Dopamino receptorių ekspresija ir pasiskirstymas dinamiškai pasikeičia žiurkių branduolyje po ištraukimo iš kokaino savęs. (2010)

Baltymų susiejimas

Šis metodas buvo išsamiai aprašytas anksčiau (Boudreau ir Wolf, 2005; Ferrario ir kt., 2010). Žiurkės buvo dekapituotos, jų smegenys buvo greitai pašalintos, o visas NAc (arba šerdies ir apvalkalo subregionai) buvo išpjautas ant ledo iš 2mm koroninės sekcijos, gautos naudojant smegenų matricą. Visas NAc audinys buvo nedelsiant supjaustytas į 400μm griežinėliais, naudojant McIllwain audinio smulkintuvą (Vibratome, St. Louis, MO), tuo tarpu mažesni pagrindiniai ir apvalūs subregionai buvo smulkinti rankomis, naudojant skalpelį. Po to audinys buvo pridėtas į Eppendorf mėgintuvėlius, kuriuose yra ledo šaltas dirbtinis CSF, įdėtas su 2 mM bis (sulfosukcinimidil) subertuotu (BS³; Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Kryžminimo reakcijai buvo leista tęsti 30 min 4 ° C temperatūroje, švelniai maišant, ir tada jis buvo nutrauktas pridedant 100mM glicino (10 min 4 ° C). Audinys buvo išpilstytas trumpu centrifugavimu, pakartotinai suspenduotas ledo šaltoje lizės buferyje, turinčiame proteazės ir fosfatazės inhibitorių, ultragarsuojamas 5 sek. Ir vėl centrifuguojamas. Supernatanto alikvotinės dalys buvo laikomos -80 ° C temperatūroje, kol bus analizuojamos Western blotting.

Western blot analizė DARs kryžminiuose audiniuose

Mėginiai (20-30μg bendras baltymas / lizatas) buvo elektroforezuojami 4-15% Tris-HCl geliuose (Biorad, Hercules, CA). Baltymai buvo perkelti į polivinilidenfluorido membranas imunoblotavimui naudojant pastovią srovę (1.15mA) 1.5 h. Siekiant išvengti pernelyg didelio šildymo, buvo naudojamas aušinimo ritė. Visą didelės molekulinės masės užpildų perkėlimą patvirtino dažymo geliai po perdavimo Coomassie blue. Be to, mes patikrinome, kad sukryžminę DAR baltymai nebuvo aptikti krūvos gelyje (duomenys nerodomi). Po perkėlimo membranos plaunamos ddH₂O, 1 val. Ore džiovinama kambario temperatūroje (RT), pakartotinai hidratuota 100% MeOH, plaunama 1x Tris buferiniu tirpalu (TBS) ir panardinta į 0.1M NaOH, pH 10 15 min. Tada jie buvo plaunami TBS, blokuojami 3% galvijų serumo albuminu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) TBS-Tween-20 (TBS-T), pH 7.4, 1 val. 4 ° C temperatūroje su antikūnais, atpažinančiais D1 DAR (1: 1000; Millipore; Cat # AB1765P), D2 DAR (1: 1000; Millipore, Billercia, CA; Cat # AB5084P) ir D3 DAR (1: 1000; Millipore; Katė # AB1786P). D4 ir D5 DAR nebuvo analizuojami dėl to, kad trūksta antikūnų, atpažįstančių tiek skersinius, tiek ląstelinius receptorius. Pažymėtina, kad šiuose eksperimentuose naudojamos DAR antikūnų partijos buvo įsigytos 2005-06; dabartinės šių antikūnų partijos (2009-10) rodo skirtingus juostos modelius, kurie nesikeičia audiniuose iš DAR nukritusių pelių (nepublikuotos pastabos). Po pirminio antikūnų inkubavimo, membranos buvo plaunamos TBS-T tirpalu, inkubuojamos 60 min su HRP konjuguotu anti-triušio IgG arba anti-pelės IgG (1: 10,000; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), plaunamos TBS- T, nuplauti ddH₂O, ir panardintas į chemiluminescencinį aptikimo substratą (Amersham GE, Piscataway, NJ). Kai buvo sukurti blotai, vaizdai buvo užfiksuoti „Versa Doc Imaging Software“ („Bio-Rad“). Paviršiaus ir ląstelių ląstelių difuziniai tankiai buvo nustatyti naudojant „Quantity One“ programinę įrangą (Bio-Rad). Paviršiaus, ląstelių ir bendros (paviršiaus + ląstelių) baltymų koncentracijos vertės buvo normalizuotos į bendrą baltymą juostoje, nustatytame naudojant Ponceau S (Sigma-Aldrich) ir analizuojamos su TotalLab (Nelineinė dinamika, Niukaslas, JK). Paviršiaus / ląstelių santykis nereikalavo normalizuoti, nes abi vertės yra nustatytos toje pačioje juostoje. Siekiant ištirti antikūnų specifiškumą, buvo atlikti DAR antikūnų preabsorbcijos tyrimai su kiekvienu antikūnu generuojamu peptidu. D1, D2 arba D3 DAR antikūnas buvo sujungtas su 10 kartus viršijančia peptido koncentracija TBS 500μl, 4 valandų mišinys 4 ° C temperatūroje, praskiestas iki galutinio 20ml tūrio, pridėtas prie membranos ir inkubuotas per naktį. 4 ° C.

