsmechanismen [1]. E wichtege Bestanddeel vun Dopamin Signaliséierung bei Wirbelen gëtt vun striatal mëttlerer Schwäin Neuronen ausgeübt (MSNs) déi selektiv eng Untersuewung vun Dopamin Rezeptoren ausdrécken an dopaminergesch Input kréien haaptsächlech aus dem ventrale tegmental Gebitt (VTA) a substantia nigra (SN) [2]An. Dopamin Rezeptoren sinn G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) mat siwe transmembrane Domainen a bestinn aus zwee Subtypen, D1-ähnlech an D2-ähnlech Rezeptoren, déi wiederhuelend Aktiounen bei Dopamin Signaléierung vermëttelen [1]. Zum Beispill aktivéieren dopamin D1-ähnlech Rezeptoren (D1, D5) adenylyl Cyclase duerch G_αs a erhéicht den intrazelluläre Niveau vum cAMP, awer dopamin D2-ähnlech Rezeptoren (D2, D3, D4) inhibitieren Adenylyl Cyclase duerch G_αi a reduzéiert den intrazelluläre Niveau vum cAMP [1], [3].

Ënner den Dopamin Rezeptoren ass den D2 Rezeptor (DRD2) agebonne bei der Pathophysiologie vu multiple grousse psychiatresche Stéierungen dorënner Schizophrenie an Drogenofhängeger. [4], sou datt vill antipsychotesch Medikamenter op d'mannst deelweis zu DRD2 zielen. Et ass och bekannt datt DRD2 Aktivitéit korreléiert gutt mat de Verhale Konsequenzen vun Drogen vu Mëssbrauch an Déiermodeller [5]An. Antidepressiva a Stëmmungsstabiliséierungseffizienz goufen och mat Verännerungen an der Zelloberflächeausdrock vun DRD2 oder downstream intrazellularer Signaléierung mediated vun PKA, ERK a GSK3 verlinkt. [1], [4], [6]An. Trotz dësen kriteschen Rollen fir DRD2 am Gehir, sinn déi detailléiert Reguléierungsmechanismen déi Heterogenitéit a Komplexitéit un DRD2 Eegeschafte vermëttelen net komplett verstanen.

Konvergerende Beweiserlinn bedeiten datt verschidde posttranslational Modifikatioune bei der Feinaféierung vun der DRD2 Aktivitéit involvéiert sinn. Extensiv Glykosylatioun vun DRD2 gouf an de fréie Foto-Affinitéit Etikettéierungsstudien opgedeckt [7], an Disulfidbandsbildung bannent DRD2 war och als eng wichteg Ännerung fir Ligandbindung identifizéiert [8]An. Ausserdeem goufen Phosphorylatiounsseiten vun DRD2 am Ufank identifizéiert kënschtlech assay mat Radioisotopen, suergt Weeër fir verschidde Reguléierungsweeër mediéiert vu verschiddene Kinasen [9]An. Tatsächlech reguléiert Proteinkinase C (PKC) DRD2-mediéiert Mobiliséierung vun intrazelluläre Kalzium a moduléiert d'Interaktioun vum DRD2 mat Zytoskeletal Proteinen [10]An. Phosphorylatioun duerch GPCR Kinase 2 (GRK2) reguléiert agonist-induzéiert Resensibiliséierungsmuster vun DRD2 [11].

Cyclin-ofhängeg Kinase 5 (Cdk5) ass eng prolin-geriicht Serine / Threonin Kinase déi preferentiell Aktivitéit huet wéinst dem Gehirspezifeschen Ausdrock vu senge wesentlechen Aktivatoren, p35 a p39 [12]An. Cdk5 ass an verschidden neuronal Prozesser involvéiert neuronal Migratioun an Axon Leedung, an Cdk5 an p35 null Musse weisen Mängel an der kortikaler Schichtung [13]An. Viru kuerzem gouf gewisen datt Phosphorylatioun vu WAVE1 an Ephexin duerch Cdk5 dendritesch Wirbelsäit Morphogenese reguléiert. [14]An. Ausserdeem, reguléiert Cdk5 och Uewerflächendréckungsniveauen vum NMDA Rezeptor, NR2B, an NR2A-mediéierten NMDA Stroum [15], [16]An. Et ass bemierkenswert datt verschidde Stécker vu Beweiser eng intim Relatioun tëscht Cdk5 an dem Dopamin System suggeréieren. Cdk5 Phosphorylatéiert Tyrosin-Hydroxylase (TH), regelt seng Stabilitéit, an doduerch d'Dopaminergic Homeostasis z'erhalen [17]An. An postsynaptesche Neuronen, wann den T75 Rescht vun Dopamin a cyclesch-AMP reguléiert Phosphoprotein-32kD (DARPP-32) gëtt duerch Cdk5 phosphoryléiert, kann et PKA Aktivitéit hämmen an doduerch Dopamin DRD1-mediéiert PKA Signaliséieren [18]. Interessanterweis, wann Kokain, en indirekten Agonist vun Dopamin Rezeptoren, chronesch an Ratten administréiert gëtt, mRNA a Protein Niveauen vun Cdk5 Erhéijung vun mëttlerer Schwäin Neuronen. [19]. Sammelt schéngt Cdk5 an Drogen-induzéierter synaptescher Adaptatiounen ze sinn. An dëser Studie weise mir eng funktionell Interaktioun vun DRD2 an Cdk5 déi d'Roll vun Cdk5 bei der Dopamin Signalisatioun weider ausdehnen.

