D'Synapse Densitéit an Dendritesch Komplexitéit ginn am Prefrontal Cortex reduzéiert no Seven Deeg vun der Zwangsstëmmung vun der Kokain Self Administration (2014

Chronesch Kokainbelaaschtung bei mënschlechen Ënnerrieder an an Nagetermodelen vu Sucht reduzéiert d'prefrontalen kortikale Aktivitéit, déi duerno d'Belounung vun der Belounung an d'héchster Opfaatzfunktion erfaasst. D'Net-Effekter vun dësem Behënnerte vu Verhalen ass erhéije Schwieregkeet fir erëmzekréien. Bis ewell hu mer fonnt datt Kokain induzéiert Erhéijunge vum Gehirn vun der neurotrophescher Faktor (BDNF) an der medial Préfrontal cortex (PFC) e neuroadaptive Mechanismus ass deen d'Verstäerkungseffizienz vum Kokain bezeechent. Wéi BDNF bekannt ass fir den neuronalen Iwwerbléck a synaptesche Plastizitéit ze beuerteelen, hu mir d'Hypothese gepréift, datt d'Abstinenz vun der Kokain-Selbstverwaltung zu Ännerungen an der neuronalen Morphologie an der synaptescher Dicht am PFC féieren. Mat enger neier Technik, Array Tomographie a Golgi-Färzen, Morphologesch Changementer an der RFC PFC goufen no der 14 Deeg vun der Kokain-Selbstverwaltung an den 7 Deeg vun der Zwangseinstëmmung analyséiert. Eis Resultater weisen datt dendritesch Dendritesch Verzweigung an total Synaptic Dichtegkeet an der RFC PFC staark reduzéiert ginn. Am Géigesaz, d'Dicht vu dënnen dendritesche Wirbelen gi signifikant erop op Schicht V pyramidalen Neuronen vum PFC. Dës Erklärungen weisen datt dynamesch Strukturreformen bei der Kokain-Abstinenz passen, déi zu der beobachtbarer Hypo-Aktivitéit vum FCKW bei cocaine-südege Mënschen dozou bäidroen.

Déieren a Wunneng

Männlech Sprague-Dawley Ratten (Rattus norvegicus) mat engem Gewiicht vun 250-300 g goufen vun Taconic Laboratories (Germantown, NY) kritt. Déieren goufen individuell mat Iessen a Waasser verfügbar ad libitum an hirem Heem Käfeg gehost. Déi experimentell Protokoller waren all konsequent mat de Richtlinne vun den US National Institutes of Health a goufen vun der Perelman School of Medicine an der University of Pennsylvania an der University of Pennsylvania's Institutional Animal Care and Use Committee approuvéiert.

befënnt

Virun der Chirurgie goufen d'Ratten mat 80 mg / kg Ketamin a 12 mg / kg Xylazin (IP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) anästetéiert. Een indwelling silastesche Katheter (Innendurchmiesser 0.33 mm, Außendurchmesser 0.64 mm) gouf an de richtege Jugelpulse an an der Plaz gesat. De Katheter gouf dann subcutan iwwer d'Schëllerblade passéiert an an eng Platform mat enger Maschinn verwandelt (CamCath, Cambridge, UK) déi direkt ënnert der Haut direkt iwwer de Scapulae nogezunn ass. D'Katheter goufen all Dag mam 0.3 ml vum Antibiotikum Timentin (Ticarcillin-Dinatrium / Kaliumclavulanat, 0.93 mg / ml, Henry Schein, Melville, NY) gespült an op hepariniseter Salzlinn (10 U / ml). D'Katheter goufen mat Plastiks Obsturater verschloss, wann net am Gebrauch sinn.

Kokain un Selbstverwaltung

D'Ratte hu bei 7 Deeg Erliewnisser vun der Operatioun erstallt, ier d'Kokain selwer eng administrativ begleet war. D'Ratte ware regelméisseg op eng vun zwou Gruppen zugewielt: Kokain selwer selbstverständlech Déieren a gestuerwene Saline Kontrollen. All Ratte, déi geschafft hunn, fir contingent Kokain Infusiounen ze reagéieren, war gepaart mat engem gestuerwene Sekteur, deen d'selwescht Zuel an déi temporär Muster vun Infusiounen als selbstverständlech vun der gepaarte Kokain experimentellen Ratten krut. Lever dréit fir d'saline-gereckte Ratten haten keng plangéiert Konsequenzen.

