Savarankiškai vartojamas etanolis atkuria su atsitiktiniu dopamino ir 5-hidroksitriptamino išsiskyrimu susijusius trūkumus priklausomose žiurkėse (1996)

Neurologija. 2010 rugpjūčio 11 d.; 169(1): 182-194. Paskelbta internete 2010 Gegužė 7. doi:  10.1016 / j.neuroscience.2010.04.056

Friedbertas Weissas,Loren H. Parsons,Gery Schulteis,Petri Hyytiä,Marge T. Lorang,Floydas E. Bloomas, irGeorge F. Koob

+ Autorių filialai


  1. 1 Neurofarmakologijos skyrius, Scripps tyrimų institutas, La Jolla, Kalifornija 92037

Abstraktus

Bazinis priekinių smegenų dopaminas (DA) ir 5-HT neurotransmisija buvo susiję su ūmaus etanolio sustiprinimo tarpininkavimu. Neuroadaptacijos teorijos numato, kad kompensaciniai neurocheminių sistemų pokyčiai, kuriuos ūmiai suaktyvina alkoholis, gali sukelti abstinencijos simptomus po lėtinio vartojimo. Norint patikrinti šią hipotezę, DA ir 5-HT išsiskyrimas buvo stebimas mikrodializės būdu priklausomų Wistar žiurkių patinų branduoliuose, pasibaigus 3–5 savaičių etanolio (8.7 % m/t) skystos dietos režimui, 8 val. pašalinimo ir atnaujinant etanolio prieinamumą, apimantį (1) galimybę savarankiškai leisti etanolį (10 % m/t) 60 minučių, po to (2) neribotą prieigą prie etanolio ir skysčio dietos. Rezultatai buvo lyginami su kontrolinėmis grupėmis, kurios poromis buvo maitinamos skysta dieta be etanolio ir buvo išmokytos savarankiškai vartoti etanolį arba vandenį. Nepriklausomoms žiurkėms savarankiškas operantinio etanolio vartojimas padidino DA ir 5-HT išsiskyrimą NAC. Atsisakius lėtinės etanolio dietos, šių siųstuvų išsiskyrimas laipsniškai sumažėjo per 8 valandas. Savarankiškas etanolio vartojimas atkūrė ir palaikė DA išsiskyrimą prieš ištraukimą, tačiau nepavyko visiškai atkurti 5-HT ištekėjimo. 5-HT lygis greitai atsistatė, tačiau per 1 valandą po pakartotinio poveikio etanolio dietai. Šios išvados rodo, kad susikaupusio monoamino išsiskyrimo trūkumas gali prisidėti prie neigiamų emocinių pasekmių, susijusių su etanolio pašalinimu, ir tokiu būdu paskatinti priklausomų asmenų elgesį ieškoti etanolio.

Piktnaudžiavimas alkoholiu ir priklausomybė su jų medicininėmis ir socialinėmis patologijomis išlieka viena didžiausių piktnaudžiavimo narkotinėmis medžiagomis problemų JAV ir visame pasaulyje.Nelsonas ir Stussmanas, 1994 m;Greenfield ir Weisner, 1995 m; Rice'as ir Harrisas, 1995 m). Alkoholis turi anksiolitinį ir euforogeninį poveikį, ir manoma, kad šios savybės prisideda prie ūmaus stiprėjančio alkoholio poveikio, dėl kurio gali tęstis alkoholio vartojimas, o galiausiai – rimtas piktnaudžiavimas ir priklausomybė jautriems asmenims. Pastaraisiais metais padaryta didelė pažanga nustatant neurotransmiterių ir receptorių sistemas, kurios dalyvauja tarpininkaujant ūminiam etanolio stiprinimui (žr. Gianoulakis, 1989 m; Hoffman ir kt., 1990; Samsonas, 1992 m; Sellers ir kt., 1992 m; Froehlich ir Li, 1993 m; Medžioklė, 1993 m; Dotacija, 1994; Tabakoffas ir Hoffmanas, 1996 m; Mihicas ir Harrisas, 1995 m).

Tarp daugybės neuromediatorių sistemų, susijusių su farmakologiniu alkoholio poveikiu, dopaminas (DA) ir 5-HT sulaukė ypatingo dėmesio dėl tariamo jų vaidmens skatinančiame etanolio poveikį.Cloninger, 1987; McBride ir kt., 1991;Engel ir kt., 1992; Samsonas, 1992 m; Sellers ir kt., 1992 m). DA atveju įtikinami elektrofiziologiniai (Gessa ir kt., 1985; Brodie ir kt., 1990 m), neurocheminis (Imperato ir DiChiara, 1986; Wozniak ir kt., 1991 m; Yoshimoto ir kt., 1991 m; Engel ir kt., 1992), ir elgseną (Imperato ir DiChiara, 1986; Walleris ir kt., 1986 m) įrodymai rodo, kad elgsenai svarbios etanolio dozės suaktyvina mezolimbinį DA atlygio kelią. Tiesioginiai DA vaidmens atlygyje už etanolį įrodymai gaunami iš išvadų, kad savarankiškai vartojamas etanolis skatina DA išsiskyrimą NAC (Weiss ir kt., 1993), kad žiurkės pačios suleis etanolį tiesiai į ventralinės tegmentinės ląstelės kūno sritį, esantį mezo-accumbens DA atlygio keliu (Gatto ir kt., 1994 m), o operantas, reaguojantis į etanolį, yra modifikuojamas farmakologiniais agentais, kurie sąveikauja su DA neurotransmisija (McBride ir kt., 1990;Samsonas ir kt., 1991; Hodge ir kt., 1993 m; Rassnick ir kt., 1993). Galiausiai, alkoholio pasirinkimas genetiniuose alkoholizmo modeliuose buvo susijęs su sumažėjusiu DA kiekiu NAC.Murphy ir kt., 1982; Murphy ir kt., 1987; Gongwer ir kt., 1989 m), taip pat padidėjęs jautrumas DA išsiskyrimą didinančiam ir judėjimą aktyvinančiam etanolio poveikiui (Walleris ir kt., 1986 m; Cloninger, 1987; Fadda ir kt., 1989; Engel ir kt., 1992; Weiss ir kt., 1993).

Yra daug įrodymų, kad 5-HT taip pat dalyvauja ieškant etanolio. Etanolis, priklausomai nuo dozės, padidina 5-HT išsiskyrimą NAC (Yoshimoto ir kt., 1992 m), kadangi farmakologinis gydymas, padidinantis sinapsinį 5-HT prieinamumą arba tiesioginis 5-HT perdavimo aktyvinimas receptorių agonistais, slopina savanorišką etanolio vartojimą gyvūnams (žr. Sellers ir kt., 1992 m; LeMarquand ir kt., 1994 m) ir gali sumažinti alkoholio vartojimą žmonėms (Naranjo ir kt., 1984 m, 1987, 1989, 1990; Gorelikas, 1989 m; Monti ir Alterwainas, 1991 m). Serotonerginį vaidmenį piktnaudžiaujant etanoliu taip pat patvirtina ryškūs priekinių smegenų 5-HT kiekio trūkumai, sumažėjusi 5-HT inervacija arba 5-HT1A receptorių reguliavimas genetiškai atrinktose, alkoholiui teikiančiose graužikų linijose.Murphy ir kt., 1982, 1987;Yoshimoto ir kt., 1985 m; Yoshimoto ir Komura, 1987 m; Gongwer ir kt., 1989 m; McBride ir kt., 1990, 1994). Galiausiai subjektyvus etanolio poveikis bent iš dalies priklauso nuo 5-HT neurotransmisijos, nes 5-HT1A receptoriaus agonistai pakeičia (Ženklai ir Schechteris, 1988 m; Grantas ir Kolombas, 1993 m; Krystal ir kt., 1994 m), tuo tarpu 5-HT3 antagonistai blokuoja diskriminacines etanolio stimuliuojančias savybes (Grantas ir Barrettas, 1991 m).

Iki šiol didžioji dalis neurofarmakologinių etanolio sutvirtinimo pagrindų tyrimų buvo atlikti su nepriklausomais gyvūnais. Tačiau norint suprasti piktnaudžiavimo etanoliu mechanizmus, taip pat reikia suprasti biologinį etanolio palaikomo sustiprinimo priklausomiems subjektams pagrindą. Buvo teigiama, kad priklausomybės vystymasis apima prisitaikymą ląstelių arba molekulių lygmeniu, kuris prieštarauja piktnaudžiavimo medžiagų farmakologiniam poveikiui ir dėl to atsiranda abstinencijos simptomų, galinčių paskatinti tolesnį vaisto vartojimą (Koob ir Bloom, 1988). Atsižvelgiant į ankstesnius įrodymus, kad etanolis skatina DA ir 5-HT išsiskyrimą NAC (Imperato ir DiChiara, 1986; Wozniak ir kt., 1991 m; Yoshimoto ir kt., 1992 m; Weiss ir kt., 1993), ši hipotezė numatytų šių neurotransmiterių išsiskyrimo trūkumą pašalinus etanolį. Be to, ši hipotezė taip pat numatytų abstinencijos sukeltų neurocheminių trūkumų panaikinimą po pakartotinio etanolio poveikio. Norėdami patikrinti šią hipotezę, dabartiniais eksperimentais buvo tiriamas lėtinio etanolio poveikio ir etanolio pašalinimo poveikis DA ir 5-HT išsiskyrimui NAC naudojant intracerebrinę mikrodializę, taip pat susikaupusio monoamino išsiskyrimo vaidmuo etanolio palaikomame sustiprinime priklausomiems pacientams. žiurkės.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Tematika

Buvo naudojami Wistar žiurkių (Charles River) patinai, kurie tyrimo metu svėrė 400–600 g. Žiurkės buvo laikomos grupėmis po dvi ar tris, reguliuojamoje drėgmės ir temperatūros (22°C) vivariume 12/12 val. šviesos/tamsos ciklu (05:00 val., 17:00 val.) su ad libitum prieiga prie maisto ir vandens. Visos procedūros buvo atliekamos griežtai laikantis Nacionalinio sveikatos instituto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo.

