PSMC5, 19S proteasomų ATPazė, reguliuoja kokaino poveikį branduoliuose (2015)

PLoS One ". 2015 gegužės 11; 10 (5): „e0126710“. doi: 10.1371 / žurnalas.pone.0126710. „eCollection 2015“.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Oho M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, „Tsuzuki T“4, Nestler EJ5.

Abstraktus

ΔFosB yra stabilus transkripcijos faktorius, kuris kaupiasi branduolyje accumbens (NAc), pagrindinėje smegenų atlygio grandinės dalyje, reaguodamas į lėtinį kokaino ar kitų piktnaudžiavimo narkotikų poveikį. Nors žinoma, kad ΔFosB su heterodimerizuojasi su Jun šeimos nariu, kad sudarytų aktyvų transkripcijos faktoriaus kompleksą, iki šiol nebuvo atvirų kitų galimų ΔFosB surišančių partnerių smegenyse tyrimų. Čia, naudojant mielių dviejų hibridų tyrimus, nustatome PSMC5, dar vadinamą SUG1, ATPazę turinčiu 19S proteasomų komplekso subvienetu, kaip naują baltymą, sąveikaujantį su ΔFosB. Mes patikriname tokią endogeninio ΔFosB ir PSMC5 sąveiką NAc ir parodome, kad abu baltymai taip pat formuoja kompleksus su kitais chromatino reguliavimo baltymais, susijusiais su genų aktyvavimu. Mes toliau parodome, kad lėtinis kokainas padidina branduolinį, bet ne citoplazminį PSMC5 kiekį NAc ir kad per didelis PSMC5 ekspresija šiame smegenų regione skatina judėjimo reakciją į kokainą. Šios išvados kartu apibūdina naują mechanizmą, kuris prisideda prie ΔFosB veiksmų ir pirmą kartą įtraukia PSMC5 į kokaino sukeltą molekulinę ir elgesio plastiką.

citavimo: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O ir kt. (2015) PSMC5, „19S Proteasomal ATPase“, reguliuoja kokaino veikimą branduolio akumuliatoriuose. „PLOS ONE 10“ (5): „e0126710“. doi: 10.1371 / žurnalas.pone.0126710

Akademinis redaktorius: James Edgar McCutcheon, Lesterio universitetas, JUNGTINĖ KARALYSTĖ

Gauta: 10, 2014; Priimta: Balandis 7, 2015; Paskelbta: Gali 11, 2015

Autorinės teisės: © 2015 Ohnishi ir kt. Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons“ priskyrimo licencija, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei įskaitomas originalus autorius ir šaltinis

Duomenys Prieinamumas: Visi svarbūs duomenys yra popieriuje.

Finansavimas: Šį darbą rėmė nacionalinių sveikatos institutų, Nacionalinio kovos su narkotikais instituto, Ishibashi fondo ir Japonijos mokslo populiarinimo draugijos (KAKENHI numeriai: 24591735, 26290064, 25116010) subsidijos. Rėmėjai neturėjo vaidmens rengiant studijas, renkant ir analizuojant duomenis, priimant sprendimus skelbti ar rengiant rankraštį.

Konkuruojantys interesai: Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojančių interesų.

Įvadas

ΔFosB, apipjaustytas produktas FosB genas, priklauso transkripcijos veiksnių šeimai „Fos“, kuriai taip pat priklauso „c-Fos“, viso ilgio „FosB“, „Fra-1“ ir „Fra-2“. ΔFosB, kaip ir kiti Fos baltymai, heterodimerizuojasi su Jun šeimos šeimos baltymais - c-Jun, JunB arba JunD -, kad sudarytų aktyvų AP-1 (aktyvatoriaus baltymo-1) transkripcijos faktoriaus kompleksą, kuris indukuoja arba slopina specifinių tikslinių genų ekspresiją. [1,2].

Įrodyta, kad ΔFosB vaidina svarbų vaidmenį sergant narkomanija [2]. Vienkartinis tarp „Fos“ šeimos baltymų, pakartotinai vartojant vaistą, dėl aukšto stabilumo jis kaupiasi branduolių akumuliatoriuose (NAc) ir kituose su atlygiu susijusiuose smegenų regionuose [3,4], kurį sąlygoja C-galinių degrono domenų trūkumas ir kelių baltymų kinazių fosforilinimas [5-7]. Toks ΔFosB indukcija NAc sąlygoja padidėjusį elgesio atsaką į piktnaudžiavimo narkotikus. Taigi, per didelis ΔFosB ekspresija šiame suaugusių gyvūnų smegenų regione, naudojant virusinius vektorius ar indukuojamas bitransgenines peles, padidina gyvūno jautrumą lokomotorinius aktyvinančius ir teigiamus kokaino ir opiatų poveikius, taip pat gyvūno motyvaciją savarankiškai vartoti. kokainas [7-11]. Dominuojančių neigiamų ΔFosB antagonistų per didelis ekspresija sukelia priešingus elgesio fenotipus [10-12].

Mes ir kiti anksčiau, naudodamiesi gelio poslinkio tyrimais, patvirtinome, kad JunD ir galbūt kiti Jun šeimos baltymai yra pagrindiniai ΔFosB jungiamieji partneriai smegenyse in vivo [13-15]. Tačiau iki šiol nebuvo atliktas nešališkas ir nešališkas ΔFosB jungiamųjų partnerių smegenyse vertinimas. Naudodamiesi mielių dviejų hibridų tyrimu, mes siekėme nustatyti naujus ΔFosB jungimosi partnerius [16,17]. Mūsų duomenys atskleidė, kad PSMC5, dar žinomas kaip SUG1, yra tvirtas ΔFosB partneris tiek in vitro, tiek NAc in vivo, kur prisijungia prie ΔFosB kaip kokaino sukeltos transkripcijos aktyvacijos komplekso dalis, kuriame taip pat yra CBP (CREB surišantis baltymas). ) ir p300 - abi histono acetiltransferazės (HAT) -, taip pat BRG1 (chromatiną rekonstruojantis baltymas). Toliau parodome, kad lėtinis kokaino poveikis keičia NAM branduolinį PSMC5, ATPazės turinčio 19S komplekso subvienetų, branduolinį lygį ir kad PSMC5 savo ruožtu kontroliuoja elgesio reakcijas į kokainą.