D'Kokain-experimentelle Ratten goufen an de moduläre Operative Chamberen (Med Associates, St. Albans, VT) platzéiert an et huet e Presse fir intravenös Kokainfuere vermieden (0.25 mg Kokain / 59 μl Salz, Infusioun iwwer 5 s) Verhältnis vu 1 (FR1) vun der Verstäerkung. Eng Kéier eng Kokain-Experimentellruecht huet zumindest 20 Infusiounen vum Kokain an enger Operatiouns Sessioun ënner dem FR1-Schema erreecht, gouf d'Responso-Ufuerderung op e FR5-Termin vun der Verstäerkung ëmgeschalt. Fir awer op zwou Festnetzpläng ze reagéieren, ass d'maximal Unzuel vu Kokain Infusioune fir 30 pro Dag vun der Selbstverwaltung begrenzt an en 20-Zäitlimit fir all dës Kokainin infusioun, an deem Zäit aktive Hebelreaktiounen tabelléiert waren awer ouni geplangte Konsequenzen . All Dag 2 h Operatounsessionen (7 Deeg / Woch) goufen vun insgesamt 14 Deeg gemaach. D'Responsungen vum onaktiven Hebel, déi keng plangéiert Konsequenzen haten, goufen och während de FR1- a FR5-Trainingssitzungen opgeholl.

Nodeems de 14^th Déi alldeegste Operatiounssitzung, Kokain-Experimentéiert a gestuerwene Saline Kontrollkriibs goufen an hir Heemegidder zréckgezunn, wou si 7 Deeg vun Drogensabstinenz gedréckt hunn. Am 7^th Dag vun der Kokain-Abstinenz, Gehirnen goufen ofgeschaf, an de PFC ass op Eis geschloen. Siwen Deeg Kokain-Abstinenz hu gewielt fir direkt Vergläicht fir eis virdru verëffentlecht Studie ze préifen, déi Kokain induzéiert Verännerungen vun der PFC BDNF Ausdrock [20].

Perfusioun

D'Ratte waren anästheséiert (100 mg / kg, IP Natrium pentobarbital) a parformaldehyd parformaldehyd am 4 M PB, pH 0.1 (PFA) parfüméiert. Eng Hemisphär vun all Gehir war fir Golgi gefierft an déi aner Hemisphär fir Array Tomographie benotzt. Am Hallefherz vun Array goufen am 7.4% PFA mat 4% Saccharose fir 2.5 Stonnen postuléiert an d'Golgi Hemisphärer goufen post for 2 h an 48% PFA festgeluecht.

Array Tomographie

Array Tomographie Experimenter goufen wéi virdrun beschriwwen [19], [21]. Kuerz gesot, de PFA-fixe Gewëss gouf an Harz eingebett an Coronal (70 nm) Sektiounen op der Niveau vum mPFC goufen geschnidden an als Bändchen gesammelt. D'Ribbons goufen am 50 mM Glycin an Tris hydratiséiert a blockéiert an der Blockéierungsléisung (0.05% Tween / 0.1% bovine Serumalbumin am Tris-Buffer (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). D'Bänner waren gefierft mat primären Antikoden, GAD65 ( Chemicon), PSD95 (Zell Signaliséierung) oder Synaptophysin (Abcam), bei der Blockéierung vun der Léisung iwwer Nuecht bei 4 ° C. Ribbonnen goufen mat Tris-Buffer gewaschen an gefierft mat sekundären Antikörpern bei 150 a Blockéierung Léisung (Goat Anti-Maus Alexa-Miel 488 a Goat Anti-Kanéng Cy3 oder Esel anti-Kaninchen cy5). Ribbons goufe finkt mat DAPI fir ze erméigléiren d'selwescht Site op all Sekt ze fannen. D'Tanne-Skane vu Biller ginn mat engem Zeiss AxioImager Z2 Epifluoreszenzmikroskop gesammelt. Biller aus dem selwechte Site op all eenzel vun 20-30-Serienabschnitten pro Band sinn am 63x mat automatiséierte Programmer fir Array-Tomographie spezialiséiert.