Elgesio tikrinimo aparatai

Etanolio savarankiško vartojimo mokymas ir mikrodializės bandymai buvo atlikti standartinėse operacinėse kamerose (Coulbourn Instruments, Allentown, PA), modifikuotose, kaip aprašyta anksčiau (Weiss ir kt., 1993), kad būtų galima vienu metu pateikti du skirtingus skystus stiprintuvus ir pritaikyti mikrodializės perfuzijos sistemos komponentus. Trumpai tariant, operacinės kameros buvo aprūpintos dviem ištraukiamomis svirtimis. Atsakant į atitinkamą operandą, į vieną iš dviejų indų (tūrio talpa 0.1 ml), esančių 0.15 cm virš tinklelio grindų ir tarp svirtelių, esančių operanto kameros priekinės plokštės centre, buvo įpilta 4 ml etanolio tirpalo arba vandens. Operacinės kameros buvo laboratorinėje procedūrų patalpoje, pritvirtintoje prie vivariumo, ir buvo uždarytos į garsą slopinančias, vėdinamas aplinkos kabinas (Coulbourn Instruments, Allentown, PA). Skysčių tiekimas ir elgsenos registravimas buvo kontroliuojamas mikrokompiuteriu.

Etanolio savarankiško vartojimo mokymai

Žiurkės buvo išmokytos savarankiškai leisti etanolį arba vandenį, atliekant dviejų svirčių, laisvai pasirenkamą operantinę užduotį, naudojant modifikuotą (Weissas ir Koob, 1991 m) saldaus tirpalo blukimo procedūra (Samsonas, 1986 m). Iš pradžių žiurkėms buvo taikomas 22 valandų vandens netekimo grafikas (apribotas iki dviejų dienų iš eilės) ir kasdien 30 minučių buvo mokoma reaguoti į bet kurią iš dviejų 0.2 % (m/v) sacharino tirpalo svirčių pagal nuolatinio stiprinimo grafiką. Sėkmingai įsigijus operantinį atsaką, namų narve vanduo vėl buvo prieinamas ad libitum. Kitas 6 dienas reaguojant viena turima svirtimi buvo pristatytas 0.1 ml etanolio (5%)/sacharino (0.2%) tirpalo. Tada gyvūnai buvo mokomi pagal vienodą grafiką, pagal kurį kiekvieną kartą paspaudus vieną svirtį buvo tiekiamas etanolio/sacharino tirpalas, o paspaudus kitą svirtį, vandens buvo pateiktas vienodu tūriu (0.1 ml). Vėlesnių treniruočių metu etanolio koncentracija buvo palaipsniui didinama iki 10% (m/t), o sacharino koncentracija buvo lėtai mažinama, o po to visiškai pašalinamas saldiklis iš geriamojo tirpalo. Pasibaigus šiam saldaus tirpalo išblukimo etapui, kuris truko 19 d., savarankiško vartojimo sesijos buvo tęsiamos dar 16–21 d., kol buvo pastebėtas stabilus etanolio (10 % m/t) suvartojimo lygis. Visi laisvai pasirenkami mokymai ir bandymai buvo atlikti be maisto ar skysčių apribojimų.

Norint kontroliuoti paprasto poveikio operantinei dėžei poveikį neurotransmiterio išsiskyrimui, taip pat buvo paruoštos etanolio nenaudotos žiurkės, pripratusios prie bandymo aplinkos. Kad būtų galima gauti panašias į etanolį vartojančių žiurkių operacijų istorijas, šiems kontroliniams gyvūnams iš pradžių taip pat buvo taikomas 22 valandų skysčių ribojimo grafikas (apribotas iki dviejų dienų iš eilės), tačiau jie buvo mokomi svirties spausti tik vandenį. Gavus operantinį atsaką, namų narve vėl buvo galima gauti vandens ad libitum, tačiau žiurkės ir toliau kasdien 30 minučių galėjo patekti į vandenį savaiminio vartojimo kamerose. Atitinka ankstesnius rezultatus (Weiss ir kt., 1993), šie gyvūnai nustojo reaguoti į vandenį pastebimu greičiu be tolesnio nepritekliaus, todėl buvo tinkama „nemotyvuota“ kontrolinė grupė.

Stereotaksinė chirurgija

Kai buvo pasiektas stabilus etanolio savaiminio vartojimo lygis, žiurkėms buvo stereotaksiškai implantuota budrumo mikrodializė su lėtine nerūdijančio plieno kreipiančia kaniule, nukreipta į NAC, taikant halotano (1.0, 1.5–313, 2.0%) anesteziją. Vadovo kaniulės (C1.3CS, Plastics One, Roanoke, VA) buvo nuleistos vienašališkai iki 1.6 mm virš dializės vietos nugaros krašto ir pritvirtintos nerūdijančio plieno kaukolės varžtais ir dantų cementu. Kalbant apie bregmą, koordinatės buvo priekinės +4.2, vidurinės ±XNUMX ir vidurinės –XNUMX pagal atlasą (Paxinos ir Watson, 1986). Naudojant mikrodializės zondus su 2.0, 6.2 mm aktyviais membranos antgaliais (išsikišusiais už kreipiančiosios kaniulės), dializės vietos buvo tarp ventralinių koordinačių –8.2 ir –XNUMX.

Priklausomybės nuo etanolio sukėlimas: skystos dietos

Praėjus 4 dienoms po operacijos, atsakas į etanolį buvo patikrintas atnaujinant kasdienes 30 min. savarankiško etanolio vartojimo sesijas. Kai vėl buvo pastebėtas stabilus suvartojimo lygis, žiurkės tapo priklausomos nuo etanolio, naudojant skystos dietos metodą (Lochry ir Riley, 1980 m). Išsami informacija apie šioje laboratorijoje pritaikytą skystos dietos procedūrą buvo pranešta anksčiau (Rassnick ir kt., 1992). Trumpai tariant, etanolio dieta buvo ruošiama šviežiai kasdien (nuo 9:00 iki 10:00 ryto), papildant šokolado skonio Sustacal – visavertį skystą maistą (Mead Johnson, Inc.) etanoliu (95 % m/t), vitaminu. /mineralų mišinio (ICN Nutritional Biochemicals) ir vandens, kad būtų sukurta skysta dieta, kurioje yra etanolio (8.7 % m/t), kuri suteikia apie 35 % etanolio gautų kalorijų (Lochry ir Riley, 1980 m). Atliekant panašų ankstesnį darbą mūsų laboratorijoje, ši procedūra paprastai sukelia etanolio koncentraciją kraujyje (BAC), svyruojančią nuo 80 iki 180 mg%.Merlo Pich ir kt., 1995 m; Schulteis ir kt., 1996). Kontrolinės žiurkės gavo vienodo kaloringumo dietą be etanolio, kurioje buvo sacharozės. Kad žiurkių suvartojamų kalorijų kiekis ir kūno svoris, laikantis kontrolinės dietos, būtų lygūs etanoliu paveiktų žiurkių šėrimui, buvo taikoma porinio šėrimo procedūra, pagal kurią gyvūnams, kuriems buvo skirta etanolio dieta, buvo suteikta neribota prieiga, o kontrolinė dieta buvo duodama ribotais kiekiais kiekvieną dieną ( Daugiau informacijos žr Schulteis ir kt., 1996).

Intrakranijinė mikrodializė

Perfuzijos sistema. Anksčiau aprašyta perfuzijos sistema (Weiss ir kt., 1993) modifikuotas, kad atitiktų metodusParsons ir teisingumas (1992) buvo naudojamas. Trumpai tariant, dializės įleidimo ir išleidimo vamzdelius sudarė lydytas silicio dioksidas (40 μm id) ir buvo apsaugotas lankstaus kaniulės jungties spyruoklinio dangtelio viduje (C313CS, Plastics One, Roanoke, VA). Dializės įleidimo vamzdelis buvo perduotas iš perfuzijos siurblio į mikrodializės zondą per dviejų kanalų skysčio pasukimą (Instech, Plymouth Meeting, PA), esantį virš narvelio centro, naudojant balansavimo svirtį. Įleidimo vamzdeliai buvo prijungti per skysčio pasukimą prie 1 ml Hamilton švirkšto, kuriame buvo dirbtinis CSF (aCSF) kaip perfuzinė terpė. Perfuzijos terpė buvo tiekiama be impulsų švirkšto pompa (CMA/100; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN). Dializatas buvo surinktas rankiniu būdu į 250 μl mikrofrakcijos buteliukus. Mėginiai buvo nedelsiant užšaldyti ant sauso ledo ir iki tyrimo laikomi –70 °C temperatūroje.