Medžiaga ir metodai

Mielių dviejų hibridų atranka

„MaV203“ mielių ląstelės („Invitrogen Life Technologies“) buvo transfekuotos kartu su pDBLeu, kaupiančiais skirtingus FosB baltymo fragmentus, ir pelės smegenų biblioteka subklonuota į pPC86 („Invitrogen Life Technologies“). Transformuotos ląstelės buvo auginamos SC terpėje, neturinčioje leucino, triptofano ir histidino ir turinčių 10 mM 3-aminotriazolo. Susirišimas tarp „FosB“ fragmentų ir partnerio kandidato sukelia tris reporterio genus („His3“, „Ura3“, ir LacZ), o indukcija suteikia transformantams galimybę išgyventi naudojamomis kultūrinėmis sąlygomis. Teigiami klonai buvo pakartotinai patikrinti su naujais PDBLeu-ΔFosB fragmentais, atliekant retransformacijos testus MaV203 ląstelėse.

Ląstelių linijos

Pelės Neuro 2A neuroblastomos ląstelės (ATCC) buvo palaikomos minimalioje Eagle būtinoje terpėje (EMEM) (ATCC), papildytoje 10% galvijų vaisiaus serumu (FBS) 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2. Žiurkės 1A ląstelės buvo Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonija) dovana [18] ir palaikoma Dulbecco MEM (DMEM) (Life Technologies), papildyta 10% FBS esant 37 ° C ir 5% CO2. Ląstelių transfekcija plazmidine DNR buvo atlikta naudojant Effectene (Qiagen) pagal gamintojo instrukcijas.

PSMC5 ir ΔFosB konstrukcijos

Buvo sukurtos kelios PSMC5 mutantinės formos, kurių kiekviena FLAG buvo pažymėta jų N gale, kad būtų galima panaudoti imunoprecipitacijai arba virusų sukeltiems genų perdavimo eksperimentams. Tai apėmė: PSMC5-K196M, PSMC5-Δsuktos ritės domeną (PSMC5-ΔCC, neturintį aminorūgščių 27 – 68), PSMC5-NT (sudarytą iš baltymo N-galo fragmento, aminorūgščių 1 – XMUMX ir 151 – 5). -CT (susidedantis iš C galinio baltymo fragmento, 172 aminorūgščių) (žr Pav 1). Mes taip pat panaudojome N-galines MYC pažymėtas laukinio tipo ΔFosB, taip pat ΔFosB formas, turinčias mutaciją jo leucino-užtrauktuko srityje (aminorūgščių 182 mutacija į 205, kuri, kaip žinoma, panaikina heterodimerizaciją su Jun šeimos šeimos baltymais [6].

miniatiūrų
1 pav. ΔFosB prisijungia prie PSMC5 in vitro.

 

A. ΔFosB, ΔFosB-LZM, kurioje mutavus leucino užtrauktuko domenas panaikina ΔFosB heterodimerizaciją Jun baltymais, schema, ir Δ2ΔFosB, kuriai trūksta pirmųjų ΔFosB N-galo 78 aminorūgščių. B. PSMC5, PSMC5-NT, apimančio pirmąsias PSMC151 aminorūgštis 5, PSMC5-CT, kurioje nėra pirmųjų PSMC235 aminorūgščių 5, ir PSMC5-ΔCC, kuriai trūksta suvyniotosios spiralės domenas, schema (aminorūgštys XNXX) . AAA domenas atitinka motyvą, ATPazes, susietas su įvairia ląstelių veikla, esančių daugelyje ATPazių. C. 28 μg pcDNA68-ΔFosB (juostos 2.4 – 3.1) arba ΔFosB-LZM (juosta 1) buvo transfekuoti kartu su 4 μg PAGAL žymėtu PSMC5 arba įvairiais delecijos mutantais į Neuro2.4a ląsteles. Praėjus dviem dienoms po transfekcijos, ląstelės buvo lizuotos ir imuniniu būdu nusodintos anti-FLAG antikūnais, tada Western blot buvo tiriamos anti-ΔFosB arba anti-FLAG antikūnais. Atminkite, kad ΔFosB, bet ne ΔFosB-LZM, tvirtai jungiasi prie PSMC5 arba PSMC2-NT, bet ne su PSMC5-CT ar PSMC5-CC. Paveiksle pateikti duomenys buvo pakartoti trimis egzemplioriais kiekviename iš trijų atskirų eksperimentų.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

gyvūnai

Visiems eksperimentams buvo naudojamos devynių – 11 savaičių C57BL / 6J pelės (Džeksono laboratorija). Gyvūnai buvo laikomi 12-h cikle „šviesus ir tamsus“, turėdami galimybę gauti maisto ir vandens ad libitum ir buvo pripratę 1 savaitę prieš eksperimentą. Buvo naudojami du gydymo kokainu režimai. Biocheminiam kokaino poveikiui ištirti gyvūnams buvo duotos 7 dienos kokaino dozės (20 mg / kg) arba fiziologinio tirpalo, ir jie buvo nužudyti 24 dekapacijos valandą po paskutinės injekcijos. Tai yra standartinis protokolas, kuris, kaip įrodyta, sukelia daugybę molekulinių ir ląstelių reakcijų į vaistą [7]. Norėdami ištirti PSMC5 įtaką branduolio akumuliatoriuose elgesio reakcijai į kokainą, mes panaudojome sub-slenkstinę vaisto dozę (7.5 mg / kg; žr. Lokomotorinės sensibilizacijos žemiau), remdamiesi hipoteze, kad PSMC5, kaip ir ΔFosB, padidins gyvūno jautrumą. kokainas [8]. Visus bandymus su gyvūnais patvirtino Sinajaus kalno institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Imuninis nusėdimas ir Vakarų pūtimas