D1 DAR

WD45 nerasta jokių reikšmingų skirtumų tarp kokaino ir fiziologinio tirpalo grupių. Tačiau kokaino savarankiško vartojimo poveikis pasireiškė WD1. Visa NAc analizė parodė, kad WD1-Coc grupėje D1 DAR paviršiaus ir (arba) ląstelių santykis yra žymiai didesnis, palyginti su grupėmis, kurias savarankiškai vartojo fiziologinis tirpalas (2a). Tai buvo dėl nedidelio paviršiaus D1 DAR padidėjimo kartu su nedideliu intracelulinių D1 DAR sumažėjimu (nė vienas iš šių dviejų poveikių nebuvo statistiškai reikšmingas), nes nebuvo jokių bendro D1 DAR lygių pokyčių (paviršiaus + ląstelių).2a). NAc branduolyje jokio D1 DAR mato reikšmė nebuvo nustatyta (2b). Vis dėlto NAc korpusas parodė panašius pakeitimus, kurie buvo pastebėti visoje NAc, tačiau šiek tiek patikimesni (2c). Dėl didelio paviršiaus D1 DAR ekspresijos padidėjimo WD1-Coc grupėje buvo padidintas paviršiaus / intracelulinis D1 DAR santykis. Ląstelių ląstelių koncentracija nepakito, tačiau padidėjo bendra D1 DAR koncentracija. Apibendrinant galima teigti, kad didesnė D1 DAR baltymo dalis buvo ekspresuota WD1-Coc žiurkių NAc lukšte, palyginti su WD1-Sal žiurkėmis. D1 DAR pasiskirstymas grįžo į kontrolinę būseną po 45 dienų, kai buvo nutrauktas vartojimas iš kokaino.

Pav 2

D1 DAR paviršiaus ekspresija padidėjo NAc lukšte po 1 ištraukimo iš kokaino savęs.