Materialien an Methoden

Antikörper

Anti-Kanéngchen Serums goufe géint Peptide erhéicht mat Phospho-Serin 321 (pS321) vun der drëtter intrazellularer Schläif vun DRD2 (D2i3). Phospho-Peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), gouf benotzt fir eng peptid-konjugéiert Kolonn fir Affinitéitsreinung ze maachen (20401, PIERCE). Anti-pS321 Antikörper gouf vun engem Affinitéitsreinigungssystem beräichert no der Instruktioun vum Hiersteller. Purifizéiert Phospho-Antikörper gouf a PBS mat 0.1% Natriumazid a 0.1% Gelatin gelagert. Anti-Maus Anti-Cdk5 Antikörper (sc-249) an Anti-Kanéngchen Anti-p35 Antikörper (sc-820) goufen fir déi westlech Blotting an Immunozytochemie vun Cdk5 / p35 benotzt. Anti-Maus Anti-GFP Antikörper (sc-9996) gouf fir d'Immunoprecipitatioun a Westernblotting vun DRD2-GFP benotzt. Anti-Kanéngchen Anti-FLAG Antikörper (sc-807), Anti-Kanéngchen Anti-HA Antikörper (sc-805), Anti-Maus Anti-GST Antikörper (sc-138), an Anti-Maus Anti-GAPDH Antikörper (sc- 32293) goufe vu Santa Cruz Biotechnologies kaaft.

Déieren

D'p35 knockout Maus war e léiwe Kaddo vum Dr Katsuhiko Mikoshiba um RIKEN Brain Science Institute a Japan a fir primär Neuron Kultur benotzt. Primer Sets fir Genotyping waren 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC an 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT wéi virdru beschriwwen [20]An. ICR Mais an Sprague Dawley Ratten goufen fir Hirn Lysat Virbereedung benotzt. All Déierprozedure goufe vun der Pohang University of Science and Technology Institutional Déierenfleeg- a Benotzungscomité guttgeheescht.

Plasmid Konstrukt

Mënschleche DRD2 laang Isoform an engem EGFP-N1 Plasmidvektor an déi drëtt intrazellular Loop vun DRD2 (212 – 373 Aminosaierreschter inklusiv den 29 zousätzlech Aminosauerreschter eenzeg an DRD2 laang Isoform) an engem pFLAG-CMV-2 Plasmidvektor goufen benotzt. Mënschleche Cdk5 gouf an engem pCMV-HA Plasmidvektor an de Mënsch p35 war an e pcDNA 3.1 Plasmidvektor agebaut. Mënschleche Cdk5 gouf ënner engem Cytomegalovirus (CMV) Promoteur zesumme mam Mënsch p35 an engem pcDNA 3.1 Vektor agebaut fir en duebelen Ausdrockkonstrukt ze maachen (Cdk5 / p35) fir Immunozytochemie, Rezeptor-Internaliséierungsassay, [³⁵S] -GTP_γS verbindlech Assay, radioligand bindend Assay an cAMP Enzym Immunoassay.

Am Vitro Kinase Assay

IP-verlinkt kënschtlech kinase assay war folgend gesuergt. Een ganzen Maus Gehir war an 3 mL Erythrozyten Lysisbuffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0)), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) vum 20 Stroke vun engem Dounce Homogenisator fir homogeniséierter Gehirn lys ze ginn. An. D'Lysate goufe fir 30 min op Äis incubéiert, Sonikéiert, a bei 16,000 × centrifugéiert g fir 10 min. D'Supernatanten goufen immunoprecipitéiert mat Anti-Kanéngchen Anti-p35 Antikörper fir en aktiven Cdk5 / p35 Komplex ze kréien. Cdk5 / p35 komplex a gereinegt GST Fusiounsprotein gouf gemëscht mat Adenosin 5′-Triposfat, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) a sech an de Kinase Prellbock (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) fir 1 h bei Raumtemperatur [18], [21]An. Purifizéiert Cdk5 / p25 Komplex (14 – 516, Millipore) gouf och benotzt fir kënschtlech kinase assay wéi uewen beschriwwen. Den 2 × Probe Luede Puffer gouf an d'Reaktiounsmëschung hinzu ginn a bei 100 ° C gekacht. D'Echantillon goufen dunn op SDS-PAGE ënnerworf an de gedréchente Gel gouf mat Autoradiographie bewäert.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spektrometrie (MS) / MS Analyse

De rekombinante GST-D2i3 Protein gouf analyséiert vun LC-MS / MS no IP-verlinkt kënschtlech kinase assay. Mir hunn Peptid Identifikatioun vun LC-MS / MS Daten mat X !! Tandem (Versioun Dec-01-2008) gemaach. All RAW Daten Datei gouf fir d'éischt mat mzXML mat der trans-proteomescher Pipeline (TPP; Versioun 4.3) ëmgewandelt. MS / MS Scans an de konvertéierte mzXMLs goufen duerno gezielt fir géint d'UniProt Maus Proteinsekvens Datebank ze sichen (Verëffentlechung 2010_07) mat abegraff GST-D2i3 Sequenz mat X !! Tandem. D'Toleranz gouf op 3 Da fir Virgängerionen gesat an 2 Da fir Fragmentionen. Enzymspesifizitéit fir Trypsin gouf benotzt. Variabel Modifikatiounsméiglechkeeten goufe fir d'Carbamidomethyléierung vu Cystein (57.021 Da), d'Oxidatioun vu Methionin (15.995 Da), d'Hydrolyse vun Asparagin (0.987 Da) an d'Fosforylatioun vu Serin (79.966 Da) benotzt.