Medžiagos ir bendrosios procedūros. Intracerebrinės kreipiamosios kaniulės ir koncentriniai mikrodializės zondai (išorinis skersmuo: 300 μm; membraninė medžiaga, regeneruota celiuliozė; ilgis, 2 mm) buvo sukonstruoti taip, kaip aprašyta Parsons ir teisingumas (1992). Zondai buvo perfuzuoti aCSF 0.2, 5 μl / min greičiu ir lėtai įterpiami taikant trumpą, negilią halotano anesteziją (< 16 min.) 10 valandų prieš pradedant tyrimą ir dializato surinkimą. [Penki gyvūnai buvo išbandyti su komerciniais mikrodializės zondais (CMA/0.5; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN), perfuzuotais 2 μl/min srauto greičiu.] Kad žiurkės būtų pripratintos prie mikrodializės tyrimo procedūrų, gyvūnai kasdien buvo prijungiami prie neaktyvią perfuzinę sistemą (be mikrodializės zondų) namų narve ∼ XNUMX savaites prieš tyrimą.

Perfuzijos terpė. ACSF, susidedantis iš 149 mm NaCl, 2.8 mm KCl, 1.2 mm CaCl2, 1.2 mm MgCl2 ir 5.4 mm dbuvo naudojama gliukozė (pH 7.2–7.4). Kaip antioksidantas buvo pridėta askorbo rūgšties, kurios koncentracija (0.25 mm) panašus į tą, kuris randamas tarpląstelinėje erdvėje.

Eksperimentinis dizainas ir procedūros

Lėtinės etanolio ekspozicijos (PRIKLAUSOMAS), nutraukimo ir vėlesnio operatyvinio savarankiško vartojimo poveikis ekstraląsteliniam DA ir 5-HT lygiui (matuojamas įprastine mikrodialize) buvo lyginamas su dviem kontrolinėmis sąlygomis, kurias sudarė (1) „prie etanolio aklimatizuotos“ žiurkės. su tokia pačia etanolio vartojimo savarankiško mokymosi istorija, bet nepriklausančios nuo etanolio (NONPRIKLAUSOMAS), ir (2) žiurkės, neveikiančios etanolio, išmokytos savarankiškai leisti tik vandenį (ETHANOL-NAIVE). Kad būtų užtikrintas panašus etanolio suvartojimo pasiskirstymas dviejose eksperimentinėse grupėse, kuriose etanolis buvo paveiktas, tik žiurkėms, kurių etanolio suvartojimas stabilus (±10 % per tris dienas iš eilės pasibaigus savarankiško vartojimo mokymui) yra bent 0.5 g/kg/30 min sesija buvo įtraukta į eksperimentą. Tada žiurkės, atitinkančios šį atrankos kriterijų, buvo kiek įmanoma suderintos pagal jų pradinį etanolio suvartojimą prieš priskiriant NEPRIKLAUSOMS ir PRIKLAUSOMS sąlygoms. Trys žiurkių grupės buvo laikomos etanolio (PRIKLAUSOMAS) arba kontrolinės skystos dietos (NONDEPENDENT ir ETHANOL-NAIVE) kaip vienintelis mitybos ir skysčių šaltinis. Skystos dietos ekspozicijos trukmė buvo 3–5 savaitės (vidutinis ± SEM dienų skaičius: 26.95 ± 2.19) PRIKLAUSOMS ir NEPRIKLAUSOMS žiurkėms, o 2–3 savaitės (16.84 ± 1.65 d.) ETHANOL-NAIVE grupėje. Per tą laiką nebuvo atliekami savarankiško gydymo seansai, o žiurkės liko uždarytos savo namų narvuose. Ekstraląstelinės DA ir 5-HT koncentracijos NAC mikrodializės būdu buvo pradėtos stebėti žiurkių namų narvuose per paskutines 2 valandas po ekspozicijos skysto etanolio racione (arba atitinkamą laikotarpį nepriklausančioms ir etanolio nevartojusioms žiurkėms) ir toliau. per vėlesnius pasitraukimo ir savarankiško vartojimo etapus. Tada etanolio pašalinimas buvo nusodintas, pakeičiant kontrolinę skystą dietą etanolio turinčia dieta (40 ml) 8 valandas. Siekiant kuo labiau suvienodinti kontrolinės dietos kiekius, suvartotus trijų gydymo grupių bandymo dieną, NEPRIKLAUSOMS ir NEPRIKLAUSOMS žiurkėms buvo duotas ribotas ėdalo kiekis, lygiagrečiai su PRIKLAUSOMIS žiurkės suvartoto maisto kiekiu. Konkrečiai, nuo mikrodializės zondų įdėjimo (vakarą prieš eksperimentą) iki „atsitraukimo“ fazės pradžios, NEPRIKLAUSOMS ir NEPRIKLAUSOSIOS etanolio žiurkės gavo 70 ml kontrolinės dietos, atitinkančios vidutinį suvartoto etanolio kiekį. PRIKLAUSOMIS žiurkėmis. Nutraukimo fazės pradžioje ETHANOL-NAIVE ir NONDEPENDENT grupės gavo papildomą 40 ml kontrolinės dietos, atitinkančios kiekį, skirtą PRIKLAUSOMS žiurkėms. Visos žiurkės suvalgė didžiąją dalį kontrolinės dietos iki abstinencijos fazės pabaigos, o suvartoto maisto kiekio skirtumai tarp grupių nebuvo akivaizdūs. Po 4–6 valandų ištraukimo žiurkės buvo perkeltos į savo namų narvus iš vivariumo į laboratorijos kambarį, kuriame buvo savarankiško vartojimo stotys, kur jos liko savo namų narvuose iki 8 valandų po etanolio. Hunter ir kt., 1974 m; Rassnick ir kt., 1992; Schulteis ir kt., 1996). Šiuo metu gyvūnai buvo patalpinti į operacines kameras ir jiems buvo suteikta galimybė 10 minučių savarankiškai vartoti 60% (m / tūrio) etanolio (PRIKLAUSOMAS ir NEPRIKLAUSOMAS) arba vandenį (ETHANOL-NAIVE). Praėjus trisdešimčiai minučių po savarankiško vartojimo, žiurkės buvo grąžintos į savo namų narvus, kur jos gavo neribotą prieigą prie savo atitinkamų dietų. Bandymai buvo atlikti tuo pačiu paros metu (nuo 6:00 iki 10:00) visoms žiurkėms. Viso eksperimento metu dializatas buvo renkamas 20 minučių intervalais, išskyrus operantinio etanolio savaiminio vartojimo metu, kai mėginiai buvo imami kas 10 minučių.

HPLC monoamino tyrimai

DA ir 5-HT dializato koncentracijos kiekviename mėginyje buvo nustatytos vienu metu mikrobūriniu atvirkštinės fazės HPLC. Dializatas buvo įšvirkščiamas į 5 μm ODS-2 kolonėlę (0.5, 100 × 1.0 mm; supakuota namuose) per VALCO aukšto slėgio vožtuvą su 0.02, XNUMX μl vidine mėginio kilpa. Mobiliąją fazę sudarė citrinų rūgštis (XNUMX m)/natrio fosfatas (vienbazis, 0.04 m) buferis, kuriame yra 0.82 mm 1-dekansulfonrūgštis kaip jonų poravimo reagentas, 4.9 mm trietilaminas, 0.2 mm Na2EDTA ir 19 % metanolio (pH 5.4). Mobilioji fazė buvo pumpuojama per kolonėlę ISCO (500 modelio) HPLC švirkšto siurbliu 16 μl/min greičiu. Analitės buvo aptiktos elektrocheminiu būdu, naudojant EG&G Princeton Applied Research [(PARC) model 400] amperometrinį valdiklį, stiklinį anglies darbinį elektrodą (PARC, modelis MP 1304) ir Ag/AgCl etaloninį elektrodą (BAS, modelis RE1). Taikytas potencialas buvo 700 mV (palyginti su Ag/AgCl). Aptikimo ribos, apibrėžtos signalo ir triukšmo santykiu >2, buvo 0.5 nm tiek DA, tiek 5-HT.

