Kokaino sukeltas dendritinių stuburo formavimasis D1 ir D2 dopamino receptorių turinčiose vidutinio dydžio smailių neuronuose (2006)

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399 – 3404.
Paskelbta internete Vas 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neurologijos
Šis straipsnis buvo minimas kiti PMC straipsniai.

Abstraktus

Psichostimuliantų sukeltas dendritinių stuburų pakitimas dopaminoceptyviems neuronams branduolių accumbens'e (NAcc) buvo hipotezuotas kaip adaptyvus neuroninis atsakas, susijęs su ilgalaikiu priklausomybės elgesiu. NAcc daugiausia susideda iš dviejų skirtingų vidutinio dydžio smailių neuronų pogrupių, išreiškiančių aukštą dopamino D1 arba D2 receptorių kiekį. Šiame tyrime analizavome dendritinių stuburo tankį po lėtinio kokaino gydymo skirtingose ​​D1 arba D2 receptorių turinčiose vidutinio dydžio smailių neuronuose NAcc. Šie tyrimai naudojo transgenines peles, kurios ekspresavo EGFP kontroliuojant D1 arba D2 receptorių promotorių (Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP). Po 28 dienų gydymo kokainu ir 2 dienų nutraukimo, stuburo tankis padidėjo tiek Drd1-EGFP-, tiek Drd2-EGFP-teigiamuose neuronuose. Tačiau stuburo tankio padidėjimas buvo palaikomas tik Drd1-EGFP teigiamuose neuronuose 30 dienų po vaisto vartojimo nutraukimo. Pažymėtina, kad padidėjusi ΔFosB ekspresija taip pat buvo pastebėta Drd1-EGFP- ir Drd2-EGFP-teigiamuose neuronuose po 2 dienų po vaisto vartojimo nutraukimo, bet tik Drd1-EGFP-teigiamuose neuronuose po 30 gydymo dienų. Šie rezultatai rodo, kad padidėjęs stuburo tankis, pastebėtas po lėtinio gydymo kokainu, yra stabilus tik D1 receptorių turintiems neuronams ir kad ΔFosB ekspresija yra susijusi su dendritinių spyglių formavimu ir (arba) palaikymu D1, taip pat D2 receptorių turintiems neuronams NAcc.

Mesolimbinis dopaminerginis kelias susideda iš neuronų, esančių ventralinio tegmentalioje srityje, kuri inervuoja branduolį accumbens (NAcc), uoslės tuberkulį, prefrontalinę žievę ir amygdalą (1), o nigrostriatyvių dopaminerginių neuronų (pars compacta) forma sudaro didėjančią nugaros striatumo projekciją (2). Psichostimuliantai padidina dopamino koncentraciją NAcc: kokainas, blokuodamas dopamino įsisavinimą iš sinaptinio skilimo ir amfetamino, skatindamas dopamino išsiskyrimą iš nervų terminalų (3-5). Dėl pakartotinio ir periodiško psichostimuliantų vartojimo padidėja elgesio atsakas (jautrinimas) ūminiam šių vaistų stimuliaciniam poveikiui (6-8). Dauguma įrodymų linijų rodo, kad adaptaciniai ventralinio tegmentalinės zonos - NAcc dopaminerginės sistemos pokyčiai yra svarbūs priklausomai nuo priklausomybės nuo plastiškumo, kuris yra vaisto sukeltos elgsenos pagrindas.

Be dopamino, būtina reaguoti į psichostimuliatorius, kad glutamatas atsirastų dėl elgsenos jautrumo (9, 10). Vidutinio dydžio spinistiniai neuronai (MSN) ventralinėje stiatumoje gauna stimuliacines glutamatergines projekcijas iš prefrontalinės žievės, kurios sinapso ant dendritinių stuburo galų. MSN taip pat yra pagrindinis dopaminerginių axonų, kurie sinapsuoja ant stuburo kaklų, tikslas.1, 11, 12). Todėl MSNs dendritiniai spygliai yra ląstelių skyrius, kuriame iš pradžių integruota dopaminerginė ir glutamaterginė transmisija.

