Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Paskelbta internete balandžio 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neurologijos
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a ir Shigetada Nakanishia,1
Šis straipsnis buvo minimas kiti PMC straipsniai.
Reikšmė
Dopamino (DA) neuronai ventralinio tegmentalioje zonoje (VTA) reaguoja į aversinius stimulus, dažniausiai pasitaikančius triukšmą. Neaišku, ar ši reakcija tiesiogiai sukelia aversinius atsakus elgdamasis peles. Mes išnagrinėjome šį klausimą optogenetiniu būdu valdant DA neuronus VTA ir nustatėme, kad DA neuronų inaktyvavimas sukėlė aversinį atsaką ir mokymąsi. Buvo laikoma, kad pagrindiniai VTA DA neuronų branduoliai (NAc) yra atsakingi už šį atsakymą, todėl ištyrėme, kurie iš pagrindinių NAc būdų buvo svarbūs šiam elgesiui, naudojant D1 arba D2 receptorių blokavimą, ir nustatė, kad D2 receptorių specifinis kelias buvo labai svarbus šiam elgesiui.
Abstraktus
Dopamino (DA) perdavimas iš ventralinio tegmentalio srities (VTA) yra labai svarbus kontroliuojant tiek naudingą, tiek aversinį elgesį. Laikinasis DA neuronų slopinimas yra vienas iš atsakymų į aversyvius dirgiklius, tačiau jos pasekmės ir nervų mechanizmai, susiję su aversiniais atsakymais ir mokymusi, iš esmės išliko sunkūs. Čia mes pranešame, kad VTA DA neuronų optogenetinis inaktyvavimas greitai sumažino reguliuojamą DA lygį ir sukėlė neuroninio aktyvumo reguliavimą branduolių accumbens (NAc) pagal Fos išraišką. Tjo optogenetinis DA neuronų šaudymo slopinimas iš karto sukėlė aversiškus atsakymus į anksčiau pageidaujamą tamsų kambarį ir privertė mokytis link optogeniškai kondicionuotos vietos. Svarbu tai, kad ši vietinė pasipiktinimas buvo panaikinta dopamino D2 receptorių nuleidimu, bet ne DKNUMX receptorių, gautų NAc, pagalba.. Taigi DA neuronų slopinimas VTA buvo būtinas norint sukelti aversinius atsakymus ir mokytis per dopamino D2 receptorius NAc.
Mesolimbinė dopaminerginė sistema ne tik atlieka svarbų vaidmenį daugelyje motyvacijos ir mokymosi (1-3), tačiau jos disfunkcija taip pat buvo susijusi su sunkiais neuropsichiatriniais sutrikimais, pavyzdžiui, Parkinsono liga, šizofrenija ir narkomanija. Dopamino (DA) neuronai ventralinio tegmentalo srityje (VTA) reaguoja į atlygį skatinančius stimulus faziniu šaudymu, o pagrindinė šio šaudymo funkcija yra teoriškai koduojama „atlygio prognozavimo klaida“, vertės skirtumo tarp numatomo atlygio ir faktinis atlygis (4). Priešingai nei atsakas į atlygį skatinančius dirgiklius, jų reakcijos į aversinius stimulus toli gražu nėra homologinės; ty kai kurie DA neuronai yra aktyvuojami reaguojant į aversinius stimulus, o dauguma kitų reaguoja laikinai slopindami jų šaudymą (5-9). Iš tiesų, naujausi tyrimai parodė, kad GABAerginių neuronų aktyvinimas ir dėl to atsirandantis DA neuronų inaktyvavimas slopina atlygio vartojimą ir sukelia aversinį atsaką (10, 11). Tačiau jis iš esmės liko nenusakomas dėl to, kokie neuronų grandinių mechanizmai yra būtini norint įgyti aversyvų mokymąsi po to, kai VTA inaktyvuoja DA neuronus ir kaip elgsenos atsakai yra kontroliuojami siekiant užkirsti kelią atlygio vartojimui ir sukelti aversyvų elgesį.
