Esminis histono metiltransferazės G9a vaidmuo kokaino sukeltame plastikume (2010)

PMCID: PMC2820240

NIHMSID: NIHMS174679

Galutinę leidėjo redaguotą šio straipsnio versiją galite rasti tinklalapyje Mokslas
Žr. Kitus PMC straipsnius citata paskelbtas straipsnis.

Abstraktus

Kokaino sukeltas genų ekspresijos pokytis sukelia neuronų morfologijos ir elgesio pokyčius, kurie gali būti priklausomi nuo kokaino. Mes nustatėme esminį histono 3 lizino 9 (H3K9) dimetilinimo ir lizino dimetiltransferazės G9a vaidmenį kokaino sukeltame struktūriniame ir elgesio plastikume. Pakartotinis kokaino vartojimas sumažino H3K9 dimetilinimo pasaulinį lygį branduolio accumbens. Tjo sumažėjimas histono metilinimo procese buvo susijęs su G9a represijomis šiame smegenų regione, kurį reguliavo kokaino sukeltas transkripcijos faktorius ΔFosB. Naudodamiesi sąlyginiu mutageneziu ir virusiniu būdu perduodamu genų perdavimu, nustatėme, kad G9a sumažino branduolių accumbens neuronų dendritinių stuburo plastiškumą ir padidino kokaino pirmenybę, taip užtikrinant histono metilinimo svarbą ilgalaikiam kokaino poveikiui.

Įvadas

Pakartotą kokaino ekspoziciją apibūdina nuolatiniai genų ekspresijos pokyčiai ir pasikeitusi neuronų morfologija branduolio accumbens (NAc), kuris yra pagrindinis smegenų atlygio grandinės komponentas (1-2). Chromatino rekonstrukcija yra svarbi permainų transkripcijos pokyčių šiame smegenų regione, kurie gali būti priklausomi nuo kokaino priklausomybės aspektų. (3-9). Chromatino struktūros kokaino reguliavimas NAc rezultatais iš dalies atsiranda dėl tiesioginių kokaino sukeltų chromatino fermentinių mechanizmų modifikacijų, dėl kurių pasikeičia histono acetilinimas ir fosforilinimas (4, 7-9); tačiau fermentų, kontroliuojančių histono metilinimą, vaidmenys dar nebuvo tiriami.

Neseniai atlikus genomo plitimo promotoriaus analizę, naudojant chromatino imunopresiją, prijungtą prie mikroschemų (ChIP-Chip), nustatyta pakartotinė represinio histono H3 lizino 9 (H3K9) ir 27 (H3K27) metilinimo reakcija specifiniuose geno promotoriuose NAc po pakartotinio gydymo kokainu (6). Todėl mes profiliavome daug lizino metiltransferazių (KMT) ir demetilazių (KDM), kurie yra žinomi, kad kontroliuoja H3K9 arba H3K27 metilinimą (1A). Tik du fermentai, G9a ir GLP, parodė nuolatinį transkripcijos reguliavimą 24 valandas po pakartotinio kokaino vartojimo, kai abiejų genų ekspresija buvo žymiai sumažinta. Kadangi G9a ir GLP specifiškai katalizuoja H3K9 (H3K9me2) dimetilinimą, jų sumažėjimas pagal kokainą atitinka sumažėjusius pasaulinius euchromatinių H3K9me2 lygius šiuo metu (1B). Priešingai, kartotinis kokaino ekspozicija nepakeičia heterochromatinio H3K27 metilinimo lygio.S1 parama internetinei medžiagai). Dėl didelio katalizinio aktyvumo lygio in vitro ir in vivo (10), mes nustatėme toliau tirti G9a represijų funkcinę reikšmę po pakartotinio kokaino poveikio NAc. G9a baltymų kiekis, kaip ir jo mRNR kiekis, po pakartotinio kokaino vartojimo žymiai sumažėjo 24 valandos (S2). Nors GCNUMXa mRNR ekspresija buvo sumažinta 9% NAc, imunohistocheminė analizė parodė, kad G35a baltymų kiekis sumažėjo 15%, lyginant su pastebimu 9% sumažėjimu H21K3me9 po pakartotinio kokaino vartojimo (1B). G9a mRNR ekspresija šiame smegenų regione taip pat sumažėjo 20% po pakartotinio kokaino vartojimo (S3).

Pav 1  

Pakartotinis kokainas slopina G9a ekspresiją NAc per FosB priklausomą mechanizmą. () H3K9 / K27 KMT ir KDM mRNR ekspresija NAc 24 val. po pakartotinio kokaino. (B) H3K9me2 koncentracija NAc 24 val. Po pakartotinio kokaino. (C) Geno analizė ...

Norėdami nustatyti, ar euchromatinių H3K9me2 pokyčiai koreliuoja su genomo pločio genų ekspresijos pokyčiais NAc, mes naudojome „microarray“ analizes, kad ištirtume geno ekspresijos profilius, sukeltus išbandytos kokaino dozės gyvūnams su anksčiau buvusiu kokaino poveikiu arba be jo (žr. genų sąrašai Lentelės S1 – S3). Kartotinai kokainą gavusiems gyvūnams buvo pastebimai padidėjusi geno ekspresija 1 valandą po kokaino poveikio, palyginti su akutiškai gydytais gyvūnais (1C). Ši padidėjusi geno ekspresija vis dar pasireiškė reaguojant į kokaino vartojimą po 1 savaitės pasitraukimo iš pakartotinio kokaino. Atsižvelgiant į ankstesnes ataskaitas, nedidelis procentas genų (~ 10%) parodė desensibilizuotą transkripcijos atsaką po pakartotinio kokaino vartojimo (1C; pamatyti Lentelė S1) (5). Norint tiesiogiai ištirti G9a sumažėjimo įtaką padidėjusiam geno ekspresijai, pastebėtai po pakartotinio kokaino, pelės gavo intravenines NAc injekcijas Herpes simplex viruso (HSV) vektoriuose, ekspresuojančiuose GFP arba G9a, ir buvo gydomi fiziologiniu tirpalu arba pakartotiniu kokainu, siekiant nustatyti, ar G9a viršijama pakako blokuoti pakartotinį kokaino sukeltą geno ekspresijos padidėjimą. Iš 12 atsitiktinai atrinktų genų, turinčių padidėjusį ekspresijos lygį po pakartotinio kokaino, išryškėjome, kad G9a žymiai sumažino šių genų 50% padidėjimą (Lentelė S4).

