Padidėjęs ciklino priklausomos kinazės 5 aktyvumas sukelia kokaino sukelto dopamino signalizacijos (2005) susilpnėjimą

Proc Natl Acad Sci JAV A. 2005 vasario 1; 102(5): 1737-1742.

Paskelbta internete 2005 sausis 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neurologijos
Šis straipsnis buvo minimas kiti PMC straipsniai.

Abstraktus

Kokainas, piktnaudžiavimo narkotikais, padidina sinapsinį dopamino kiekį juostoje, blokuodamas dopamino reabsorbciją aksonų galuose. Nustatyta, kad nuo ciklino priklausoma kinazė 5 (Cdk5) ir jos aktyvatorius p35, baltymai, dalyvaujantys postmitozinių neuronų substratų fosforilinimo procese, yra sureguliuoti po lėtinio kokaino poveikio. Norėdami toliau ištirti Cdk5 ir p35 indukcijos poveikį striataliniam dopamino signalizavimui, sukūrėme dvi nepriklausomas transgenines pelių linijas, kuriose Cdk5 arba p35 buvo per daug ekspresuojami neuronuose. Čia pranešame, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas dėl p35, bet ne dėl per didelės Cdk5 ekspresijos, susilpnina kokaino sukeltą dopamino signalizaciją. Padidėjęs Cdk5 sukeltas dopamino ir cAMP reguliuojamo fosfoproteino fosforilinimas, kurio molekulinė masė 32 kDa (DARPP-32) ties Thr-75, buvo lydimas sumažėjusio DARPP-32 fosforilinimo ties Thr-34. Padidėjęs Cdk5 sukeltas ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės kinazės 1 fosforilinimas Thr-286 buvo lydimas sumažėjusio ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės 1/2 aktyvacijos. Šie poveikiai prisidėjo prie kokaino sukelto cAMP atsako elementą surišančio baltymo fosforilinimo susilpnėjimo, taip pat mažesnio c-fos indukcijos striatumoje. Šie rezultatai patvirtina idėją, kad Cdk5 aktyvumas yra susijęs su pakitusia genų ekspresija po lėtinio kokaino poveikio ir todėl turi įtakos ilgalaikiams neuronų funkcijos pokyčiams, kurie yra priklausomybė nuo kokaino.

Raktiniai žodžiai: priklausomybė nuo kokaino, fosforilinimas, striatum

Kokainas padidina sinapsinio dopamino kiekį juostoje ir keičia genų ekspresiją dopaminoreceptiniuose neuronuose, aktyvindamas intracelulinius kelius, kurie skleidžia pradinį signalą iš dopamino D1 receptoriaus į branduolį.1). Lėtinis kokaino poveikis padidina kai kurių transkripcijos faktorių reguliavimą, dėl kurio atsiranda ilgalaikių genų ekspresijos pokyčių, kurie, kaip manoma, yra neuronų prisitaikymo prie priklausomybės nuo kokaino pagrindas.2). ΔFosB, nustatytas kaip toks transkripcijos faktorius (3), padidina gyvūnų elgsenos reakciją į kokainą (4, 5). Todėl tikimasi, kad tikslinių genų, reguliuojamų ΔFosB indukcija, nustatymas padės geriau suprasti priklausomybės nuo kokaino molekulinį mechanizmą. Neseniai buvo įrodyta, kad lėtinis gyvūnų gydymas kokainu padidina nuo ciklino priklausomos kinazės 5 (Cdk5) ir jos aktyvatoriaus p35 ekspresiją striatumoje, indukuodamas ΔFosB (6, 7).

Cdk5 yra serino/treonino kinazių Cdk šeimos narys. Skirtingai nuo kitų Cdk, kurie yra pagrindiniai ląstelių ciklo progresavimo reguliatoriai, Cdk5 daugiausia dalyvauja substratų fosforilinime postmitoziniuose neuronuose. (8). Cdk5 aktyvumo neuronų specifiškumas pasiekiamas susiejant su jo aktyvatoriais, arba p35, arba p39, kurie daugiausia ekspresuojami postmitoziniuose neuronuose.8). Be esminio Cdk5 vaidmens smegenų vystymuisi (9, 10), it taip pat buvo susijęs su dopaminerginiu perdavimu postnatalinėse smegenyse.11, 12). Cdk5 aktyvumo slopinimas padidina dopamino išsiskyrimą striatumoje, o tai rodo Cdk5, kaip neigiamo dopamino išsiskyrimo reguliatoriaus, presinapsinę funkciją. (11). Be to, Cdk5 moduliuoja postsinapsinio dopamino signalizacijos efektyvumą fosforilinant dopamino ir cAMP reguliuojamą fosfoproteiną, kurio molekulinė masė yra 32 kDa (DARPP-32) ties Thr-75, kuris paverčia DARPP-32 į nuo cAMP priklausomos kinazės (PKA) inhibitorių. (12).