Dopaminas veikia dviem pagrindiniais receptorių pogrupiais: D1 pogrupiu (D1 ir D5 potipiais) ir D2 pogrupiu (D2, D3 ir D4 potipiais) (13). Nugaros striatume anatominiai tyrimai parodė, kad striatonigriniai MSN turi didelį D1 receptorių kiekį (kartu su medžiaga P ir dinamorfinu), o striatopallidiniai MSN daugiausia išreiškia D2 receptorius (kartu su enkefalinu) (14-17). NAcc projekcijos yra sudėtingesnės nei nugaros striatume, o NAcc apvalkalas ir pagrindinės dalys projektuojasi į atskirus ventralinio paladžio ir ventralinio tegmentalio srities ir materia nigra subregionus.18). Kadangi D2 receptoriai ir enkefalinas yra labai išreikšti ventralinio paladžio projekcijomis, D1 receptoriai ir P medžiaga yra lygiai pasiskirstę projekcijose į ventralinį palidumą ir ventralinį tegmentalą (19). D1 arba D2 receptoriams selektyvių agonistų ir antagonistų tyrimai parodė, kad tiek D1, tiek D2 receptoriai reikalingi nuo psichostimuliantų priklausomiems elgesio pokyčiams (20-25). Tačiau šių receptorių vaidmenys yra skirtingi. Pavyzdžiui, D1 receptorių stimuliavimas susilpnina kokaino, kurį sukelia kokaino įpurškimai ir su kokainu susiję aplinkos ženklai, skatinimą, o D2 receptorių stimuliavimas palengvina kokaino sukeltą atstatymą (26-28).

Elgesio sutrikimai, susiję su priklausomybe nuo psichostimuliatoriaus, yra labai ilgaamžiai. Todėl dopamino ir glutamato reguliuojamose neuronų grandinėse yra didelis susidomėjimas nustatant ilgalaikius vaistų sukeltus pokyčius molekuliniu ir struktūriniu lygiu.29-32). Ypač pastebėta, kad ilgalaikis kokaino ar amfetamino poveikis padidina dendritinių šakų taškų ir MSN spyglių skaičių NAcc (33-35). Nustatyta, kad šie struktūriniai pokyčiai tęsiasi iki ≈1 – 3.5 mėnesių po paskutinio vaisto poveikio (30, 35) ir buvo pasiūlyta pagrįsti ilgalaikius sinaptinio plastiškumo pokyčius, susijusius su psichostimuliuojančiu poveikiu.

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti kokaino sukeltus struktūrinius dendritinių stuburo pokyčius submopuliarių MSN, kurie išreiškia D1 arba D2 receptorius. Šiuose tyrimuose mes naudojome bakterines dirbtines chromosomų (BAC) transgenines peles, kurios ekspresuoja EGFP, kontroliuojant D1 (Drd1-EGFP) arba D2 (Drd2-EGFP) dopamino receptorių promotorių (36). Rezultatai rodo, kad nors padidėjęs stuburo tankis iš pradžių atsiranda su D1 receptorių turinčiais MSNs ir D2 receptorių turinčiais MSNs, pakeistas stuburo tankis yra stabilus tik D1 receptorių turintiems neuronams. Be to, randame panašius pokyčius transkripcijos faktoriaus ΔFosB ekspresijoje, o tai rodo, kad ΔFosB gali būti susijęs su dendritinių spyglių formavimu ir (arba) palaikymu D1, taip pat D2 receptorių turinčiais neuronais NAcc.

rezultatai

MSN analizė Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP BAC transgeninėse pelėse.

DNS1-EGFP arba Drd2-EGFP BAC transgeninių pelių MSNs projekcijos modelis iš dorsalinės ir ventralinės striatumo buvo apibūdintas analizuojant GFP ekspresiją (36). Diferencinė GFP ekspresija dorsalinės stiatos MSN atitinkamai atitinka endogeninių D1 arba D2 receptorių ekspresiją (36). Toliau analizavome diferencinę GFP ekspresiją NAcc Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP pelėse (Pav 1a ir b). Nors c58% NAcc neuronų išreiškė GFP Drd1-EGFP pelėse (Pav 1a), C48% NAcc neuronų išreiškė GFP Drd-2-EGFP pelėse (Pav 1b). MSN yra 90 – 95% visų neuronų, esančių NAcc (12, 37). D1 receptoriai yra išreikšti tik MSN, o D2 receptoriai yra išreikšti MSN ir cholinerginiuose interneuronuose, kurie atstovauja 1 – 3% striatalų neuronų (37). Atsižvelgiant į šiuos veiksnius, rezultatai leidžia manyti, kad minimaliai, NAXc N10 – 15% MSNs gali išreikšti D1 ir D2 receptorius.

Pav. 1. 

MSN analizė Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelėse. (a ir b) Drd1-EGFP fiksuoto smegenų gabaliukai iš NAcc (a) arba Drd2-EGFP (b) BAC transgeninės pelės buvo imuninės GFP ir NeuN (kaip bendras neuroninis žymeklis). Sujungti vaizdai geltonos spalvos rodo kolokalizaciją ...

Dendritinių spyglių analizė Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelėse.