Norėdami nustatyti ankstesnius transkripcijos įvykius, kurie tarpininkauja pakartotinai sukeltą kokaino sukeltą G9a ekspresiją, ištyrėme galimą ΔFosB, labai stabilaus artimojo ankstyvojo geno susiliejimo produkto, vaidmenį. fosB. ΔFosB kaupiasi NAc po kokaino poveikio, kai jis susijęs su padidėjusiu kokaino atlygiu (11). ΔFosB gali veikti kaip transkripcijos aktyvatorius arba repressorius, priklausomai nuo dalyvaujamo tikslinio geno (3, 5, 6, 12). Naudojant bitransgeninius NSE-tTA × tetOP-ΔFosB pelės, kur AFosB ekspresija gali būti pasirinktinai paskatinta suaugusių gyvūnų NAc ir dorsalinėje striatume (13), mes išnagrinėjome ΔFosB išraišką dėl kokaino reguliavimo H3K9me2 ir KMT į NAc. ΔFosB viršijimas buvo pakankamas tiek H3K9me2 (1D pav) ir G9a išraiška (1E), tokiu būdu imituojant pakartotinio kokaino poveikį. Atvirkščiai, ΔFosB nesumažino GLP ekspresijos šiame smegenų regione ir neturėjo poveikio atitinkamai SUV39H1 ir EZH2, pagrindiniams trimetilinimo fermentams, atitinkamai H3K9 ir H3K27 (S4). Šiems duomenims patvirtinti naudojant nepriklausomą AFosB ekspresijos sistemą, laukinės rūšies suaugusios pelės gavo dvišales intra-NAc injekcijas su Adeno-susijusiais virusais (AAV), ekspresuojančiais GFP arba ΔFosB. BrainFosB pernelyg intensyvi ekspresija per mažai sumažino G9a ekspresiją šiame smegenų regione (1E).

Toks ryškus ir specifinis G9a reguliavimas paskatino mus ištirti, ar G9a ekspresijos kitimas NAc neuronuose reguliuoja elgesio atsaką į kokainą. Laukinės rūšies pelėms buvo įšvirkštos VNV vektorių injekcijos, ekspresuojančios GFP arba G9a, ir po to buvo analizuojamos naudojant nešališką kokainą sąlygojančios vietos pirmenybės paradigmą, kuri suteikia netiesioginį vaisto atlygio matą. G9a virusu pernelyg didėjant NAc neuronams buvo patvirtinta atlikus elgesio tyrimus (2A). G9a pernelyg didelė ekspresija žymiai sumažino kokaino pasirinkimą, palyginti su gyvūnais, kurie pernelyg išreiškė GFP (2B) ir padidino H3K9me2 lygius NAc (2C). G9a (G9aH1093K) kataliziškai nugaišusio mutanto viršijimas (14) neturėjo įtakos kokaino pasirinkimui (\ t2B) ir neturėjo įtakos H3K9me2 koncentracijai šiame smegenų regione (2C).

Pav 2 

G9a NAc reguliuoja kokaino sukeltą elgesio plastiškumą. () Reprezentatyvus HSV-medijuojamos transgeno ekspresijos vaizdas NAc. Iš pelės smegenų atlaso buvo paimtas koronalinės smegenų gabalas. (B) Kondicionuojamas kokaino ir. \ T ...

Toliau ištirti G9a vaidmenį kokaino elgsenos poveikiuose ir tiksliau imituoti pakartotinį kokaino sukeltą G9a ekspresijos represiją NAc, suaugusiems G9afl / fl pelės (14) gavo intra-NAc injekcijas AAV vektoriams, ekspresuojantiems Cre rekombinazę arba GFP kaip kontrolę. AAV-Cre „G9a“ nukritimas NAc, kuris buvo patvirtintas imunohistochemiškai (S5), žymiai padidino kokaino poveikį kondicionavimo eksperimentams ir sumažino H3K9me2 lygius NAc (2D, E). G9a ir GLP, BIX01294 (BIXXNUMX) komerciškai prieinamas farmakologinis inhibitorius.15-16), buvo naudojamas siekiant nustatyti, ar fermentų slopinimas panašiai veikia elgesio atsaką į kokainą. Iš tiesų, G9a ir GLP farmakologinis slopinimas žymiai padidino kokaino pirmenybę ir sumažino H3K9me2 NAc (2F, G).

Pakartotinis kokaino vartojimas padidina dendritinių spyglių tankį NAc vidutinio spyglių neuronuose (17), procesą, susijusį su funkciniais pokyčiais eksitaciniais glutamaterginiais sinapse į šiuos neuronus (18-19) ir jautrūs elgesio atsakai į vaistą (17, 20). Taigi mes įtarėme, kad G9a aktyvumo mažėjimas NAc kartotiniu kokainu gali sukelti kokaino gebėjimą reguliuoti NAc neuronų dendritinį stuburo tankį. Naudojant chromatino imunopretipitaciją (ChIP) su anti-G9a antikūnu, mes nustatėme keletą galimų G9a genų taikinių NAc, kurių kiekvienas anksčiau buvo susijęs su kokaino sukeltu dendritiniu plastiškumu (3A) (20-26). Mes nustatėme, kad pakartotinis kokaino vartojimas žymiai sumažino G9a surišimą, taip pat H3K9me2 koncentraciją šiuose geno promotoriuose (3B). Priešingai, ūminis kokaino vartojimas greitai įdarbino G9a į kai kuriuos iš tų pačių genų promotorių, atitinkantį padidėjusią G9a ekspresiją, pastebėtą NAc 1 valandą po ūminės kokaino dozės (S6). Nors G9a surišimas specifiniuose geno promotoriuose koreliuoja su jo ekspresijos pokyčiais, lieka neaišku, ar tokius įvykius sąlygoja pakitę pasauliniai G9a lygiai NAc ir / arba G9a įdarbinimo skirtumai po ūminio vs kartotinis kokaino vartojimas.

Pav 3  

G9a NAc reguliuoja kokaino sukeltą dendritinį stuburo plastiškumą. () Kiekybinis G9a ChIP NAc iš gyvūnų, gydytų atitinkamai su kokainu, atitinkamai 1 arba 24 hr. APRT buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Duomenys pateikiami kaip giminaitis ...