Šie stebėjimai rodo, kad Cdk5 ir p35 yra ilgalaikio dopamino signalizacijos aktyvavimo reguliatoriai po lėtinio kokaino poveikio, taigi ir priklausomybės nuo kokaino. Norėdami toliau spręsti Cdk5 vaidmenį striatalinio dopamino signalizacijoje, sukūrėme dvi transgenines pelių linijas, kuriose Cdk5 arba p35 buvo per daug ekspresuojami neuronuose, kuriuos kontroliuoja p35 promotorius. Mūsų išvados parodė, kad Cdk5 aktyvumas buvo sureguliuotas padidėjus p35 baltymo kiekiui, bet ne Cdk5 baltymui, o tai rodo, kad p35 baltymo lygis riboja Cdk5 aktyvumo greitį. Pateikiame čia in vivo įrodymų, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas dėl pernelyg didelės p35 ekspresijos silpnina kokaino sukeltą dopamino signalą į branduolį, nes slopina PKA ir ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) kaskadas.

Medžiagos ir metodai

Antikūnai. Polikloniniai antikūnai prieš Cdk5 (C-8) ir p35 (C-19) buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology. Nuo fosforilinimo priklausomi ir nepriklausomi antikūnai prieš ERK kinazę (MEK) 1/2, ERK1/2 ir cAMP atsako elementą surišantį baltymą (CREB) buvo gauti iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antikūnai prieš fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), viso DARPP-32 (12), ir c-fos (14) buvo naudojami taip, kaip aprašyta. Antikūnas prieš aktiną buvo nupirktas iš Sigma.

Eksperimentiniai gyvūnai. Anksčiau mes klonavome pelės p35 geną CD5r1, kuris koduoja p35 baltymą, ir apibūdina jo genominę struktūrą (15). Norint sukurti transgeninę pelę su pernelyg dideliu p35 (Tgp35) neuronu, 6 kb. EcoRI-EcoRI fragmentas, turintis 1.2 kb promotoriaus sritį, buvo subklonuotas į pGEM9Z(–) plazmidę, o 45 bp žyma, gauta iš SV40, buvo įterpta į KpnI svetainė pasroviui nuo poli(A+) signalas (Pav 1A). Etiketėje buvo a speSvetainė skirta gyvūnų genotipams nustatyti. 6 kb fragmentas buvo iškirptas iš plazmidės ir išgrynintas, po to įšvirkštas transgenas, kad būtų sukurtos transgeninės pelės. Ištirti transgeno ekspresijos profilį, reguliuojamą 1.2 kb p35 promotoriaus in vivo, dviguba transgeninė pelė (Tgp35; p35–/–) buvo toliau sukurta naudojant dviejų etapų veisimo strategiją, pagal kurią Tgp35 pelė buvo regeneruota endogeniniame p35-null fone. Kiti šiame tyrime naudojami pelių modeliai buvo p35+/–, p35–/–, Cdk5+/– ir transgeninė pelė, kurios neuronuose buvo per daug Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Šių pelių genotipai buvo nustatyti atliekant Southern blot analizę arba PGR genominėje DNR, išskirtoje iš uodegos biopsijų. Pelės buvo laikomos 12 valandų šviesos / 12 valandų tamsos ciklu. Visa priežiūra buvo teikiama laikantis Nacionalinių sveikatos institutų gairių dėl laboratorinių ir eksperimentinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo.

Pav. 1.  

Transgeninės pelės generavimas su neuronų per dideliu p35 ekspresija, nukreipta p35 promotoriumi (Tgp35). (A) Transgeno konstrukcija parodyta su laukinio tipo ir tikslinių p35 alelių schemomis. Raudonos juostos rodo zondą, naudojamą genotipui nustatyti. ...