GFP ekspresija Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelėse buvo naudinga dėmėti neuroninių ląstelių kūnus. Tačiau GFP signalas dendrituose ir dendritiniuose stuburuose buvo per silpnas, kad būtų galima atlikti jų analizę po imuninės spalvos su anti-GFP antikūnais. Neseniai fluorescencinių dažų dalijimasis balistiniu balionu buvo naudojamas greitai ir efektyviai pažymėti neuronų populiacijas (38). Visus neuronus galima žymėti naudojant šią techniką, ir šis metodas atrodo panašus į Golgi – Cox dažymą. Norint išanalizuoti Ncc neuronų dendritinę morfologiją, fiksuoti akmeniniai griežinėliai buvo pažymėti lipofiliniu fluorescencijos dažikliu 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocianino perchloratu (DiI), naudojant genų ginklą. Parodyta DiI nudažyto MSN pavyzdys Pav 1c. Esant tokioms sąlygoms, mes paprastai stebėjome pažymėtus neuronus be dublinų dendritų iš kitų žymėtų neuronų. Esant didesniam padidinimui, galima stebėti išsamią dendritinę morfologiją, įskaitant dendritinius stuburus (Pav 1d).

Tada mes naudojome DiI žymėjimo ir imunohistochemijos derinį GFP arba Drd1-EGFP, arba Drd2-EGFP transgeninėse pelėse, kuri buvo įmanoma naudojant mažą ploviklio koncentraciją audinių permeabilizacijai (žr. Metodai). Atidžiai palyginus DiI dėmę ir GFP ekspresiją MSN ląstelių kūnuose, galėtume nustatyti DiI ir GFP-teigiamus arba DiI-teigiamus ir GFP-neigiamus neuronus Drd1-EGFP (Pav 2a) arba Drd2-EGFP (Pav 2b) pelėms. Tolesniuose tyrimuose mes analizavome dendritinę morfologiją tik DiI- ir GFP-teigiamuose neuronuose iš Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP pelių.

Pav. 2. 

Dendritinių spyglių analizė Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelėse. Neuronai NAcc arba Drd1-EGFP pelėms (a) arba Drd2-EGFP pelėms (b) pirmą kartą buvo paženklinti DiI (raudona) ir po to imunohistochemija, naudojant anti-GFP antikūną (EGFP, žalia). Tik ...

Lėtiniai kokaino gydymo rezultatai padidėjusio stuburo tankio lygiu, kai yra MSD, išreiškiantys Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP.

Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP pelės buvo pakartotinai švirkštos su kokainu (30 mg / kg) arba fiziologiniu tirpalu keturias savaites iš eilės (žr. Metodai). Dvi dienos (2WD) arba 30 dienos (30WD) po paskutinio gydymo vaistais, smegenys buvo apdorotos DiI žymėjimui ir imunohistochemijai, kaip aprašyta aukščiau. Anksčiau atliktas tyrimas parodė, kad nuolatinis gydymas amfetaminu padidino stuburo tankį distanciuose, bet ne proksimaliniuose MSN dendrituose NAcc (35). Todėl mes apribojome savo analizę su distaliniais dendritais (ty su antrosios ar trečiosios kategorijos filialais), įskaitant terminalų regionus. Analizuojant 2WD, nustatyta, kad stuburo tankis padidėja Drd1-EGFP teigiamuose MSN (128% druskos grupės).Pav 3a ir c) ir mažesniu mastu - Drd2-EGFP-teigiami neuronai (115% druskos grupės).Pav 3 b ir d). Po 30WD padidėjo stuburo tankis Drd1-EGFP teigiamuose neuronuose (118% fiziologinio tirpalo).Pav 3 a ir c), bet ne Drd2-EGFP teigiamuose neuronuose (Pav 3 b ir d).

Pav. 3. 

Lėtinis kokaino sukeltas stuburo tankio padidėjimas, teigiamas Drd1-EGFP- arba Drd2-EGFP-MSN, NAcc. (a ir b) Drd1-EGFP (a) arba Drd2-EGFP (b) pelės buvo gydomos fiziologiniu tirpalu (Sal) arba kokainu (Coc, 30 mg / kg) 4 savaitėms. Buvo apdorotos pelės smegenys 2WD arba 30WD ...

Dendritinių stuburo morfologija kinta atsižvelgiant į jų ilgį ir stuburo galvos plotį. Todėl mes klasifikuojame dendritines iškyšas į keturias stuburo klases (stubby, grybų, plonas ir filopodijas), vartojusias 2WD iš kokaino (duomenys nerodomi). Grybų tipo tankis (119.7 ± 4.0%, P <0.01) ir ploni stuburai (120.0 ± 3.4% P <0.01) padidino gydymas kokainu teigiamų MSD turinčių Drd1-EGFP, tuo tarpu užsikrėtimo tankis (182.4 ± 21.6%, P <0.05) ir grybų spyglius (122.5 ± 5.0%, P <0.01) padidėjo Drd2-EGFP teigiamų MSN. Drd1-EGFP teigiamų neuronų stuburo stuburų reikšmingai nepadidėjo, o Drd2-EGFP teigiamų neuronų - stuburo stuburų.