„Neuro 2A“ ląstelės buvo transfekuotos PSMC5 laukinio tipo arba mutantinėmis formomis. Praėjus dviem dienoms po transfekcijos, ląstelės buvo plaunamos PBS, lizuojamos RIPA buferiu (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natrio deoksicholato, 10 mM natrio butirato, proteazės inhibitoriaus). . Lizatai buvo padalyti ir inkubuojami su neimuniniais IgG (Sigma) arba anti-FLAG antikūnais (Sigma) 3 val., Esant 4 ° C. Imuninis nusodinimas buvo atliktas naudojant baltymo G granules (Invitrogen), kaip aprašyta [19]. Trumpai tariant, imuniteto nusėdę baltymai buvo paveikti SDS-PAGE ir analizuojami atliekant Western blot analizę, naudojant anti-FosB / ΔFosB antikūnus (Cell Signaling Technology), remiantis paskelbtais protokolais [7]. In vivo baltymų prisijungimo tyrimams mes panaudojome išgrynintas branduolines frakcijas iš peštukų išpjaustytų pelių NAc po lėtinio gydymo kokainu (20 mg / kg IP per parą 7 dienas, pelėms naudojant 24 val. Po paskutinės injekcijos). Bendras imunoprecipitacija iš branduolinių frakcijų buvo atlikta naudojant Branduolinio komplekso bendro IP rinkinį (Active Motif), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Buvo naudojami šie antikūnai: MYC arba ß-aktinas, ląstelių signalizacijos technologija (Danvers, MA), PSMC5 ir histonas H3, Abcam (Kembridžas, MA), CBP, p300 ir BRG1, Santa Cruz biotechnologija (Santa Cruz, CA) ir FLAG M2, Sigma.

Imunohistochemistry

Imunohistochemija buvo atlikta pagal paskelbtas procedūras [20]. Pelės buvo anestezuojamos ir perfuzuojamos intrakardialiai 4% paraformaldehidu PBS. Smegenys buvo apsaugotos nuo kryžminės apsaugos su 30% sacharozės kiekiu, po to užšaldomos ir iki naudojimo laikomos -80 ° C temperatūroje. Vainikinės pjūviai (40 μm) buvo supjaustyti kriostatu ir paruošti imunohistochemijai. Laisvai plūduriuojančios sekcijos buvo iš anksto inkubuotos blokuojančiame buferyje, kuriame yra 0.3% Triton ir 3% normalaus asilo serumo. ΔFosB buvo aptiktas naudojant ožkos polikloninį antikūną, išaugintą prieš baltymo N-galinę dalį (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 buvo aptiktas naudojant triušio polikloninius antikūnus (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Vaizdai buvo nufotografuoti konfokaliniu mikroskopu (60x padidinimas; Zeiss).

Lokomotorinis jautrinimas

Visoms pelėms kasdien buvo skiriamos fiziologinio tirpalo IP injekcijos 3 dienomis, kad jos būtų pritaikytos prie injekcijų patiriamo streso. Kitą dieną pelėms buvo įšvirkšta fiziologinio tirpalo arba sub-slenkstinė kokaino dozė (7.5 mg / kg; žr. Skyrių „Gyvūnai aukščiau“) IP ir iškart dedamos į naujas lokomotorines dėžutes. Pelių lokomotorinis aktyvumas buvo užfiksuotas naudojant foto pluošto sistemą kaip ambulatorinės spindulio pertraukas 30 min. Šie gydymo metodai buvo kartojami kasdien 3 dienomis.

Viruso perduodamas genų perdavimas

Mes panaudojome plačiai skelbiamus virusų sukelto genų perdavimo metodus [7,8,11,19]. Trumpai tariant, PSMC5 arba keleto jo mutantų (žr. PSMC5 ir ΔFosB konstruktus aukščiau) ekspresijos plazmidės buvo subklonuotos į bicistroninę p1005 (+) HSV plazmidę, ekspresuojančią GFP, kontroliuojant CMV promotoriui, ir PSMC5 arba jos mutantus, esantiems toje pačioje vietoje. IE4 / 5 promotorius. Atliekant anesteziją ketamino (100 mg / kg) / ksilazino (10 mg / kg) metu, pelės buvo dedamos į mažiems gyvūnams skirtą stereotaksinį instrumentą, o kaukolės paviršius buvo paveiktas. Trisdešimt trys gabaritinės švirkšto adatos buvo panaudotos, kad būtų galima abipusiai infuzuoti 0.5 μl HSV vektoriaus į NAc 10 ° kampu (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) greičiu 0.1 μl / min. Gyvūnams, kuriems buvo švirkščiama HSV, buvo leista atsigauti 2 dienas po operacijos prieš eksperimentą.

Statistika

Buvo naudojami ANOVA ir studentų t-testai, pataisyti keliems palyginimams, kurių reikšmingumas nustatytas p <0.05.

rezultatai

PSMC5: naujas ΔFosB surišantis partneris

Mes atlikome preliminarius eksperimentus, norėdami nustatyti tinkamą ΔFosB fragmentą, kuris tarnavo kaip masalas mielių dviejų hibridų tyrime, neaktyvinant sistemos. Holo-ΔFosB sukėlė reporterio geno aktyvumą savarankiškai, kaip ir baltymo N-galo 1 – 78 aminorūgščių fragmentas. Tačiau N-terminalas sutrumpintas ΔFosB (1A pav), vadinamu Δ2ΔFosB, kuriam trūksta pirmųjų baltymo 78 aminorūgščių, šio poveikio neturėjo. Todėl mes naudojame Δ2ΔFosB kaip jauko baltymą.