Southern Blot analizė. Genominė DNR, išskirta iš uodegos biopsijų, buvo suardyta EcoRI ir speI, elektroforezė ant 0.9% agarozės gelio ir perkelta ant nailono membranos. Membrana buvo hibridizuota su atsitiktiniu gruntu 32P pažymėtas zondas 42 °C temperatūroje per naktį. 485 bp zondas, skirtas p35 išmuštų (p35–/–) ir Tgp35 pelių genotipams nustatyti, buvo sukurtas naudojant PGR, naudojant šiuos pradmenis: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3′ ir 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3. Hibridizuota membrana buvo plaunama du kartus 2 × SSC / 0.1, 42% SDS 10 ° C temperatūroje 0.1 minučių ir du kartus 0.1, 65 × SSC / 20, XNUMX% SDS XNUMX ° C temperatūroje XNUMX minučių ir veikiama rentgeno plėvele.

Narkotikų gydymas. Kokainas (Sigma) buvo ištirpintas steriliame fiziologiniame tirpale. Gyvūnams 15 mėnesių amžiaus buvo sušvirkšta kokaino (3 mg/kg) arba tokio pat tūrio fiziologinio tirpalo, o po injekcijos jie buvo nužudyti nukirsdami galvą skirtingais laiko momentais (15, 30, 60 ir 120 min.). Smegenys buvo greitai pašalintos ir atšaldytos lediniame PBS. Tada striatai buvo išpjaustyti ir jiems buvo atlikta Northern arba Western blot analizė. Imunohistocheminei analizei iš pelių buvo paimtos striatalinės sekcijos praėjus 2 valandoms po injekcijos.

Northern Blot analizė. Bendra RNR buvo išskirta iš striatų su TRIzol reagentu (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ir buvo atlikta Northern blot analizė, kaip aprašyta (18). C-fos mRNR aptikimui kaip zondas buvo naudojamas pelės c-fos cDNR 189 bp fragmentas, kaip aprašyta (19). C-fos mRNR lygiai buvo kiekybiškai įvertinti matuojant konkrečios juostos optinį tankį, naudojant vaizdo analizės sistemą su nih vaizdo programine įranga, 1.62 versija.

Western Blot analizė. Striatiniai audiniai buvo ultragarsu apdorojami 1% SDS ir virinami 10 min. Baltymų koncentracija kiekviename mėginyje buvo nustatyta BCA baltymų tyrimu (Pierce). Vienodas baltymų kiekis buvo atskirtas SDS / PAGE, prieš perkeliant ant nitroceliuliozės membranos. Membranos buvo užblokuotos 1 × PBS, kuriame yra 5% lieso pieno ir 0.05, 20% Tween 4, ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais per naktį 60 ° C temperatūroje. Inkubavimas su peroksidaze konjuguotu anti-pelės arba triušio IgG (Sigma) buvo atliktas kambario temperatūroje XNUMX min. Signalas buvo aptiktas sustiprinta chemiliuminescencija (Pierce), o juostų optinis tankis buvo kiekybiškai įvertintas, kaip aprašyta aukščiau.

Cdk5 kinazės tyrimas. Striataliniai lizatai buvo paruošti su lizės buferiu, susidedančiu iš 50 mM Tris·HCl, pH 7.4/50 mM NaCl/5 mM EDTA/1 % Triton X-100/1mMDTT/1 mM fenilmetilsulfonilfluorido/1 μg/ml aprotinino/1 μg. ml leupeptino/fosfatazės inhibitorių (I ir II fosfatazės inhibitorių mišinys, Sigma). Lizatai buvo imunoprecipituoti arba anti-Cdk5 (C-8) arba anti-p35 (C-19) antikūnais. Cdk5 imunoprecipitatai buvo paruošti inkubuojant 300 μl lizato (atitinkančio 300 μg baltymo) su anti-Cdk5 antikūnu (3 μg) per naktį 4 °C temperatūroje, po to toliau inkubuojant su 25 μl baltymo A-agariozės. % suspensijos lizės buferyje; Santa Cruz Biotechnology) 50 valandas 3 °C temperatūroje. P4 imunoprecipitatams paruošti 35 μl lizato (atitinkančio 500 mg baltymo) buvo inkubuojami su anti-p1 antikūnu (35 μg), kaip aprašyta aukščiau. Imunoprecipitatai du kartus plaunami lizės buferiu ir du kartus kinazės buferiu, susidedančiu iš 3 mM Tris·HCl, pH 50/7.4 mM MgCl.2/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1 mM DTT, resuspenduotas 60 μl kinazės buferio. Kinazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant histoną H1 kaip substratą (18).

