Padidėjęs ciklino priklausomos kinazės 5 aktyvumas sukelia kokaino sukelto dopamino signalizacijos (2005) susilpnėjimą

Proc Natl Acad Sci JAV A. 2005 vasario 1; 102(5): 1737-1742.

Paskelbta internete 2005 sausis 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neurologijos
Šis straipsnis buvo minimas kiti PMC straipsniai.

Abstraktus

Kokainas, piktnaudžiavimo vaistas, padidina sinaptinių dopamino koncentraciją striatume blokuodamas dopamino pakartotinį įsisavinimą per axono terminalus. Nustatyta, kad ciklino priklausoma kinazė 5 (Cdk5) ir jo aktyvatorius p35, baltymai, dalyvaujantys substratų fosforilėjime postmitoziniuose neuronuose, yra laikomi reguliuojamais po lėtinio kokaino poveikio. Siekiant toliau tirti Cdk5 ir p35 indukcijos poveikį striatrijos dopamino signalizacijai, sukūrėme dvi nepriklausomas transgenines pelės linijas, kuriose Cdk5 arba p35 buvo ekspresuota specifiškai neuronuose. Čia pranešime, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas, atsiradęs dėl p35, bet ne Cdk5, pernelyg išreiškia kokaino sukeliamą dopamino signalizaciją. Padidėjęs dopamino ir cAMP-reguliuojamo fosfoproteino, molekulinės masės 5 kDa (DARPP-32), fosforilinimas, padidėjęs Cdk32-fosforilinimas Thr-75, buvo susijęs su sumažėjusiu DARPP-32 fosforilinimu Thr-34. Padidėjęs ekstraląstelinio signalo reguliuojamo kinazės kinazės 5 fosforilinimas Crk-1 metu buvo susijęs su sumažėjusiu ekstraląstelinio signalo reguliuojamo kinazės 286 / 1 aktyvavimu. Šie poveikiai prisidėjo prie kokaino sukeltos cAMP atsako elemento prisijungimo baltymo fosforilinimo slopinimo, taip pat mažesnio c-fos indukcijos striatume. Šie rezultatai patvirtina idėją, kad Cdk2 aktyvumas dalyvauja pakeistoje genų ekspresijoje po lėtinio kokaino poveikio ir todėl daro įtaką ilgalaikiam kokaino priklausomybės neuronų funkcijos pokyčiui.

Raktiniai žodžiai: priklausomybė nuo kokaino, fosforilinimas, striatumas

Kokainas padidina sinaptinių dopamino koncentraciją striatume ir keičia genų ekspresiją dopaminoceptiniuose neuronuose, aktyvuodamas intracelulinius kelius, kurie pradeda dopamino D1 receptoriaus pradinį signalą į branduolį (1). Lėtinis kokaino poveikis reguliuoja keletą transkripcijos faktorių, dėl kurių atsiranda ilgalaikiai genų ekspresijos pokyčiai, kurie, kaip manoma, yra neuronų prisitaikymas prie priklausomybės nuo kokaino (2). ΔFosB, identifikuotas kaip toks transkripcijos faktorius (3), buvo įrodyta, kad padidina gyvūnų elgesį su kokainu (4, 5). Todėl tikimasi, kad tikslinių genų, kuriuos reguliuoja ΔFosB indukcija, identifikavimas prisidės prie didesnio molekulinio mechanizmo, kuris yra priklausomas nuo kokaino, supratimo. Pastaruoju metu buvo įrodyta, kad lėtinis kokaino gydymas gyvūnais reguliuoja ciklino priklausomos kinazės 5 (Cdk5) ir jo aktyvatoriaus p35 ekspresiją striatume, indukuodamas ΔFosB (6, 7).