Lėtinis kokainas sukelia ΔFosB ekspresiją Drd1-EGFP- arba Drd2-EGFP-teigiamuose MSNs NAcc.

ΔFosB yra transkripcijos faktorių Fos šeimos narys. Nors ūminis kokaino vartojimas sukelia greitą ir laikiną kelių Fos izoformų indukciją NAcc, pakartotinis kokaino poveikis padidina ΔFosB lygį. Be to, ΔFosB ekspresijos padidėjimas išlieka NAcc savaitėmis ir mėnesiais po vaisto vartojimo nutraukimo, ir buvo pasiūlyta, kad jis dalyvauja ilgalaikiame geno ekspresijos reguliavime, netgi nutraukus vaisto vartojimą (29, 39, 40).

Norint ištirti ΔFosB indukciją NAcc iš Drd1-EGFP arba Drd2-EGFP pelių po gydymo kokainu, analizavome FosB ir GFP ekspresiją dvigubu žymėjimu (Pav 4 ir Lentelė 1) Anti-FosB antikūnas atpažįsta visas FosB formas, bet mes manome, kad padidėjęs imunodažas yra ΔFosB (žr. Metodai tolesnėms diskusijoms). Pelių, gydytų fiziologiniu tirpalu, 16% Drd1-EGFP-teigiamų neuronų ir 15% Drd2-EGFP-teigiamų neuronų išreiškė FosB imunoreaktyvumą santykinai silpnu intensyvumu (Pav 4 a ir b ir Lentelė 1). Pakartotinis gydymas kokainu, po kurio buvo 2WD, žymiai padidino teigiamų Drd1-EGFP neuronų, kurie ekspresavo ΔFosB (55% GFP-teigiamų neuronų), skaičių.Pav 4c ir Lentelė 1). Drd2-EGFP-teigiami neuronai (GFP-teigiamų neuronų 25%) buvo mažesni, bet vis dar reikšmingi ΔFosB ekspresijos padidėjimai (Pav 4d ir Lentelė 1). Kaip ir stuburo tankio pokyčiams, padidėjusi ΔFosB ekspresija buvo palaikoma Drd1-EGFP-teigiamuose neuronuose (46% GFP-teigiamų neuronų), bet ne Drd2-EGFP-teigiami neuronai (15% GFP-teigiamų neuronų) po 30WD (Pav 4 e ir f ir Lentelė 1). Atkreipkite dėmesį, kad padidėjusi ΔFosB išraiška pastebėta Pav 4f yra Drd2-EGFP-neigiami neuronai.

Pav. 4. 

Lėtinis kokainas sukelia ΔFosB ekspresiją Drd1-EGFP- arba Drd2-EGFP-teigiamuose MSNs NAcc. Drd1-EGFP (a, c, ir e) arba Drd2-EGFP (b, d, ir f) pelės buvo gydomos fiziologiniu tirpalu arba lėtiniu kokainu, kaip aprašyta Pav 3. 2WD (c ir d) arba 30WD (e ir ...
1 lentelė. 

EGFP teigiamų neuronų, išreiškiančių Δ, kiekybinis nustatymasFosB

Diskusija

Manoma, kad ilgai trunkantys dopaminerginio neurotransmisijos adaptacijos veiksniai yra susiję su psichostimuliuojančiais vaistais. Visų pirma, hipotezė, kad psichostimuliantų sukeltas MSNs dendritinio stuburo tankio padidėjimas NAcc yra susijęs su sinaptinio ryšio reorganizavimu (30). NAcc daugiausiai susideda iš dviejų skirtingų MSN pogrupių, išreiškiančių aukštą D1 arba D2 dopamino receptorių kiekį. Atliekant šį tyrimą, po chroniško gydymo kokainu analizavome stuburo tankį skirtingose ​​D1 arba D2 receptorių turinčiose MSNs NAcc. Gauti rezultatai rodo, kad nors padidėjęs stuburo tankis iš pradžių atsiranda su D1 receptorių turinčiais MSNs ir D2 receptorių turinčiais MSNs, pakeistas stuburo tankis yra stabilus tik D1 receptorių turintiems neuronams. Be to, randame panašius pokyčius transkripcijos faktoriaus ΔFosB ekspresijoje D1 ir D2 receptorių turinčiose MSN.