Immunoprecipitatioun

Immunoprecipitation gouf op Zell lysates an ELB lysis Puffer duerchgefouert. Anti-GFP Antikörper gouf zu de Lysate bäigebaut an fir 3 h bei 4 ° C incubéiert. Immunokomplexe goufe mat Protein-A agarose gereinegt. D 'Ausfäll goufen mat SDS Probe Luede Puffer fir 30 min bei 37 ° C incubéiert an ënnerworf mat SDS-PAGE a Western Blots.

GST Pull-Down Assay

10 µg vu gereinigte GST a GST – D2i3 goufe mat Ratten-Gehirlysat fir 1.5 h bei 4 ° C incubéiert. 30 µL Glutathion (GSH) -konjugéiert Sepharose 4B Perlen (17-0756-01, GE Healthcare) equilibréiert mat Lysisbuffer gouf bäigefüügt a fir zousätzlech 1 h incubéiert. Perlen goufen duerch Zentrifugatioun op 2,000 × gesammeltg a mat XISUMX Mol mat Lysis-Puffer gerannt [22], [23]An. Viraussetzunge goufen duerch Westernblotting mat Anti-Cdk5 an Anti-p35 Antikörper analyséiert.

Immunozytochemie

Transfizéiert HEK 293 Zellen a striatal Neuronen, déi op Coverlips kultivéiert goufen, goufe eemol mat Phosphatgebufferem Salz Salz (PBS) gewaschen a fixéiert duerch Immersioun a kale 4% paraformaldehyd / PBS fir 30 min. Primär Antikörper war an der Blockéierungsléisung verdünnt (2% Päerdserum an 1% Triton X-100 a PBS). Alexafluor-647-konjugéiert Anti-Maus Antikörper (A20990, Invitrogen) an Alexafluor-568-konjugéiert Anti-Kanin Antikörper (A11011, Invitrogen) goufen als sekundär Antikörper benotzt. Hoechst goufe fir Kärfarbung benotzt. Biller goufen duerch konfokal Mikroskopie kritt (Olympus, FluoView-1000).

Empfänger Internaliséierung Assay

24 h no Transfektioun, goufen Zellen mat 1 μM Quinpirole (Q102, Sigma) fir 30 min an 90 min bei 37 ° C behandelt. Zellen goufen an 2 ml kale PBS nei opgehal an 200 µL Aliquote goufe fir all Reaktioun benotzt. Drogenbehandlungen goufen bei Raumtemperatur fir 3 h an de folgende Konzentratioune gemaach; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​Sulpirid (895, TOCRIS), 10 µM ​​Haloperidol (H1512, Sigma). Hydrophobesch [³H] -spiperone gouf benotzt fir total ausgedréckte Rezeptoren ze labeléieren an hydrofilesch Sulpirid gouf benotzt fir membranous Rezeptor gebonnen [³H] -spiperone Signaler. Membran-assoziéiert Rezeptor-Signaler goufen berechent andeems hien intrazellulär Rezeptorwäerter aus den total ausgedréckte Rezeptorwäerter subtrahéiert. Zellen goufen op engem GF / B (Millipore) Filter gefiltert an 3 Mol mat Wäschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. Filtere goufen ausgedrockt an déi verbleiwend Radioaktivitéit gouf mat engem flëssege Scintillatiounsmiesser gemooss [24].

Zell Membran Virbereedung

Confluent Zellen an 100 mm Kulturgeschir no Transfektioun goufe mat Äiskale PBS gewascht an an 1 mL HME Puffer (25 mM HEPES (pH 7.5)), 2 mM MgCl gewasst₂, 1 mM EDTA). Homogeniséierte Lysate goufe mat 500 × g fir 15 min centrifugéiert an d'Supernatanten goufen duerno mat 36,000 × g fir 30 min centrifugéiert. Pellets nei suspendéiert an HME Puffer goufen fir Assays benotzt.

[³⁵S] -GTP_γS bindend Assay

Zell Membran Fraktiounen goufe mat 1 µM ​​Quinpirole (Q102, Sigma) virgeschloen an den assaybuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA an 0.01 mM BIP) fir 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) gouf zu der definitiver Konzentratioun vum 3 nM an 30 µL hinzugefügt a weider fir 90 min incubéiert. 170 µL Äis-kale Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, an 0.1 mM GTP) gouf fir d'Reaktioun ze stoppen. Membranen goufen op engem GF / B Filter (Millipore) gefiltert an 3 Zäiten mam Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. Filtere goufe gedréchent an d'Radioaktivitéit gouf mat der Scintillatiounsteller gemooss [25], [26].

Radioligand Bindung Assay

Preparéiert Zellmembranen goufe mat 0.01 nM incubéiert³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) an Erhéijung Konzentratioune vu Quinpirol (Q102, Sigma) fir 30 min am Assaybuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranen goufen op engem GF / B Filter (Millipore) gefiltert an 3 Zäiten mam Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) gewaschen. D'Reaktioun gouf duerch séier Filtratioun duerch GF / C Filteren ofgeschloss. Rescht Radioaktivitéit gouf mat engem flëssege Scintillatiounskierper gemooss [27]-[29].

cAMP Enzym Immunoassay

Transfizéiert HEK 293 Zellen goufe virbehandelt mat 10 µM ​​Rolipram (R6520, Sigma) fir 1 h, an duerno mat 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) behandelt a Konzentratioune vu Quinpirol (Q102, Sigma) fir 30 min erhéicht. Primär kultivéiert striatal Neuronen goufe mat 10 µM ​​Rolipram fir 1 h behandelt, an dann 1 µM ​​Dopamin fir 1 h [22]An. Zell Lysate goufe mat 0.1 M HCl virbereet an cAMP Niveauen goufen duerch cAMP Enzym Immunoassay Kit (Sapphire Bioscience) no der Instruktioun vum Hiersteller festgestallt.