Cdk5 yra serino / treonino kinazių Cdk šeimos narys. Skirtingai nuo kitų Cdks, kurie yra pagrindiniai ląstelių ciklo progresavimo reguliatoriai, Cdk5 daugiausia dalyvauja substratų fosforilinimo postmitoziniuose neuronuose. (8). Cdk5 aktyvumo neuronų specifiškumas pasiekiamas susiejant su jo aktyvatoriais - p35 arba p39, kurie daugiausia yra ekspresuojami postmitoziniuose neuronuose (8). Be esminio Cdk5 vaidmens smegenų vystyme (9, 10), it taip pat buvo susijęs su dopaminergine transmisija postnatalinėse smegenyse (11, 12). Cdk5 aktyvumo slopinimas sukelia padidėjusį dopamino išsiskyrimą į striatumą, nurodant Cdk5 presinaptinę funkciją kaip neigiamą dopamino išsiskyrimo reguliatorių. (11). Be to, Cdk5 moduliuoja postinaptinio dopamino signalizacijos efektyvumą, fosforilindamas dopamino ir cAMP reguliuojamą fosfoproteiną, molekulinę masę 32 kDa (DARPP-32) Thr-75, kuris konvertuoja DARPP-32 į cAMP priklausomą kinazę (PKA). (12).

Šie stebėjimai leidžia manyti, kad Cdk5 ir p35 yra ilgalaikiai dopamino signalizacijos aktyvavimo reguliatoriai po lėtinio kokaino poveikio, taigi ir priklausomybės nuo kokaino. Toliau sprendžiant Cdk5 vaidmenį striatrijos dopamino signalizacijoje, mes sukūrėme dvi transgenines pelės linijas, kuriose arba Cdk5, arba p35 buvo pernelyg išreikštas neuronuose, kontroliuojant p35 promotorių. Mūsų rezultatai parodė, kad Cdk5 aktyvumas buvo reguliuojamas padidėjusiu p35 baltymo kiekiu, bet ne Cdk5 baltymu, o tai rodo, kad p35 baltymo lygis yra ribojamas Cdk5 aktyvumui. Pateikiame čia in vivo įrodymai, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas, dėl p35 viršsekspresijos, sumažina kokaino sukeltą dopamino signalizaciją į branduolį, slopindamas PKA ir ekstraląstelinius signalus reguliuojančius kinazės (ERK) kaskadus.

Medžiagos ir metodai

Antikūnai. Polikloniniai antikūnai prieš Cdk5 (C-8) ir p35 (C-19) buvo įsigyti iš Santa Cruz biotechnologijos. Fosforilinimo priklausomi ir nepriklausomi antikūnai prieš ERK kinazę (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 ir cAMP atsako elementą surišančius baltymus (CREB) gauti iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antikūnai prieš fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), iš viso DARPP-32 (12) ir c-fos (14) buvo naudojami kaip aprašyta. Antikinas prieš aktiną buvo įsigytas iš Sigma.

Eksperimentiniai gyvūnai. Mes anksčiau klonavo pelės p35 geną Cdk5r1, kuris koduoja p35 baltymą ir pasižymi jo genomine struktūra (15). Norėdami generuoti transgeninę pelę, turinčią p35 (Tgp35) neuroninę perteklinę ekspresiją, 6-kb EcoRI-EcoRI fragmentas, turintis 1.2 kb promotoriaus sritį, buvo subklonuotas į pGEM9Z (-) plazmidę, o 45-bp žymė, gauta iš SV40, buvo įdėta į KpnI vieta po poli (A)+) signalas (Pav 1A). Žyma buvo a speI vieta gyvūnų genotipui nustatyti. 6 kb fragmentas buvo išskiriamas iš plazmidės ir išgrynintas, po to transgeno ekspresinė injekcija transgeninių pelių generavimui. Ištirti transgeno ekspresijos profilį pagal 1.2 kb p35 promotoriaus kontrolę in vivodvigubas transgeninis pelė (Tgp35; p35 - / -) dar buvo sukurta naudojant dviejų pakopų veisimo strategiją, pagal kurią Tgp35 pelė buvo regeneruota endogeniniame p35 null fone. Kiti šiame tyrime naudojami pelės modeliai buvo p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– ir transgeninė pelė su neuronine Cdk5 (TgCdk5) ekspresija (9, 16, 17). Šių pelių genotipai buvo nustatyti atliekant arba Southern blot analizę, arba PCR dėl genomo DNR, išskirtos iš uodegos biopsijų. Pelės buvo laikomos tamsiame 12-h / 12-h cikle. Visa priežiūra buvo atlikta laikantis Nacionalinių sveikatos institutų rekomendacijų dėl laboratorinių ir eksperimentinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo.