Norėdami patikrinti galimus rišamuosius partnerius, mes panaudojome pelės smegenų biblioteką, subklonuotą pPC86. Mes nustatėme 11 kandidatus į privalomus partnerius. Nors šie baltymai apėmė žinomus ΔFosB heterodimerizacijos partnerius, c-Jun ir JunD (Lentelė 1), iki šiol labiausiai paplitęs kandidatas buvo PSMC5. Nors ir stebina, tai buvo įdomus atradimas, nes PSMC5 prieš vienerius metus buvo parodytas prisijungti prie c-Fos in vitro [21]. Tačiau jokių ankstesnių pranešimų apie PSMC5 dalyvavimą kokaino veikloje nėra. Nepaisant to, dėl mielių dviejų hibridų analizės stiprumo PSMC5, mes ketiname toliau tirti galimas studyFosB-PSMC5 sąveikas.

miniatiūrų
1 lentelė. Mielių dviejų hibridinių atrankos su Δ2ΔFosB rezultatai.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Pirmiausia, norėdami patvirtinti fizinę ΔFosB ir PSMC5 sąveiką, mes atlikome in vitro imunodepresikacijos eksperimentus. Mes nustatėme, kad FLAG pažymėtas PSMC5 (1B pav), perneštos į „Neuro 2A“ ląsteles, efektyviai atitraukė ΔFosB (1C pav). Antra, norėdami identifikuoti PSMC5 regioną, atsakingą už jo jungimąsi su ΔFosB, sukūrėme kelis FLAG pažymėtus PSMC5 mutantus (1B pav) ir pakartojo bendro imunoprecipitacijos eksperimentą. ΔFosB buvo veiksmingai nugriautas su PSMC151 (PSMC5-NT) aminorūgščių N-terminalais 5, bet ne su baltymo C-galo 172 aminorūgšties fragmentu (PSMC5-CT) (1C pav). PSMC5, kuriam trūko ritės domeno (PSMC5-CC), taip pat buvo neveiksmingas nusodinant ΔFosB. Šie duomenys rodo, kad PSMC5 jungiasi ΔFosB per savo susukto ritės domeną (aminorūgštys 27 – 68). Be to, su FLAG pažymėtu PSMC5 nesusidarė ΔFosB mutantinės formos su mutavusio leucino užtrauktuko domenu (ΔFosB-LZM) (1C pav), nurodant, kad ΔFosB arba jungiasi su PSMC5 per šį domeną, arba, labiau tikėtina, kad norint surišti PSMC5 reikia ΔFosB heterodimerizacijos.

PSMC5-ΔFosB jungiasi NAc po lėtinio kokaino vartojimo

Remdamiesi šiais atradimais in vitro, mes ištyrėme, ar PSMC5 lygis NAc keičiasi reaguojant į lėtinį kokaino vartojimą. Dalinių ląstelių frakcionavimo ir Western blot metodais mes nustatėme, kad lėtinis kokainas padidina PSMC5 branduolinį kiekį šiame smegenų regione, nekeisdamas citoplazmos lygio (2A pav). Po vienkartinių kokaino dozių šio poveikio nepastebėta (duomenys nepateikti). Toliau mes ištyrėme PSMC5 ir ΔFosB lokalizaciją NAc, atlikdami konfokalinės imunofluorescencijos mikroskopiją. Mes išanalizavome pelių 24 val. Po paskutinės kartotos kokaino dozės - laiko, kai ΔFosB yra vienintelis aptinkamas FosB genų produktas (žr. „Nestler 2008“). NAc radome stiprų PSMC5 imunoreaktyvumą, įskaitant stiprų branduolinį signalą. ~ 85% ΔFosB + branduolių, dažytų PSMC5 (2B pav). Be to, atlikome NAc ekstraktų imunodepresikacijos eksperimentus ir nustatėme, kad po lėtinio gydymo kokainu ΔFosB buvo veiksmingai nugriautas anti-PSMC5 antikūnas (2C pav). Priešingai, vartojant anksčiau nevartotus NAc (po pakartotinių injekcijų fiziologiniu tirpalu), analizė nerado aptinkamo ΔFosB sumažėjimo (duomenys nepateikti). Šie duomenys atitinka mūsų atradimus ląstelių kultūroje ir patvirtina, kad ΔFosB ir PSMC5 sąveikauja NAc in vivo.

miniatiūrų
2 pav. PSMC5 reguliavimas pelių NAc.

 

A. Pelenų, kasdien gydytų fiziologiniu tirpalu arba kokainu (20 mg / kg), 7 dienas, atliekant Vakarų ląstelių NAc branduolinių ir citozolinių frakcijų tyrimus, gyvūnai buvo analizuojami praėjus 24 valandoms po paskutinės injekcijos. Kokainas padidina branduolinį, bet ne citozolinį PSMC5 lygį. Kaip įkrovos kontrolė buvo naudojami histonas H3 ir ß-aktinas, kurių kokainas nepaveikė. Duomenys yra vidutiniai ± SEM (n = 8–10 / grupė, * p <0.05). B. Endogeninio PSMC5 (žalias) ir ΔFosB (mėlynas) lokalizavimas pelėms, kurios buvo chroniškai gydomos kokainu, kaip ir AC, pelės NAc branduolio lizatams po lėtinio gydymo kokainu imuninė nuosėdos buvo kontroliuojamos naudojant anti-PSMC5 antikūnus arba pelės IgG kaip kontrolę. ir tada Western išblukintas anti-FosB / ΔFosB antikūnais. Paveiksle parodytos PSMC5-ΔFosB sąveikos NAc in vivo. B ir C duomenys buvo pakartoti trimis egzemplioriais kiekviename iš trijų atskirų eksperimentų.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 pagerina ΔFosB ekspresiją in vitro

Kadangi PSMC5 yra žinomas proteasomų komplekso narys, mes išbandėme, ar jis reguliuoja ΔFosB lygius, naudodamas žiurkės 1A ląsteles. PSMC5 per didelis ekspresija neturėjo įtakos baziniam ΔFosB lygiui, tačiau paskatino nedidelį, bet reikšmingą ΔFosB indukcijos padidėjimą, stimuliuojant ląstelių serumą (3A pav). Panaši tendencija buvo pastebima ir viso ilgio „FosB“, tačiau šis poveikis nepasiekė statistinio reikšmingumo. Ir atvirkščiai, endogeninės PSMC5 raiškos slopinimas žiurkės 1A ląstelėse, pasiektas naudojant siRNR, nukreipiančius į PSMC5, nepadarė įtakos baziniam ΔFosB lygiui, bet stipriai slopino ΔFosB indukciją serumo stimuliacijos būdu (3B pav). Panašus poveikis buvo pastebėtas viso ilgio „FosB“. Šie duomenys leidžia manyti, kad PSMC5 neskatina ΔFosB proteasominio skilimo, kaip galima tikėtis kaip pagrindiniam proteasomos subvienetui, tačiau jis reikalingas maksimaliam akumuliacijai. FosB genų produktai in vitro, galbūt stabilizuojant baltymus.

miniatiūrų
3 pav. PSMC5 FosB / ΔFosB ekspresijos reguliavimas žiurkės 1A ląstelėse.