Imunohistochemija. Pelės buvo anestezuotos ip injekcijomis avertinu (250 mg/kg, Fluka) ir perfuzuojamos transkardialiai 0.1 M natrio fosfato buferiu, pH 7.4, po to Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), nekryžiuojančiu fiksatoriumi. Išpjaustytos smegenys buvo toliau fiksuojamos tame pačiame fiksatoriuje per naktį 37 ° C temperatūroje. Tada smegenys buvo įterptos į parafiną, supjaustytos į 5 μm storio vainikines dalis ir imunohistochemija, naudojant avidino-biotino-peroksidazės komplekso techniką (Vector Laboratories) su diaminobenzidinu kaip substratu. Sekcijos buvo inkubuojamos su afinitetu išgrynintu polikloniniu antikūnu prieš c-fos per naktį 4 ° C temperatūroje. Dažymo specifiškumas buvo įvertintas praleidžiant pirminį antikūną.

rezultatai

Transgeninių pelių, turinčių neuronų per didelę p35 ekspresiją, generavimas. Transgenas, naudojamas siekiant padidinti p35 neuronų ekspresiją, sudarė 6 kb klonuoto pelės p35 geno fragmentą, turintį 1.2 kb promotorių, ir visą koduojančią p35 seką (Pav 1 A). Pelių genotipai buvo nustatyti Southern blot analize, naudojant zondą, skirtą atskirti p35–/– ir Tgp35 peles nuo laukinio tipo pelių.Pav 1 A ir B). Norėdami ištirti transgeno ekspresiją, kontroliuojant 1.2, 35 kb p35 promotorių, sukūrėme dvigubas transgenines peles (Tgp35; p35–/–), kuriose p35 ekspresija buvo skatinama tik iš transgeno. P35 ekspresija Tgp35; pXNUMX–/– pelėse buvo stebima tik smegenyse (Pav 1C), kur erdvinės išraiškos modelis buvo panašus į laukinio tipo pelių (Pav 1D). Įrodyta, kad dėl p35 trūkumo pelių smegenų žievėje ir hipokampe susidaro nenormali sluoksniavimo struktūra.10). Tačiau Tgp35; p35–/– pelės visiškai išgelbėjo p35–/– smegenų fenotipą (Pav 1E). Šie duomenys parodė, kad 1.2, 35 kb p35 promotorius kontroliavo transgeno ekspresiją su panašiu ekspresijos profiliu kaip p35 iš endogeninio pXNUMX geno.

P35 baltymo lygis riboja greitį, kad būtų galima reguliuoti Cdk5 aktyvumą. Ištyrėme p35 ir Cdk5 koduojančių genų poveikį baltymų ekspresijai p35–/–, p35+/–, laukinio tipo, Tgp35, Cdk5+/– ir TgCdk5 pelių plyšių ekstraktuose 3 mėnesių amžiaus. P35 ir Cdk5 baltymo lygiai gerai koreliavo su genų dozėmis, atitinkamai (Pav 2 A ir B). Tgp35 pelių p1.6 baltymo lygis padidėjo ≈35 karto, palyginti su laukinio tipo pelėmis, tuo tarpu skirtingi p5 baltymo kiekiai neturėjo įtakos Cdk35 baltymų lygiui. TgCdk5 pelėms Cdk1.9 baltymų lygis padidėjo ≈5, 35 karto, palyginti su laukinio tipo pelėmis, tuo tarpu p5 baltymų lygis neturėjo įtakos skirtingiems Cdk35 baltymo lygiams. Norint ištirti skirtingų p5 baltymo kiekių poveikį Cdk5 aktyvumui, Cdk5 buvo imunoprecipituotas iš striatalinių ekstraktų su anti-Cdk5 antikūnais ir išmatuotas kinazės aktyvumas. Panašiai, norint ištirti skirtingų Cdk35 baltymų kiekių poveikį kinazės aktyvumui, p35 buvo imunoprecipituotas iš striatalinių ekstraktų su anti-p5 antikūnu ir išmatuotas kinazės aktyvumas. Cdk35 aktyvumas gerai koreliavo su p5 baltymo lygiu, bet ne su CdkXNUMX baltymo lygiu (Pav 2 C ir D). Šie rezultatai parodė, kad p35 baltymo kiekis yra greitį ribojantis faktorius Cdk5 aktyvumui. Todėl mes panaudojome Tgp35 peles, kad ištirtume padidėjusio Cdk5 aktyvumo poveikį striataliniam dopamino signalizavimui.