Remiantis G9a reguliavimu, susijusiu su daugybe su plastika susijusių genų, mes tiesiogiai ištyrėme, ar G9a ekspresijos palaikymas šiame smegenų regione po pakartotinio gydymo kokainu buvo pakankamas, kad blokuotų kokaino sukeltą dendritinių stuburo formavimąsi. Naudojant anksčiau atliktą kokaino gydymo protokolą, skatinantį dendritinių stuburo indukciją NAc (20), mes ištyrėme stuburo tankį gyvūnams, švirkščiamiems HSV-GFP arba HSV-G9a. Sutinku su ankstesniais duomenimis, pastebėjome reikšmingą dendritinių stuburo tankio padidėjimą NAc po gydymo kokainu, kuris buvo visiškai užblokuotas G9a viršijimo (3C). G9a viršsekspresija vien tik nepakankama, kad būtų sumažintas NAc dendritinio stuburo tankis be kokaino. Norėdami papildyti šiuos duomenis, G9afl / fl pelėms buvo įšvirkštos HSV-Cre injekcijos, o stuburo tankis buvo kiekybiškai įvertintas ir palygintas su gyvūnais, gaunančiais HSV-GFP be kokaino. G9a ekspresijos išjungimas žymiai padidino stuburo tankį NAc vidutinio nugaros neuronuose (3C).

Atsižvelgiant į įrodymus, kad G9a sumažėjimas NAc po pakartotinio kokaino yra tarpininkaujamas ΔFosB, mes išnagrinėjome, ar šis transkripcijos faktorius taip pat yra susijęs su NAc dendritinių spyglių reguliavimu. Nors ΔFosB anksčiau nebuvo siejamas su tokiu dendritiniu plastiškumu, keli jo tikslai, įskaitant Cdk5 ir NFκB subvienetus, buvo taip susiję (20-23), ir FosB nuolatinė ekspresija NAc neuronuose koreliuoja su padidėjusiu dendritiniu stuburo tankiu po pakartotinio gydymo kokainu (27). Pirma, mes nustatėme, kad ΔFosB indukcija bitransgeninėse pelėse be kokaino, kuris sumažino G9a ir H3K9me2 išraišką (1D, E), sumažėjo G9a prisijungimas prie daugelio su plastika susijusių genų, kurių daugelis taip pat buvo tiesioginiai ΔFosB tikslai (3D pav) (3, 6). Mes taip pat parodėme, kad ΔFosB pernelyg didelė ekspresija NAc reikšmingai padidino dendritinio stuburo tankį bazinėmis sąlygomis, panašus į tą, kuris pastebėtas po pakartotinio kokaino vartojimo (\ t3E). Atvirkščiai, dominuojančio neigiamo ΔJunD baltymo, kuris antagonizuoja ΔFosB transkripcinį aktyvumą, pernelyg didėjantis DNR, blokavo pakartotinio kokaino gebėjimą didinti dendritinių stuburo formavimąsi NAc (3C).

Mūsų pastaba, kad ΔFosB reguliuoja G9a ekspresiją NAc ir kad ΔFosB ir G9a reguliuoja kai kuriuos tuos pačius tikslinius genus, paskatino ištirti kitas sąveikas tarp ΔFosB ir G9a. Po ūminio kokaino, kai padidėjo G9a koncentracija, G9a prisijungimas prie fosB genas buvo padidintas, o po pakartotinio kokaino, kai G9a ekspresija buvo slopinta, G9a \ t fosB sumažėjo genas (3A). Toks sumažėjęs G9a prisijungimas po pakartotinio kokaino nebuvo stebimas c-fos, kai G9a surišimas padidėja pakartotiniu kokainu (S7). Tai atitinka faktą, kad, skirtingai nuo fosB, c-fos yra slopinamas, nesukeliamas, dėl lėtinio psichostimuliatoriaus poveikio (5). ΔFosB overeekspresija bitransgeninėse pelėse buvo pakankama, kad žymiai sumažėtų G9a, \ t fosb genas (3D pav). Be to, G9a per didelė ekspresija buvo pakankama, kad sumažėtų padidėjusi ΔFosB ekspresija po pakartotinio kokaino vartojimo (Lentelė S4). Šie duomenys rodo autoreguliavimo kilpą, pagal kurią G9a iš pradžių riboja ΔFosB indukciją ūminiu kokaino vartojimu. Tačiau, kadangi ΔFosB kaupiasi kartu su pakartotiniu vaisto poveikiu, jis slopina G9a ir taip stiprina savo tolesnę indukciją.

Apibendrinant, mes parodėme, kad histono lizino metilinimas NAc yra labai svarbus reguliuojant neuronų geno ekspresiją atsakant į kokainą. G9a ir H3K9me2 slopinimas po pakartotinio kokaino vartojimo skatina kokaino pirmenybę, iš dalies dėl transkripcinio daugelio genų, žinomų, kad reguliuoja dendritinės plastiškumo aberrantines formas. Geresnis supratimas apie tokiais mechanizmais reguliuojamus genus pagerins mūsų žinias apie sudėtingą biologinį priklausomybės nuo narkotikų pagrindą ir galėtų padėti sukurti veiksmingesnius priklausomybės sutrikimų gydymo būdus.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnai ir gydymas

Jei nenurodyta kitaip, pelės buvo laikomos nuo keturių iki penkių narvų kolonijoje su 12 valandos šviesos / tamsos ciklu (apšvietimas iš 7: 00 AM į 7: 00 PM) pastovioje temperatūroje (23 ° C) ad libitum prieiga prie vandens ir maisto. Visi gyvūnų protokolai buvo patvirtinti IACUC tiek UT pietvakarių medicinos centre, tiek Sinajaus kalno medicinos mokykloje.