Pav. 1.  

Transgeninės pelės generavimas p35 promotoriaus (Tgp35) nukreipta p35 neuronine pernelyg išraiška. (A) Transgeno konstrukcija pavaizduota su laukinių tipų ir tikslinių p35 alelių schemomis. Raudonos juostos nurodo zondą, naudojamą genotipui nustatyti. ...

Southern Blot analizė. Genominė DNR, išgauta iš uodegos biopsijų, buvo suardoma EcoRI ir speI, elektroforezuojama 0.9% agarozės gelyje, ir pernešama ant nailono membranos. Membrana buvo hibridizuota atsitiktiniu būdu gruntuota 32P-žymėtas zondas per naktį 42 ° C temperatūroje. 485-bp zondas p35 knockout (p35 - / -) ir Tgp35 pelių genotipui buvo sukurtas naudojant PCR, naudojant šiuos pradmenis: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'ir 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Hibridizuota membrana buvo plaunama du kartus 2 × SSC / 0.1% SDS 42 ° C temperatūroje 10 min, ir du kartus 0.1 × SSC / 0.1% SDS 65 ° C temperatūroje 20 min.

Narkotikų gydymas. Kokainas (Sigma) ištirpinamas steriliame fiziologiniame tirpale. Gyvūnai buvo suleidžiami su kokainu (15 mg / kg) arba vienodo tūrio fiziologinio tirpalo kiekiu 3 mėnesių amžiuje, o po injekcijos nužudyti skirtingu laiku (15, 30, 60 ir 120 min). Smegenys greitai pašalintos ir atšaldytos ledu šaltoje PBS. Po to striata buvo išpjauta ir atlikta Šiaurės ar Vakarų blot analizė. Imunohistocheminės analizės metu iš pelės 2 h po injekcijos buvo gautos striatrijos sekcijos.

Northern Blot analizė. Bendra RNR ekstrahuota iš striata su TRIzol reagentu (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ir atlikta Northern blot analizė, kaip aprašyta (18). C-fos mRNR aptikimui pelės c-fos cDNA 189-bp fragmentas buvo naudojamas kaip zondas, kaip aprašyta (19). C-fos mRNR kiekiai buvo nustatyti kiekybiškai, matuojant konkrečios juostos optinį tankį naudojant vaizdo analizės sistemą su nih vaizdų programine įranga, versija 1.62.

Western Blot analizė. Striatyviniai audiniai buvo ultragarsuojami 1% SDS ir virinami 10 min. Kiekvieno mėginio baltymų koncentracija buvo nustatyta pagal BCA baltymų tyrimą (Pierce). Lygūs baltymų kiekiai buvo atskirti SDS / PAGE, prieš juos pernešant į nitroceliuliozės membraną. Membranos buvo blokuojamos 1 × PBS, kurių sudėtyje yra 5% nugriebto pieno ir 0.05% Tween 20, ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje. Inkubavimas su peroksidaze konjuguotu anti-pele arba triušiu IgG (Sigma) buvo atliktas kambario temperatūroje 60 min. Signalas buvo aptiktas sustiprintu chemiliuminescencija (Pierce), o juostų optiniai tankiai buvo kiekybiškai įvertinti, kaip aprašyta aukščiau.

Cdk5 kinazės tyrimas. Striatų lizatai buvo paruošti lizės buferiu, susidedančiu iš 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenilmetilsulfonilfluorido / 1 μg / ml aprotinino / 1 μg / ml leupeptino / fosfatazės inhibitorių (fosfatazės inhibitoriaus mišinys I ir II, Sigma). Lizatai buvo imunizuoti su anti-Cdk5 (C-8) arba anti-p35 (C-19) antikūnais. Cdk5 imunoprecipitatai buvo paruošti inkubuojant 300 μl lizato (atitinkančio 300 μg baltymo) su anti-Cdk5 antikūnu (3 μg) per naktį 4 ° C temperatūroje, po to tolesnį inkubavimą su 25 μl baltymų A-agarozės granulių (50 % srutų lizės buferyje, Santa Cruz biotechnologija) 3 h 4 ° C temperatūroje. Ruošiant p35 imunoprecipitatus, 500 μl lizato (atitinkantis 1 mg baltymų) inkubuotas su anti-p35 antikūnu (3 μg), kaip aprašyta aukščiau. Imunoprecipitatai du kartus plaunami lizės buferiu ir du kartus su kinazės buferiu, susidedančiu iš 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl21 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspenduotas kinazės buferio 60 μl. Kinazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant histoną H1 kaip substratą (18).