 

A. Žiurkės 1A ląstelės buvo transfekuotos 4 μg PSMC5 arba kontrolinės DNR. PSMC5 per didelė ekspresija neturėjo jokios įtakos baziniam FosB ar ΔFosB baltymo ekspresijos lygiui, nustatytam Western blotingo metodu, tačiau sukėlė nedidelį, bet reikšmingą ΔFosB indukcijos padidėjimą stimuliuojant serumą (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Žiurkės 1A ląstelės buvo transfekuotos 5 pmol vienos iš dviejų siRNR arba užšifruotos RNR (kontrolinė). Abi siRNR efektyviai sumažino PSMC5 baltymų kiekį, palyginti su kontrolinėmis sąlygomis (siRNR # 1, 23 ± 5% kontrolės; siRNR # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 nukentėjimas neturėjo įtakos baziniam FosB ar ΔFosB lygiui, tačiau stimuliavo tiek FosB, tiek ΔFosB indukciją stimuliuojant serumą (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83). , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB ir PSMC5 sudaro kompleksus su CBP, p300 ir BRG1 NAc

Norėdami geriau suprasti transkripcijos mechanizmus, kuriais PSMC5 gali įtakoti ΔFosB funkciją, mes ištyrėme galimus abiejų NAc baltymų jungimosi partnerius lėtiniu kokainu gydomomis sąlygomis. Yra viena ataskaita, kad PSMC5 jungiasi prie CBP - HAT ir padidina histono H3 acetiliaciją MHC-II proksimaliniame promotoriuje HeLa ląstelėse [22]. Be to, pelėms, kurioms trūksta CBP, sumažėja elgesio jautrumas kokainui, taip pat sumažėja histono acetilinimas FosB rengėjas [23]. Taigi mes išbandėme, ar PSMC5 gali jungtis su ΔFosB kaip kompleksų, kuriuose taip pat yra CBP ir galbūt kitų transkripcijos aktyvatorių, dalis.

Pirmiausia pademonstravome, kad ΔFosB efektyviai pašalino ir CBP, ir p300, susijusį su HAT, „Neuro2A“ ląstelėse (4A pav). Priešingai, ΔFosB mutantinė leucino užtrauktuko forma, kaip ir tikėtasi, šio aktyvumo nepasižymėjo. Panašiai PSMC5 veiksmingai nugriovė CBP ir p300 (4B pav). Įdomu tai, kad šis poveikis buvo pastebėtas ir PSMC5-CC, kuris nenuleido ΔFosB, parodydamas, kad PSMC5 sąveikauja su CBP ir p300 per kitus baltymo domenus ir nepriklausomai nuo jo prisijungimo prie ΔFosB.

miniatiūrų
4 pav. ΔFosB ir PSMC5 sąveikauja su CBP, p300 ir BRG1 in vitro ir in vivo.

 

A. Neuro2A ląstelės buvo transfekuotos 2.4 μg MYC pažymėtu FosB arba MYC pažymėtu ΔFosB-LZM. Ląstelių ekstraktai buvo imuniniu būdu nusodinti naudojant anti-CBP arba anti-p300 antikūnus, o nuosėdos buvo išpūstos Western blot tuo pačiu antikūnu arba anti-MYC antikūnu. Tiek CBP, tiek p300 sąveikauja su ΔFosB ir tokiai sąveikai reikalingas nepažeistas leucino užtrauktukas. B. Neuro2A ląstelės buvo transfekuotos 2.4 μg su FAG-tagged PSMC5 arba FLAG-tagged PSMC5-CC. Ląstelių ekstraktai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-CBP arba anti-p300 antikūnais, o nuosėdos buvo išpūstos Western blot tuo pačiu antikūnu arba anti-FLAG antikūnu. Tiek CBP, tiek p300 sąveikauja su PSMC5 ir tokiai sąveikai nereikia CC srities. C. Branduoliniai pelių NAc lizatai po lėtinio gydymo kokainu imuniniu būdu buvo nusodinami anti-CBP arba anti-p300 antikūnais. Vėlesnis gautų nuosėdų su anti-FosB / ΔFosB antikūnu vakarinis blotinimas parodė endogeninę ΔFosB ir CBP / p300 sąveiką. D. Tų pačių branduolinių lizatų alikvotinės dalys buvo imuniniu būdu nusodintos anti-BRG1 arba anti-PSMC5 antikūnais, po to nuosėdos buvo nubrėžtos Vakarų būdu naudojant anti-FosB / ΔFosB arba anti-BRG1 antikūnus. Rezultatai rodo endogeninę sąveiką tarp ΔFosB ir BRG1 bei BRG1 ir PSMC5. E. Transkripcijos aktyvavimo komplekso, sudaryto iš FosB: JunD heterodimerai, sąveikaujantys su CBP / p300, BRG1 ir PSMC5, schematinė schema.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Norėdami patvirtinti, kad ši sąveika taip pat vyksta in vivo, mes chroniškai skyrėme kokainą, kad sukeltų ΔFosB ir branduolinės PSMC5 lygį, tada imunoprecipituoti NAc ekstraktai su anti-CBP arba anti-p300 antikūnais. Remiantis mūsų ląstelių kultūros duomenimis, CBP arba p300 imuninis nusėdimas veiksmingai sumažino FosB (4C pav). Remdamiesi ankstesne išvada, kad BRG1 yra įdarbinamas tam tikruose ΔFosB tiksliniuose genuose kartu su jų aktyvacija NAc po lėtinio kokaino, mes išbandėme, ar BRG5, pagrindinis SWI-SNF chromatino rekonstravimo komplekso subvienetas, taip pat gali jungtis su ΔFosB ir PSMC1.24]. Mes nustatėme, kad BRG1 imunoprecipitacija sumažino ΔFosB NAc ekstraktuose ir kad PSMC5 imunoprecipitacija taip pat buvo iškritusi iš endogeninės BRG1 (4D pav). Visi šie rezultatai rodo, kad ΔFosB-PSMC5 sudaro NAc kompleksus, kurie taip pat apima CBP / p300 ir BRG1 (4E pav).