Pav. 2.  

Cdk5 aktyvumo padidėjimą riboja p35 baltymo lygis. (A) Western blot'ai, rodantys, kad p35 ir Cdk5 baltymų lygiai koreliuoja su atitinkamai p35 ir Cdk5 genų genų dozėmis. (B) Santykinis p35 arba Cdk5 baltymo kiekis ...

Kokaino sukeltas DARPP-32 fosforilinimas prie Thr-34 yra susilpnintas Tgp35 pelėse. DARPP-32 funkcija priklauso nuo jo fosforilinimo būsenos keliose vietose (20). PKA fosforilina DARPP-32 ties Thr-34, o Cdk5 fosforilina DARPP-32 ties Thr-75. Taigi, mes ištyrėme DARPP-32 fosforilinimo būseną laukinio tipo ir Tgp35 pelių striataliniuose ekstraktuose. Fosfo-Thr-75 DARPP-32 lygis buvo didesnis Tgp35 pelėse (Pav 3A; 1.6 ± 0.2 karto didesnė už laukinio tipo pelių vertę). Toliau įvertinome padidėjusio Cdk5 aktyvumo poveikį striataliniam dopamino signalizavimui. Mes ištyrėme kokaino sukeltą PKA aktyvaciją Tgp35 pelėse, analizuodami DARPP-32 fosforilinimo būseną Thr-34. Fosfo-Thr-34 DARPP-32 lygis laukinio tipo pelėms padidėjo praėjus 15 minučių po kokaino injekcijos (Pav 3B; 1.8 ± 0.2 karto didesnis už bazinį lygį). Tačiau kokaino poveikis DARPP-34 fosforilinimui Thr-32 buvo susilpnintas Tgp35 pelėse (1.2 ± 0.3 karto didesnis už bazinį lygį). Šie rezultatai parodė, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas susilpnino kokaino sukeltą PKA aktyvaciją tikriausiai dėl DARPP-32 fosforilinimo ties Thr-75.6, 12). Taip pat gali būti, kad padidėjęs presinapsinis Cdk5 aktyvumas sumažina dopamino išsiskyrimą, o tai prisideda prie kokaino poveikio sumažėjimo. Pažymėtina, kad viena kokaino injekcija neturėjo įtakos p35 ir Cdk5 baltymų kiekiui, taip pat kinazės aktyvumui.Pav 3 C ir D). Tai skiriasi nuo ankstesnio tyrimo, kuriame buvo įrodyta, kad lėtinis kokaino poveikis padidina p35 ir Cdk5 ekspresiją.6).

Pav. 3.  

Padidėjęs Cdk5 aktyvumo reguliavimas padidina fosfo-Thr-75 DARPP-32 lygį ir susilpnina kokaino sukeltą PKA aktyvaciją. (A) Imunoblotas, rodantis padidėjusį DARPP-32 fosforilinimą ties Thr-75 (P-D32 Thr-75) Tgp35 pelių striataliniuose ekstraktuose. Į ...