Imunohistochemija. Pelės buvo anestezuotos ip injekcijomis avertino (250 mg / kg, Fluka) ir perfuzijos transcardialiniu būdu su 0.1 M natrio fosfato buferiu, pH 7.4, po to Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), nekryžminiu fiksatoriumi. Išardytos smegenys dar kartą fiksuotos tame pačiame fiksatoriuje per naktį 37 ° C temperatūroje. Tada smegenys buvo įdėtos į parafiną, supjaustytos į 5-μm storio koronines sekcijas ir imtasi imunohistochemijos naudojant avidino-biotino-peroksidazės komplekso metodą (Vector Laboratories) su diaminobenzidinu kaip substratu. Sekcijos buvo inkubuojamos su afinitetiniu būdu išvalytu polikloniniu antikūnu prieš c-fos per naktį 4 ° C temperatūroje. Dažymo specifiškumas buvo įvertintas pirminio antikūno praleidimu.

rezultatai

Transgeninių pelių, turinčių neuroninių p35 ekspresijų, generavimas. Transgenas, naudojamas p35 padidėjusiai neuroninei ekspresijai pasiekti, sudarė klonuoto pelės p6 geno 35 kb fragmentą, turintį 1.2 kb promotorių ir visą kodavimo p35 seką (Pav 1 A). Pelių genotipai buvo nustatyti Southern blot analize, naudojant zondą, skirtą atskirti p35 - / - ir Tgp35 peles iš laukinio tipo pelių (Pav 1 A ir B). Norėdami ištirti transgeno ekspresiją kontroliuojant 1.2 kb p35 promotorių, mes sukūrėme dvigubas transgenines peles (Tgp35; p35 - / -), kuriose p35 ekspresija buvo vykdoma tik iš transgeno. P35 ekspresija Tgp35, p35 - / - pelėms buvo pastebėta tik smegenyse (Pav 1C), kur erdvinės ekspresijos modelis buvo panašus į laukinių tipų pelių \ tPav 1D). Nustatyta, kad p35 trūkumas lemia neįprastą sluoksnių struktūrą smegenų žievėje ir pelių hipokampe (10). Tačiau Tgp35, p35 - / - pelės parodė, kad p35 - / - smegenų fenotipas buvo visiškai išgelbėtas (Pav 1E). Šie duomenys parodė, kad 1.2 kb p35 promotorius kontroliavo panašios ekspresijos profilio transgeno ekspresiją su p35 iš endogeninio p35 geno.

P35 baltymų lygis riboja Cdk5 aktyvumo reguliavimą. Ištyrėme p35 ir Cdk5 koduojančių genų genų dozavimo poveikį baltymų ekspresijai iš p35 - / -, p35 +/–, laukinio tipo, Tgp35, Cdk5 +/– ir TgCdk5 pelių 3 mėnesių amžiaus. P35 ir Cdk5 baltymų kiekis gerai koreliavo su atitinkamai genų dozėmis (Pav 2 A ir B). Tgp35 pelėms p1.6 baltymų koncentracija padidėjo ≈35 kartų, lyginant su laukinės rūšies pelėmis, tuo tarpu skirtingi p5 baltymo lygiai neturėjo įtakos Cdk35 baltymų kiekiui. TgCdk5 pelėms Cdk1.9 baltymų koncentracija padidėjo ≈5 kartų, lyginant su pelių rūšimis, turinčiomis bakterijų, o p35 baltymų kiekis neveikė skirtingų Cdk5 baltymų lygių. Norint ištirti skirtingų p35 baltymų kiekių poveikį Cdk5 aktyvumui, Cdk5 buvo imunizuotas iš striatalų ekstraktų su anti-Cdk5 antikūnu ir kinazės aktyvumu. Taip pat, norint išnagrinėti skirtingų Cdk5 baltymų kiekių poveikį kinazės aktyvumui, p35 buvo imunizuotas iš striatalų ekstraktų su anti-p35 antikūnu, o kinazės aktyvumas buvo matuojamas. Cdk5 aktyvumas gerai siejasi su p35 baltymų kiekiu, bet ne su Cdk5 baltymų kiekiu (Pav 2 C ir D). Šie rezultatai parodė, kad p35 baltymo kiekis yra Cdk5 aktyvumo greičio ribojimo faktorius. Todėl mes naudojome Tgp35 peles, kad ištirtume padidėjusio Cdk5 aktyvumo poveikį striatrijos dopamino signalizacijai.