Šiuose tyrimuose buvo panaudotos BAC transgeninės pelės, ekspresuojančios GFP specifinėse MSN subpopuliacijose, kontroliuojant arba D1, arba D2 receptorių promotorių. Be to, sukūrėme dvigubo ženklinimo metodą, kuris sujungė imunohistochemiją GFP su balistiniu neuronų ženklinimu naudojant DiI. Ankstesniuose tyrimuose buvo naudojamas Golgi – Cox metodas, skirtas analizuoti psichostimuliantų poveikį stuburo tankiui (34), ir čia naudojamas DiI metodas davė kiekybiškai palyginamus rezultatus. Sukūrėme dvigubo ženklinimo metodą, nes Golgi dažymas nesuderinamas su imunohistochemija. Imunizavimui paprastai reikalingas audinių permeabilizavimas plovikliais, procesas, kuris paprastai sukelia lipofilinių dažų tirpinimą iš membranos (38). Tačiau mūsų dabartiniuose tyrimuose imunofiltruojant GFP nereikėjo didelės ploviklio koncentracijos audinių permeabilizacijai, todėl jį galima naudoti kartu su lipofiliniais dažais. Mūsų dvigubo ženklinimo metodas turėtų būti iš esmės naudingas tyrimams, susijusiems su dendritinių stuburų struktūriniais pokyčiais, pavyzdžiui, kai jie naudojami analizuojant BAC transgenines peles, kuriose GFP yra išreikštas specifinėse neuronų populiacijose žievėje (36).

Nors vis dar šiek tiek prieštaringa, manoma, kad D1 ir D2 receptoriai daugiausia yra anatomiškai atskirti nuo tiesioginių (striatonigralinių) ir netiesioginių (striatopallidinių) striatrijos projekcinių neuronų (17, 41). Pradinė GFP lokalizavimo Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelėse apibūdinimas atitiko šią išvadą (36). Be to, analizuojant GFP teigiamų neuronų skaičių NAcc iš Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP pelių, daroma išvada, kad ≈50% MSNs išreiškia tik D1 receptorius, kad ≈35 – 40% išreiškia tik D2 receptorius, ir kad N10 – 15% ekspresuoja tiek D1, tiek D2 receptorius. Ši koekspresijos reikšmė yra panaši į tą, kurią numato dorsalinės stiatos tyrimai, kurie sujungė vienos striatrijos neuronų patch-clamp analizę su RT-PCR metodais mRNR išskyrimui ir amplifikavimui (≈17% enkefalino ir medžiagos P ekspresija).42). Pažymėtina, kad mūsų dabartiniuose tyrimuose nenagrinėjamas D3, D4 ir D5 receptorių ekspresijos klausimas, taip pat neatsižvelgiama į mažo D1 receptorių ekspresijos MSN, kurie išreiškia aukštus D2 receptorių kiekius, klausimą ir atvirkščiai.

Keli ankstesni tyrimai ištyrė psichostimuliantų sukeltos Fos ekspresijos neuronų lokalizaciją ir D1 bei D2 receptorių vaidmenį (43-45). Šie tyrimai patvirtino išvadą, kad Fos ir ΔFosB indukciją skatina D1 receptorių aktyvacija. Tačiau Fos ekspresijos ląstelių lokalizaciją įtakoja aplinkos kontekstas, kuriame vartojami psichostimuliantai vaistai (46, 47). Pavyzdžiui, amfetamino arba kokaino, skirto namo narve, indukuoja tiesioginius ankstyvuosius genus (įskaitant Fos), ypač P-teigiamose ląstelėse, kurios ekspresuoja D1 receptorius. Priešingai, šie vaistai gali sukelti Fos ekspresiją tiek D1, tiek D2 receptorių turinčiuose MSN, kai jie skiriami naujoje aplinkoje. Mūsų dabartiniuose tyrimuose naudojamas protokolas neapėmė vaistų injekcijos suporavimo su nauja aplinka. Tačiau negalime atmesti tam tikro konteksto priklausomo streso, kuris yra atsakingas už ΔFosB ekspresiją D2 receptorių turinčiuose MSN.

Svarbus dabartinių rezultatų bruožas buvo lygiagrečiai padidėjęs stuburo tankis ir ΔFosB ekspresija. Padidėjęs stuburo tankis ir ΔFosB ekspresija iš pradžių įvyko MSN, ekspresuojantys Drd1-EGFP ir Drd2-EGFP. Tačiau šie pokyčiai buvo stabilūs tik D1 receptorių turintiems neuronams. Vienas iš galimų paaiškinimų, kad padidėjęs stuburo tankis ir ΔFosB ekspresija buvo laikinai aptikta D2 receptorių turinčiuose neuronuose, yra tai, kad tai įvyko nedidelėje MSN grupėje, kuri ekspresuoja tiek D1, tiek D2 dopamino receptorius. Taigi trumpalaikis šių padidėjimų pobūdis gali būti susijęs su D2 receptorių aktyvacijos antagonistiniu poveikiu nuo D1 priklausomiems signalizacijos keliams (48). Įdomu tai, kad stuburo tankio ir ΔFosB ekspresijos pokyčiai buvo grįžtami, o tai gali atspindėti nuo D2 receptorių priklausomų signalizacijos būdų gebėjimą paveikti ΔFosB stabilumą.