Kokaino eksperimentams [imunohistochemitry, western blotting, kiekybinis PCR (qPCR), mikroarray analizė ir chromatino imunopretipitacija (ChIP)] buvo naudojamos 8-10 savaitės vyrų C57BL / 6J pelės. Gyvūnams kasdien buvo švirkščiama „fiziologinis tirpalas“ (7 gydymas druskos tirpalu, ip), „ūminis“ kokainas (6 gydymas druskos tirpalu + vienas gydymas 20 mg / kg kokaino-HCl, ip) arba „pakartotinis“ kokainas (7 gydymas 20 mg / kg kokaino-HCl, ip). Pelės buvo nužudytos 1 valandą arba 24 valandomis po galutinio gydymo. „Microarray“ tyrimų metu gyvūnai buvo gydomi kasdien su „fiziologiniu tirpalu“ (15 gydymas fiziologiniu tirpalu, ip), „ūminiu“ kokainu (14 gydymas fiziologiniu tirpalu ir 1 gydymu 20 mg / kg kokaino-HCl, ip), „kartotinis + ūminis“ kokainas ( 7 gydymas druskos tirpalu + 8 gydymas 20 mg / kg kokaino-HCl, ip) arba „kartotinis pasikartojimas + ūminis“ kokainas (7 gydymas 20 mg / kg kokaino-HCl + 7 gydymas druskos tirpalu 1 mg / kg kokaino-HCl, ip) ir po galutinio apdorojimo buvo paaukoti 20 valandą. Elgesio eksperimentuose pelės buvo atskirai laikomos po operacijos ir buvo gydomos 1 mg / kg kokaino-HCl, ip, kaip aprašyta toliau. Dendritinių stuburo analizei ir mikroarray patvirtinimui po HSV-GFP ir HSV-G10a-GFP infekcijos pelėms buvo gydoma „fiziologiniu tirpalu“ (9 gydymas druskos tirpalu, ip) arba „pakartotiniu kokainu“ (5 gydymas 5 mg / kg kokaino-HCl, ip ) 20 dienų metu, kadangi buvo įrodyta, kad šis injekcijos protokolas padidina stuburo tankį ant branduolių accumbens (NAc) neuronų per Herpes simplex viruso (HSV) transgeno ekspresijos laikotarpį.Papildomas ref S1). Pelėms, naudojamoms dendritiniam stuburo tyrimui, po paskutinio gydymo buvo nužudytos 4 valandos.

Norint paskatinti vietinę G9a transkripto ištrynimą, apribotą NAc neuronais, mes naudojome mutantines peles, kurios buvo homozigotinės, jei buvo tiriamas G9a alelis, kurios išsamiai aprašytos kitur (S2). „Cre“ sukeltas rekombinavimas sukuria 22 eksoną 25 iš išorinio rėmo, dėl kurio atsiranda nesąmonė, sukėlus mutaciją. Mes naudojome „G9a“ plaukiojančias peles, kurios buvo visiškai persiunčiamos į C57BL / 6J peles. Pelės sterilizuotos injekcijomis į NAc su Adeno sukeltomis viruso (AAV) vektoriais (2 serotipu), ekspresuojančiomis GFP arba Cre-GFP tarp 7 ir 10 savaičių. Cre-medijuojamo rekombinacijos efektyvumui patikrinti buvo naudojama imunohistocheminė analizė (žr Papildomas pav. S5). Mes naudojome AAV švirkščiamus gyvūnus 21 dienas po operacijos, nes rekombinacija G9a plūduriuojančiose pelėse buvo stabili ir maksimali šiuo metu, atsižvelgiant į paskelbtas ataskaitas (S3-S4). G9a ir AJunD viršijimo eksperimentai buvo panašiai atlikti naudojant HSV virusų vektorius, ekspresuojančius arba GFP, laukinio tipo G9a-GFP, kataliziškai negyvą G9aH1093K-GFP arba ΔJunD-GFP (žr. S2 išsamesnės informacijos apie G9a konstrukcijų kūrimą). HSV viršekspressuojančios pelės buvo vartojamos 3 dienas po operacijos, nes pernelyg didelė ekspresija šiuo metu buvo maksimali, kaip nustatyta per imunohistochemiją. Dėl trumpalaikio HSV ekspresijos pobūdžio ir žymiai stabilesnio AAV ekspresijos pobūdžio, HSV vektoriai buvo naudojami eksperimentuose, reikalaujančiuose greito, trumpalaikio transgeno ekspresijos, o AAV vektoriai buvo naudojami eksperimentuose, kuriems reikia ilgų transgeno ekspresijos laikotarpių. Abu ankstesni tyrimai parodė, kad abu vektoriai gali užkrėsti tik neuroninių ląstelių kūnus injekuotų smegenų srityje, be jokių afferentinių ar efferentinių neuronų infekcijos.

Elgesio eksperimentams, naudojant farmakologinį G9a / GLP inhibitorių, BIX01294 (25 ng / μl), pelės buvo sterotiškai implantuotos dviem po oda esančiais mini siurbliais, taip pat dvišaliais kreipiamosiomis kanulėmis į NAc. Minimalūs siurbliai buvo suaktyvinti 12 valandas prieš implantavimą, pradedant nepertraukiamu vaisto (0.25 hidroksipropil β-ciklodekstrino) arba vaisto tiekimu (5 μl / val.) 14 dienoms, kurių metu buvo atlikti elgesio vertinimai.

ΔFosB viršsprendimo eksperimentams [western blotting, qPCR ir ChIP], vyriški bitransgeniški NSE-tTA × tetOP-ΔFosB buvo naudojamos pelės (10 savaitės), nes be tetraciklino darinio doksiciklino (8 savaitės nuo doksiciklino), gyvūnai rodė tvirtą striatų ribotą ΔFosB ekspresiją (S5). OsFosB overexpression šiose pelėse buvo patvirtinta per qPCR. Norėdami patvirtinti išvadas naudodami NSE-tTA × tetOP-ΔFosB pelės, laukinės 8 savaitės senos C57BL / 6J pelės buvo sterotaksiškai injekuotos į NAc vidų su AAV vektoriais, ekspresuojančiais GFP arba ΔFosB-GFP. Šiuo atveju buvo naudojami AAV vektoriai, siekiant užtikrinti maksimalią ΔFosB ekspresiją 8 savaitėmis po operacijos, leidžiantį tiesiogiai palyginti virusiškai užkrėstus ir bitransgeniškus AFosB viršįtampius peles. Viršutinė viruso ekspresija buvo patvirtinta naudojant qPCR 8 savaitėmis po operacijos (15 gabarito NAc štampai buvo išpjauti po injekcijos vietos). AAV-GFP ir AAV-ΔFosB-GFP pelės, kurios nebuvo vartojamos qPCR, buvo gydomos fiziologiniu tirpalu (14 gydymas fiziologiniu tirpalu, ip) arba pakartotiniu kokainu (14 gydymas 30 mg / kg kokaino-HCl, ip), pradedant nuo 6 savaitės operacija. 4 dienos po galutinio apdorojimo smegenys buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu, suskirstytos į vibratomą ir naudojamos dendritinių stuburo analizei.