Pav. 2.  

Cdk5 aktyvumo reguliavimas ribojamas p35 baltymų kiekiu. (A) Western blotai, rodantys, kad p35 ir Cdk5 baltymų kiekis koreliuoja su p35 ir Cdk5 genų dozėmis. (B) Santykiniai p35 arba Cdk5 baltymų kiekiai ...

Kokaino sukeltas DARPP-32 fosforilinimas Thr-34 yra sumažintas Tgp35 pelėse. DARPP-32 funkcija priklauso nuo jo fosforilinimo būsenos keliose vietose (20). PKA fosforilina DARPP-32 Thr-34, o Cdk5 fosforilina DARPP-32 Thr-75. Taigi, ištyrėme DARPP-32 fosforilinimo būseną laukinių rūšių ir Tgp35 pelių striatų ekstraktuose. Fosfo-Thr-75 DARPP-32 kiekis buvo didesnis Tgp35 pelėms (Pav 3A; 1.6 ± 0.2 kartus didesnis už laukinių rūšių pelių vertę). Toliau įvertinome padidėjusio Cdk5 aktyvumo poveikį striatrijos dopamino signalizacijai. Tgp35 pelėse ištyrėme kokaino sukeltą PKA aktyvaciją, analizuojant DARPP-32 fosforilinimo būseną Thr-34. Fosfo-Thr-34 DARPP-32 kiekis buvo padidintas laukinio tipo pelėse 15 min po kokaino injekcijos (Pav 3B; 1.8 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio). Tačiau kokaino poveikis Thr-34 DARPP-32 fosforilinimui buvo susilpnintas Tgp35 pelėse (1.2 ± 0.3 kartus virš bazinio lygio). Šie rezultatai parodė, kad Cdk5 aktyvumo padidėjimas susilpnino kokaino sukeltą PKA aktyvaciją greičiausiai per DARPP-32 fosforilinimą Thr-75 (6, 12). Taip pat įmanoma, kad padidėjęs presinaptinis Cdk5 aktyvumas sumažina dopamino išsiskyrimą ir tai mažina kokaino poveikį. Pažymėtina, kad vienkartinė kokaino injekcija neturėjo įtakos p35 ir Cdk5 baltymų kiekiui bei kinazės aktyvumui (Pav 3 C ir D). Tai prieštarauja ankstesniam tyrimui, kuriame nustatyta, kad lėtinis kokaino poveikis reguliuoja p35 ir Cdk5 ekspresiją (6).

Pav. 3.  

Cdk5 aktyvumo reguliavimas padidina fosfo-Thr-75 DARPP-32 lygį ir susilpnina kokaino sukeltą PKA aktyvaciją. (A) Imunoblotas, rodantis padidėjusį DARPP-32 fosforilinimą Thr-75 (P-D32 Thr-75) striatrijos ekstraktuose iš Tgp35 pelių. Į ...