PSMC5 per didelis ekspresas padidina lokomotorinį atsaką į kokainą

Aktyvus PSMC5 susiejimas su ΔFosB NAc paskatino mus ištirti, ar padidėjęs PSMC5 lygis šiame smegenų regione reguliuoja elgesio reakcijas į kokainą. Mes sukūrėme herpes simplex viruso (HSV) vektorių, kuris per daug ekspresuoja arba laukinio tipo PSMC5, arba vieną iš jo mutantų, ir įteisino vektorius NAc in vivo (5A pav). Virusų sukelta PSMC5 ekspresija vyrauja ląstelės branduolyje (5B pav). Pelėms, kurios per daug ekspresuoja laukinio tipo PSMC5, nepasireiškė pakitęs atsakas į pradines kokaino dozes, tačiau padidėjo lokomotorinė aktyvacija, reaguojant į pakartotines kokaino dozes, palyginti su GFP ekspresuojančiomis kontrolinėmis pelėmis. Pelės, priešingai, ekspresuojančios PSMC5 mutantinę formą, kuriai trūksta ritės domeno (PSMC5-ΔCC), šio poveikio neparodė (5B pav). Įdomu tai, kad per didelis PSMC5-K196M ekspresija, kuriai trūksta laukinio tipo baltymo ATPazės aktyvumo, taip pat suintensyvino kokaino lokomotorinę reakciją.

miniatiūrų
5 pav. PSMC5 per didelis NAc ekspresas padidina lokomotorinį atsaką į kokainą.

 

A. Reprezentatyvi HSV medijuojama transgeno ekspresija medialiniame NAc. AC, priekinis komisaras. NAc šerdies ir apvalkalo subregionai pažymėti paveiksle. B. Reprezentatyvūs didesni (60x) imunohistocheminio PSMC5 dažymo padidėjimai NAc neuronuose po HSV-PSMC5 injekcijos, rodantys, kad baltymas yra daugiausia branduolinis, kaip pažymėta DAPI dažymu. C. Pelėms buvo atliktos dvišalės HSV injekcijos į NAc, po to kasdien buvo skiriamos vidutinės kokaino dozės (7.5 mg / kg) IP injekcijos. Lokomotoriniai atsakai rodomi reaguojant į pirmąją ir paskutinę iš 3 paros vaisto dozių. Pernelyg didelis PSMC5 arba PSMC5-K196M ekspresija padidina judėjimo reakciją į pakartotinį kokainą, tokio poveikio nematyti naudojant PSMC5-ΔCC. Nebuvo jokio reikšmingo transgenų poveikio judėjimo reakcijai į pradines kokaino dozes. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 pagal Dunnetto postthoc testą.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskusija

Šio tyrimo rezultatai atskleidžia naują mechanizmą, kuriuo ΔFosB perduoda jo poveikį smegenims, ir naują mechanizmą, susijusį su kokaino veikimu. Taikydami nešališką metodą, mielių dviejų hibridų tyrimą, mes nustatėme PSMC5 kaip naują ΔFosB surišimo partnerį. Šį radinį patvirtinome tiek auginamose ląstelėse in vitro, tiek NAc in vivo, įrodydami tvirtą PSMC5-ΔFosB jungimąsi. Svarbu tai, kad lėtinį kokaino vartojimą NAc sukelia PSMC5 branduolinis lygis. Mes taip pat parodėme, kad PSMC5-FosB jungiasi kartu su keliais kitais transkripcijos aktyvatorių baltymais, būtent CBP ir p300 (du HAT) ir BRG1 (pagrindine SWI-SNF chromatino rekonstravimo komplekso sudedamąja dalimi). Kartu mūsų išvados patvirtina hipotezę, kad PSMC5 yra dalis transkripcijos aktyvacijos komplekso, kuris yra pritraukiamas į bent tam tikrus ΔFosB sukeltus genus lėtinio kokaino vartojimo metu (4E pav). Ši hipotezė patvirtina papildomą išvadą, kad per didelis PSMC5 ekspresas NAc, kaip ir pats ΔFosB ekspresija, skatina elgesio reakcijas į kokainą. Ateityje bus įdomu stebėti šiuos in vivo stebėjimus apibūdinant PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 sąveiką, naudojant in vitro reporterio testus.

PSMC5 įsitraukimas į kokaino veikimą yra visiškai naujas. Praėjusiais metais buvo įrodyta, kad PSMC5, kuris iš pradžių buvo identifikuotas kaip didelės proteasomą sudarančių ATPazių šeimos narys, sąveikavo su keliais transkripcijos veiksniais, įskaitant c-Fos, p53, branduolinio hormono receptorius ir bazinio transkripcijos komplekso sudedamąsias dalis.25], tačiau per metus buvo atlikta nedaug funkcijų tyrimų [26]. Geriausias jos nustatytas veiksmas yra skatinti MYC transkripcijos veiksnių aktyvumą išaugintose ląstelėse [27]. PSMC5 įtaka transkripcijos mechanizmams rodo galimą ubikvitinacijos ir proteasominio aktyvumo vaidmenį reguliuojant genų transkripciją, tačiau PSMC5 dalyvavimas tokiame reguliavime iki šiol praktiškai netirtas.28,29].