D2 DAR

Visame NAc, pagrindinis pastebėtas poveikis buvo sumažėjęs D2 DAR ekspresija žiurkėms, kurios savarankiškai vartojo kokainą, palyginti su druskų tirpalu (3a). Tai buvo ryškiausia WD45, kai sumažėjo paviršiaus juosta, visos trys ląstelių ląstelės (~ 55, 75 ir 100kDa), ir iš viso D2 DAR lygiai, lyginant su fiziologiniu tirpalu. WD2-Coc grupėje paviršiaus ir (arba) ląstelėje esančios D45 DAR santykis buvo šiek tiek, bet gerokai padidėjęs dėl didesnio intracelulinio nei paviršiaus D2 DAR kiekio sumažėjimo, galbūt rodo, kad ląstelės kompensuoja sumažintą D2 DAR ekspresiją, paskirstydamos didesnę dalį turimų D2 DAR į paviršių. Svarbu nepamiršti, kad padidėjęs paviršiaus ir (arba) ląstelių santykis nereiškia padidėjusio D2 DAR perdavimo šiuo konkrečiu atveju, nes sumažėjo paviršiaus išraiška D2 DAR. WD1-Coc grupėje vienintelis reikšmingas poveikis buvo D2 DAR monomero (~ 55kDa) ląstelių ląstelių kiekio sumažėjimas, lyginant su WD45-Sal ir WD1-Sal grupėmis, nors ir keletas kitų priemonių taip pat sumažėjo (3a).

Pav 3

Po 2 dienų, kai buvo nutrauktas vartojimas iš kokaino, intraceliulinis ir paviršinis D45 DAR lygis NAc buvo sumažintas.

Bendras D2 DAR ekspresijos sumažėjimas taip pat buvo pastebėtas NAc pagrindiniuose ir apvalkaluose (3b ir 3c, atitinkamai), nors poveikis kevalams buvo labiau ryškus. Taigi, paviršiaus D2 DAR koncentracijos sumažėjo kokaino žiurkėms tik WD45 šerdyje, bet WD1 ir WD45 lukštuose. Iš viso D2 DAR žymiai sumažėjo tik lukštais. Ląstelėse esančių D2 DAR juostų sumažėjimas įvyko abiejose ištraukos dienose tiek šerdyje, tiek lukštuose, nors buvo skirtumų, susijusių su ištraukimu ir regionu, pagal kuriuos ląstelinė juosta parodė statistiškai reikšmingą poveikį. Apibendrinant, DKNUMX DAR paviršius ir intracelulinis baltymų kiekis NAc po kokaino savarankiško vartojimo sumažėjo. WD2 jau pastebėjo tam tikrą sumažėjimą.

D1 DAR paviršiaus ekspresija, nutraukus kokaino savarankišką vartojimą, laikinai padidėja NAc lukšte

Po kokaino savarankiško vartojimo D1 DAR paviršiaus ekspresija padidėjo NAc apvalkale WD1, bet normalizuota WD45, tuo tarpu šerdyje nepastebėta jokių pokyčių, rodančių trumpalaikį padidėjimą, apribotą apvalkalu. Panašūs rezultatai gauti ankstesnėse studijose, naudojant receptorių autoradiografiją. Ben-Shahar et al. (2007) padidėjo D1 DAR tankis žiurkių 20 min (bet ne 14 ar 60 dienų) NAc apvalkale po to, kai buvo nutrauktas išplėstas vartojimas (6 hr / day), savarankiškai vartojant kokainą; - vartojimas (2 val. per parą). Nader et al. (2002) pastebėtas nedidelis D1 DAR tankio padidėjimas lukštuose, bet ne rhesuso beždžionių, nužudytų po paskutinio 100 kokaino savarankiško seanso, branduolys. Po to, kai nutraukus tą pačią schemą, beždžionės 30 dienas įvertino padidėjusį D1 DAR tankį Rostral NAc ir tiek šerdyje, tiek lukštuose, tačiau D1 DAR tankis buvo normalizuotas 90 dienomis (Beveridge ir kt., 2009). Visi šie rezultatai, kaip ir mūsų, rodo trumpalaikį D1 DAR koncentracijos padidėjimą, ypač lukštuose, nutraukus kokaino vartojimą. Tačiau ankstesnis šios grupės tyrimas parodė D1 DAR tankio sumažėjimą NAs (labiausiai tvirta korpuso) rhesuso beždžionių, kurie patys vartojo kokainą daug ilgesnį laikotarpį (18 mėnesiai; Moore ir kt., 1998a). Sumažėjęs D1 DAR surišimas NAc taip pat buvo nustatytas 18 val. Po to, kai buvo nutrauktas išplėstinis gydymo režimas žiurkėms, nors bendras šio kokaino vartojimas šiame tyrime buvo didesnis nei pirmiau aptartų žiurkių tyrimų metu.De Montis ir kt., 1998). Šie rezultatai rodo, kad D1 DAR pritaikymas priklauso nuo daugelio kokaino poveikio aspektų. Kitas aspektas yra tai, kad receptorių autoradiografija matuoja bendrą ląstelių receptorių kiekį, o mūsų baltymų kryžminimo eksperimentai gali atskirti paviršiaus ir ląstelių receptorius. Įdomu tai, kad imunoblotavimo tyrimas parodė, kad žmogaus kokaino vartotojų DKNUMX DAR lygiai didėja.Worsley ir kt., 2000).