Padidėjęs Cdk5 aktyvumo reguliavimas susilpnina kokaino sukeltą ERK1/2 aktyvavimą. Naujausi įrodymai rodo, kad dopamino receptorių aktyvinimas striatumoje taip pat suaktyvina kitas signalizacijos kaskadas, įskaitant ERK kelią.21, 22), kuris atlieka svarbų vaidmenį elgsenoje reaguojant į kokainą (23). Todėl ištyrėme, ar Cdk5 aktyvumas gali turėti įtakos kokaino sukeltam ERK kelio aktyvavimui. ERK kelio suaktyvėjimas buvo pastebėtas po kokaino injekcijos laukinių pelių striataliniuose ekstraktuose, kaip matyti iš padidėjusio MEK1/2 fosforilinimo ties Ser-217 ir Ser-221 (1.5 ± 0.2 karto virš bazinio lygio) ir ERK1 fosforilinimo. /2 Thr-202 ir Tyr-204 (ERK2 fosforilinimas: 1.5 ± 0.2 karto didesnis už bazinį lygį) (Pav 4 A ir B). Tačiau kokaino sukeltas MEK1/2 aktyvavimas (1.2 ± 0.2 karto didesnis už bazinį lygį) ir ERK1/2 (ERK2 fosforilinimas: 1.2 ± 0.2 karto didesnis už bazinį lygį) buvo susilpnintas Tgp35 pelėse (Pav 4 A ir B). Be to, bazinis fosfo-ERK1/2 lygis Tgp35 pelėms buvo mažesnis (0.8 ± 0.2 karto mažesnis už laukinio tipo pelių vertę), tuo tarpu ši tendencija nebuvo statistiškai reikšminga. Pastarasis rezultatas gali būti siejamas su nuo Cdk5 priklausomu MEK1 fosforilinimu Thr-286, dėl kurio sumažėja katalizinis aktyvumas (24). Norėdami įvertinti šią galimybę, ištyrėme MEK1 fosforilinimo būseną Thr-286 ir nustatėme, kad Tgp286 pelių striataliniuose ekstraktuose buvo didesnis fosfo-Thr-1 MEK35 kiekis.Pav 4C; 1.3 ± 0.1 karto didesnė už laukinio tipo pelių vertę). Be to, viena kokaino injekcija nepakeitė MEK1 fosforilinimo būsenos Thr-286, o tai atitinka išvadą, kad gydymas neturėjo įtakos Cdk5 aktyvumui.Pav 3D).

Pav. 4.  

Cdk5 sukeltas MEK1/2 slopinimas susilpnina kokaino sukeltą ERK1/2 aktyvaciją. Iš laukinio tipo (WT) ir Tgp35 pelių, 15 minučių po kokaino arba fiziologinio tirpalo injekcijos, buvo paruošti striatų ekstraktai ir atlikti imunoblotingas. ...

Dopamino signalų plitimą į branduolį susilpnina padidėjęs Cdk5 aktyvumas. Kokaino sukeltas kelių signalizacijos kaskadų, apimančių PKA ir ERK, aktyvavimas lemia vėlesnį transkripcijos faktoriaus CREB aktyvavimą branduolyje per jo fosforilinimą Ser-133.22, 25). Norėdami ištirti, ar Cdk5 sukeltas slopinamasis poveikis PKA ir ERK aktyvinimo kaskadoms gali susilieti su CREB fosforilinimo būsena branduolyje, ištyrėme CREB fosforilinimo būseną Ser-133 laukinio tipo ir Tgp35 pelių striataliniuose ekstraktuose. Tgp35 pelių bazinis fosfo-CREB lygis buvo mažesnis (0.7 ± 0.1 karto didesnis už laukinio tipo pelių vertę) (Pav 5). Reaguojant į kokaino injekciją, laukinio tipo pelių striatumoje padidėjo fosfo-CREB kiekis (1.5 ± 0.1 karto didesnis už bazinį lygį), tačiau šis atsakas į kokainą susilpnėjo Tgp35 pelėms (1.2 ± 0.1). sulenkite virš bazinio lygio) (Pav 5).

Pav. 5.  

Padidėjęs Cdk5 aktyvumo reguliavimas sumažina CREB fosforilinimą Ser-133 pelėms, suleidus fiziologinį tirpalą arba kokainą. 35 minučių po injekcijos iš laukinio tipo (WT) ir Tgp30 pelių buvo paruošti striataliniai ekstraktai ir atlikti imunoblotingi. ...