Labai mažai žinoma apie PSMC5 funkciją smegenyse. Ankstesnis tyrimas parodė plačią PSMC5 mRNR ekspresiją smegenyse [30], tačiau jo funkcinis aktyvumas liko neištirtas. Mūsų išvados paskatino toliau tirti šį įdomų baltymą, kad būtų galima geriau suprasti jo vaidmenį reguliuojant genų transkripciją ir jo ryšį su ubikvitinacija - proteasomine funkcija smegenyse. PSMC5 prisijungimą prie ΔFosB tarpininkauja PSMC5 susukto ritės domenas. Be to, PSMC5 gebėjimas skatinti lokomotorinį atsaką į kokainą, nors ir reikalingas susukto ritės domenas, nereikalauja ATPazės aktyvumo, būdingo baltymui. Šie rezultatai kelia galimybę, kad bent jau mūsų sistemoje pagrindinis PSMC5 aktyvumas gali būti tarpininkaujamas jungiantis prie ΔFosB ir kitų transkripcijos reguliuojančių baltymų, o ne per jo proteasominį aktyvumą. Norint tiesiogiai išbandyti šią ir alternatyvias galimybes, reikia toliau dirbti. Nepaisant to, kad buvo naudojamas 5 dienos kokaino gydymo režimas, yra pagrįstos hipotezė, kad virusų sukelta per didelė PSMC3 ekspozicija padidino lokomotorinį atsaką į kokainą, sąveikaujant su ΔFosB, nes žinoma, kad per tą laiką smegenyse kaupiasi pastebimi ΔFosB lygiai [3].

Šios išvados papildomai pagrindžia neobjektyvaus, atviro tipo eksperimentinių metodų naudingumą tiriant smegenų reguliavimo molekulinius pagrindus. Pradinis mūsų dėmesys PSMC5 buvo grindžiamas vien tik ryškiu ΔFosB prisijungimu mielių dviejų hibridų tyrime, tačiau atrodo, kad tai yra svarbus transkripcijos pokyčių komponentas, kurį NAc pakartoja pakartotinai vartojant kokainą. Geresnis supratimas apie išsamius mechanizmus, pagal kuriuos kokainas sukelia PSMC5 branduolinius lygius, o tai, savo ruožtu, kuria PSMC5 prisideda prie kokaino sukeltų transkripcijos aktyvacijos kompleksų, yra dabartinių tyrimų dėmesys. Tuo tarpu mūsų mielių dviejų hibridų tyrimas atskleidė keletą papildomų tariamų ΔFosB jungimosi partnerių (Lentelė 1), kuris dabar taip pat pateisina tiesioginį kokaino modelių tyrimą. Kartu šis darbas padeda geriau suprasti sudėtingus molekulinius mechanizmus, per kuriuos kokainas keičia NAc funkciją.

Padėka

Šis darbas buvo paremtas Nacionalinio kovos su narkotikais instituto ir Ishibashi fondo bei Japonijos mokslo populiarinimo draugijos (KAKENHI numeriai: 24591735, 26290064, 25116010) subsidijomis.

Autoriaus įnašai

Suprojektuoti ir suprojektuoti eksperimentai: YHO YNO EJN. Atliko eksperimentus: YHO YNO PJK RN. Išanalizavo duomenis: YHO YNO EJN. Pateikti reagentai / medžiagos / analizės priemonės: TN MO OY AN RN TT. Parašė popierių: YHO EJN.