Array Tomographie Analyse

Déi serial Biller vun all Band waren sequentiell opgemaach, an e Stack ëmgeleet a mat den Plugins MultiStackReg a StackReg ausgeriicht (courtesy of B. Busse an der Stanford University a [21], [22]. Crop Boxen (19.5 μmx19.5 μm) goufe benotzt fir Regiounen aus Interesse (ROI) am Neuropil fir Quantifizéierung ze wielen. D'Selektioun huet neuronale Zell Kierper oder aner verdeckt Feature ausgeschloss. Fir automatiséierter Bildanalyse sinn Zorten vun Interesse (oder ROI) fir Synaptophysin, Glutaminsäure-Decarboxylase-65 (GAD65) an PSD95 goufen automatesch mat automatiséiertem Algorithmus am ImageJ geschwächt. D'Crops waren codéiert an d'Analyse war blann a Konditioun. E automatiséiert, threshold-baséiert Detektiounsprogramm fir d'Quantifizéierung vu Puncta, déi als positive Synapsen identifizéiert gouf, benotzt wéi virdrun [23]. D'Densitéit vu presynaptesche Termen, excitative postsynaptic Terminals an de Prozentsaz vun GAD-positiven (hemmende) Synapen goufen aus engem Duerchschnëtt vun 75 Stellplazen pro Tier gesammelt fir aus zwee verschiddene Gewësseklacke vum PFC (n=5 Cocaine behandelt, 5 Salzin behandelte Déieren) fir eng total vu 29,154 postsynaptic Puncta a 53,565 presynaptic Puncta aus 818 Samplingplazen iwwer den 5-salin behandelte Déieren a 29,662 postsynaptic a 17,034 presynaptic punkta aus 588-Samplingplazen iwwer den 5 Kokain behandelte Déieren. Déi mediane Wäerter fir d'Synapsedensity an de Prozentsaz vun hemmungsbeezege Synapsen pro Déier goufen berechent an T-Tester lafen duerch d'Déiere vu Medie fir ze testen, ob et eng Differenz tëscht Gruppengesetz ass.

Rapid-Golgi-Method

Eenzel Deel Golgi Färze gouf wéi virdrun beschriwwen [24], [25]. Kuerz drop ass de mPFC vun enger Hemisphär vun all Déier an 100 μm Koronalabschnitte geschnidden an post-fixéiert am 1% Osmium Tetraoxid, gefollegt vun dräi Wäschen am 0.1 M PB, pH 7.4. Sections goufen ëmgewandelt am 3.5% Kaliumdichromat iwwerluecht, kuerz a wäscht a gëtt mat 1.5% Silbernitrat duerch d'Sandwich-Methode infiltriert [25]. Sections goufen op gelatinesch geschnidden Rutschen mat 20% Sacrose montéiert an duerch eng Rei vu Alkoholkonzentrationen entwässert, gefollegt vu Défatting a Xylen a Coverlippung.

Golgi Analyse

Golgi Rutschbunnen waren codéiert a sinn blann a Konditioun analyséiert an all déi vum selben Experimentatioun analyséiert. Neuronale Biller an Tracungen an repräsentative Biller vun dendritesche Spinnen goufen mat engem opriichte BX51 Olympus-Mikroskop mat enger integréiert motoriséierter Phase (prior Scientific, Rockland, MA) mat engem 20 × 0.7 NA Objektiv gesammelt. Fir dendritesch Verzéierungsanalyse goufen 7 Neuronen fir Analyse pro Déieren ausgewielt. Mir hunn d'Neurite Längt a Komplexitéit mat den Macros NeuronJ a Advanced Sholl Analysis respektéiert. D'Zuel vu Kreeschkierch (Verdeelungspunkte) an de konzentresche Kreeser an den Radien tëscht 5-250 μm (och Basale an Apical Dendriten) gi gemooss an an de Verglach tëscht Gruppen. Fir d'Dilatitude Analyse, 4-5 Segmente vun mindestens 20 μm vun der Länge vun der drëtter Uerdnung Basal Dendriten ginn pro Neuron vun 5-7 Neuronen pro Déier benotzt mat engem Zeiss AxioImager Z2 Epifluoreszenzmikroskop mat engem 63x-Öl-Taux Objektiv. Spin Morphologie war klasséiert wéi virdrun beschriwwen [26]. Linear Spin Densitéit fir all dendritesch Segment a SpinM Morphologie (dënn, stäubend, Pilz, Cup-geformt) vun all Réckwee sinn tëschent de Gruppen verständlech. Open Source Software vum National Institutes of Health (ImageJ) gouf fir Golgi an Array Tomographie Daten Analyse benotzt.