Primär kultivéiert Striatal Neuron

Striatal Regioun gouf vum Maus embryonal Gehir isoléiert (E15). Dissected Tissu gouf a minimale wesentlechen Medien (MEM) (11095, Invitrogen) getrennt, enthale mat 0.25% Trypsin (T4549-100, Sigma) an 0.1% DNase I fir 6 min bei 37 ° C. Zellen goufen an de Plättermedien nei opgehuewen (MEM mat 0.01 M HEPES (pH 7.4) an 10% (Vol / Vol) Päerdserum (16050-122, GIBCO)). Neurone goufen fir 7 Deeg kultivéiert kënschtlech (DIV 7) an MEM mat B27 Zousaz (17504-044, Invitrogen) ier se op cAMP Enzymimmunoassays applizéiert ginn.

Resultater

Cdk5 Phosphorylaten Serine 321 an der drëtter intrazellularer Loop vun DRD2 kënschtlech

Fir nei Cdk5 Substrate z'identifizéieren, hu mir eng systematesch Sich duerchgefouert mat (S / T) PX (K / H / R) als d'Cdk5 Unerkennungskonsenssequenzen [30] an identifizéiert DRD2 als Kandidatensubstrat. D'Konsenssequenz, abegraff serin 321, ass an der drëtter intrazellularer Loop vun DRD2 (D2i3) lokaliséiert wou verschidde Reguléierungsmechanismen agebonne goufen [3], [10], [11]An. D'Sekwenz ass evolutiv konservéiert an DRD2 bei Wirbelen, souwäit eng funktionell Wichtegkeet vum Rescht (Figur 1A).

eroflueden:   

• PPT

  PowerPoint Slide

• PNG

  méi grouss Biller (2.08MB)

• TIFF

  ursprénglecht Bild (4.36MB)

Figur 1. Cdk5 Phosphorylatéiert Serine 321 an der drëtter intrazellularer Loop vun DRD2 in vitro.

(A) Amino sauer Sequenz Ausrichtung déi konservéiert Regiounen vun der DRD2 vu verschiddenen Arten (schattend) weisen. De potenziellen Cdk5 Phosphorylatiounsplaz gëtt mat enger Asterisk uginn. (B) IP-verbonne kënschtlech kinase assay mat rekombinant GST-D2i3 a GST-D2i3 Mutant Proteinen. Cdk5 / p35 Komplex beräichert vum Maus Gehir Extrakt duerch Anti-p35 Immunoprecipitatioun gouf fir Kinase Reaktiounen benotzt. En Autoradiograf vu phosphorylerte Proteine ​​gëtt zesumme mat Coomassie brillant blo Faarf vum selwechte Gel gewisen. Arrowhead weist radioaktivt Signal entspriechend GST-D2i3s an oppe Pfeilhead weist radioaktiv Signaler vu p35. (C) MS / MS Spektrum vum phosphorylerte Peptidfragment vun D2i3. D'theoretesch Fragmentatiounsmuster sinn ënner dem Spektrum ugewisen. Ënner all de Fragmenter Ionen ginn déi festgestallt Y- a b-Ionen am Spektrum gezeechent. Den y₆ an y₇ ionen staark un der Phosphorylatioun vu Serine 321 uginn. (D) In vitro kinase assay mat purifizéierter Cdk5 / GST-p25 Komplex mat GST-D2i3 a GST-D2i3 Mutant Proteinen. Phosphorylerte Proteine ​​goufen an engem Autoradiograf gewise, zesumme mat Coomassie brillant blo Faarfung. Arrowhead weist radioaktivt Signal entspriechend GST-D2i3 an oppe Pfeilhead weist radioaktiv Signaler vu GST-p25.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Fir d'Kapazitéit vu Cdk5 fir Phosphorylat D2i3 ze beurteelen, hu mir IP-verlinkt kënschtlech kinase Assays mat Hëllef vun engem aktiven Cdk5 / p35 Komplex beräichert vu Maus Gehir Lysat duerch p35 Immunoprecipitatioun mat purifizéiertem recombinant GST-D2i3 (Aminosauerreschter 212 – 373) Proteine ​​wéi d'Substrater. Mir observéiert Phosphorylatiounssignaler an de gereinigte GST-D2i3 an GST-D2i3 S297A Proteinen, awer d'Signal war wesentlech reduzéiert mat GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Fir weider Phosphorylatioun vu Serine 321 am GST-D2i3 z'iwwerpréiwen, hu mir LC-MS / MS Analyse vun de Proben aus IP-verlinkt kënschtlech kinase Assays mat LTQ XL Massespektrometrie. Konsequent, Phospho-Peptiden entspriechend der Mass vun de Phospho-Serin 321 Peptiden goufen erholl (Abb. 1C). Bedenkt datt d'Daten-ofhängeg Acquisitioun während der LC-MS / MS Analyse tendéiert reichend Proteinen am Probe z'entdecken [31], dës Donnéeën hindeit datt de serine 321 Rescht ass den dominante Phosphorylatiounsplaz vum Cdk5 an der D2i3 Regioun. Fir direkt Phosphorylatioun vu Serine 321 an der GST-D2i3 vun Cdk5 ze beweisen, kënschtlech kinase Assay andeems purifizéiert Cdk5 / GST-p25 Komplex mat gesécherten recombinant GST-D2i3 Proteine ​​gemaach gouf. Mir identifizéiert e bedeitende Phosphorylationssignal am GST-D2i3 deen am GST-D2i3 S321A absent war (Fig. 1D). Zesummegefaasst hunn dës Resultater ugewisen datt den D2i3 S321 Rescht e preferentiellt Zil fir Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun ass.