Ar laikinas D1 DAR paviršiaus ekspresijos padidėjimas, kurį pastebėjome NAc korpuse, yra svarbus inkubuojamo kokaino troškimo inkubacijai? Tai sunku įvertinti, nes nė viename tyrime nebuvo ištirtas D1 DAR agonistų ar antagonistų įsišvirkštimo į NAc poveikį kokaino, sukeliančio namo narvelio pašalinimą, poveikio (arba dėl kokaino, kuris po išnykimo treniruojasi, atkūrimo). Tačiau D1 receptoriai medialinėje NAc (lukšto ir medialinėje šerdyje) yra susiję su kokainu grįžtamu kokaino atkūrimu po išnykimo, matyt, naudojant mechanizmą, reikalaujantį aktyvaus D1 ir D2 DAR aktyvinimo (Anderson ir kt., 2003; 2008; Bachtell ir kt., 2005; Schmidt ir Pierce, 2006; Schmidt ir kt., 2006). Kartu su mūsų rezultatais tai gali reikšti, kad NAc korpuso neuronai labiau reaguoja į D1 DAR medijuojamą kokainą, norėdami anksti pasitraukti dėl trumpalaikio D1R reguliacijos. Vis dėlto atsargumo priemonės turi būti taikomos ekstrapoliuojant nuo pakartotinio inkubacijos tyrimų, nes ekstinkcijos mokymas ir naminių narvų pašalinimas yra susijęs su skirtingomis neuroadaptacijomis NAc (Sutton ir kt., 2003; Ghasemzadeh ir kt., 2009; Vilkas ir Ferrario, 2010). Svarbu pažymėti, kad D1 DAR bazolateriniame amygdaloje ir prefrontalinėje žievėje taip pat yra svarbūs, kad būtų skatinamas kokaino ieškojimas (pvz., Ciccocioppo ir kt., 2001; Alleweireldt ir kt., 2006; Berglind ir kt., 2006).

Ląstelių lygiu tiek presinaptiniai, tiek postinaptiniai DAR gali moduliuoti vidutinio spygliuočių neuronų, vyraujančių ląstelių tipo ir išeities neurono, gebėjimą veikti.Nicola ir kt., 2000; O'Donnell, 2003). Yra žinoma, kad pakartotinis nekontroliuojamas kokaino vartojimas sustiprina kai kuriuos D1 DAR aktyvinimo poveikius NAc. Taigi, vieną dieną iki vieno mėnesio po gydymo kokainu nutraukimo, visame NAc buvo pastebėtas padidėjęs D1 DAR agonistų gebėjimas slopinti vidutinių spygliuočių neuronų (valdomų jonoforetinio glutamato) aktyvumą.Henry ir White, 1991; 1995). Tačiau padidėjusi D1 DAR paviršiaus išraiška, apie kurią pranešta, mažai tikėtina, kad paaiškins šiuos ankstesnius rezultatus, nes ji apsiriboja apvalkalu ir buvo įrodyta tik WD1. Vieną dieną po kokaino vartojimo 10-14 dienų praėjus kelioms kartotinėms kokaino injekcijoms, Beurrier ir Maleka (2002) pastebėtas DA-medijuojamo eksitacinių sinaptinių atsakų slopinimo padidėjimas NAc vidutinio spygliuočių neuronuose, kurie, matyt, buvo tarpininkauti presinaptiniais D1 tipo DAR glutamato nervų terminaluose. Tačiau galimas poveikio injekcijos poveikis (pvz., Žr. \ T Boudreau ir kt., 2007 ir Kourrich ir kt., 2007) kartu su rūšių skirtumais ir pagrindinių įrašų trūkumu sunku palyginti jų rezultatus su mūsų pačių duomenimis. Taip pat reikėtų pažymėti, kad DAR naudojami agonistai ir antagonistai Henry ir White (1991; 1995) ir Beurrier ir Malenka (2002) nesiskyrė D1 ir D5 DAR.