CREB fosforilinimas Ser-133 padidina jo transkripcijos aktyvumą per cAMP atsako elementą tam tikrų genų, įskaitant c-fos geną, promotoriaus srityje.26). Todėl ištyrėme c-fos indukciją laukinio tipo ir Tgp35 pelių striatumoje po kokaino injekcijos. Laukinio tipo pelėms c-fos mRNR lygis padidėjo iki didžiausios vertės (1.8 ± 0.2 karto viršija bazinį lygį) praėjus 30 minučių po kokaino injekcijos, o vėliau grįžo į bazinį lygį praėjus 120 minučių po injekcijos.Pav 6 A ir B). Tačiau c-fos mRNR lygis Tgp30 pelėms buvo ≈35% mažesnis nei laukinio tipo pelėms iki 30 minučių po injekcijos (Pav 6 A ir B). Mažesnę c-fos indukciją Tgp35 pelėse dar labiau patvirtino imunohistochemija (Pav 6 C-F). Kokaino vartojimas padidino c-fos imunoreaktyvumą tiek laukinio tipo, tiek Tgp35 pelėms stipriai dorsomedial-dorsocentral striatum dalyse ir silpnai šoninėse dalyse. Tačiau kokaino sukeltas c-fos imunopozityvių ląstelių skaičiaus padidėjimas buvo labai susilpnėjęs Tgp35 pelių striatumoje (Pav 6G). Kartu šie rezultatai parodė, kad Tgp35 pelėms buvo slopinamas kokaino sukeltas striatalinio dopamino signalo į branduolį stiprinimas, o tai tikėtinas padidėjusio Cdk5 aktyvumo rezultatas.

Pav. 6.  

Padidėjęs Cdk5 aktyvumo reguliavimas sumažina striatalinę c-fos ekspresiją ir mažesnę jos indukciją po kokaino vartojimo. (A) Northern blot, rodantis c-fos indukcijos laiką laukinio tipo (WT) ir Tgp35 (Tg) pelėms po kokaino injekcijos. ...

Diskusija

Cdk5 ir jo aktyvatorius p35 buvo nustatyti kaip tiksliniai genai, kuriuos reguliuoja lėtinis kokaino poveikis (6). Pateikiame įrodymus, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas, atsirandantis dėl p35, o ne dėl Cdk5, sukelia kokaino sukeltos dopamino signalizacijos susilpnėjimą striataliniuose neuronuose. Norint ištirti padidintos Cdk5 arba p35 ekspresijos pasekmes striataliniam dopamino signalizavimui, buvo analizuojamos dvi transgeninės pelių linijos, TgCdk5 ir Tgp35 pelės. Mes nustatėme, kad Cdk5 aktyvumas buvo reguliuojamas proporcingai padidėjusiam p35 baltymo lygiui, tačiau padidėjęs Cdk5 baltymo lygis jam įtakos neturėjo. Ankstesnė ataskaita taip pat parodė, kad Cdk5 aktyvumas TgCdk5 pelių smegenyse buvo mažesnis nei laukinio tipo pelių smegenyse, kai aktyvumas buvo matuojamas naudojant Cdk5 imunoprecipitates (17), o tai rodo, kad dėl pernelyg didelės Cdk5 ekspresijos padidėja monomerinio Cdk5 lygis, jei p35 lygis nepadidėja. Šie rezultatai parodė, kad p35 baltymo lygis yra greitį ribojantis Cdk5 aktyvumo veiksnys.

Po ūmios kokaino injekcijos Tgp35 pelėms pasireiškė mažesnė tiek CREB fosforilinimo, tiek c-fos indukcija striatumoje, o tai rodo, kad striatalinį atsaką į kokainą slopino padidėjęs Cdk5 aktyvumas. Kokaino sukeltos dopamino signalizacijos susilpnėjimas Tgp35 pelėse greičiausiai buvo pasiektas dėl Cdk5 sukelto kelių signalizacijos kaskadų, apimančių DARPP-32, PKA ir ERK, slopinimo. Kokaino vartojimas padidino DARPP-32 PKA fosforilinimą ties Thr-34 laukinio tipo pelėms, o šis atsakas buvo susilpnintas Tgp35 pelėms. Nustatyta, kad DARPP-32 PKA fosforilinimas ties Thr-34 slopina baltymo fosfatazės 1 (PP1), fermento, atsakingo už CREB Ser-133 defosforilinimą, aktyvumą.27). Taigi, PP1 aktyvumas nebūtų antagonizuotas per DARPP-32 / PP1 kelią Tgp35 pelėse.