Cdk5 Phosphorylaten Serine 321 an der drëtter intrazellularer Loop vun DRD2 an Zellen

Fir d'Phosphorylatioun vu Serine 321 z'identifizéieren, hu mir Antikörper spezifesch fir Phospho-Serin 321 (pS321) opgeworf. Probe vum IP-verlinkt kënschtlech kinase assay goufen duerch Western blotting mat Anti-pS321 antibody analyséiert. Blots hunn eng ënnerschiddlech Band an der kinase Reaktioun gewisen, déi ofhängeg war vun GST-D2i3 (Figur 2A). Fir déi potenziell Phosphorylatioun vu Serine 321 an DRD2 vum Cdk5 an Zellen z'iwwerpréiwen, goufen Anti-GFP Immunoprecipitaten aus HEK 293 Zellen ausdrécklech DRD2-GFP an DRD2 S321A-GFP mat oder ouni HA-Cdk5 an Analyse mat PXNX benotzt anti-pS35 Antikörper. Charakteristesch verschmiert Bandsignaler duerch Anti-GFP Antikörper, déi bekannt sinn wéinst exzessiver Glykosyléierung vun DRD321 ginn nëmme a Präsenz vun DRD2-GFP observéiert, an Anti-pS2 Antikörper entdeckt ähnlech DRD321 Signaler nëmmen mat Cdk2 / p5 Co Ausdrock (Fig. 2B) [7]An. Fir weider der Phosphorylatioun vu Serine 321 duerch Cdk5 ze verifizéieren, goufen D2i3 (FLAG-D2i3) a mutant Form vun D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) generéiert. FLAG-D2i3 a FLAG-D2i3 S321A ausgedréckt mat oder ouni HA-Cdk5 an p35 an HEK 293 Zellen goufe mat engem SDS-Gel Mobilitéitsverschmiessung analyséiert. Eng bedeitend Cdk5-ofhängeg Mobilitéitsverrécklung gouf fir FLAG-D2i3 observéiert, awer net fir FLAG-D2i3 S321A (Abb. 2C). Mir hunn de Phosphorylatiounsniveau vun DRD2 bei Ser321 op Agonist Stimulatioun bewäert. HEK 293 Zellen, déi DRD2-GFP an Cdk5 / p35 Komplex ausdrécken, goufen duerch Quinpirole stimuléiert, an Anti-GFP Immunoprecipitaten aus den Zelllysaten goufen duerch Western Blotting mat Anti-GFP an Anti-pS321 Antikörper analyséiert. Mir hu festgestallt datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DRD2 bei Ser321 net vun agonist Stimulatioun beaflosst war, wat anescht aus GRK- a PKC-mediéiert Phosphorylatioune schéngt (Fig. 2D) [32], [33]An. Zesummen hunn dës Resultater ugewisen datt Cdk5 de serine 321 Rescht vun DRD2 an der cellulärer Ëmfeld fosforyléiere kann.

eroflueden:   

• PPT

  PowerPoint Slide

• PNG

  méi grouss Biller (1.92MB)

• TIFF

  ursprénglecht Bild (3.5MB)

Figur 2. Cdk5 Phosphorylatéiert Serine 321 an der drëtter intrazellularer Loop vun DRD2 an Zellen.

Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vu Serine 321 gouf mat Anti-pS321 Antikörper analyséiert. (A) Echantillon vu IP-verlinkt kënschtlech kinase-Assay andeems GST-D2i3 Proteine ​​mat Western blotting (WB) mat gezeechenten Antikörper analyséiert goufen. Arrowheads weisen GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP an DRD2 S321A-GFP gouf mat oder ouni HA-Cdk5 an p35 an HEK 293 Zellen ausgedréckt. Anti-GFP Immunoprecipitaten goufen duerch Western blotting mat Anti-GFP an Anti-pS321 Antikörper analyséiert. D'Klammer bezeechent DRD2 Signaler an oppe Pfeilkop signaliséiere nonspezifesche Signaler vun den Anti-GFP Immunopfällungen. '% Input' ass% Volumen vum gesamt Lysat fir eng IP Reaktioun. Schwäch endogen Cdk5 Signaler goufen vun Asterisken gezeechent. (C) Gel Mobilitéit Verschibung assay. HEK 293 Zellen transfizéiert wéi uginn goufen duerch Western blotting analyséiert. (D) Transfizéiert HEK 293 Zellen goufe mat Quinpirol behandelt an Anti-GFP Immunoprecipitaten goufen duerch Western Blotting mat Anti-GFP an Anti-pS321 Antikörper analyséiert. Open Pfeilkop bedeit nonspezifesch Signaler vun Anti-GFP Immunoprecipitaten.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Komplex an DRD2 sinn kierperlech associéiert