Nustojus vartoti kokainą, D2 DAR sumažėja NAc

Pagrindinis mūsų tyrime nustatytas poveikis buvo D2 DAR baltymo sumažėjimas tiek NAc šerdyje, tiek lukštuose, nutraukus kokaino savarankišką vartojimą, palyginti su fiziologiniu tirpalu. Tai buvo ryškesnė apvalkale, kur tiek WD1, tiek WD45 sumažėjo intraceliulinė, paviršinė ir bendra juosta. Iš esmės D2 DAR paviršiaus ekspresija sumažėjo tik WD45 ir bendras D2 DAR lygis reikšmingai nesumažėjo. Kituose tyrimuose taip pat nustatyta, kad nutraukus kokaino savarankišką vartojimą sumažėjo D2 DAR ekspresija. Reesus beždžionėms, turinčioms didelę kokaino savarankiško vartojimo patirtį, D2 DAR tankis, išmatuotas receptoriaus autoradiografija, daugelyje striatų regionų, įskaitant NAc šerdį ir lukštą, sumažėjo, kai audinys buvo gautas iš karto po paskutinės sesijos (Moore ir kt., 1998b; Nader ir kt., 2002). Naudojant PET, šis poveikis baziniame ganglijoje buvo nustatytas per 1 savaitę, kai buvo pradėtas vartoti kokainas (Nader ir kt., 2006). D2 DAR kiekio pasveikimo nutraukimo metu greitis gali priklausyti nuo bendro kokaino suvartojimo. Atliekant autoradiografijos tyrimą, D2 DAR lygiai NAc atsigavo po 30 arba 90 dienų po 100 kokaino savarankiško vartojimo nutraukimo kontrolinių verčių.Beveridge ir kt., 2009). Tačiau, atlikus tyrimą su beždžionėmis, kurių ekspozicija buvo ilgesnė (1 metai) ir dėl to padidėjo bendras kokaino vartojimas, 3 iš 5 beždžionių parodė D2 DAR kiekio atsigavimą po 90 dienų, o 2 beždžionėms nepavyko atsigauti net po 12 mėnesių (Nader ir kt., 2006). Apskritai, šie rezultatai gerai atitinka mūsų nustatytus D2 DAR lygių sumažėjimus per pašalinimą.