Kokaino sukeltas ERK1/2 aktyvinimas taip pat buvo susilpnintas Tgp35 pelėse. Yra keletas skirtingų mechanizmų, kuriais Cdk5 gali slopinti kokaino sukeltą ERK1 / 2 aktyvavimą. Pirma, nuo Cdk5 priklausomas DARPP-32 fosforilinimas ties Thr-75 gali slopinti PKA, todėl vėliau bus slopinama bet kokia PKA sukelta MEK1/2 aktyvacija, reikalinga ERK1/2 aktyvacijai. Neseniai atliktas tyrimas taip pat nustatė, kad DARPP-32 fosforilinimas Thr-34 yra reikalingas kokaino sukeltam ERK1/2 aktyvavimui keliais būdais, apimančiais netiesioginį MEK aktyvacijos reguliavimą, taip pat striatu praturtintos fosfatazės, tirozino, reguliavimą. fosfatazė, kuri tiesiogiai veikia ERK1/2 (28). Šią galimybę patvirtina išvada, kad kokaino sukeltas MEK1/2 fosforilinimas Ser-217 ir Ser-221 Tgp35 pelėse buvo panaikintas. Kitas tikėtinas kelias yra nuo Cdk5 priklausomas MEK1 fosforilinimas Thr-286, dėl kurio sumažėtų jo katalizinis aktyvumas ir sumažėtų ERK1 / 2 aktyvumas.24).

Nustatyta, kad Cdk5 aktyvumo slopinimas striatumoje sustiprina lėtinio gydymo kokainu poveikį gyvūnų elgsenai.6). Remiantis hipoteze, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumo reguliavimas gali prisidėti prie neuronų prisitaikymo, siekiant neutralizuoti pakartotinio kokaino vartojimo poveikį. (6), mes nustatėme, kad Cdk5 sukeltas DARPP-32 ir MEK1 fosforilinimas prisidėjo prie kokaino sukeltos ERK1/2 aktyvacijos susilpnėjimo, todėl CREB fosforilinimas ir c-fos striatumoje buvo indukuojami mažiau. Mūsų išvados patvirtina idėją, kad padidėjęs Cdk5 aktyvumas dėl p35 reguliavimo gali pakeisti genų ekspresiją striatumoje po lėtinio kokaino poveikio. Tai gali įvykti pasikeitus transkripcijos faktorių, tokių kaip CREB ir c-fos, veikla. Taigi, Cdk5 aktyvatorius p35 dėl savo greitį ribojančio poveikio Cdk5 aktyvumui gali prisidėti prie ilgalaikių neuronų funkcijos pokyčių, dėl kurių priklauso priklausomybė nuo kokaino..

Padėka

Dėkojame dr. Mary Jo Danton, Philip Grant ir Sashi Kesavapany už kritišką rankraščio skaitymą. Šį darbą parėmė Nacionalinių sveikatos institutų dotacija Z01DE00664-05 (ABK), JAV visuomenės sveikatos tarnybos dotacija DA10044 ir Simonso fondo, Peterio J. Sharpo fondo ir Picowerio fondo (PG) dotacijos.

pastabos

Santrumpos: Cdk5, nuo ciklino priklausoma kinazė 5; ERK, ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazė; DARPP-32, dopamino ir cAMP reguliuojamas fosfoproteinas, molekulinė masė 32 kDa; PKA, nuo cAMP priklausoma kinazė; MEK, ERK kinazė; CREB, cAMP atsako elementą surišantis baltymas.

Nuorodos

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE & Nestler, EJ (1992) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 89, 5764 – 5768. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT ir Widnell, KL (1993) Neuron 11, 995 – 1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS ir Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235 – 1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, et al. (1999) Gamta 401, 272–276. [PubMed]
5. McClung, CA & Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6, 1208 – 1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, et al. (2001) Gamta 410, 376 – 380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. ir Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965 – 8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. kun. Mol. Ląstelė. Biol. 2, 749 – 759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ ir Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 93, 11173 – 11178. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. ir Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29 – 42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 101, 2191 – 2196. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, et al. (1999) Gamta 402, 669 – 671. [PubMed]
13. Snyder, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12, 3071 – 3083. [PubMed]
14. Young, ST, Porrino, LJ ir Iadarola, MJ (1991) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 88, 1291 – 1295. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, CA, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO ir Kulkarni, AB (1996) Genomics 35, 372 – 375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 98, 2764 – 2769. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO ir Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550 – 558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506 – 10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. ir Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6, 252 – 260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14 – 23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Kunigas Neurosci. 2, 119 – 128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487 – 11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701 – 8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB ir Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528 – 534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Pojūčiai 20, 257 – 260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 88, 5061 – 5065. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB ir Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435 – 447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. JAV 103, 491 496.