Sukaupti įrodymai atskleidė, kad motyvacinį ir pažintinį mokymąsi, reaguojant į teigiamus ir neigiamus stimulus, daugiausia reguliuoja nervų grandinės, įskaitant bazines ganglijas (12), kurie gauna daug dopaminerginės projekcijos iš vidurio smegenų. Strijuje dvi pagrindinės neuroninės grandinės susideda iš nurodytų vidutinio dydžio smailių neuronų (MSNs), kurių kiekvienas išreiškia atskirą DA receptorių tipą (13).
- Viena grandinė yra tiesioginis kelias, kurį sudaro MSN, tiesiogiai nukreipiantys į bazinių ganglijų išėjimo branduolius, materia nigra pars reticulata (SNr), ir daugiausia išreiškiantys dopamino D1 receptorius (D1R).
- Kitas yra netiesioginis kelias, kurį sudaro netiesiogiai per globus pallidus į SNr projektuojantys MSN ir pirmiausia išreiškia dopamino D2 receptorius (D2R).
DA signalai iš vidurinės smegenų dinamiškai moduliuoja šiuos du lygiagrečius kelius priešingu būdu per D1R ir D2R, o šis moduliavimas turėtų palengvinti motyvacinį mokymąsi (3, 14).
- Kalbant apie atlygį skatinančius dirgiklius, D1R aktyvuoja ir todėl dažniausiai palengvina tiesioginį kelią branduoliuose accumbens (NAc)..
- Kita vertus, DA neuronų šaudymo slopinimas reaguojant į aversinius dirgiklius mažina DA lygius NAc; ir ši reakcija turėtų konkrečiai skatinti signalo perdavimą netiesioginiame kelyje per aktyvuotus D2R.
Nors tyrimai, naudojant farmakologines strategijas ir grįžtamąjį neurotransmisijos blokavimo (RNB) metodą, palaikė šį reguliavimo mechanizmą NAc (15, 16), liko nežinoma, ar DA neuronų šaudymo slopinimas yra pakankamas netiesioginio kelio aktyvumui skatinti, o paskui sukelia vengimo elgesį. Šiame tyrime šį klausimą nagrinėjome selektyviai inaktyvuodami DA neuronus VTA optogenetiniu būdu manipuliuodami membranos hiperpolarizuojančiu Arch baltymu (17) ir aiškiai parodė, kad DA neuronų slopinimas VTA vėliau sumažino DA koncentraciją NAc ir sukėlė aversinę reakciją ir mokymąsi. Be to, ištyrėme šios reakcijos reguliavimo mechanizmus ir atskleidėme, kad šią aversinę reakciją specialiai kontroliavo D2R NAc.
rezultatai
DA Neuronų optogenetinė inaktyvacija blokuoja tamsiai kambario pirmenybę.
Norėdami selektyviai inaktyvuoti DA neuronų deginimą, mes įšvirkštėme Cre-indukuojamą adeno susietą virusinį konstruktą, koduojantį Arch-eGFP [AAV-dvigubo pluošto apverstas atviras skaitymo rėmelis (DIO) -Arch] (17) vienašališkai į suaugusiųjų tirozino hidroksilazės (TH) -Cre pelių VTA (18) ir laukinio tipo (WT) kraikas ir įdėti optinį pluoštą virš VTA (S1 A ir C). Po dviejų savaičių po operacijos „Arch-eGFP“ buvo ribotai aptikta VTA (S1B). Mes išbandėme Arch baltymo hiperpolarizuojamąjį poveikį elektrofiziologiniu įrašymu ir išmatuoti AAV-DIO-Arch sušvirkštų TH-Cre pelių VTA optinės stimuliacijos poveikį. Iš anestezuotų TH-Cre pelių VTA elektrofiziologiniai įrašai in vivo parodė, kad galimų DA neuronų optinis stimuliavimas slopino jų degimą (S2), nurodant, kad optinė stimuliacija pakankamai hiperpolarizavo Arch-ekspresuojančių DA ląstelių membranos potencialą ir taip slopino jų spontanišką degimą.