Alkoholio kiekio kraujyje nustatymas

BAC buvo matuojamas vieną kartą kiekvienai žiurkei praėjus 3–4 dienoms po pakartotinio eksperimentinio etanolio dietos poveikio. Buvo nustatyti BACpo eksperimentų užbaigimas tik dėl to, kad atliekant kraujo mėginių ėmimo procedūras mikrodializės tyrimo metu gali atsirasti neuromediatorių išsiskyrimo artefaktų. 0.1 ml kraujo mėginys buvo paimtas tail bleed metodu nuo 12:00 iki 2:00. Kraujas buvo paimtas į sandarius Eppendorf buteliukus, kuriuose buvo 4 μl heparino (1000 USp vienetų/ml) kaip antikoaguliantą, ir centrifuguojamas 3200 aps./min. . Serumas buvo ekstrahuotas trichloracto rūgštimi ir tiriamas etanolio kiekis, naudojant NAD-NADH fermento spektrofotometrinį metodą (Sigma, St. Louis, MO).

Histologija

Baigus eksperimentus, mikrodializės vietos buvo histologiškai ištirtos. Smegenys buvo pašalintos nužudžius 5% halotanu ir laikomos 10% formaldehido. Vėliau zondo išdėstymas NAC buvo patikrintas iš 50 μm užšaldytų, krezilo violetine dažytų sekcijų. Visais ištirtais atvejais mažiausiai 80% aktyvios dializės membranos dalies buvo anatominėse NAC ribose (XNUMX pav.). 1).

Pav. 1.

Anatominė mikrodializės zondų vieta.Vertikalios žymės žymi „aktyviąsias“ dializės membranų sritis. Visi zondo išdėstymai buvo paskirstyti 1.20, 2.20–0.80, 1.80 mm priekyje ir XNUMX, XNUMX–XNUMX, XNUMX mm į šoną nuo bregmos.

Duomenų analizė

Dializės neuromediatorių koncentracijų skirtumai tarp PRIKLAUSOMO, NEPRIKLAUSOMO ir NEPRIKLAUSOMO etanolio grupių buvo analizuojami mišriomis faktorinėmis (grupės × mėginių ėmimo intervalai) ANOVA, naudojant atskiras DA ir 5-HT analizes. Dializės frakcijose, surinktose operacinės savaiminio vartojimo fazės metu, buvo analizuojami monoamino koncentracijų skirtumai, palyginti su paskutiniais trimis išlaukos laikotarpio mėginiais, ir „bazinio lygio procentais“ pokyčiai, palyginti su vidutinėmis DA ir 5-HT koncentracijomis per paskutinę pašalinimo valandą. . Patvirtinus reikšmingus pagrindinius efektus arba sąveikas bendruose ANOVA, skirtumai tarp atskirų vidurkių buvo nustatyti Simple Effects ANOVA ir Duncan's Multiple Range post hoc testais. Priklausomų ir NEPRIKLAUSOMIŲ žiurkių savarankiško etanolio vartojimo duomenys buvo išanalizuoti dėl etanolio suvartojimo skirtumų dviejų uodegų Studento.t testas.

REZULTATAI

Savarankiškas etanolio vartojimas ir elgesio stebėjimai

Operantinio savarankiško administravimo mokymai

Keturiasdešimt trims žiurkėms buvo atlikta sacharino išblukimo etanolio savaiminio vartojimo mokymo procedūra. Kaip ir ankstesniame darbe (Weiss ir kt., 1990; Weiss ir kt., 1993), daugumai gyvūnų pasireiškė stabilus savarankiško etanolio vartojimo greitis, kai kasdien suvartojama pakankamai, kad susidarytų farmakologiškai svarbios BAC. Žiurkės, kurioms nepavyko gauti nei reikšmingo, nei patikimo paros etanolio suvartojimo (n = 11) buvo pašalinti iš tolesnio mokymo ir testavimo. Vidutinis ± SEM 30 min. etanolio suvartojimas savarankiško vartojimo treniruotės pabaigoje buvo 0.72 ± 0.10 gm/kg žiurkėms, kurioms vėliau buvo priskirta DEPENDENT (n = 11) būklė ir 0.68 ± 0.05 gm/kg žiurkėms, priskirtoms NEPRIKLAUSOMS (n = 10) grupė. Vandens suvartojimas buvo įvairus, tačiau vidutiniškai nesiekė 40 % suvartojamo etanolio. Visos ETHANOL-NAIVE žiurkės (n = 11) kontrolinė grupė sėkmingai reaguodavo į vandenį, bet nustojo reaguoti, nes pradiniame etape nebuvo nuolatinio vandens trūkumo.

Skysta dieta

Kasdienis skysčių suvartojimas skystos dietos pradžioje svyravo nuo maždaug 70 iki 80 ml/d., atitinkantis 6.1–7.0 g etanolio paros dozes. Dietos suvartojimas per 3–5 gydymo savaites padidėjo iki 100–120 ml per dieną (atitinka 8.7–10.4 g etanolio). Vidutinė ± SEM alkoholio koncentracija kraujyje 3 ar 4 dieną po pakartotinio etanolio dietos, išmatuota praėjus 2–3 valandoms po gėrimo butelių papildymo šviežiu skystu maistu, buvo 98.0 ± 21.7 mg%. Nepriklausomų (549.9 ± 20.4 g), poromis maitinamų NEPRIKLAUSOMU (503.8 ± 5.4 g) ir kontrolinės dietos poriniu etanoliu-naivių maitintojo skysčių dietos pabaigoje reikšmingų vidutinių ± SEM kūno svorio skirtumų nepastebėta. (463.5 ± 32.3 g) grupės (F (2,29) = 3.37; NS).

Etanolio pašalinimas

Elgesio stebėjimas po etanolio dietos pašalinimo patvirtino lengvo abstinencijos sindromo buvimą, panašų į aprašytą kituose darbuose, naudojant panašias skystos dietos procedūras, siekiant sukelti priklausomybę nuo etanolio.Hunter ir kt., 1974 m; Merlo Pich ir kt., 1995 m; Schulteis ir kt., 1996). Nors nebuvo taikomos jokios specialios kiekybinės priemonės, pastebėti abstinencijos požymiai buvo hiperreaktyvumas, retkarčiais drebulys arba uodegos standumas.

Lėtinio etanolio poveikis baziniam neuromediatorių lygiui

Nors DA ir 5-HT buvo stebimi tuo pačiu metu tiems patiems gyvūnams, kai kuriais atvejais baziniai vienos ar abiejų analičių lygiai buvo mažesni už aptikimo ribas. Vadinasi, duomenų apie DA nebuvo prieinama apie dvi žiurkes kiekvienoje iš PRIKLAUSOMO, NEPRIKLAUSOMO ir NUO ETANOLIŲ NEPRIKLAUSYTŲ gyvūnų grupių, tuo tarpu 5-HT duomenų nebuvo apie tris PRIKLAUSOMS, dviem NEPRIKLAUSOMS ir trims nuo etanolio NEPRIKLAUSOMS gyvūnams. Gauti mėginių dydžiai buvo n = 9/8 (DA/5-HT) PRIKLAUSOJE, n = 8/8 (DA/5-HT) NEPRIKLAUSOJE irn = 9/8 (DA/5-HT) ETHANOL-NAIVE grupėse.

Vidutinė ± SEM bazinio dializato neuromediatorių koncentracijos, išmatuotos per paskutines 2 valandas po kontrolinio skysto maisto raciono, žiurkėms, kurių etanolis nenaudojo, buvo 3.45 ± 0.64 n.m DA ir 1.15 ± 0.22 nm skirtas 5-HT. Palyginti su kontroline grupe ETHANOL-NAIVE, bazinio dializato DA lygiai PRIKLAUSOMS žiurkėms iš esmės nepakito, o reikšmės buvo 3.90 ± 0.68 n.m. Priešingai, šių gyvūnų dializato 5-HT koncentracija buvo žymiai padidėjusi iki 1.78 ± 0.28 nm (žr. 3). Statistinė analizė patvirtino, kad 5-HT ištekėjimas priklausomoms žiurkėms buvo žymiai didesnis nei ETHANOL-NAIVE (p < 0.05) ir NEPRIKLAUSOMAS (p < 0.05) gyvūnai (Dancan's po ANOVA):F (2,21) = 3.98; p <0.03).

Pav. 3.

Dopaminas (viršų) ir serotoninas (dugnas) ištekėjimas per paskutinę skysto etanolio dietos (PRIKLAUSOMAS) arba vienodo kaloringumo kontrolinės dietos (NONDEPENDENT ir ETHANOL-NAIVE) valandą ir vėlesnį 8 valandų išlauką. Duomenys pateikiami kaip bazinių verčių vidurkis ± SEM procentas iš trijų iš eilės 20 minučių mėginių rinkinių, paimtų kas 2 valandas [*p < 0.01; skiriasi nuo bazinių (0 laiko) lygių]. Įterpimai, vidurkis ± SEM DA (viršų) ir 5-HT (dugnas) dializato koncentracijos PRIKLAUSOMOMS, NEPRIKLAUSOMS IR NEPRIKLAUSOMS NEI etanolio žiurkėms. Koncentracijos duomenys atitinka pirmiau nurodytų pradinių duomenų procentą prieš paėmimą (laikas 0) ir 7–8 valandų išėmimo taškus. Etanolio pašalinimas buvo susijęs su reikšmingu DA ir 5-HT dializato kiekio sumažėjimu [*F (1,23) = 23.02, p <0.001; **F (1,21) = 13.46, p < 0.0001. Skirtingai nuo atitinkamos DEPENDENT išankstinio išėmimo pradinės linijos (BSL); paprastų efektų ANOVA]. Taip pat atkreipkite dėmesį į nuolatinį bazinio DA išeigos padidėjimą NEPRIKLAUSOMS, prie etanolio aklimatizuotoms žiurkėms [+ p < 0.05; skiriasi ir nuo DEPENDENT, ir nuo ETHANOL NAIVE pradinio lygio (BSL)].