Cdk5 aktyvumo reguliavimas Sumažina kokaino sukeltą ERK1 / 2 aktyvavimą. Naujausi duomenys rodo, kad dopamino receptorių aktyvacija striatume taip pat aktyvina kitas signalizavimo kaskadas, įskaitant ERK kelią (21, 22), kuris vaidina svarbų vaidmenį elgsenos reakcijoje į kokainą (\ t23). Todėl ištyrėme, ar Cdk5 aktyvumas gali turėti įtakos kokaino sukeltam ERK kelio aktyvavimui. ERK kelio aktyvacija buvo stebima po kokaino injekcijos laukinių rūšių pelių striatų ekstraktuose, kaip matyti iš padidėjusio MEK1 / 2 fosforilinimo Ser-217 ir Ser-221 (1.5 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio) ir ERK1. / 2 Thr-202 ir Tyr-204 (ERK2 fosforilinimas: 1.5 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio) (Pav 4 A ir B). Tačiau kokaino sukeltas MEK1 / 2 aktyvavimas (1.2 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio) ir ERK1 / 2 (ERK2 fosforilinimas: 1.2 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio) buvo sumažintas Tgp35 pelėse (Pav 4 A ir B). Be to, baziniai fosfo-ERK1 / 2 lygiai buvo mažesni Tgp35 pelėse (0.8 ± 0.2 kartus žemiau laukinių pelių vertės), o ši tendencija nebuvo statistiškai reikšminga. Pastarasis rezultatas gali būti priskirtas prie MEK5 priklausomo fosforilinimo, priklausančio nuo Thr-1, dėl Cdk286 priklausomo fosforilinimo, todėl sumažėjo katalizinis aktyvumas (24). Norėdami įvertinti šią galimybę, ištyrėme MEK1 fosforilinimo būseną Thr-286 ir nustatėme, kad Tgp286 pelių striatalų ekstraktuose yra didesnių fosfo-Thr-1 MEK35 kiekių (Pav 4C; 1.3 ± 0.1 kartus didesnis už laukinių rūšių pelių vertę). Be to, vienintelė kokaino injekcija nekeičia MEK1 fosforilinimo būsenos Thr-286, nes tai parodė, kad gydymas Cdk5 veikimu neturėjo įtakos (Pav 3D).

Pav. 4.  

Dėl MEK5 / 1 sukeltos Cdk2 slopinimo atsiranda kokaino sukeltas ERK1 / 2 aktyvacijos slopinimas. Striatų ekstraktai buvo paruošti iš laukinio tipo (WT) ir Tgp35 pelių 15 min. Po kokaino ar fiziologinio tirpalo injekcijos ir imunoblotuojant. ...

Dopamino signalizacijos į branduolį paplitimas yra susilpnintas padidėjusiu Cdk5 aktyvumu. Kokaino sukeltas daugialypių signalizacijos kaskadų aktyvavimas, apimantis PKA ir ERK, sukelia tolesnį transkripcijos faktoriaus CREB aktyvavimą branduolyje per jo fosforilinimą Ser-133 (22, 25). Norint ištirti, ar Cdk5 tarpininkaujamas PKA ir ERK aktyvinimo kaskadų poveikis gali susilieti su CREB fosforilinimu branduolyje, ištyrėme CREB fosforilinimo būseną Ser-133 šunų ekstraktuose iš laukinio tipo ir Tgp35 pelių. Fosfo-CREB bazinis lygis buvo mažesnis Tgp35 pelėms (0.7 ± 0.1 kartų didesnis už laukinių tipų pelių vertę) (Pav 5). Reaguodama į kokaino injekciją, fosforo-CREB kiekis buvo padidintas laukinių rūšių pelių striatume (1.5 ± 0.1 kartus virš bazinio lygio), tačiau šis atsakas į kokainą buvo sumažintas Tgp35 pelėse (1.2 ± 0.1- viršyti bazinį lygį) (Pav 5).

Pav. 5.  

Cdk5 aktyvumo reguliavimas padidina CREB fosforilinimą Ser-133 pelėse, suleidžiant druską arba kokainą. Stremaliniai ekstraktai buvo paruošti iš laukinio tipo (WT) ir Tgp35 pelių 30 min po injekcijos ir imtasi imunoblotavimo. ...