Mir hunn d'potenziell kierperlech Interaktioun tëscht dem Cdk5 / p35 Komplex an DRD2 ënnersicht well vill Cdk5 Substrate bekannt sinn kierperlech mat Cdk5 / p35 Komplex assoziéiert. [23], [34], [35]An. Als éischt gouf den GST pull-down Experiment gemaach. Gegrënnt rekombinant GST-D2i3 Protein gouf mat Ratten-Gehirlysat incubéiert a GST Pull-Down Ausfäll goufen fir Westernblotting analyséiert. Wéi an Figur 3A, endogene Cdk5 an p35 goufen an den zéien Nidderschléi identifizéiert, wat eng kierperlech Interaktioun tëscht DRD2 an dem Cdk5 / p35 Komplex bezeechent (Figur 3A). Ausserdeem goufen HA-Cdk5 a p35 an den Anti-GFP Immunoprecipitaten aus HEK 293 Zelllysate festgestallt, déi DRD2-GFP an Cdk5 / p35 ausdrécken (Fig. 3B). Zousätzlech hu mir immunozytochemesch Analysen gemaach an observéiert datt DRD2-GFP, HA-Cdk5 an p35 bedeitend Co-Lokaliséierungssignaler am Membran Beräich vun HEK 293 Zellen (Abb. 3C, iewescht Brieder). Mir hunn och Co-Lokaliséierung vun DRD2 an Cdk5 / p35 am neuronalen Kontext ënnersicht. Konsequent huet DRD2-GFP och bedeitend Co-Lokaliséierung mat endogene Cdk5 an p35 an de kultiverte striatal Neuronen (DIV7) gewisen, wat weider funktionell Links tëscht DRD2 an Cdk5 / p35 ënnerstëtztAbb. 3C, ënnen Brieder). D'Resultater weisen datt DRD2 an Cdk5 / p35 e Komplex kënne bilden an domat d'Notioun ënnerstëtzen datt DRD2 e physiologescht Substrat vum Cdk5 ass.

eroflueden:   

• PPT

  PowerPoint Slide

• PNG

  méi grouss Biller (3.91MB)

• TIFF

  ursprénglecht Bild (5.35MB)

Figur 3. Cdk5 / p35 ka mat DRD2 e Komplex bilden.

(A) GST Pull-Down Assay mat gereinigtem recombinant GST-D2i3 Protein mat Rat Rat Gehir Extrakt. GST Pull-Down Ausfäll goufen an Western blotting Analysë ënnerworf. 'Bead' bezeechent den zéien Nidderschlag ouni GST Proteinen. (B) Immunoprecipitatioun vum DRD2 an Cdk5 / p35 Komplex. Anti-GFP IP vu Lysate vun transfekterten Zellen goufen op Western blotting Analysë ënnerworf. D'Klammer bezeechent DRD2 Signaler an oppe Pfeilkop signaliséiere nonspezifesche Signaler vun den Anti-GFP Immunopfällungen. En iwwerbelaaschtte Blot fir Input gëtt och uewe riets gewisen. (C) Immunozytochemesch Analysen vun DRD2 an Cdk5 / p35. HEK 293 Zellen, déi DRD2-GFP an Cdk5 / p35 ausdrécken, goufe mat Anti-Cdk5 an Anti-p35 Antikierper (Uewer Brieder) fleeft. DRD2-GFP gouf eleng an de kultifizéierte striatal Neuronen ausgedréckt a mat Anti-Cdk5 an Anti-p35 Antikörper gestierzt (ënnescht Brieder). Hoechst goufe fir Kärfarbung benotzt. D'Skala Bar ass 5 um. All Biller goufen mat Hëllef vu confokaler Mikroskopie (Olympus, FluoView-1000) kritt.

Doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DRD2 Attenuéiert Receptor Aktivitéit

Et gouf bericht datt Phosphorylatioun kritesch Eegeschafte vu GPCRs moduléiert wéi G Proteinkopplung, Rezeptorinternaliséierung, intrazellularer Lokaliséierung, a Verbindung mat Modulatorproteinen [9], [11], [24]. Agonist-induzéiert Rezeptor-Internaliséierung ass e kriteschen regulatoresche Prozess vu Signaltransduktioun. Mir hunn d'Cdk5-mediéiert Modulatioun vun der DRD2-Internaliséierung ënnersicht. HEK 293 Zellen, déi DRD2-GFP ausdrécken an DRD2 S321A-GFP mat oder ouni Cdk5 / p35 goufe mat 1 µM ​​Quinpirole incubéiert fir agonist-stimuléiert DRD2 Internaliséierung ze induzéieren (Figur 4A). [³H] -spiperone Signaler vun DRD2-GFP Ausdrockzellen goufe wesentlech bei 30 min Quinpirolbehandlung reduzéiert an op 90 min erëmgeholl. Interessant, [³H] -spiperone Signaler vun DRD2-GFP an Cdk5 / p35 Ausdrockzellen goufen och bei 30 min quinpirole Behandlung reduzéiert awer net op 90 min erholl (Figur 4A, zweet Sektioun). Op der anerer Säit, [³H] -spiperone Signaler vun DRD2 S321A-GFP Ausdrockzellen goufe bei 30 min reduzéiert an op 90 min erëmfonnt, onofhängeg vum Co-Ausdrock mat Cdk5 / p35. Virdru Studien hu gewisen datt d'internaliséiert DRD2 zréckgeet an d'Plasma Membran zréck op verlängert Agonist Stimulatioun [11]. Thus et schéngt datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DRD2 an de Resensibiliséierungsprozesser no der agonist-induzéierter DRD2 Internaliséierung involvéiert ass.

eroflueden:   

• PPT

  PowerPoint Slide

• PNG

  méi grouss Biller (387KB)

• TIFF

  ursprénglecht Bild (1.31MB)

Figur 4. Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun attenuéiert DRD2 Uewerfläch Ausdrock a downstream Signalisatioun.