Pastaba, kad ΔFosB ir stuburo tankio ekspresijos yra lygiagrečios, atitinka idėją, kad ΔFosB dalyvauja pradiniame dendritinių spyglių formavime ir vėlesniame jų palaikyme D1 receptorių turinčiuose neuronuose NAcc. ΔFosB išraiška yra valdoma pagal D1 / DARPP-32 / PP1 priklausomą signalizacijos kelią MSN (49). Keletas tyrimų parodė, kad ΔFosB atlieka svarbų vaidmenį atlyginant ir skatinant aktyvinti psichostimuliatorių veiksmus (39), galbūt įtakojant daugelio genų, įskaitant neurotransmiterių receptorius, signalinius baltymus ir baltymus, dalyvaujančius reguliuojant neuronų morfologiją, ekspresiją (50). Tačiau specifiniai molekuliniai mechanizmai, susiję su lėtine kokaino sukelta stuburo formavimu, šiuo metu nežinomi. Ankstesni tyrimai parodė, kad Cdk5 inhibitoriaus roscovitino infuzija į akis susilpnino kokaino sukeltą stuburo tankio padidėjimą (51). Be to, Cdk5 yra ΔFosB tikslinis genas, susijęs su kompensaciniais adaptyviais pokyčiais, susijusiais su lėtiniu gydymu kokainu (52). Todėl, priklausomai nuo Cdk5 priklausomo fosforilinimo, yra tikėtinas kokaino sukeltos stuburo susidarymo ir (arba) stuburo stabilumo pagrindas. PAK (53), β-kateninas (54), PSD-95 (55) ir spinofilinas (56) yra Cdk5 substratai ir visi dalyvauja stuburo morfogenezės reguliavime (57-60). Tikimasi, kad šių ir kitų Cdk5 substratų apibūdinimas stuburuose apšvies mechanizmus, susijusius su stuburo formavimu psichostimuliantais.

Metodai

Gyvūnai.

Pelės, turinčios EGFP transgeną kontroliuojant D1 arba D2 dopamino receptorius, buvo sukurtos Gensat BAC transgeniniu projektu (36). Šiame tyrime naudojamos transgeninės pelės buvo 4 – 5 savaitės ir buvo Šveicarijos – Websterio fone. Pelės buvo palaikomos 12: 12-h šviesos / tamsos cikle ir buvo laikomos 2 – 5 grupėse su maistu ir vandeniu. Visi gyvūnų protokolai buvo suderinti su Nacionaliniais sveikatos vadybos laboratorijų laboratorijų gyvūnų priežiūros ir naudojimo institutais, kuriuos patvirtino Rockefellerio universiteto institucinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Narkotikų gydymas.

Buvo pranešta, kad lėtinis kokaino gydymas (30 mg / kg per parą) stipriai padidina nugaros smegenų tankio tankį tiek žiurkės NAcc šerdyje, tiek lukštuose, tačiau mažesnė dozė (15 mg / kg) padidino stuburo tankį tik apvalkalas (61). Todėl mes panaudojome didesnę kokaino dozę, kad sukeltume struktūrines modifikacijas abiejose NAcc dalyse. Pelės gavo vieną 30 mg / kg kokaino-HCl (arba fiziologinio tirpalo) injekciją kiekvieną dieną 5 iš eilės, o po to 2 injekcijos nebuvo, ir ši procedūra buvo pakartota 4 iš eilės einančių savaičių. Injekcijos buvo atliekamos namų narve. 2WD arba 30WD, pelės smegenys buvo apdorotos DiI žymėjimui ir (arba) imunohistochemijai.

Balistinis ženklinimas su fluorescenciniu dažikliu.

Pelės buvo anestezuotos 80 mg / kg natrio pentobarbitaliu ir perfuzijos transcardialiniu būdu su 5 ml PBS, po to sparčiai perfuzuojama 40 ml 4% paraformaldehido PBS (20 ml / min). Smegenys greitai pašalintos iš kaukolės ir po 4 min. Smegenų griežinėliai (10 μm) buvo pažymėti fluorescencinio dažiklio DiI (Molecular Probes) balistiniu būdu, kaip aprašyta ref. 38. Bendras DiI ženklinimo ir imunohistochemijos metodas buvo sukurtas mažai ploviklio koncentracijos. DiI-žymėti skyriai buvo permeabilizuoti 0.01% Triton X-100 PBS 15 min ir tada inkubuoti 0.01% Triton X-100 ir 10% normalaus ožkų serume PBS 1 h, kad būtų sumažintas nespecifinis ženklinimas. Po to audinių sekcijos buvo inkubuojamos su 1% normaliu ožkų serumu / 0.01% Triton X-100 ir anti-GFP antikūnu (Abcam, Cambridge, MA) kambario temperatūroje 2 h, plaunamos ir inkubuojamos 1: 1,000 praskiedus FITC- konjuguotas antrinis antikūnas (Molecular Probes). Sekcijos buvo dedamos ant mikroskopo skaidres ir padengtos montavimo terpė. Balistinio ženklinimo metodas leido atlikti išsamią dendritinės stuburo struktūros analizę, o gauti rezultatai buvo kokybiškai ir kiekybiškai palyginami su ankstesniais tyrimais, naudojant Golgi – Cox impregnavimo metodą žiurkių smegenų griežinėliais (34). Tačiau, priešingai nei ankstesniuose tyrimuose, mes retai stebėjome dvikrypčius stygius DiI dažytuose neuronuose. Šis skirtumas gali atsirasti dėl dažymo metodų jautrumo ar pelės (šio tyrimo) ir žiurkių audinių (34).