CREB fosforilinimas Ser-133 padidina transkripcijos aktyvumą per cAMP atsako elementą tam tikrų genų promotoriaus regione, įskaitant c-fos geną (26). Todėl ištyrėme c-fos indukciją laukinių ir Tgp35 pelių striatume po kokaino injekcijos. Laukinių rūšių pelėms c-fos mRNR kiekis padidėjo iki didžiausios vertės (1.8 ± 0.2 kartus virš bazinio lygio) 30 min. Po kokaino injekcijos, o vėliau po injekcijos 120 grįžo į bazinį lygį.Pav 6 A ir B). Tačiau c-fos mRNR koncentracija Tgp30 pelėse buvo N35% mažesnė nei laukinių rūšių pelėms iki 30 min.Pav 6 A ir B). Mažesnę c-fos indukciją Tgp35 pelėse dar labiau patvirtino imunohistochemija (Pav 6 C-F). Kokaino vartojimas padidino c-fos imunoreaktyvumą, stipriai dorsomedialinės ir dorsocentrinės striatumo dalyse ir silpnai šoninėse dalyse, tiek laukinių, tiek Tgp35 pelių. Tačiau kokaino sukeltas c-fos-imunopozitinių ląstelių skaičiaus padidėjimas buvo ypač susilpnintas Tgp35 pelių striatume (Pav 6G). Kartu šie rezultatai parodė, kad Tgp35 pelėms, galimai padidėjusiam Cdk5 aktyvumui, buvo slopinamas kokaino sukeltas striatalo dopamino signalizacijos į branduolį stiprinimas.

Pav. 6.  

Cdk5 aktyvumo reguliavimas sukelia striatalo c-fos ekspresijos sumažėjimą ir jo mažesnį indukciją po kokaino vartojimo. (A) „Northern blot“ parodo c-fos indukcijos laiką laukinių (WT) ir Tgp35 (Tg) pelių po kokaino injekcijos. ...

Diskusija

Cdk5 ir jo aktyvatorius p35 buvo nustatyti kaip tiksliniai genai, kuriuos reguliuoja lėtinis kokaino poveikis (6). Čia pranešime apie įrodymus, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas, kaip p35 reguliavimas, o ne Cdk5 reguliavimas, sukelia kokaino sukeltos dopamino signalizacijos slopinimą strialių neuronuose. Siekiant ištirti Cdk5 arba p35 reguliuojamos ekspresijos pasekmes striatrijos dopamino signalizacijai, analizuojamos dvi transgeninės pelės linijos, TgCdk5 ir Tgp35 pelės. Mes nustatėme, kad Cdk5 aktyvumas buvo reguliuojamas proporcingai padidėjusiam p35 baltymo kiekiui, tačiau padidėjo Cdk5 baltymų kiekis. Mūsų ankstesnė ataskaita taip pat parodė, kad Cdk5 aktyvumas TgCdk5 pelės smegenyse buvo mažesnis nei laukinių pelių smegenų, kai aktyvumas buvo matuojamas naudojant Cdk5 imunopecipitatus (17), o tai rodo, kad Cdk5 viršijimo rezultatas padidina monomero Cdk5 lygį, jei p35 lygis nėra padidintas. Šie rezultatai parodė, kad p35 baltymo lygis yra Cdk5 aktyvumo greičio ribojimo faktorius.

Tgp35 pelėms pasireiškė mažesnis CREB fosforilinimo ir c-fos indukcijos striatume po ūminio kokaino injekcijos, o tai rodo, kad striatų atsakas į kokainą buvo slopinamas padidėjusiu Cdk5 aktyvumu. Kokaino sukeltos dopamino signalizacijos slopinimas Tgp35 pelėse greičiausiai buvo pasiektas naudojant Cdk5 tarpininkaujantį daugelio signalizacijos kaskadų slopinimą, apimantį DARPP-32, PKA ir ERK. Kokaino vartojimas padidino DARPP-32 PKA fosforilinimą Thr-34 laukinių rūšių pelėse, o šis atsakas buvo susilpnėjęs Tgp35 pelėse. Nustatyta, kad DARPP-32 fosforilinimas PKA-34 metu slopina baltymų fosfatazės 1 (PP1), atsakingo už Ser-133 CREB defosforilinimą, aktyvumą (27). Taigi, PP1 aktyvumas nebus antagonizuojamas per DARPP-32 / PP1 kelią Tgp35 pelėse.