Nors bazinio dializato DA lygių skirtumų tarp NEPRIKLAUSOMŲ IR NEPRIKLAUSYTŲ ETANOLIŲ žiurkių nebuvo, DA ištekėjimas buvo žymiai padidėjęs NEPRIKLAUSOMS grupės žiurkėms iki 6.21 ± 0.72 n.m (F (2,23) = 4.76;p < 0.02). Dializės DA lygis šioje grupėje buvo žymiai didesnis nei abiejų PRIKLAUSOMO (p < 0.05) ir ETANOLIS NAIVAS (p < 0.05) žiurkės. Nepriklausomų žiurkių vidutinėje ± SEM bazinėje 5-HT koncentracijoje, kuri buvo 0.97 ± 0.11 n, skirtumų nuo kontrolinių ETHANOL-NAIVE nerasta.m (Pav. 2).

Pav. 2.

viršus, Vidutinė ± SEM dializato dopamino koncentracija, stebima mikrodializės būdu PRIKLAUSOMIŲ žiurkių branduoliuose po ilgalaikio skysto etanolio dietos, NEPRIKLAUSOMS, bet etanoliu veikiamoms žiurkėms ir kontroliniams gyvūnams, kuriuose nebuvo etanolio. Priklausomoms žiurkėms nepastebėta bazinio dopamino kiekio skirtumų nuo etanolio nevartojusių žiurkių. Tačiau bazinis dopamino išsiskyrimas buvo žymiai padidėjęs nepriklausomoms žiurkėms, kurios buvo ribotos prieigos prie etanolio treniruočių metu (*p < 0.05; skiriasi nuo ETHANOL-NAIVE ir DEPENDENT grupių). apačia, Dializuokite serotonino koncentraciją PRIKLAUSOMS, NEPRIKLAUSOMS ir NEPRIKLAUSOMS NEI etanolio žiurkėms. Bazinis 5-HT ištekėjimas buvo žymiai padidėjęs nuo etanolio priklausomoms žiurkėms (*p < 0.05; Skirtingai nuo NEPRIKLAUSOSIŲ NEI etanolio ir NEPRIKLAUSIŲ žiurkių).

Nutraukimo sukelti DA ir 5-HT lygio pokyčiai

Etanolio pašalinimas buvo susijęs su laipsnišku DA ir 5-HT dializato kiekio sumažėjimu per visą nutraukimo laikotarpį. Praėjus aštuonioms valandoms po etanolio, vidutinis ± SEM DA lygis sumažėjo nuo 3.9 ± 0.68 nm iki 2.31 ± 0.48 nm arba 64.2 ± 8.4 % bazinio lygio prieš ištraukimą. Panašus slopinimas pasireiškė ir 5-HT ištekėjimui, kuris sumažėjo nuo 1.78 ± 0.26 nm iki 0.89 ± 0.15 nm arba 55.1 ± 10.6 % koncentracijos prieš išgėrimą. Šie duomenys apibendrinti paveikslėlyje 3, o tai taip pat rodo, kad DA ir 5-HT lygiai per šį laikotarpį nepakito ETHANOL-NAIVE ir NONDEPENDENT grupėse. Nutraukimo sukeltas neuromediatorių išsiskyrimo slopinimas buvo patvirtintas reikšminga sąveika tarp gydymo grupių ir mėginių ėmimo laiko dializės koncentracijai (DA:F (8,92) = 5.86; p < 0.0001; 5-HT: F (8,84) = 9.02; p < 0.00001) ir procentais nuo pradinių verčių prieš išėmimą (DA:F (8,92) = 5.93; p < 0.0001; 5-HT: F (8,84) = 4.28; p < 0.0002). Vėlesnė paprastų efektų analizė (mėginių ėmimo laikas) patvirtino reikšmingą dializės koncentracijos sumažėjimą (DAF (4,92) = 16.12; p < 0.0001; 5-HT: F (4,84) = 23.38; p < 0.0001) ir procentais nuo pradinio lygio (DAF (4,92) = 16.03; p < 0.0001; 5-HT: F (4,84) = 9.67; p < 0.0001) laikui bėgant PRIKLAUSOMOSE, bet ne NEPRIKLAUSOMOSE arba NEATVIETOJE etanolio grupėse.

Savarankiško etanolio vartojimo poveikis DA ir 5-HT išsiskyrimui

Operacinis savarankiškas administravimas

Vidutinis ± SEM 60 min. tūrio ir operacinio savarankiško etanolio kiekiai 8 valandų išlaukos laikotarpio pabaigoje buvo 5.55 ± 0.78 ml arba 0.95 ± 0.14 gm/kg priklausomoms žiurkėms. Etanolio suvartojimas šioje grupėje gerokai viršijo nepriklausomų, prie etanolio aklimatizuotų, nepriklausančių žiurkių suvartojimą, kuris buvo 2.90 ± 0.55 ml arba 0.57 ± 0.10 g/kg (XNUMX pav.). 4). Didesnis etanolio suvartojimas DEPENDENT grupėje nei NONDEPENDENT grupėje buvo patvirtintas statistine analize (t 19 = 2.25;p <0.05).

Pav. 4.

Alkoholio vartojimas per 60 min. savaiminio vartojimo seansą (PRIKLAUSOMAS, n = 10) ir (NEPRIKLAUSOMAS, n = 11) žiurkės, išmatuotos praėjus 8 valandoms po etanolio arba kontrolinės skystos dietos pašalinimo. Savarankiškai vartojamo alkoholio kiekis abstinencijos testo metu buvo žymiai didesnis priklausomoms žiurkėms nei nepriklausomoms žiurkėms (*p < 0.05; žymiai skiriasi nuo nepriklausomų žiurkių, Studento t bandymas).

Kai kuriems gyvūnams savarankiško vartojimo pradžioje buvo aptinkamas tik vienas iš dviejų neurotransmiterių. DEPENDENT grupė (originalasn = 11) įtrauktos trys žiurkės, kurių statistiniam palyginimui buvo gauti duomenys apie DA arba 5-HT, bet ne abi analites. Vidutinis alkoholio suvartojimas DA ir 5-HT „grupėse“, atsiradęs dėl dviejų siųstuvų aptikimo „asimetrijos“, buvo identiškas per 1 val. seansą (DA: 0.93 ± 0.44 g/kg; 5-HT: 0.95 ± 0.18 gm/kg), nors etanolio suvartojimo pasiskirstymas laikui bėgant skyrėsi (XNUMX pav.). 5 E). NONDEPENDENT grupėje (originalas n = 10), DA lygis buvo mažesnis už aptikimo ribą trijuose gyvūnuose ir 5-HT koncentracija keturiems gyvūnams. Tarp ETHANOL NAIVE žiurkių (originalas n = 11), DA nebuvo aptiktas dviejuose gyvūnuose, o 5-HT liko neaptinkamas trijuose gyvūnuose. Šios eksperimento dalies imties dydžiai buvo tokie: PRIKLAUSOMAS (DA/5-HT: n = 8/8), NEPRIKLAUSOMAS (DA/5-HT:n = 7/6), ETANOLIS-NAIVAS (DA/5-HT: n = 9/8).

Pav. 5.

Operantinio alkoholio savaiminio vartojimo NEPRIKLAUSOMS ir PRIKLAUSOMS žiurkėms, kurioms pašalinamas etanolis, poveikis DA ir 5-HT ištekėjimui nucleus accumbens. Dializės neuromediatorių lygis lyginamas su ETHANOL-NAIVE žiurkių, išmokytų savarankiškai leisti vandenį, lygiais. Vidutinis vandens suvartojimas šioje grupėje buvo nereikšmingas (<0.8, XNUMX ml) ir nerodomas. A, Neuromediatorių išvesties pokyčiai, palyginti su lygiais, užfiksuotais per paskutinę pašalinimo valandą. Duomenys išreiškiami procentais nuo pradinių verčių, apskaičiuotų kaip trijų 20 minučių mėginių, paimtų per 8 išėmimo valandą, vidurkis, parodytas B – D. Atitinkamos dializato neuromediatorių koncentracijos parodytos B (NAIVO etanolis), C (NEPRIKLAUSOMAS) irD (PRIKLAUSOMAS). Norėdami parodyti neuromediatorių ištekėjimo pokyčius įvairiose eksperimentinėse fazėse, B – D taip pat rodyti išankstinį atsiėmimą (BSL) ir pasitraukimas (WD) DA ir 5-HT dializato koncentracijos per 8 pašalinimo val. Išskirtos linijos reiškia vidurkį ± SEM prieš ištraukiant dializato DA arba 5-HT koncentracijas. E, Savarankiškai vartojamo etanolio kiekis (10 % m/t) 10 min. intervalais, skirtas PRIKLAUSOMS (kietos juostos) ir NEPRIKLAUSOMAS (atviri barai) grupės. Savarankiškas etanolio vartojimas DEPENDENT žiurkėms atkūrė DA lygius iki verčių prieš pašalinimą. Priešingai, savarankiškai vartojant etanolį, nepavyko atkurti 5-HT koncentracijos iki prieš išėmimą lygių. Tačiau etanolis veiksmingai atkūrė 5-HT išsiskyrimą iki lygių, panašių į ETHANOL-NAIVE kontrolinės grupės lygius (statistinius palyginimus žr. Rezultatuose).