Imunohistochemija.

Gyvūnai buvo anestezuoti ir perfuzuoti, kaip aprašyta aukščiau. Smegenys buvo pašalintos ir laikomos per naktį 4% paraformaldehidu 4 ° C temperatūroje. Smegenys buvo perkeltos į 30% sacharozę PBS tirpale, siekiant apsaugoti kriogeninę apsaugą. Koroniniai pjūviai (12 μm) buvo nupjauti užšaldantį mikrotomą (Leica) ir tada apdoroti imunohistochemijai. Tada smegenų sekcijos permeabilizuotos 0.3% Triton X-100 PBS 15 min ir du kartus plaunamos PBS. Sekcijos buvo iš anksto inkubuojamos 10% normalaus ožkų serume PBS 1 val. 37 ° C temperatūroje, veikiamos pirminių antikūnų (praskiestų 1% normaliu ožkų serumu PBS) metu per naktį 4 ° C temperatūroje, po to plaunamos PBS ir inkubuotos su antrine 1 h antikūnai 37 ° C temperatūroje. Buvo naudojami tokie antikūnai: triušio anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz biotechnologija), pelės anti-NeuN (Chemicon), triušio anti-GFP, FITC konjuguotas anti-triušio IgG ir rodamino- konjuguotas anti-pelės IgG (Molecular Probes). Trigubo žymėjimo (AFosB, NeuN ir GFP) atveju smegenų sekcijos pirmą kartą buvo imunizuotos anti-pan FosB antikūnu ir anti-NeuN antikūnu, o po to inkubuotos su antriniais antikūnais (rodamino konjuguotas anti-triušio IgG ir ciano konjuguotas anti-pelės IgG) ). Dvigubai dažytos smegenų sekcijos toliau apdorojamos GFP imunodažui naudojant Zenon ženklinimo technologiją (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anti-pan-FosB antikūnas buvo pakeltas į FosB N galą ir atpažįsta ΔFosB ir pilno ilgio FosB (62). Remiantis ankstesniais tyrimais, kurie parodė, kad ΔFosB, bet ne FosB ar kiti Fos susiję antigenai yra stabiliai ekspresuojami po lėtinio kokaino gydymo, mes manome, kad ilgalaikis imunoreaktyvumo padidėjimas yra stabili ΔFosB ekspresija. Tačiau imunoreaktyvaus FosB signalo, pastebėto druskos tirpaluose, tapatybė nežinoma. Statistinė analizė. \ T Lentelė 1 naudojo Studentą t testas.

Dendritinės stuburo analizė.

Atskiri MSNs buvo atrinkti stuburo analizei, remiantis keliais kriterijais. (i) Siekiant užtikrinti, kad skirtingų ląstelių procesai nebūtų supainioti, buvo mažai arba visiškai nesutampa su kitomis pažymėtomis ląstelėmis. (ii) Analizei naudojamoms ląstelėms reikia matyti bent tris pirminius dendritus. (III) Buvo tiriami distaliniai dendritai (galiniai dendritai arba arti galinio dendrito). Išanalizuoti dendritai iš abiejų MSN, esančių NAcc šerdyje ir apvalkale. Nors mes stebėjome nedaug spygliuotus MSN (spygliuotas II tipas), mes analizavome tik tankiai spygliuotus MSN (I spygliuotas tipas). Norint apskaičiuoti stuburo tankį, dendrito ilgis (> 20 μm ilgio) buvo atsektas naudojant konfokalinį mikroskopą (Zeiss LSM 510) su panardinamuoju lęšiu (× 40). Visi dendritų vaizdai buvo daromi skirtingais būdais z (0.5 – 1 μm gylio intervalai), siekiant ištirti dendritinių stuburo morfologiją. Visi matavimai atlikti naudojant metamorfinio vaizdo analizės programinę įrangą (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistinė analizė naudojo Kolmogorovo – Smirnovo testą.