Kokaino sukelta ERK1 / 2 aktyvacija taip pat buvo susilpnėjusi Tgp35 pelėse. Yra keletas skirtingų mechanizmų, kuriais Cdk5 gali slopinti kokaino sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją. Pirma, DARPP-5 priklausomai nuo fosforilinimo Cdk32 priklausomai nuo Thr-75 gali slopinti PKA, todėl vėlesnis bet kokio PKA-medijuojamo MEK1 / 2 aktyvacijos slopinimas, kuris reikalingas aktyvuojant ERK1 / 2. Neseniai atliktas tyrimas taip pat parodė, kad DARPP-32 fosforilinimas Thr-34 sistemoje reikalingas tam, kad medikamentas sukeltų ERK1 / 2 aktyvavimą daugeliu būdų, įskaitant netiesioginį MEK aktyvacijos reguliavimą, taip pat įtraukiant striatų praturtintą fosfatazę, tiroziną fosfatazę, kuri veikia tiesiogiai ERK1 / 2 (28). Šią galimybę remia tai, kad TGp1 pelėse buvo panaikintas MEK2 / 217 kokaino sukeltas fosforilinimas Ser-221 ir Ser-35. Kitas tikėtinas kelias yra per MEK5 priklausomą fosforilinimą pagal Thr-1, kuris sukeltų jo katalizinio aktyvumo sumažėjimą ir sukeltų ERK286 / 1 aktyvumo slopinimą (24).

Nustatyta, kad Cdk5 aktyvumo slopinimas striatume stiprina lėtinio gydymo gyvūnais elgesio poveikį (6). Suderinama su hipoteze, kad Cdk5 aktyvumo reguliavimas gali prisidėti prie neuronų prisitaikymo prie pakartotinio kokaino vartojimo poveikio. (6), mes nustatėme, kad DDPP-5 ir MEK32 sukeltas Cdk1 ir MEK1 fosforilinimas prisidėjo prie kokaino sukeltos ERK2 / XNUMX aktyvacijos susilpnėjimo, todėl mažesnis CREB fosforilinimo ir c-fos indukcijos striatume. Mūsų išvados patvirtina idėją, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas, dėl p35 padidėjimo, gali pakeisti geno ekspresiją striatume po lėtinio kokaino poveikio. Tai gali įvykti pasikeitus transkripcijos faktorių, tokių kaip CREB ir c-fos, aktyvumui. Taigi, Cdk5 aktyvatorius p35, dėl savo greičio ribojančio poveikio Cdk5 aktyvumui, gali prisidėti prie ilgalaikių kokaino priklausomybės neuronų funkcijos pokyčių.

Padėka

Dėkojame dr. Mary Jo Danton, Philip Grant ir Sashi Kesavapany už kritinį rankraščio skaitymą. Šį darbą palaikė Nacionaliniai sveikatos priežiūros institutai Z01DE00664-05 (ABK), JAV visuomenės sveikatos tarnybos dotacija DA10044, Simons fondo, Peter J. Sharp fondo ir Picower fondo (PG) dotacijos.

pastabos

Santrumpos: Cdk5, nuo ciklino priklausoma kinazė 5; ERK, ekstraląstelinė signalo reguliuojama kinazė; DARPP-32, dopamino ir cAMP reguliuojamas fosfoproteinas, molekulinė masė 32 kDa; PKA, nuo cAMP priklausoma kinazė; MEK, ERK kinazė; CREB, cAMP atsako elemento surišantis baltymas.

Nuorodos

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE & Nestler, EJ (1992) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 89, 5764 – 5768. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT & Widnell, KL (1993) „Neuron 11“, 995 – 1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS & Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235 – 1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr, Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, et al. (1999) Gamta 401, 272 – 276. [PubMed]
5. McClung, CA ir Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6, 1208 – 1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, et al. (2001) Gamta 410, 376 – 380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. & Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965 – 8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. Kunigas Mol. Langelis. Biol. 2, 749 – 759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ & Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 93, 11173 – 11178. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. & Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29 – 42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 101, 2191 – 2196. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, et al. (1999) Gamta 402, 669 – 671. [PubMed]
13. Snyderis, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12, 3071 – 3083. [PubMed]
14. Youngas, ST, Porrino, LJ ir Iadarola, MJ (1991) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 88, 1291 – 1295. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, CA, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO ir Kulkarni, AB (1996) Genomika 35, 372 – 375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 98, 2764 – 2769. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550 – 558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506 – 10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. & Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6, 252 – 260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14 – 23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Neurosci. 2, 119 – 128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487 – 11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701 – 8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB & Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528 – 534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Pojūčiai 20, 257 – 260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 88, 5061 – 5065. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB & Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435 – 447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. JAV 103, 491 496.