Žmogaus kokaino narkomanų PET tyrimai taip pat nustatė sumažėjusius D2 DAR lygius daugelyje striatrijos regionų, įskaitant ventralinį striatumą, kurie buvo akivaizdūs ankstyvo pasitraukimo metu, taip pat po 3-4 detoksikacijos mėnesių (Volkow ir kt., 1990, 1993, 1997). Tačiau elgesio reikšmė neaiški, nes D2 DAR prieinamumas neatitinka teigiamo subjektyvaus kokaino poveikio ar sprendimo, kad po pradinės dozės vartoti daugiau kokaino.Martinez ir kt., 2004). Svarbu pažymėti, kad nors kokaino sukeltas kokaino troškimas pasitraukia iš priklausomybės nuo laiko („inkubacija“), tai nėra kokaino sukeltos kokaino paieškos metu.Lu ir kt., 2004a). Todėl rezultatai Martinez ir kt. (2004) palikite atvirą galimybę, kad D2 DAR prieinamumas gali būti koreliuojamas su kokaino sukeltu kokaino ieškojimu. Žema D2 DAR galimybė žmogaus kokaino vartotojams koreliuoja su sumažėjusiu priekinės žievės apykaitos metabolizmu (Volkow ir kt., 1993). Kartu su kitais pakeitimais, tai gali prisidėti prie kontrolės praradimo, kuris atsiranda tada, kai narkomanai patiria narkotikų ar narkotikų suporuotų užuominų, ir didesnį narkotikų svarbą, palyginti su ne narkotikų naudai (Volkow ir kt., 2007; Volkow ir kt., 2009). Pažymėtina, kad sumažėjęs D2 DAR lygis PET tyrime gali rodyti didesnį DA išsiskyrimą, o ne sumažėjusį D2 DAR lygį, tačiau naujausi rezultatai prieštarauja šiam paaiškinimui dėl nuo kokaino priklausomų pacientų (Martinez ir kt., 2009). Be to, atlikus tyrimą dėl žmogaus kokaino naudotojų, nustatyta, kad imunoblotavimo būdu nustatyta tendencija mažinti D2 DAR lygį NAc.Worsley ir kt., 2000).

Žmogaus kokaino narkomanų tyrimai negali nustatyti, ar sumažėjęs D2 DAR prieinamumas yra polinkis į kokainą, bet kiti rezultatai rodo, kad abu yra tiesa. Viena vertus, bandymai su ne narkotikais piktnaudžiaujančiais žmonėmis nustatė atvirkštinę koreliaciją tarp D2 DAR prieinamumo ir pranešimų apie „narkotikų skonį“ vartojant metilfenidatą (Volkow ir kt., 1999; 2002). Šie rezultatai rodo, kad mažas D2 DAR prieinamumas gali padidinti pažeidžiamumą priklausomybei. Panašią išvadą patvirtina tyrimai su reeso beždžionėmis. Socialiai laikomuose beždžionėse socialinio dominavimo pasiekimas padidina D2 DAR prieinamumą striatume, o tai susiję su mažesniu jautrumu kokaino stiprinančiam poveikiui, palyginti su pavaldiniais beždžionėmis (Morgan ir kt., 2002). Socialinis statusas taip pat siejamas su striatalu D2 DAR prieinamumu žmonėms, kurie nėra laisvi (žr.Martinez ir kt., 2010). Kita vertus, ir PET, ir receptorių autoradiografijos tyrimai rodo, kad ilgalaikis kokaino savęs vartojimas sumažina striatalų D2 DAR receptorių prieinamumą individualiai laikomuose beždžionėse, kaip aptarta pirmiau (Moore ir kt., 1998b; Nader ir kt., 2002; Nader ir kt., 2006). Lėtinis kokaino savarankiškas vartojimas taip pat mažina D2 DAR prieinamumą dominuojančiose socialiai apgyvendintose beždžionėse (Czoty ir kt., 2004). Taigi, po ilgalaikio kokaino savarankiško vartojimo, dominuojančių ir pavaldžių beždžionių D2 receptorių prieinamumo ar kokaino sustiprinimo poveikis nebebuvo didelis.Czoty ir kt., 2004). Tačiau abstinencijos metu padidėjęs D2 DAR lygis dominuojančiose beždžionėse sumažėjo ir tai buvo koreliuojama su ilgesne latentine reakcija į naujumą - tai bruožas, numatantis sumažėjusį jautrumą sustiprinančiam kokaino poveikiui (Czoty ir kt., 2010).