Dendritų iškyšos buvo suskirstytos į keturias rūšis, remiantis jų ilgiu, kaip aprašyta ref. 63 ir 64. 1 klasės išsikišimai, dar vadinami užsispyrusiais išsikišimais, buvo <0.5 μm ilgio, neturėjo didelės stuburo galvos ir neatrodė, kad turėtų kaklą; 2 klasės arba grybo formos spygliai buvo tarp 0.5 ir 1.25 μm ilgio, jiems būdingas trumpas kaklas ir didelė stuburo galva; 3 klasės arba plonos spygliai svyravo nuo 1.25 iki 3.0 μm ir turėjo pailgą stuburo kaklą su mažomis galvutėmis; 4 klasė arba filopodiniai pratęsimai buvo ilgi gijiniai išsikišimai, kuriems nebuvo pastebimos stuburo galvos.

Padėka

Šį darbą palaikė Jungtinių Valstijų visuomenės sveikatos tarnybos dotacija „DA10044“ („PG“ ir „ACN“) bei „Simons Foundation“, Peter J. Sharp fondas, „Picower“ fondas ir FM Kirby fondas.

Santrumpos

  • NAcc
  • branduolys accumbens
  • MSN
  • vidutinio dydžio smailinis neuronas
  • BAC
  • bakterinės dirbtinės chromosomos
  • Drd1
  • dopamino receptorių D1 promotoriaus
  • Drd2
  • dopamino receptorių D2 promotoriaus
  • DiI
  • 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocianino perchloratas
  • 2WD
  • 2 dienos po paskutinio gydymo vaistais
  • 30WD
  • 30 dienos po paskutinio gydymo vaistais.

Išnašos

 

Interesų konflikto pareiškimas: Konfliktų nėra.

Nuorodos

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989: 2: 285 – 298. [PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998: 86: 353 – 387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Pharmacol. 1975: 24: 847 – 852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Science. 1987: 237: 1219 – 1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004: 25: 210 – 218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. 1991: 16: 223 – 244. [PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. 1997: 25: 192 – 216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Psychol. 2003: 54: 25 – 53. [PubMed]
9. Wolf ME, Khansa MR Brain Res. 1991: 562: 164 – 168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW psichofarmakologija. 2000: 151: 99 – 120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neurolis. 1992: 320: 145 – 160. [PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990: 13: 259 – 265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992: 13: 61 – 69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neuroscience. 1986: 19: 147 – 158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988: 460: 161 – 167. [PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000; 23: S64 – S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr, Sibley DR Science. 1990: 250: 1429 – 1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. 2000: 24: 85 – 105. [PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998: 82: 767 – 780. [PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Lett. 1987: 79: 315 – 320. [PubMed]
21. Woolverton WL, virusas RM Pharmacol. Biochem. Behav. 1989: 32: 691 – 697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Pharmacol. 1990: 1: 355 – 363. [PubMed]
23. Epping-Jordan MP, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998: 784: 105 – 115. [PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergmanas JJ Pharmacol. Gal. Ther. 1999: 291: 353 – 360. [PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998: 9: 1763 – 1768. [PubMed]
26. Savęs DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Science. 1996: 271: 1586 – 1589. [PubMed]
27. Khroyan TV, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Gal. Ther. 2000: 294: 680 – 687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002: 159: 284 – 293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Neurosci. 2001: 2: 119 – 128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neurofarmakologija. 2004: 47: 33 – 46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Opin. Pharmacol. 2004: 4: 23 – 29. [PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Neurosci. 2001: 2: 695 – 703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997: 17: 8491 – 8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999: 11: 1598 – 1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003: 28: 1082 – 1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng C., Doughty ML, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME ir kt. Gamta. 2003: 425: 917 – 925. [PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002: 53: 590 – 605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB metodai. 2003: 30: 79 – 85. [PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr, Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW, et al. Gamta. 1999: 401: 272 – 276. [PubMed]
40. Nestler EJ Neurofarmakologija. 2004: 47: 24 – 32. [PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neurolis. 1995: 355: 418 – 426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996: 16: 6579 – 6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Gal. Ther. 1995: 275: 1671 – 1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995: 15: 8167 – 8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996: 17: 147 – 156. [PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, diena HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Smegenys. Res. 1999: 103: 203 – 209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Day HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001: 13: 1977 – 1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Pharmacol. 1998: 42: 454 – 457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Aug 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003: 6: 1208 – 1215. [PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003: 116: 19 – 22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, et al. Gamta. 2001: 410: 376 – 380. [PubMed]
53. Nikolikas M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Nature. 1998: 395: 194 – 198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001: 13: 241 – 247. [PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004: 24: 865 – 876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. JAV. 2005: 102: 3489 – 3494. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004: 42: 773 – 787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002: 35: 91 – 105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001: 21: 9325 – 9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. JAV. 2000: 97: 9287 – 9292. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004: 20: 1647 – 1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., Ulery PG, Wallace DL, Self DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005: 21: 2817 – 2824. [PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992: 12: 2685 – 2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. JAV. 2002: 99: 1639 – 1644. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]