Naudodamiesi šiomis pelėmis, mes toliau ištyrėme, ar DA neuronų optinis inaktyvavimas VTA gali būti aversinis signalas elgesio mokymuisi. Pelės turi įgimtą polinkį tamsioje aplinkoje (19). Mes sukūrėme elgsenos aparatą, kuriame pelės galėtų laisvai ištirti tamsų kambarį ir atidaryti šviesią erdvę (Pav 1A). Po pripratimo WT pelės išliko tamsiame kambaryje su optine stimuliacija tamsioje patalpoje arba be jos (S1D), užtikrinant, kad pati optinė stimuliacija neturėjo įtakos jų tamsiai kambario elgesiui. Suplanavome gyvūnų elgsenos eksperimentą, kad išbandytume DA neuronų optinio inaktyvavimo poveikį jų elgesiui (S1E). Po pripratimo ir pretestų pelės buvo kondicionuojamos optiniu būdu stimuliuojant DA neuronus VTA, kai jie liko tamsoje patalpoje. Net ir pirmojo kondicionavimo 5 min. Metu TH-Cre pelės išliko iš anksčiau pageidaujamos tamsios patalpos ir vengė tamsios patalpos visą kondicionavimą (Pav 1B). TH-Cre pelės nesukėlė jų vengimo prieš tamsų kambarį, net jei jie neoptimaliai stimuliavo posttestą (Pav 1C). Šie duomenys rodo, kad DA neuronų hiperpolarizacija ne tik sukėlė trumpalaikį aversyvų elgesį, bet ir buvo signalas aversyviam mokymuisi prieš tamsų kambarį ir taip pat parodė, kad DA neuronų inaktyvavimas turėjo priežastinį vaidmenį tiek trumpalaikiame aversiškame elgesyje, tiek ilgai trunkančiame mokyme.
Optogenetinis DA lygių reguliavimas NAc.
Toliau ištyrėme, ar DA neuronų inaktyvacija VTA iš tikrųjų pakeitė DA koncentraciją savo pagrindiniame nukreipimo regione, NAc. ND matavome DA lygius greitai nuskaitytais cikliniais voltammetrais (FSCV) anestezuotose TH-Cre pelėse, kurios buvo injekuotos su AAV-DIO-Arch į savo VTA. DA koncentracija NAc buvo greitai padidinta VTA elektrine stimuliacija, o sukeltas DA išskyrimas buvo žymiai sumažintas tuo pačiu metu optinės VTA stimuliacijos būdu.S3). Tada ištyrėme, ar VTA optinė stimuliacija gali sumažinti toninį DA lygį NAc. Tuose pačiuose eksperimentiniuose nustatymuose pastebėjome, kad DA lygmuo NAc buvo laikinai sumažintas VTA optinės stimuliacijos 20 s (Pav 2), kuris atitinka FSCV reakciją prieš aversinius stimulus (20). Šie duomenys rodo, kad VTA optinė stimuliacija buvo pakankamai veiksminga, kad VTA DA neuronus inaktyvuotų ir sumažintų DA lygį NAc elgesio eksperimento metu.
Foso genų ekspresijos reguliavimas optiniu inaktyvavimu DA neuronuose VTA.