Kaip ir žmonėms ir beždžionėms, žiurkių tyrimai parodė, kad mažas D2 DAR prieinamumas yra kokaino pažeidžiamumo rizikos veiksnys. Taigi, PET tyrimai su didelėmis impulsyvumo žiurkėmis (su savybės, susijusios su padidėjusiu kokaino savarankišku vartojimu) rodo sumažintą D2 / D3 DAR prieinamumą ventralinėje stiatumoje (Dalley ir kt., 2007). D2 DAR lygiai NAc taip pat yra mažesni žiurkėms, turinčioms didelį lokomotorinį atsaką į naujumą, kitą požymį, susijusį su priklausomybės pažeidžiamumu (Hooks ir kt., 1994). Mūsų rezultatai žiurkėms rodo, kad sumažėjęs D2 DAR lygis NAc gali būti ir pakartotinio kokaino poveikio pasekmė, atitinkanti tyrimus su beždžionėmis ir žmonėmis (aukščiau). Tačiau dviejuose receptorių autoradiografijos tyrimuose su žiurkėmis nustatyta, kad rezultatai skiriasi nuo mūsų. Ben-Shahar et al. (2007) po nutraukimo (2 min., 20 dienos 14 dienų) DKNUMX DAR kiekio sumažėjo nuo išplėstinės prieigos prie kokaino savarankiško vartojimo režimo, panašaus į mūsų pačių (60 hr / per dieną), nors NAc korpuse pastebėtas sumažėjimas po ribotos prieigos režimo (6 hr / day) ir 2 išėmimo dienų (Ben-Shahar ir kt., 2007). Stéfanski ir kt. (2007) D2 DAR lygių pokyčiai branduolyje ar lukštu 24 h nerasta, nutraukus ribotą prieigą prie kokaino savarankiško vartojimo (2 val. per parą), nors D2 DAR lygiai sumažino kokaino kontrolę. Kaip minėta aukščiau, receptoriaus autoradiografija matuoja bendrą ląstelių receptorių kiekį, o PET ir baltymų kryžminimo tyrimai matuoja ląstelių paviršiaus receptorius.

Apskritai, D2 DAR lygių ir kokaino savarankiško vartojimo santykių tyrimai palaiko modelį, kuriame D2 DAR paprastai riboja kokaino savarankišką vartojimą. Todėl mes siūlome, kad sumažėję D2 DAR lygiai, pastebėti mūsų eksperimentuose, gali prisidėti prie kokaino sukeltų kokaino paieškos po kokaino vartojimo nutraukimo. Ypač tai, kad D2 DAR paviršiaus ekspresija NAc šerdyje sumažėjo WD45, bet ne WD1, kartu su pagrindiniu NAc branduolio vaidmeniu, susijusiu su kokaino ieškojimu, rodo, kad nuo laiko priklausantis D2 DAR sumažėjimas NAc branduolyje gali būti prisidėti prie laiko priklausomo kokaino skatinimo intensyvinimo. Taip būtų galima prognozuoti, kad D2 agonisto infuzija tarp NAc sumažins vartojant kokainą. Deja, jokiuose tyrimuose nebuvo tiriamas NAC D2 DAR vaistų poveikis inkubacijos modeliui. Kita vertus, kokaino pakartotinio gydymo tyrimai rodo, kad D1 ir D2 DAR korpuso ir mediumo pagrinduose bendradarbiauja skatindami kokaino vartojimą (Anderson ir kt., 2003; Bachtell ir kt., 2005; Schmidt ir Pierce, 2006; Schmidt ir kt., 2006). Remiantis šiais duomenimis, mūsų eksperimentuose pastebėta sumažėjusi D2 DAR ekspresija gali sumažinti kokaino vartojimą, tai reiškia, kad atsiranda poveikis, kuris yra priešingas priklausomybei nuo intensyvinimo, kuris iš tikrųjų pastebimas. Neatitikimas gali atspindėti problemas, atsiradusias apibendrinant iš kokaino grįžtamąjį grįžimą po ekstinkcijos mokymų, kad po medikamento pašalinimo būtų pasiektas kokainas.

Nutraukus kokaino vartojimą, NAc šerdyje atsiranda laiko priklausomas D3 DAR paviršiaus ekspresijos padidėjimas.