ETHANOL-NAIVE kontrolinių žiurkių dializatuose, turint galimybę reaguoti į vandenį, jokiu metu nebuvo pastebėta jokių reikšmingų DA ar 5-HT koncentracijos pokyčių. Priešingai, savarankiškas etanolio vartojimas patikimai padidino DA ir 5-HT ištekėjimą (XNUMX pav.). 5). Priklausomoms žiurkėms, kurioms buvo atliktas abstinencijos procesas, savarankiškai vartojant etanolį, DA ištekėjimas padidėjo 200–250%, palyginti su pašalinimo lygiu. Tiesą sakant, etanolis atstatė šių gyvūnų DA ištekėjimą iki pasisavinimo lygio per pirmąsias 10 min. Be to, kai buvo atkurta, tarpląstelinės DA koncentracijos buvo palaikomos tokiu lygiu vartojant etanolį likusią 1 valandos bandymo dalį. Priklausomoms žiurkėms pradėjus vartoti savarankiškai, buvo pastebėtas 145-HT ištekėjimo greitis iki 5 % padidėjimas. Tačiau etanolis nesugebėjo veiksmingai atkurti tarpląstelinės 5-HT koncentracijos iki verčių, užfiksuotų prieš pašalinimą. Savarankiško alkoholio vartojimo poveikis DA išsiskyrimui buvo patvirtintas reikšmingomis grupių × mėginių ėmimo laiko sąveikomis abiem dializato koncentracijoms (F (20,210) = 2.45; p < 0.001) ir procentais nuo pradinio lygio (F (16,168) = 3.27; p < 0.0001), ir naudojant vėlesnius paprastų efektų ANOVA pokyčius per mėginių ėmimo laiką tik DEPENDENT grupėje (dializės koncentracija: F (10,210) = 5.28;p < 0.0001; procentai bazinių duomenų:F (10,210) = 4.32; p < 0.0001). Alkoholio sukeltas 5-HT ištekėjimo padidėjimas buvo panašiai patvirtintas reikšmingomis grupių × mėginių ėmimo laiko sąveikomis (dializės koncentracijos: F (20,190) = 1.67;p < 0.05) arba pagrindinis grupių poveikis (pradinių pokyčių procentas: F (8,152) = 3.9; p < 0.0005) bendroje ANOVA, po to analizuojamas paprastas mėginių ėmimo laiko poveikis (dializės koncentracija:F (10,190) = 3.27; p < 0.001; procentai nuo pradinio lygio: F (8,152) = 3.59;p < 0.001) PRIKLAUSOMS žiurkėms.

Savarankiškas etanolio vartojimas taip pat laikinai padidino vidutinį ± SEM DA ir 5-HT ištekėjimą NEPRIKLAUSOJE grupėje ir pasiekė 130 ± 4.0 % (DA) ir 141 ± 25.2 % (5-HT) bazinių verčių (XNUMX pav.).5 C). Šis poveikis buvo patvirtintas atlikus paprastų efektų analizę po bendros ANOVA (aukščiau), kuri atskleidė patikimus bet kurio dializato koncentracijos skirtumus (DA:F (2,210) = 4.32; p < 0.0001) arba procentais nuo pradinių duomenų (5-HT: F (8,152) = 2.00; p < 0.05) per atrankos laiką.

Skystų dietų atnaujinimas

Atlikus operantinio savarankiško vartojimo testą, pakartotinio ekspozicijos etanolio turinčiai ir kontrolinei skystai dietai poveikis buvo ištirtas per 1 valandą keliose atsitiktinai atrinktose PRIKLAUSOMOSIOSe (n = 5) ir ETANOLIS-NAIVAS (n = 7) žiurkės. Tuo metu, kai atsinaujino skysto etanolio dietos prieinamumas, DA ištekėjimas šiek tiek sumažėjo, palyginti su lygiu, pasiektu savarankiškai vartojant operacinį vaistą, kuris buvo šiek tiek (bet nežymiai) padidėjęs, palyginti su pradine prieš išėmimą (XNUMX pav.). 6). Vidutinė ± SEM dializato DA koncentracija per pirmąją valandą po vartojimo etanolio dietos (3.65 ± 0.71 nm) reikšmingai skyrėsi nuo abstinencijos lygių (2.24 ± 0.74 nm; planuojamas palyginimas po bendros ANOVA:F (3,39) = 5.24; p < 0.01), tačiau statistiškai nesiskyrė nuo bazinių lygių, užregistruotų šiems gyvūnams prieš pašalinant etanolį (3.98 ± 0.97 n).m) ir iš ETHANOLIS NAIVE žiurkių (4.14 ± 0.53).

Pav. 6.

Pakartotinio etanolio poveikio ir kontroliuojamų skystų dietų poveikis DA ir 5-HT lygiams PRIKLAUSOMAS (n = 5) ir ETANOLIS-NAIVAS (n = 7) žiurkės. Palyginimui taip pat įtrauktos monoamino kiekiai prieš ištraukimą, pašalinimą (8 val.) ir operacinės savarankiško vartojimo sąlygos. Visi duomenys atitinka 1 valandos vidurkius per atitinkamus etapus. [*DA, Skiriasi nuo Išankstinis pasitraukimas (p < 0.05) irSavivalda (p < 0.01) ir skiriasi nuo atitinkamos būklės žiurkėms, kurių etanolis nenaudojamas (p <0.05). 5-HT, Skiriasi nuoAtšaukimas ir Savivalda(p < 0.05) ir skiriasi nuo atitinkamos ETANOLIS NAIVE būklės (p < 0.001]).

Dializės 5-HT koncentracija PRIKLAUSOMOJOJE grupėje po pakartotinio veikimo su skystu etanoliu padidėjo iki lygio, viršijanti tą, kuri buvo užregistruota per operantinį savarankišką vartojimą (1.25 ± 0.22 ir 1.46 ± 0.13 n).m; Fig. 6). Nors vidutinis 5-HT ištekėjimas nepasiekė lygių prieš ištraukimą (1.46 ± 0.13 vs 2.01 ± 0.41 nm), statistiniai skirtumai tarp 5-HT prieš ir po nutraukimo nebebuvo akivaizdūs po to, kai buvo pradėta vartoti skysta etanolio dieta.

Nepriklausomoms žiurkėms, kurioms buvo suteikta prieiga prie kontrolinės dietos po operantinio savarankiško vartojimo, nebuvo užfiksuota jokių skirtumų nuo DA ir 5-HT pradinio lygio (duomenys nerodomi).

DISKUSIJA

Rezultatai patvirtina, kad savarankiškas etanolio vartojimas padidina tarpląstelinį DA ir 5-HT kiekį NAC, dviejų neuromediatorių, kurie yra susiję su ūminiu farmakologiniu ir stiprinančiu etanolio poveikiu, o etanolio pašalinimas lydi reikšmingo išsiskyrimo slopinimo. šių monoaminų. Rezultatai taip pat rodo, kad priklausomos žiurkės „dirbs“ atitraukimo metu, kad gautų etanolį, atlikdamos operatyvinio savarankiško administravimo užduotį, ir kad etanolio vartojimas panaikina su pašalinimu susijusį ekstraneuroninį DA ir 5-HT deficitą.