Western blot analizė

14 gabarito NAc štampai buvo paimti iš 1 mm koroninių sekcijų, gautų naudojant nerūdijančio plieno pelės smegenų matricą, ir buvo apdoroti ultragarsu 1 M HEPES lizės buferyje (1% SDS), turinčiame proteazės ir fosfatazės inhibitorių. 10-30 μg viso baltymo mėginiai buvo elektroforezuoti 18% SDS gelyje. Baltymai perkelti į PVDF membranas ir inkubuoti su anti-H3K9me2 (pelės monokloniniu, 1: 500), anti-β-tubulinu (pelės monokloniniu, 1: 60,000), anti-total histone H3 (triušio polikloniniu, 1: 5,000), anti-GFP (naudojamas vienodos virusinės ekspresijos patikrinimui perforuotame audinyje) (triušio polikloninis, 1: 1000), anti-H3K27me3 (triušio polikloninis, 1: 500) arba anti-aktino antikūnai (pelės monokloninis, 1: 60,000) 4 ° C (visos membranos buvo užblokuotos 5% piene arba 5% galvijų serumo albuminu). Tada membranos buvo inkubuojamos su peroksidazėmis pažymėtomis antrinėmis antikūnomis (1: 15,000-1: 60,000, priklausomai nuo naudojamo pirminio antikūno, ir juostos buvo vizualizuotos naudojant SuperSignal West Dura substratą. Juostos buvo kiekybiškai įvertintos naudojant NIH Image J programinę įrangą ir H3K9me2 juostos buvo normalizuotos arba su aktinu, arba β-tubulinu, ir į bendrą histoną H3, kad būtų galima kontroliuoti vienodą apkrovą. Pakartotinis kokainas neturėjo poveikio aktino kiekiui (S8) arba viso histono 3 (S1) NAC. Be to, HSV-G9a-GFP ir HSV-G9aH1093K-GFP infekcija neturėjo jokio poveikio β-tubulino kiekiui NAc (S8).

Imunohistochemistry

Pelės buvo seduotos su mirtina chloro hidrato doze ir perfuzuojamos 4% paraformaldehidu, prieš analizuojant vieną ar dvigubą imunohistochemiją, kaip aprašyta anksčiau (S6). Trumpai tariant, po fiksuotos smegenys buvo inkubuojamos kambario temperatūroje per naktį 30% sacharozėje, prieš jas suskirstant į 35 μm (dendritinės stuburo analizės smegenys buvo suskirstytos į vibratomą 100 μm sekcijose be 30% sacharozės). Laisvai plūduriuojančios NAc sekcijos buvo plaunamos 1X PBS, blokuotos (3% normalus asilo serumas, 0.1% tritonX, 1X PBS) ir vėliau inkubuojamos su anti-GFP (vištienos polikloniniu, 1: 8000) ir / arba anti-G9a , 1: 500) antikūnai blokuojančiame tirpale. Dendritinių stuburų analizės sekcijos buvo inkubuojamos su triušio polikloniniu anti-GFP antikūnu 1: 200. Po inkubacijos per naktį 3 minutėmis su 10 PBS buvo nuplauti NAN sekcijos 1 kartus, po to 2X PBS blokavimo tirpale 3X tirpalu inkubuojama su Cy1 ir / arba Cy2 fluorescuojančiomis antrinėmis antikūnomis. Morfologijos tyrimams naudojami sekcijos buvo inkubuojami antriniame antikūne per naktį kambario temperatūroje. Branduolinis bendras dažymas buvo pasiektas inkubuojant sekcijas 1X PBS, kurių sudėtyje yra DAPI (1: 50,000) 10 minučių. Sekcijos vėl plaunamos, po to etanolis dehidratuotas ir montuojamas DPX. Visi sekcijos buvo vaizduojamos naudojant konfokalinę mikroskopiją.

RNR izoliacija ir qPCR

Dvišaliai 14 matuoklių NAc štampai buvo homogenizuoti Trizol ir apdoroti pagal gamintojo instrukcijas. RNR buvo išvalyta RNAesy Micro kolonomis ir spektroskopija patvirtino, kad RNR 260/280 ir 260/230 racionai buvo> 1.8. Tada RNR buvo atvirkščiai transkribuota naudojant „Bio-Rad iScript Kit“ rinkinį. cDNR kiekybiškai įvertinta naudojant qPCR, naudojant SYBR Green. Kiekviena reakcija buvo vykdoma dviem ar trimis egzemplioriais ir analizuojama taikant ΔΔCt metodą, kaip aprašyta anksčiau, kaip normalizavimo kontrolę naudojant gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazę (GAPDH) (S7). Pamatyti papildoma lentelė S5 mRNR pradmenų sekoms.

DNR mikroarray analizė

Keturios grupės (3 nepriklausomos biologinės kartotinės grupės kiekvienai grupei) buvo panaudotos „microarray“ tyrimui, iš viso 12 mikroprocesoriams. 1 valanda po paskutinės kokaino injekcijos, gyvūnai greitai dekapituoti ir smegenys buvo pašalintos ir dedamos ant ledo. NAc fragmentai buvo paimti naudojant 15 gabarito adatos štampavimą ir greitai užšaldyti sausame lede, kol išgavo RNR. Dvišaliai štampai buvo sujungti iš keturių gyvūnų po vieną, iš viso 12 pelių grupėje. RNR izoliacija, mikrokratų apdorojimas ir duomenų analizė buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau (S8). Trumpai tariant, RNR buvo išskirta ir išgryninta, kaip aprašyta aukščiau, ir patikrinta jų kokybė naudojant „Agilent's Bioanalyzer“. Atvirkštinė transkripcija, amplifikacija, žymėjimas ir hibridizavimas su „Illumina MouseWG-6 v2.0“ masyvais buvo atliktas naudojant standartines procedūras, atliktas UT Southwestern mikroraiškos šerdies. Neapdoroti duomenys buvo atimti iš fono ir normalizuoti kvantilės naudojant „Beadstudio“ programinę įrangą. Normalizuoti duomenys buvo analizuojami naudojant „GeneSpring“ programinę įrangą, o genelistai buvo sukurti naudojant reikšmingumo kriterijus, taikomus 1.3 karto didesniam pokyčiui, kartu su nestandartine p vertės riba p <0.05.