Abstinenz vum Kokain reduzéiert déi total Synapsdicht

Array Tomographie ass benotzt fir d'Verännerunge vun der excitatorescher an inhibitorescher Synapsen ze mellen fir d'spezifesch morphologesch Ännerunge festzeleeën, déi am PFC an der Äntwert op d'Abstinenz vun der Kokain-Selbstverwaltung kommen. Array Tomographie ass eng High-Throughput-Methode déi et erméiglecht fir d'exakt Quantifizéierung vun totalem, inhibitoren a excitatoresche Synapsen an Strukturen déi ze kleng sinn fir richteg korrekt identifizéieren oder lokaliséiert mat traditionellen konfokalen Mikroskopiemethoden [19]. Well esou hemmbar an excitatoresch Synapsen sinn wesentlech Bestanddeeler vun der Droge Belawschaft Schaltungsrhythmus [13], [27], [28] Mir hunn dës Roman Methodologie benotzt fir morphologesch Verännerungen am PFC während der Abstinenz vum Kokain ze bewerten. Seventy nm PFC-Sektiounen aus enger Gehirnhëllef vu 5-Joch-Saline a 5-Kokain-erfuere Ratten goufe mat Antikörpern op PSD95, e postsynaptesche Erregungsmerkmal, Synaptophysin, e presynaptesche Marker a GAD65, wat mam hemmende Neuron a Synapsen markéiert. Synapse Densitéiten an de Prozentsaz vun hemmungsbeezefleche Synapsen goufen an der Kortikale Schicht V (Figure 1A an 1B). Eis Resultater weisen datt an der Abstentenz vum Kokain eng signifikant Reduktioun vun der Synaptophysin Dicht (Figure 1C), déi all presynaptesch Terminals [t (7)=2, p <0.05]. Et war kee signifikante Réckgang an der excitatorescher Synapsdensitéit [t (8)=0.48, p=0.32] gemoos duerch Zielen vu PSD95 puncta (Figure 1D). Interessanterweis war et eng net signifikativ Tendenz zu enger Vergréisserung vun der Prozentsaz vu GAD65-positiv Inhibitoren Synapsen [t (8)=-1.39, p=0.9] (Figure 2E).

 

Figure 1

D'Array Tomographie weist d'Verännerungen vun der Synapsedensity am PFC no folgend 7 Deeg vun der Abstinenz vum Kokain.

 

Figure 2

Eenzel Deel Golgi Analyse weist Ändere vun der Dendritescher Verzweigung an der Wirbelsbildung am PFC no der 7 Deeg vun der Abstinenz aus Kokain.

Abstinenz vum Kokain verringert dendritesch Verzweigung während enger transienter Zuel vu Drock am PFC

D'Golgi-Methode gouf benotzt fir d'Verännerungen an der neuronaler Verzweigung an der dendritescher Wirbeldäsch ze iwwerpréift fir d'ultrastrukturell Verännerungen ze observéieren, déi an der Synapsedensity beobachtet ginn (Figure 1). Mir hunn eng eenzeg Rubrik Schnell Golgi Imprägnatioun an engem Deel vun Neuronen am PFC aus den aneren Hemispherien vun déiselwecht Déieren gemaach déi benotzt goufen fir d'Array Tomographie Studien. Dendritesch Verzweigung, dendritesch Wirbelsäulenzuel a SpinMorphologie goufen evaluéiert. Zwee repräsentative Pyramidalneuronen aus dem PFC vun engem Diktat-Salina-Kontroll a Kokain-Expositiounsratt ginn an Figure 2A. De Sholl Diagramm gemooss gouf d'Zuel vun den Kräizungen (Verdeelungspunkte) an de konzentresche Krees op Radien tëscht 5-250 μm. Eis Resultater weisen datt folgend 7 Deeg vun erzwongener Abstinenz vun der Kokain-Selbstverwaltung eng signifikant Reduktioun vun der dendritescher Komplexitéit hunn (Figure 2B). Zwee Weewe Wiederhuelend Moossnamen ANOVA Analyse vun ausspionéierte Plotdaten huet e wesentleche groussen Effekter vun der Behandlung ugewisen [F_(1,738)=30.59, p <0.0001] a Radius [F_{(245, 738)}=289.6, p <0.0001] (Figure 2B), a confirméiert e Verloscht vun Dendriten déi mat dem Verloscht vu Synapsen gemooss goufen an Array Studien (Figure 1C). Analyse vun der zweeter an drëtter Bestëmmung basilar dendriten huet e signifikante Steigerung vun dendritesche Spinnewieder no der 7 Deeg vun der Kokain-Abstinenz [t (6)=-3.12, p <0.05] (Figure 2D). Méi spezifesch huet d'Abstinenz vun der Kokain Exposition d'Zuel vun dënnem Dréi subtype erhéicht, ouni datt et keen signifikante Effekt op aner Dréi subtypen (Figure 2E), wéi déi zwee verschidde Wiederholungsmethoden ANOVA mat haaptsächlech Auswierkungen vun der Behandlung ugewisen huet [F_(1,30)=11.9, p=0.0017], Dréi subtiler [F_(4,30)=57.7, p <0.0001], an eng bedeitend Behandlung x Wirbelsäite-Ënnertyp Interaktioun [F_{(1, 4, 30)}=8.8, p <0.0001].

D'Autoe wëllen Gavin Sangrey soen fir seng Hëllef mat der Preparatioun vun den Embedded Kapselen.