(A) DRD2 Uewerfläch Ausdrock gemooss duerch [³H] -spiperone verbindlech Assay. Transfizéiert HEK293 Zellen goufen mat 1 μM Quinpirole fir déi gezeechent Zäit stimuléiert a gesammelt, gefollegt vu 3 nM [³H] -spiperone Behandlung fir 3 h. Radioaktivitéit gouf gemooss an Uewerflächesignaler goufen ausgerechent. Feelerstäbe representéieren heeschen ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Een-Wee ANOVA mam Dunnett Post hoc Test: vergläichen all Säulen vs. (B) [³⁵S] -GTP_γS bindend Assay. Zellmembranen goufen aus den Zellen transfizéiert wéi uginn. Membranpräparatiounen goufe mat 1 μM Quinpirole gefollegt vu 3 nM [³⁵S] -GTP_γS fir 90 min. Feelerstäbe representéiere mëttler ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Een-Manéier ANOVA mam Bonferroni Post hoc Test: vergläicht all Puer Säulen). (C) Quinpirol-konkurréierend [³H] -spiperone verbindlech Assay. Membranpräparatiounen aus transfektéierten Zellen goufe mat 0.01 nM incubéiert [³H] -spiperon a wuessend Konzentratioune vu Quinpirol fir 30 min. Net-linear Regressioun gouf vum GraphPad kritt. Feelerstäber weisen un ± SE (n = 3). (D) cAMP Enzymimmunoassays an transfizéierter HEK 293 Zellen. Transfektéiert Zelle ware mat 10 µM Rolipram fir 1 h virbehandelt, an duerno mat 0.1 µM forskolin co-behandelt an ëmmer méi Konzentratioune vu Quinpirol fir 30 min. Net-linear Regressioun gouf vum GraphPad kritt. Feelerstäbe representéiere mëttler ± SE (n = 4; ** p <0.01; zweestänneg t-Tester). (E) Kulturéiert striatal Neuronen aus wilde Typ an p35 Nout Embryonen (DIV 7) goufe mat 10 µM ​​Rolipram fir 1 h gefollegt vu 1 µM ​​Dopamin fir 1 h. Feeler Baren representéieren mëttler ± SE (n = 4; **p& Si besteet; zwee-tailed t-Tester).

Doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Mir hu weider eng potenziell Ännerung vun agonist-stimuléiert G Protein Kupplung zu DRD2 mat Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun mat [³⁵S] -GTP_γS bindend Assay [25], [26]An. DRD2-GFP an DRD2 S321A-GFP mat oder ouni Cdk5 / p35 goufen an HEK 293 Zellen ausgedréckt. Membranen goufen bereet a mat 1 μM Quinpirole stimuléiert a weider erlaabt [³⁵S] -GTP_γS Abezéiung. DRD2-GFP an Cdk5 / p35 ausdrécklech Zellmembran hunn däitlech behënnerte gewisen [³⁵S] -GTP_γS verbindlech am Verglach zu all deenen aneren Zellmembranen (Fig. 4B). Dës Resultater weisen datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun down-reguléiert agonist-stimuléiert G Protein Bindung bei DRD2.

Zousätzlech, quinpirole-Konkurrenz [³H] -spiperone verbindlech Assays goufen ausgefouert fir all potenziell Ännerung vun der Agonist-Affinitéit bei DRD2 duerch Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun z'ënnersichen. Kompetitiv Bindung vun [³H] -spiperone bei der Behandlung vun erhéijen Konzentratioune vu Quinpirol zu der Membranpräparatioun aus transfektéiert gouf gemooss. Konkurréiere Bindung vu Quinpirol an [³H] -spiperone bei DRD2-GFP an DRD2 S321A-GFP hunn ähnlech LogK gemaach_i Wäerter (−9.789 fir DRD2-GFP; −9.691 fir DRD2 S321A-GFP), wat beweist datt d'Affinitéit vu Ligand zu DRD2 net wesentlech vun Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun bei DRD2 beaflosst gëtt (Abb. 4C).

Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun Down-reguléiert den DRD2-cAMP Signaléierungswee

Als nächst wäerte mir iwwerpréift ob d'Modifikatioun vum DRD2 duerch Cdk5 op downstream Signalerweeër beaflosst. Mir iwwerwaacht DRD2-mediéiert Inhibitioun vun forskolin-stimuléiert cAMP Produktioun duerch Adenylyl Cyclase an den Zellen, déi DRD2-GFP an DRD2 S321A-GFP ausdrécken andeems cAMP Enzym Immunassay benotzt. DRD2-ausdrécklech Zellen hu reduzéiert cAMP Niveauen an Äntwert op Quinpirole op enger Dosisofhängeger Manéier. Bemierkenswäert, Co-Ausdrock vun Cdk5 / p35 bedeitend déi maximal Hemmung vun der CAMP Bildung reduzéiert (Fig. 4D, lénksen Tafel). Op der anerer Säit, an der DRD2 S321A-GFP Ausdrockzellen, goufen d'AMP Formatiounen effektiv als Äntwert op d'Quinpirolbehandlung hemmt onofhängeg vum Ausdrock vun Cdk5 / p35 (Fig. 4D, riets Panel). Dës Resultater bedeiten datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DRD2 d'inhibitéierend Aktivitéit vun DRD2 op der downstream cAMP Signaléierungswee bedeit. Fir d'Erscheinunge weider an engem méi physiologesch relevante Kader ze bestätegen, hu mir mat primäre kulturéierten Neuronen aus Knockout Embryonen gebraucht am p35, e wesentleche Cdk5 Aktivator. Primär kultivéiert striatal Neuronen goufe mat 1 µM ​​Dopamin behandelt an duerch cAMP Enzym Immunoassay analyséiert. Neuronen aus p35 Knockout Musse weisen reduzéierter CAMP Niveauen am Verglach mat wilde Typ Neuronen wann se mat Dopamin stimuléiert goufen (Fig. 4E). Taken zesummen, hu mir ofgeschloss datt Cdk5-mediéiert Phosphorylatioun vun DRD2 zu enger Ofsenkung vum hemmenden Toun op der cAMP Werdegang vun DRD2 resultéiert.