Mes dėl šių priežasčių palaikome didelį pasitikėjimą šiais duomenimis. Pirma, visi gyvūnai buvo tvarkomi, gydomi ir žudomi tuo pačiu metu tomis pačiomis sąlygomis. Taip pat visi RNR ir masyvo apdorojimo darbai buvo atlikti vienu metu. Antra, mes atlikome trimis egzemplioriais ir sujungėme kelis gyvūnus pagal masyvo mėginį, taip sumažinant skirtumus dėl individualaus kintamumo ir didėjančios statistinės galios (S9). Trečia, duomenų analizės kriterijus, naudojamus mūsų tyrimui, rekomenduoja „MicroArray Quality Control“ projektas, nes šie kriterijai buvo patvirtinti, kad būtų užtikrintas aukštas pakartotinio atkuriamumo laipsnis ir atkuriamumas tarp ir tarp ląstelių (S10-S11).

Virusinių vektorių konstravimas

Dėl virusinio vektoriaus įterpimo dydžio apribojimų, laukinės rūšies G9a (G9a) arba kataliziškai mirusių G9a (G9aH1093K) koduojančios sekos buvo subklonuotos į bicistroninį p1005 + HSV plazmidę, ekspresuojančią GFP, kontroliuojant žmogaus tiesioginį ankstyvąjį citomegaloviruso promotorių (CMV). įterpimo dydis buvo ~ 9 kb, kuris viršija didžiausią AAV-3.96 vektorių įterpimo dydį). „IE2“ / „4“ promotorius valdo „G5a“ išraišką. Fragmentai buvo subklonuoti į bicistroninę p9 + HSV plazmidę per nelygias galines ligas su Klenow apdorotais PmeI ir EcoRI virškinamais G1005a (iš pcDNA9) ir CIP apdorotu p3.1 + po EcoRI virškinimo. Gaminant HSV-AJunD-GFP, koduojanti AJunD seka, apgaubta EcoRI restrikcijos vietomis, buvo sukurta PCR, naudojant pradmenų oligonukleotidus, turinčius EcoRI vietą. Tada PCR produktas buvo liguojamas į p1005 + vektoriaus EcoRI vietą. Vietinė Cre rekombinazės ekspresija NAc neuronuose buvo pasiektas geno transliacijomis naudojant virusą, naudojant AAV vektorių, kaip aprašyta (S12). GFP arba GFP su N-terminu susiliejimas į Cre buvo subklonuotas į rekombinantinį AAV-2 vektorių, turintį CMV promotorių, su splice donoro akceptoriaus seka ir poliadenilinimo signalu. Visi vektoriniai įterpimai buvo patvirtinti dideoksi sekvenavimu. Viraliniai vektoriai buvo pagaminti naudojant trigubą transfekciją, be pagalbininko metodą, kaip aprašyta anksčiau (S13). Išvalytas virusas buvo laikomas -80 ° C temperatūroje. Virusinė kokybė buvo įvertinta infekciniu titru, įvertintu HEK293 ląstelėse. AAV-AFosB-GFP virusai buvo panašiai paruošti. HSV-Cre atveju Cre ekspresija buvo valdoma IRES promotoriumi, priešingai nei IE4 / 5 promotorius, siekiant sumažinti Cre ekspresiją ir užkirsti kelią toksiškumui neuronams (žr. S14 virusinės konstrukcijos). Visais atvejais buvo patvirtintas viruso viršijimas in vitro ir in vivo per qPCR, ir virusai buvo imunohistochemiškai patvirtinti, kad po operacijos pasirodytų NAc ribota ekspresija.

Stereotaksinė chirurgija

Ketamino (100 mg / kg) / ksilazino (10 mg / kg) anestezijos metu pelės buvo pastatytos į mažo gyvūno stereotaksinį instrumentą, o galvos paviršius buvo veikiamas. Trisdešimt trys švirkšto adatos buvo naudojamos 0.5 μl viruso įterpimui į NAc dvigubai 10 ° kampu (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4), naudojant 0.1 μl / min. HSV injekcijas gavusiems gyvūnams buvo leista atsigauti po 2 dienų po operacijos, o pelėms, naudojamoms elgsenos bandymams, gaunantiems AAV vektorius, buvo leista susigrąžinti 20 dienas prieš pradedant juos laikyti. Šie laikai atitinka maksimalaus virusinio transgeno ekspresijos laikotarpius dviem vektoriams. BIX01294 infuzijoms kiekvienas iš dviejų mini siurblių buvo padedamas po oda ant pelės nugaros. Kanapių išdėstymas buvo pasiektas išgręžiant dvi mažas kaukolės skylutes virš NAc ir pristatant kanulę iš bregmos (AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4). Pelėms buvo leista susigrąžinti 4 operacijos metu iki 5 dienų, prieš pradedant kokaino paruošimo procedūrą, kaip aprašyta toliau.