Pagrindinis šio tyrimo susidomėjimas buvo DA ir 5-HT dalyvavimo stiprinant alkoholio poveikį priklausomiems asmenims tyrimas. Tradiciškai buvo sunku įrodyti, kad etanolio pašalinimas skatina gyvūnų elgesį ieškoti etanolio (apžvalgą žr. Ciceronas, 1980 m; Grant ir kt., 1990; Meischas ir Stewartas, 1994 m), nors buvo gauti teigiami rezultatai su žiurkėmis, turint galimybę susieti etanolio vartojimą su abstinencijos simptomų palengvėjimu per kelis priverstinio abstinencijos epizodus (Hunter ir kt., 1974 m). Tačiau neseniai buvo įrodyta, kad taikydamos atitinkamas etanolio inicijavimo procedūras, žiurkės pačios sušvirkš didelius etanolio kiekius net ir pirmą kartą pašalindamos iš jo.Schulteis ir kt., 1996). Šie rezultatai patvirtina šį stebėjimą ir suteikia galimą neurocheminį pagrindą sustiprinti etanolio poveikį priklausomoms žiurkėms. Visų pirma, duomenys rodo, kad žiurkės reguliavo savo etanolio suvartojimą tiek operuojant savarankiškai, tiek vėliau vartodamos skystą maistą taip, kad atkurtų ir išliktų DA ištekėjimas prieš ištraukimą. Ankstesnėje ataskaitoje buvo parodyta, kad intragastrinė etanolio dozė atkuria nepakankamą DA išsiskyrimą ventraliniame striatum ir panaikina etanolio vartojimo nutraukimo simptomus.Rossetti ir kt., 1992). Akivaizdus elgsenos etanolio suvartojimo „titravimas“, siekiant susigrąžinti sąlygas prieš pasitraukimą šiame eksperimente, išplečia šį atradimą, įtraukdamas kaupiamąjį DA išsiskyrimą į etanolio palaikomą sustiprinimą priklausomiems subjektams ir, atitinkamai, nuolatinį piktnaudžiavimą ir priklausomybę.

Priešingai nei DA, 5-HT lygiai atsistatė tik iš dalies, kai buvo vartojamas pats etanolis. Šį atradimą gali paaiškinti keli paaiškinimai. Gali būti, kad priešingai nei ūmus poveikis nepriklausomoms žiurkėms, etanolis daro laipsniškesnį arba uždelstą poveikį priklausomų žiurkių 5-HT išsiskyrimui, nors tai atrodo mažai tikėtina, nes etanolis sukėlė greitą pradinį 5-HT ištekėjimo padidėjimą per 10 min. nuo savarankiško vartojimo pradžios. Kitu atveju 5-HT sintezės ir (arba) išsiskyrimo mechanizmai gali būti pažeisti nuolatinio etanolio poveikio metu arba nutraukimo metu, todėl bendras jautrumas etanolio poveikiui gali sumažėti, kaip siūloma, pavyzdžiui, susilpnėjus etanolio poveikiui susikaupusiai. 5-HIAA lygiai etanoliui tolerantiškose P žiurkėse (Murphy ir kt., 1988). Trečiasis aiškinimas yra susijęs su pastebėjimu, kad 5-HT lygis prieš pašalinimą priklausomoje grupėje buvo žymiai padidėjęs, palyginti su žiurkėmis, kurios anksčiau nevartojo etanolio. Jei adaptyvūs pokyčiai, kuriais grindžiamas 5-HT išsiskyrimo padidėjimas lėtiniu etanoliu, yra trumpalaikiai ir greitai pasikeičia nutraukimo metu, visiškai atstatyti iki pasitraukimo buvusio lygio nesitikima. Tiesą sakant, šiuo atveju „dalinis“ 5-HT ištekėjimo atkūrimas funkciškai gali prilygti „visiškam“ atkūrimui.

Atsižvelgiant į 5-HT duomenų poveikį motyvaciniam etanolio vartojimo nutraukimo poveikiui, tikėtina, kad neuromediatorių trūkumo, net jei tik dalinio, panaikinimas, kuris yra abstinencijos kančios pagrindas, skatina etanolio ieškojimą. Iš tiesų, apžvelgdami literatūrą, LeMarquand ir kolegos (LeMarquand ir kt., 1994 m) daro išvadą, kad sumažėjęs 5-HT sistemų funkcinis aktyvumas, lydimas etanolio pašalinimo, gali sudaryti biochemines sąlygas atnaujinti etanolio vartojimą. Tačiau dar reikia nustatyti specifinį susikaupusio 5-HT vaidmenį emociniuose pokyčiuose, susijusiuose su etanolio pašalinimu. Alkoholio pasirinkimas genetiškai atrinktoms Indianos P ir HAD linijų žiurkėms buvo susijęs su sumažėjusiu 5-HT neurotransmisijos funkciniu aktyvumu NAC.Murphy ir kt., 1982, 1987; Gongwer ir kt., 1989 m; McBride ir kt., 1990), ir šioms žiurkėms pasireiškia padidėjęs anksiogeninis atsakas dėl įvairių elgesio nerimo rodiklių (Stewart ir kt., 1993). Tiek, kiek susikaupę serotonerginiai trūkumai lemia padidėjusį šių gyvūnų nerimą, galima spėti, kad emocinės sąlygos, skatinančios gerti etanolį žiurkėms, kurios pirmenybę teikia žiurkėms, ir gėrimo atnaujinimas abstinencijos metu, turi bendrą neurocheminį pagrindą.

Laipsniškas ekstraląstelinio DA ir 5-HT sumažėjimas per 8 valandas etanolio vartojimo nutraukimo laikotarpiu prieš savarankiško vartojimo seansą pratęsia ankstesnius stebėjimus apie su pašalinimu susijusį striatalinio DA apykaitos ir viso audinio kiekio sumažėjimą.Gil ir kt., 1992), taip pat 5-HT metabolizmo ir 5-HT arba jo metabolito 5-hidroksiindolacto rūgšties (5-HIAA) kiekio sumažėjimas graužikų smegenų, limbinių ir striatalinių audinių preparatuose (Kahnas ir Scudderis, 1976 m; Tabakoff ir kt., 1977 m; Badawy ir Evansas, 1983 m; Kempf ir kt., 1990 m; Wahlström ir kt., 1991 m; Yamamura ir kt., 1992 m). Dar svarbiau, kad šie rezultatai lokalizuoja su abstinencija susijusius monoamino funkcijos trūkumus smegenų atlygio regione, kuris buvo susijęs su stipriu alkoholio ir kitų piktnaudžiavimo medžiagų poveikiu.

Kalbant apie mechanizmus, reguliuojančius DA ir 5-HT išsiskyrimą arba ekstraneuroninę koncentraciją NAC, šie duomenys rodo, kad lėtinio etanolio poveikio metu išsivysto „sistemos prisitaikymas“, kad tos pačios neurocheminės sistemos. kurie aktyvuojami dėl ūmaus farmakologinio etanolio poveikio, nesant nuolatinio vaisto stimuliavimo, pasireiškia funkcinis trūkumas (Koob ir Bloom, 1988). Alkoholis staigiai padidina A 10 ventralinių tegmentinių DA neuronų degimo greitį (Gessa ir kt., 1985; Brodie ir kt., 1990 m) kadangi A 10 neuronų aktyvumas drastiškai slopinamas pašalinus etanolį (Diana et al., 1992, 1993). Taigi, nepastebėta, kad gyvūnams, vartojusiems skystą etanolį, padidėjusį DA lygį, palyginti su žiurkėmis, kurios anksčiau nenaudojo etanolio (1 pav.). 3), kartu su staigiu DA ištekėjimo sumažėjimu pašalinus etanolį, gali atspindėti meso-acumbens DA aktyvumo slopinimą, siekiant „subalansuoti“ lėtinę stimuliaciją etanoliu. Adaptyvūs pokyčiai biocheminiame lygmenyje taip pat gali būti mechanizmas, kaip sumažinti skirtumų tarp priklausomų ir etanolio nevartojusių žiurkių DA išsiskyrimą prieš pašalinimą ir ekstraneuroninio DA sumažėjimą pašalinimo metu. Pavyzdžiui, lėtinis etanolio poveikis slopina K+- stimuliuojamas DA išleidimas (Dardenas ir Hantas, 1977 m), tikriausiai dėl Ca ​​slopinimo2+ antplūdis (Kim ir kt., 1994) arba atjungiant kalcio patekimą ir DA išsiskyrimą (Leslie et al., 1986). Dar svarbiau yra tai, kad ūmus etanolio vartojimas stimuliuoja DA sintezę, o chroniškai etanoliu gydomiems gyvūnams šis poveikis yra silpnesnis (Tabakoff ir Hoffman, 1978;Fadda ir kt., 1980).

Neuroadaptyvioji reakcija gali būti ne tokia akivaizdi 5-HT atveju, kai prieš pasitraukimą (ty lėtinio etanolio stimuliuojamo) lygis buvo padidėjęs, palyginti su etanoliu nevartojančiomis ir nepriklausomomis žiurkėmis, o tai patvirtina ankstesnius duomenis, rodančius, kad lėtinis gydymas etanoliu didėja. priekinio smegenų audinio 5-HT ir 5-HIAA lygiai (Tytell ir Myers, 1973 m; Mena ir Herrera, 1980 m; Huntas ir Majchrowiczius, 1983 m; Morinanas, 1987 m; Kaneyuki ir kt., 1991 m). Tačiau yra žinoma, kad 5-HIAA kiekio padidėjimas smegenyse, atsirandantis dėl etanolio poveikio, sumažėja etanoliui tolerantiškose alkoholiui (P) žiurkėms, ypač NAC (Murphy ir kt., 1988; McBride ir kt., 1990). Taigi gali būti, kad padidėjęs 5-HT ištekėjimas pasibaigus lėtiniam etanolio režimui buvo sumažintas (ty pasireiškė adaptyvus susilpnėjimas), palyginti su pradiniu serotonerginiu atsaku į etanolio dietą. Nors ši hipotezė laukia patvirtinimo, 5-HT išsiskyrimo slopinimas abstinencijos stadijoje aiškiai rodė neuroadaptyvius 5-HT funkcijos pokyčius, reaguojant į lėtinį etanolį.