D3 DAR pirmenybę teikiančių vaistinių preparatų tyrimai kokaino savarankiško vartojimo ir atkūrimo paradigmose rodo, kad D3 DAR antagonistai gali būti naudingi gydant priklausomybę nuo kokaino ir ypač mažinant reaktyvumą su kokainu susijusiais ženklais (Heidbreder ir kt., 2005; 2008; Le Foll ir kt., 2005; Xi ir Gardner, 2007). Šie rezultatai rodo, kad endogeninio DA gali sukelti D3 DAR aktyvavimą tarpininkaujant kokaino paieškai. Mūsų rezultatai rodo, kad D3 DAR paviršiaus ekspresija NAc šerdyje WD1 nepakitusi iš išplėstinės kokaino savarankiško vartojimo, bet padidėjo WD45 kartu su kokaino troškimo inkubavimu. D3 DAR paviršiaus ekspresija ląstelėje žymiai nepadidėjo, nors buvo nedidelis, bet reikšmingas paviršiaus / ląstelių santykio padidėjimas. Atsižvelgiant į D3 DAR transliacijos vaidmenį reaguojant į kokaino sukeltus užuominas ir į branduolio svarbą norint sukelti kokainą, yra viliojanti spėlioti, kad padidėjęs D3 DAR paviršiaus išraiška NAc šerdyje prisidėjo prie kokaino sukeltos kokaino inkubacijos WD45 pastebimas troškimas. Tačiau nenustatyta neuroninė vieta, kurioje D3 DAR antagonistai mažina kokaino vartojimą. Konkrečiai, nė viename tyrime neištirtas D3 DAR injekcijos poveikis NAc, pirmenybę teikiant vaistų nuo kokaino sukeltam kokainui. Kitame modelyje Schmidt ir kt. (2006) nustatė, kad D3 pirmenybę teikiančio agonisto PD 128,907 injekcija į šerdį ar lukštą nesukėlė kokaino atkūrimo po išnykimo.

Mūsų rezultatai paprastai atitinka receptoriaus autoradiografijos tyrimus, kurie nustatė bendrą D3 DAR lygį NAc po kokaino poveikio. Staley ir Mash (1996) pranešė, kad D3 DAR surišimas buvo didesnis kokaino perdozavimo aukoms, palyginti su kontroliuojant amžių. Po sąlyčio su kokainu sąlygotoje vietoje pirmenybės paradigmoje ir tris dienas pasitraukus, pelėms padidėjo D3 DAR rišimasis NAc šerdyje ir apvalkale (Le Foll ir kt., 2002). Neisewander et al. (2004) išmatuotas D3 DAR surišimas žiurkėms, turinčioms didelę kokaino savarankiško vartojimo patirtį, kurios buvo ištirtos dėl kokaino pakartotinio atkūrimo po skirtingų pasitraukimo laikotarpių ir vėliau nužudė 24 h. D3 DAR surišimas NAc buvo nepakitęs WD1, bet padidėjo po ilgesnio laiko (WD31-32), atitinkantis mūsų laikui priklausančio padidėjimo stebėjimą. Be to, gydymas vaistais nutraukimo metu, kad sumažėjo kokaino vartojimas, taip pat sumažino D3 DAR surišimo padidėjimą, o tai rodo, kad D3 DAR reguliavimas yra funkcionaliai susijęs su kokaino paieška. Pažymėtina, kad D3 DAR padidėja Neisewander et al. (2004) buvo reikšmingi šerdyje, o tik lukštuose buvo pastebėtos tendencijos, tačiau subregionai buvo analizuojami NAr rostralioje dalyje, kur šerdis ir apvalkalas yra mažiau skirtingi. Mūsų analizė buvo atlikta ant šerdies ir apvalkalo iš rostralinių ir caudalinių NAc dalių.

Šiam darbui pritarė DA009621, DA00453 ir „NARSAD Distinguished Investigator Award“ apdovanojimas „MEW“, „DA020654“ į MM ir ikimokyklinio nacionalinio tyrimų tarnybos apdovanojimas „DA021488“ KLC.