Reguliuojamos vietos nustatymas

Vietos kondicionavimo procedūra buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau, su šiais pakeitimais (S7). Trumpai tariant, praėjus 3 dienoms po HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP arba HSV-GFP vidaus NAc infuzijų, pelės buvo dedamos į kondicionavimo kameras, kurias sudaro trys skirtingos aplinkos. Pelės, kurios parodė reikšmingą pirmenybę bet kuriai iš dviejų kondicionavimo kamerų, nebuvo įtrauktos į tyrimą (<10% visų gyvūnų). Kondicionavimo grupės buvo subalansuotos, kad prisitaikytų prie vis dar egzistuojančio kameros šališkumo. Kitomis dienomis gyvūnams buvo suleistas fiziologinis tirpalas ir po 30 minučių buvo uždarytas vienoje kameroje po pietų, po to suleistas kokainas (10 mg / kg, ip) ir 30 minučių uždarytas į kitą kamerą vakare 2 dienas (dvi fiziologinis tirpalas ir dvi kokaino poros). Tyrimo dieną pelės buvo negrąžintos 20 minučių atgal į aparatą ir išbandytos, kad įvertintų, kuriai pusei jie teikia pirmenybę. Judėjimo reakcija į kokainą buvo įvertinta spindulių pertraukomis suporuotose kokaino kamerose, kad būtų užtikrintas gydymo narkotikais efektyvumas. Atliekant AAV ir BIX01294 CPP eksperimentus, buvo naudojamas šiek tiek modifikuotas protokolas. Gyvūnams vėl buvo švirkščiamas fiziologinis tirpalas arba kokainas (10 mg / kg, ip) ir uždaromi į tam tikras kameras 30 minučių, bet vietoj jų buvo kondicionuojami tik vieną kartą per dieną 4 dienas, po to atliktas bandymas 5 dieną (gyvūnai buvo kondicionuojami vakare ir kondicionavimo procedūros buvo pakaitomis). Visoms grupėms buvo įvertintas pradinis judėjimas, reaguojant į fiziologinį tirpalą, siekiant užtikrinti, kad gydymas virusais ar inhibitoriais nepaveiktų judėjimo.

Intraveninis kokaino savarankiškas vartojimas

Buvo gauti vyrų paaugliai Long-Evans žiurkės, sveriančios 230 – 250 g bandymo pradžioje. Jie buvo patalpinti drėgmės ir temperatūros kontroliuojamoje aplinkoje atvirkštinio 12 valandos šviesos / tamsos ciklo metu (išjungtas 9: 00 am) su ad libitum prieiga prie maisto ir vandens. Žiurkėms buvo leista aklimatizuotis savo naujoje aplinkoje ir kasdien 1 buvo apdorota prieš eksperimento pradžią. Visos procedūros buvo atliktos pagal Nacionalinio sveikatos instituto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą ir patvirtino Sinajaus kalno gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas. Savęs administravimo įranga buvo įrengta infraraudonųjų spindulių sijos, skirtos judėjimo elgsenai matuoti. Savęs įvedimas buvo atliktas kaip aprašyta anksčiau (S15-S16) kateteriais, implantuotais į dešinę kaklo veną, taikant anesteziją izofluranu (2.4–2.7%). Kateteriai praplauti 0.1 ml fiziologinio tirpalo, kuriame yra 10 V heparino ir ampicilino (50 mg / kg). Po vienos savaitės atsigavus po operacijos, tamsioje šviesos / tamsos ciklo fazėje prasidėjo savęs administravimo mokymai. Gyvūnams buvo leidžiama kasdien 3 valandas naudotis kokainu (0.75 mg / kg / infuzija) pagal fiksuoto santykio-1 (FR1) sutvirtinimo grafiką, kai vienu aktyviu svirties paspaudimu buvo suleista viena vaisto infuzija. Žiurkės stabilizavo kokaino suvartojimą po 1 dienų (<6% atsako dažnio kitimas per 15 dienas iš eilės, mažiausiai 3% reagavo į sustiprintą svirtį). Praėjus 75 valandoms po paskutinio savarankiško vartojimo, žiurkės buvo greitai nukirptos, smegenys greitai pašalintos ir apdorotos RNR izoliacijai ir qPCR.

Chromatino imunoprecipitacija (ChIP)

Švieži NAc štampai buvo formaldehido, susieto ir paruošti ChIP, kaip aprašyta anksčiau (S17-S18) su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, 4 14 gabarito NAc perforatoriai vienam gyvūnui (5 gyvūnai sujungti į vieną mėginį) buvo surinkti, susieti su 1% formaldehidu ir užšaldyti 2 M glicinu prieš užšaldant -80 ° C. 1 diena prieš bandymą su ultragarsu, avių anti-triušis / pelė (priklausomai nuo nusodinimo antikūno) IgG magnetiniai karoliukai buvo paruošti inkubuojant atitinkamus magnetinius rutuliukus su anti-G9a (triušio polikloniniu ChIP) arba anti-H3K9me2 (pelės monokloniniu ChIP laipsniu) antikūnai per naktį esant 4 ° C temperatūrai, esant pastoviam rotavimui blokiniame tirpale. Audinių ultragarsinis apdorojimas ir chromatino pjovimas buvo atliekami kaip aprašyta anksčiau (S17). Po ultragarsinio apdorojimo vienodos chromatino koncentracijos buvo perkeltos į naujus mėgintuvėlius ir ~ 5% galutinių produktų buvo išsaugoti kaip „įvesties“ kontrolė. Po kruopštaus konjuguotų granulių / antikūnų mišinių plovimo ir resuspensijos, kiekvienam chromatino mėginiui buvo pridedami vienodi antikūnų / granulių mišinių kiekiai (~ 7.5 μg antikūnas / mėginys) ir inkubuojami 16 valandomis, esant pastoviam sukimui 4 ° C temperatūroje. Mėginiai toliau plaunami ir atvirkštiniu būdu susieti 65 ° C temperatūroje per naktį prieš DNR gryninimą naudojant PCR gryninimo rinkinį. Po DNR gryninimo mėginiai buvo apdoroti qPCR ir buvo normalizuoti pagal atitinkamus „įvesties“ kontrolės metodus, kaip aprašyta anksčiau (S17). Taip pat buvo atlikti normalūs pelės IgG imunoprecipitacijos naudojant pelės polikloninį anti-IgG antikūną, kad būtų kontroliuojamas tinkamas signalo stiprinimo praturtėjimas. Adenino fosforiboziltransferazė (APRT) buvo naudojama kaip neigiamas kokaino ir ΔFosB ekspresijos eksperimentų kontrolė. Pamatyti Papildoma lentelė S5 promotoriaus pradmenų sekoms.