Nuorodos

  1. 1. „Morgan JI“, „Curran T“ (1995). Pirmieji ir ankstyvieji genai: po dešimties metų. „Neurosci 18“ tendencijos: 66 – 67. pmid .: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripciniai priklausomybės mechanizmai: deltaFosB vaidmuo. „Philos Trans R Soc London B Biolo Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid .: 18640924
  3. Žiūrėti straipsnį
  4. PubMed / NCBI
  5. "Google Scholar"
  6. Žiūrėti straipsnį
  7. PubMed / NCBI
  8. "Google Scholar"
  9. Žiūrėti straipsnį
  10. PubMed / NCBI
  11. "Google Scholar"
  12. Žiūrėti straipsnį
  13. PubMed / NCBI
  14. "Google Scholar"
  15. Žiūrėti straipsnį
  16. PubMed / NCBI
  17. "Google Scholar"
  18. Žiūrėti straipsnį
  19. PubMed / NCBI
  20. "Google Scholar"
  21. Žiūrėti straipsnį
  22. PubMed / NCBI
  23. "Google Scholar"
  24. Žiūrėti straipsnį
  25. PubMed / NCBI
  26. "Google Scholar"
  27. Žiūrėti straipsnį
  28. PubMed / NCBI
  29. "Google Scholar"
  30. Žiūrėti straipsnį
  31. PubMed / NCBI
  32. "Google Scholar"
  33. Žiūrėti straipsnį
  34. PubMed / NCBI
  35. "Google Scholar"
  36. Žiūrėti straipsnį
  37. PubMed / NCBI
  38. "Google Scholar"
  39. Žiūrėti straipsnį
  40. PubMed / NCBI
  41. "Google Scholar"
  42. Žiūrėti straipsnį
  43. PubMed / NCBI
  44. "Google Scholar"
  45. Žiūrėti straipsnį
  46. PubMed / NCBI
  47. "Google Scholar"
  48. Žiūrėti straipsnį
  49. PubMed / NCBI
  50. "Google Scholar"
  51. Žiūrėti straipsnį
  52. PubMed / NCBI
  53. "Google Scholar"
  54. Žiūrėti straipsnį
  55. PubMed / NCBI
  56. "Google Scholar"
  57. Žiūrėti straipsnį
  58. PubMed / NCBI
  59. "Google Scholar"
  60. Žiūrėti straipsnį
  61. PubMed / NCBI
  62. "Google Scholar"
  63. Žiūrėti straipsnį
  64. PubMed / NCBI
  65. "Google Scholar"
  66. Žiūrėti straipsnį
  67. PubMed / NCBI
  68. "Google Scholar"
  69. Žiūrėti straipsnį
  70. PubMed / NCBI
  71. "Google Scholar"
  72. Žiūrėti straipsnį
  73. PubMed / NCBI
  74. "Google Scholar"
  75. Žiūrėti straipsnį
  76. PubMed / NCBI
  77. "Google Scholar"
  78. Žiūrėti straipsnį
  79. PubMed / NCBI
  80. "Google Scholar"
  81. Žiūrėti straipsnį
  82. PubMed / NCBI
  83. "Google Scholar"
  84. Žiūrėti straipsnį
  85. PubMed / NCBI
  86. "Google Scholar"
  87. Žiūrėti straipsnį
  88. PubMed / NCBI
  89. "Google Scholar"
  90. 3. „Hope BT“, „Nye HE“, „Kelz MB“, „Self DW“, „Iadarola MJ“, „Nakabeppu Y“ ir kt. (1994) Ilgalaikio AP-1 komplekso, sudaryto iš pakitusių į fosą panašių baltymų, indukcija smegenyse lėtiniu kokainu ir kitais lėtiniais gydymo būdais. „Neuron 13“: 1235 – 1244. pmid .: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutantinės pelės: Lėtinio su kokoso Fos baltymų indukcijos praradimas ir padidėjęs jautrumas kokaino psichomotorui ir naudingam poveikiui. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ΔFosB stabilumo reguliavimas fosforilinant. „J Neurosci 26“: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A ir kt. (2007) Konservuoto C-galinio degrono domeno nebuvimas prisideda prie ΔFosB unikalaus stabilumo. „Eur J Neurosci 25“: 3009 – 3019. pmid .: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M ir kt. (2013) Elgesio ir struktūrinėms reakcijoms į lėtinį kokainą reikalinga pirmyn nukreipta kilpa, kurioje yra ΔFosB ir CaMKII branduolio akumuliatoriaus apvalkale. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid .: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM ir kt. (1999) Transkripcijos faktoriaus ΔFosB ekspresija smegenyse kontroliuoja jautrumą kokainui. Gamta 401: 272 – 276. pmid .: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB sustiprina kokaino paskatą. „J Neurosci 23“: 2488 – 2493. pmid .: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003). CREB ir DFosB kontroliuoja genų ekspresiją ir atlygį už kokainą. „Nat Neurosci 11“: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB ir kt. (2006) ΔFosB: Esminis ΔFosB vaidmuo branduolyje kaupiasi veikiant morfinui. Gamtos „Neurosci 9“: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. „Peakman MC“, „Colby C“, „Perrotti LI“, „Tekumalla P“, „Carle T“, „Ulery P“ ir kt. (2003) Dėl indukuojamos, smegenų srities specifinės dominuojančio neigiamo c-Jun mutanto išraiška transgeninėse pelėse sumažina jautrumą kokainui. „Brain Res 970“: 73 – 86. pmid .: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y ir kt. (1995) Delta FosB ir į FosB panašių baltymų reguliavimas atliekant elektrokonvulsinius traukulius ir gydymą kokainu. „Mol Pharmacol 48“: 880 – 889. pmid .: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marekas G. J., Brownas J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA ir kt. (1998) Esminis fosB geno vaidmuo atliekant elektrokonvulsinių traukulių molekulinius, ląstelinius ir elgesio veiksmus. „J Neurosci 18“: 6952 – 6962. pmid .: 9712664
  102. 15. Perezo-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP parkinsonizmą lydi nuolatinė D-FosB tipo baltymo ekspresija dopaminerginiuose keliuose. „Mol Brain Res 53“: 41 – 52. pmid .: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Eukariotinių transkripcijos inhibitorių pavertimas aktyvatoriais. Ląstelė 55: 443 – 446. pmid .: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. „Chien CT“, „Bartel PL“, „Sternglanz R“, laukai S (1991). Dviejų hibridų sistema: metodas baltymams, kurie sąveikauja su dominančiu baltymu, identifikuoti ir klonuoti. „Proc Natl Acad Sci USA“ 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Ramiųjų Rat-1A ląstelių proliferacinis aktyvavimas delta FosB. „Mol Cell Biol 13“: 4157 – 4166. pmid .: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH ir kt. (2014) Esminis poli (ADP-ribosil) amino rūgšties vaidmuo kokaino veikime. „Proc Natl Acad Sci USA“ 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid .: 24449909
  107. 20. „Perrotti LI“, „Weaver RR“, „Robison B“, „Renthal W“, „Maze I“, „Yazdani S“ ir kt. (2008) Skiriami ΔFosB indukcijos smegenyse modeliai, vartojantys narkotikus. Sinapsė 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid .: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) žinduolio Sug1 ir „c-Fos“ branduolio 26S proteasomoje. „Proc Natl Acad Sci USA“ 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S ir kt. (2008) 19S proteasominės ATPazės Sug1 pagrindinio II klasės histokompatibilumo komplekso proksimalų acetilinimo reguliavimas. „Mol Cell Biol 28“: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid .: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, XuS, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB surišantis baltymas kontroliuoja atsaką į kokainą, acetilindamas histonus fosB promotoriuje pelės striatumoje. „Proc Natl Acad Sci USA“ 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT ir kt. (2005) Chromatino rekonstravimas yra pagrindinis mechanizmas, pagrindžiantis kokaino sukeltą plastiškumą striatumoje. „Neuron 48“: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dvigubos transkripcijos reguliatorių funkcijos: mitas ar tikrovė. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Protezomos 26S subvienetų sąveika, sudėtinga problema. „Biochem Sci 25“ tendencijos: 83 – 88. pmid .: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) ubiquitin / proteasome sistemos taikymas myc-reguliuojamoje transkripcijoje. Ląstelių ciklas 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) ubikvitinas ir proteasomos transkripcijoje. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid .: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasomas: naudinga priemonė transkripcijai? „Curr Op Genet Dev 16“: 197 – 202. pmid .: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Filogenetiškai konservuoto Sug1 CAD šeimos nario, kuris yra skirtingai išreikštas pelės nervų sistemoje, identifikavimas. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5