Tada tarpląstelinis monoamino trūkumas NAC gali būti tam tikrų alkoholio abstinencijos simptomų pagrindas, ypač emociniai pokyčiai, kurie yra priešingi tiems, kuriuos sukelia etanolis. Etanolis gali smarkiai sustiprinti smegenų stimuliavimo atlygį (reiškinys, bent iš dalies priklausomas nuo mezolimbinio DA perdavimo funkcinio vientisumo)Moolten ir Kornetsky, 1990; Lewis, 1991), kadangi etanolio pašalinimą lydi atlygio trūkumas, matuojamas intrakranijinės savistimuliacijos slenksčių padidėjimu (Schulteis ir kt., 1995). Taip pat yra įrodymų, kad 5-HT aktyvinimas gali palaikyti arba sustiprinti smegenų stimuliavimo atlygį (Gibsonas ir kt., 1970 m;Miliaressis ir kt., 1975 m; Redgrave'as ir Horrellas, 1976 m). Taigi, galima tikėtis, kad šio siųstuvo ekstraneuroninis trūkumas padidins nuo DA priklausomą atlygio trūkumą, ypač atsižvelgiant į naujausius įrodymus, kad 5-HT skatina DA išsiskyrimą NAC.Chen ir kt., 1991; Devaud ir Hollingsworth, 1991 m; Yoshimoto ir McBride'as, 1992 m; Parsons ir teisingumas, 1993). Šiame kontekste įdomu pastebėti, kad tarpląstelinio deficito progresavimas šiame tyrime buvo glaudžiai susijęs su elgesio nutraukimo simptomų atsiradimu ir laikinu profiliu susijusiame darbe, įskaitant smegenų stimuliacijos atlygio trūkumą, hiperdirglumą, elgesio slopinimą ir anksiogeninį poveikį.Baldwin ir kt., 1991; Rassnick ir kt., 1992;Schulteis ir kt., 1995). Taigi, sinchroniškas šių elgesio ir neurocheminių pokyčių atsiradimas gali atspindėti DA ir 5-HT vaidmenį neigiamose emocinėse sąlygose, kurios lydi etanolio pašalinimą.

Nors šiame tyrime pagrindinis rūpestis buvo DA ir 5-HT vaidmuo atlygyje nuo etanolio ir priklausomybės nuo etanolio, savarankiško etanolio vartojimo poveikis šių siųstuvų išsiskyrimui nepriklausomose žiurkėse taip pat yra įdomus. DA išleidimo padidėjimas nepriklausomoje grupėje patvirtina ankstesnę ataskaitą (Weiss ir kt., 1993) ir toliau palaiko DA vaidmenį stiprinant etanolio poveikį. Tačiau ypač svarbus buvo pastebėjimas, kad nepriklausomoms žiurkėms savarankiškai vartojant etanolį, padidėjo 5-HT ištekėjimas, nes šie rezultatai išplečia padidėjusį 5-HT išsiskyrimą NAC po sisteminio ir vietinio alkoholio vartojimo.Yoshimoto ir kt., 1991 m, 1992) į galimą 5-HT vaidmenį stiprinant etanolio poveikį.

Išvada, kad bazinė DA produkcija buvo žymiai padidėjusi NEPRIKLAUSOMS žiurkėms, palyginti su etanolio neturinčiomis ir priklausomomis grupėmis, buvo stebina, nes nepriklausantys gyvūnai 2–3 savaites neturėjo prieigos prie etanolio, kol jiems buvo skirta kontrolinė skysta dieta. mikrodializės testas. Viena iš galimybių paaiškinti šį pastebėjimą yra ta, kad pertraukiamas alkoholio vartojimas gali sukelti nuolatinį bazinio DA išsiskyrimo padidėjimą. Arba ši išvada gali būti siejama su eksperimentinių ir kontrolinių gyvūnų atranka. Etanoliu treniruotos žiurkės buvo priskirtos NEPRIKLAUSOMS arba PRIKLAUSOMS grupėms tik tuo atveju, jei jos atitiko atrankos kriterijų (stabilus dienos etanolio suvartojimas ≥ 0.5 g/kg etanolio suvartojimo), tuo tarpu visos ETHANOL-NAIVE žiurkės buvo tiriamos be atrankos. Jei daroma prielaida, kad yra dopaminerginis „nenormalumas“, dėl kurio žiurkės pradeda vartoti daugiau etanolio, šis atrankos procesas galėjo sukelti „neurocheminį poslinkį“ į sustiprintą bazinį DA išsiskyrimą PRIKLAUSOMOSIOS ir NEPRIKLAUMOSIOS mėginiuose. Atsižvelgiant į tai, padidėjęs DA ištekėjimas NEPRIKLAUSOMS žiurkėms gali būti atrankos procedūros, kuri palankiai įvertino subjektų, turinčių šią neurocheminę charakteristiką, įtraukimą. Atsižvelgiant į bazinio DA ištekėjimo skirtumus tarp PRIKLAUSOMO ir NEPRIKLAUSOMŲ grupių, ši ataskaita taip pat leistų daryti išvadą, kad lėtinis etanolis slopina bazinį DA išsiskyrimą šioje žiurkių populiacijoje.

Tačiau kai kurie argumentai prieštarauja šiam aiškinimui. Tai, kad tarpląstelinio DA skirtumų tarp ETHANOL NAIVE ir DEPENDENT žiurkių duomenų, gerai sutampa su ankstesniais in vitro tyrimais, kurie parodė, kad chroniškai etanoliu gydyti gyvūnai nesiskiria nuo negydytų kontrolinių gyvūnų DA sinteze ir DOPAC lygiais.Tabakoffas ir Hoffmanas, 1978 m; Fadda ir kt., 1980; Patelis ir Pohoreckis, 1989 m; Gil ir kt., 1992). Atsižvelgiant į dabartinių ir šių ankstesnių viso audinio duomenų nuoseklumą (kurie buvo naudojami tam tikri priverstinio etanolio skyrimo būdai ir todėl nebuvo susiję su galimu atrankos šališkumu), mažai tikėtina, kad vien dabartinės atrankos procedūros galėtų paaiškinti patobulintą DA leidimas NONDEPENDENT grupėje. Daugiau tiesioginio pagrindo, kad šis poveikis yra susijęs su pertraukiamu etanolio vartojimu, o ne su atrankos šališkumu, gaunamas iš neseniai šioje laboratorijoje atlikto darbo, parodančio, kad atsitiktinai atrinktos Wistar žiurkės, kurioms buvo pakartotinai sušvirkštos intraperitoninės etanolio, smarkiai padidino bazinę tarpląstelinę DA koncentraciją. NAC, išmatuotas praėjus 24 valandoms po galutinio apdorojimo etanoliu (A. D. Smith ir F. Weiss, nepaskelbti stebėjimai). Kita vertus, nors šie duomenys patvirtina hipotezę, kad pakartotinis etanolio poveikis gali padidinti bazinį DA ištekėjimą NAC, išliktiBazinio DA ištekėjimo padidėjimas NONDEPENDENT grupėje aiškiai reikalauja patvirtinimo, o galimą šios išvados reikšmę etanolio ieškančiam elgesiui dar reikia išsiaiškinti.

Apibendrinant galima teigti, kad rezultatai rodo, kad dvi neuromediatorių sistemos, kurios, kaip manoma, tarpininkauja alkoholio ūminėms stiprinančioms savybėms, taip pat gali turėti įtakos stiprinant alkoholio poveikį priklausomiems asmenims. Šie rezultatai patvirtina neuroadaptacijos teorijas, kurios mano, kad pasitraukimas atsiranda dėl fiziologinių smegenų atlygio schemų pokyčių, kurie pasireiškia kaip priešinga reakcija vaistui nutraukus vaisto poveikį.

Išnašos

    • Įstojo į Lapkričio 2, 1995.
    • Gauta peržiūra Vasaris 23, 1996.
    • Priimta Vasaris 28, 1996.
  • Šį darbą parėmė Nacionalinis piktnaudžiavimo alkoholiu ir alkoholizmo institutas AA 08164 ir AA 10531 (FW) ir Nacionalinio piktnaudžiavimo alkoholiu ir alkoholizmo instituto specializuoto centro stipendija AA 06420 (GK, FW; direktorius, GFK). PH buvo kviestinis mokslininkas iš Biomedicininių tyrimų centro, Alko Ltd., Helsinkis, Suomija. Tai leidinio numeris NP-8871 iš „The Scripps Research Institute“.

    Susirašinėti reikia Friedbert Weiss, Neurofarmakologijos departamento (CVN-15), The Scripps Research Institute, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037.

NUORODOS

Straipsniai, kuriuose minimas šis straipsnis