Dendritinė stuburo analizė

Norėdami ištirti G9a vaidmenį reguliuojant neuronų morfologiją in vivo, taikėme anksčiau aprašytus metodus su šiais pakeitimais (S1). Praėjus trims dienoms po HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP injekcijos (visi virusai buvo naudojami pelės C57Bl / 6J) arba HSV-Cre-GFP (naudojami G9afl / fl pelėms), kai viruso ekspresija buvo maksimali, pelės buvo perfuzuotos, smegenys buvo kriogenizuotos ir vėliau suskirstytos į 100 μm vibratome. Po to sekcijos buvo imuninės, naudojant antikūną prieš GFP, kaip aprašyta aukščiau (žr. Imunohistochemiją). Norint įvertinti G9a pernelyg didelio ekspresijos ir išjungimo poveikį stuburo skaičiui, taip pat ΔJunD viršsekspresijos poveikį, mes nustatėme maždaug 1 – 2 neuritų stuburo skaičių neuronui, lyginant bent 299 μm antrinių dendritų iš GFP ekspresuojančios NAc terpės smegenų neuronai (MSN). Atsižvelgiant į tai, kad MSN yra morfologiškai skiriasi nuo kitų NAc neuronų populiacijų, taip pat ankstesnės ataskaitos, rodančios, kad HSV pirmiausia užkrečia DARPP-32 ekspresuojančius neuronus šiame smegenų regione (S19), esame įsitikinę, kad MSN buvo vertinami tik šiuose tyrimuose. Kiekvienam gyvūnui tyrėme 6 – 8 neuronus 3 – 4 gyvūnų grupėje (7 grupės), po to statistinei analizei kiekvienam gyvūnui buvo nustatyta vidutinė vertė. Eksperimentai, kuriais buvo siekiama ištirti ΔFosB overexpression poveikį NAc stuburo tankiui, buvo atlikti panašiai kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad AAV vektoriai buvo naudojami ekspresuoti GFP arba ΔFosB-GFP ilgą laiką (8 savaites). Visi HSV vaizdai buvo užfiksuoti naudojant konfokalinį mikroskopą su 100X aliejaus imersijos tikslu (AAV vaizdai buvo užfiksuoti naudojant 63X alyvų panardinimo tikslą). Vaizdai buvo įsigyti naudojant 1 savavališkai įrengtą piniginę ir 1024 × 1024 rėmo dydį. Dendritinis ilgis buvo išmatuotas naudojant NIH Image J programinę įrangą, o stuburo numeriai buvo skaičiuojami aklu pagal pirminį eksperimentą, nes skaidrės buvo koduotos prieš eksperimentinį nuskaitymą. Apskaičiuotas dendrito 10 μm vidutinis spyglių skaičius.

Statistinė analizė

Vieno ir dviejų krypčių ANOVA buvo atliktos siekiant nustatyti reikšmę sąlyginei vietai ir dendritinei stuburo analizei su daugiau nei dviem grupėmis. Studentų t testai buvo naudojami kitiems palyginimams, įskaitant qPCR, western blotting, dendritinių stuburo analizę, lyginant HSV-GFP su HSV-Cre G9afl / fl pelių, mikrodalelių analizės (žr. aukščiau) ir chromatino imunoprecipitacijos eksperimentai. Suplanuoti studentų t testai buvo naudojami atlikus dvipusę ANOVA analizę dėl dendritinio stuburo tankio po ΔFosB perekspresijos, patvirtinus reikšmingą pagrindinį gydymo vaistais ir virusu poveikį. Visos paveikslų legendose pateiktos vertės rodo vidurkį ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Išsami statistinė analizė Fig. 1-3 pagrindiniame tekste pateikiami: Išsamūs skaičiai, įskaitant statistiką.

Papildoma medžiaga

Išnašos

Patvirtinu, kad nė viena iš rankraštyje nurodytų medžiagų nėra teisėta Esminis histono metiltransferazės G9a vaidmuo kokaino sukeltame plastikume anksčiau buvo paskelbti ar svarstomi kitur, taip pat ir internete.

Visi darbai, susiję su gyvūnų naudojimu, buvo vykdomi pagal institucines ir IACUC gaires Teksaso universiteto pietvakarių medicinos centre ir Sinajaus kalno medicinos mokykloje.

Nuorodos ir pastabos

1. Robinson TE, Kolb B. Neurofarmakologija. 2004; 47 (Suppl 1): 33. [PubMed]
2. Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Annu Rev Neurosci. 2006: 29: 565. [PubMed]
3. Kumar A ir kt. Neuronas. 2005: 48: 303. [PubMed]
4. Renthal W et al. Neuronas. 2007: 56: 517. [PubMed]
5. Renthal W et al. J Neurosci. 2008: 28: 7344. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
6. Renthal W et al. Neuronas. 2009: 62: 335. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
7. Stipanovich A ir kt. Gamta. 2008: 453: 879. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
8. Borrelli E, Nestler EJ, Allis CD, Sassone-Corsi P. Neuron. 2008: 60: 961. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
9. Brami-Cherrier K, Roze E, Girault JA, Betuing S, Caboche J. JNeurochem. 2009: 108: 1323. [PubMed]
10. Tachibana M, Sugimoto K, Fukushima T, Shinkai Y. J Biol Chem. 2001: 276: 25309. [PubMed]
11. Nestler EJ. Philos Trans R Soc London, B Biol Sci. 2008: 363: 3245. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
12. McClung CA, Nestler EJ. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208. [PubMed]
13. Kelz MB ir kt. Gamta. 1999: 401: 272. [PubMed]
14. Sampath SC, et al. Mol Cell. 2007: 27: 596. [PubMed]
15. Kubicek S, et al. Mol Cell. 2007: 25: 473. [PubMed]
16. Chang Y et al. Nat Struktūra Mol Biol. 2009: 16: 312. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
17. Robinson TE, Kolb B. J Neurosci. 1997: 17: 8491. [PubMed]
18. Nieko MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. Gamta. 2001: 411: 583. [PubMed]
19. Thomas MJ, Malenka RC. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003: 358: 815. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
20. Russo SJ, et al. J Neurosci. 2009: 29: 3529. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
21. Bibb JA et al. Gamta. 2001: 410: 376. [PubMed]
22. Norrholm SD, et al. Neurologija. 2003: 116: 19. [PubMed]
23. Pulipparacharuvil S et al. Neuronas. 2008: 59: 621. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
24. Ujike H, Takaki M, Kodama M, Kuroda S. Ann NY Acad Sci. 2002: 965: 55. [PubMed]
25. Toda S et al. J Neurosci. 2006: 26: 1579. [PubMed]
26. Graham DL. Nat Neurosci. 2007: 10: 1029. [PubMed]
27. Lee KW, et al. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
28. Šis darbas buvo paremtas Nacionalinio narkotikų vartojimo instituto: P01 DA08227 (EJN), R01 DA07359 (EJN) ir P0110044 (PG) dotacijomis.