Diskussioun

Mir identifizéiert DRD2 als e neie Substrat vum Cdk5. D'Fosforylatioun schéngt den DRD2 Uewerflächausdrock erof ze regléieren andeems d'Schicksal vum DRD2 no der Rezeptorinternaliséierung beaflosst gëtt, doduerch d'DRD2 G reduzéiert_i-Kupplung an erof streamt CAMP Wee. Wéi de Phosphorylatiounsreschter S321 existéiert souwuel an DRD2 laang a kuerz Isoformen, kann de Mechanismus, deen an dëser Studie proposéiert ass, e generelle Reguléierungsmodus am DRD2-mediéierte Signaliséierung sinn.

DRD2 a mëttlere schlank Neuronen gouf net nëmmen als e groussen Dopamin Rezeptor Subtype ugesinn, awer och fir seng Empfindlechkeet fir Verännerunge vun der Verfügbarkeet als Äntwert op Ëmweltstimuli unerkannt. Agonist-induzéiert Desensibiliséierung a Resensibiliséierung vun DRD2 goufen extensiv studéiert [11], [24]. Besonnesch eng Zuel vu Studien hu gewisen datt d'Effekter vun chronescher psychostimuléierender Belaaschtung, sou wéi Kokain an Amphetamin, déi den extrazelluläre Niveau vun Dopamin an der striatal Synapse erhéijen, begleet vun dynamesche Verännerunge vun DRD2 postsynaptesch [36]. Tatsächlech, chronesch Kokain Benotzer sinn bekannt datt se DRD2 Niveauen an der striataler Regioun reduzéiert hunn, an DRD2 Disponibilitéit an der nucleus accumbens (NAcc) weist eng negativ Korrelatioun mat der Medikament Sich a Verstäerkungsverhalen bei Mais an Primaten. [37]-[39]. Dës Befindunge weisen datt d'Funktionalitéit vum DRD2 héich ufälleg ass fir adaptiv oder kompenséierend Reguléierung an Äntwert op verschidde Reizen inklusiv chronescher Medikamentbelaaschtung. Eis Resultater weisen datt de S321 Rescht an der drëtter intrazellularer Schläif vun DRD2 kann duerch Cdk5 phosphoryléiert ginn, wat zu enger Ofsenkung vum hemmende Afloss vun DRD2 op der cAMP Wee resultéiert. Dës Interaktioun proposéiert e neie Reguléierungsmechanismus verbonne mat Cdk5 an dopaminoceptive Neuronen, déi mat der dynamescher Natur vun der DRD2 Uewerfläch Disponibilitéit verbonne sinn.

Et sollt bemierkt ginn datt Cdk5 als e Schlësselkomponent bekannt ass fir adaptiv Ännerunge vun der neuronaler Ëmwelt ze mediéieren. Zum Beispill strukturell a funktionell Verännerunge vun dendritesche Wirbelen an den Neuronen vum limbesche Krees sinn eng vun de Konsequenzen vun der wiederhuelter psychostimuléierender Belaaschtung [40]. Dës Ännerunge si vu verschiddenen molekulare Verännerunge begleet, ënner anerem d'Induktioun vu cAMP-Äntwert Element-verbindlecht Protein (CREB) an ΔFosB, Transkriptiounsfaktoren, déi eng bestänneg Upregulatioun a Äntwert op chronescher Kokainverwaltung weisen [41], [42]. Wichteg ass Cdk5 en Zil vun ΔFosB [19], a vill kritesch Komponenten déi an der dendritescher Wirbeldynamik involvéiert waren, wéi PSD-95, p21-aktivéiert Kinase (PAK), ß-catenin, a Spinophilin, goufen als Cdk5 Substrater gemellt [43]-[46]. Konsequent, genetesch oder pharmakologesch Manipulatiounen vun der Cdk5 Aktivitéit brénge Verännerunge vun der dendritescher Wirbelsäit Morphologie a Verhalensreaktiounen op Kokain, implizéiere kritesch Rollen fir Cdk5 an de molekulare a morphologesche Verännerunge vu mesolimbesche Dopamin Circuiten. [47], [48]. Eis Resultater déi weisen datt DRD2 en neit Zil vun Cdk5 ass zousätzlech Abléck an d'adaptiv Verännerunge vum Dopamin System an Äntwert op chronesch Medikamentbelaaschtungen wéinst der spéiderer ΔFosB-mediéierter Up-Reguléierung vum Cdk5 kann eng Tonic Erhéijung vun der Phosphorylatioun vun DRD2 induzéieren An. Desweideren, DRD2 ass bekannt fir vill cellulär Prozesser ze beaflossen, dorënner Reguléierung vu cAMP a MAP Kinase Weeër a downstream transkriptiouns Eventer [42], [49]. Also, d'Resultater an dëser Studie stellen vläicht net nëmmen eng direkt Reguléierung vun DRD2 vum Cdk5 of. Awer och eng nei Abléck an d'adaptiv Äntwerte vum Dopamin System op chronesch Medikamentekspositioun.

Autor Contributeuren

Erwuess an entworf d'Experimenter: JJ YUP DH SKP. Déi Experimenter gemaach: JJ YUP DKK YK. Donnéeën analyséiert: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Bedeelegt Reagenz / Material / Analyse Tools: YHS. Schreift de Pabeier: JJ SKP.