Elgesio pokyčiai, atsiradę dėl sąlyginio DA neuronų inaktyvacijos VTA, parodė, kad optinė stimuliacija tiesiogiai pakeitė nervinį aktyvumą ir lėmė elgesio veikimo perėjimą. Taigi mes toliau tyrinėjome regionus, kuriuose neuroninis aktyvumas buvo pakeltas sąlyginio DA neuronų inaktyvavimu, išnagrinėjant tiesioginio ankstyvojo geno Fos ekspresiją. Netrukus po to, kai tamsoje patalpoje buvo atliktas kondicionavimas, pelės greitai apdorojamos siekiant nustatyti Fos ekspresijos kiekį kiekybiškai in situ hibridizacijos analizėje (Pav 3 ir S4). NAc, regionas, gaunantis didelį kiekį dopaminerginių projekcijų iš VTA, parodė žymiai padidėjusį Fos ekspresijos kiekį TH-Cre pelėse (Pav 3). Šis reguliavimas taip pat buvo aptiktas optinės stimuliacijos priešingoje pusėje, kurią tariamai sukėlė nedidelis viruso infekcijos kiekis į tą pusę. Tačiau aukštyn reguliavimas buvo daug didesnis ipsilaterinėje pusėje, nei opozicinės stimuliacijos priešingoje pusėje, o tai rodo, kad DA neuronų optinis inaktyvavimas tiesiogiai pakoregavo NAc neuroninį aktyvumą. Padidėjusi Fos ekspresija taip pat buvo pastebėta ir kituose smegenų regionuose, įskaitant pertvarą, striatumo periventrikulinius regionus, bazolaterinę amygdalą (BLA) ir šoninę hipotalamiją, bet ne šoniniame habenuloje ar medialiniame prefrontaliniame žieve (mPFC; S4). Šie rezultatai rodo, kad regionai, aktyvuoti DA neuronų optiniu inaktyvavimu, neapsiribojo tiesioginiais VTA DA neuronų tiksliniais regionais, bet buvo įtraukti regionai, kurie gali būti netiesiogiai aktyvuoti priklausomai nuo neuronų grandinės. Šis stebėjimas rodo, kad DA neuronų optinis inaktyvavimas pakeitė grandinės pločio neuronų aktyvumą ir gali ne tik sukelti aversinę reakciją, bet ir sukelti keletą kitų smegenų funkcijų, tokių kaip nerimas, baimė ir streso atsakas (21).
DA signalizacija per D2R yra svarbi Optogenetiškai sukeltai kondicionavimui.
Dauguma VTA dopaminerginių signalų perduodami NAN MSN per DA receptorius, D1R ir D2R. D1R yra beveik išskirtinai ekspresuojamas P P (koduojama Tac1 geno), išskiriančio MSN, ir D2R daugiausia yra ekspresuojamas enkefalinu (koduotu Penk genas), išskiriantį MSN; kiekvienas MSN tipas yra atitinkamai tiesioginis ir netiesioginis NAc kelias (3). Kadangi D2R (nM tvarka) afinitetas DA yra daug didesnis nei D1R (µM tvarka) (22, 23), manoma, kad DA lygių sumažėjimas sukelia G inaktyvavimąisujungtas D2R, bet neturi pastebimo poveikio D1R (3, 24), tokiu būdu reguliuojant neuroninį aktyvumą konkrečiai netiesioginiame kelyje. Be to, „Fos“ aktyvinimas buvo labiau pastebimas „Penk“ arba „Drd2“ (D2R) ekspresuojančiose ląstelėse nei Tac1- arba Drd1a (D1R) išskiriančiose ląstelėse (S5). Remdamiesi šiais stebėjimais, mes hipotetizavome, kad DA signalizacija per D2R galėtų atlikti svarbų vaidmenį stebimame aversiniame kondicionavime.
Norėdami išbandyti šią hipotezę, atlikome trijų kamerų kondicionuojamo vietos vengimo (CPA) testą (S6). Parengėme elgsenos aparatą, kuriame buvo dvi kameros su beveik identiškomis aplinkybėmis ir vienas mažas koridorius. Ši nešališka aplinkos būklė CPA bandyme leido mums toliau tirti, ar VTA DA neuronų inaktyvavimas gali sukelti aversinę reakciją ir mokymąsi, o ne užblokuoti tamsią kambario pasirinkimą. Kai gyvūnams buvo leista laisvai judėti visame aparate, dauguma jų liko dviejose kamerose be jokio tipiško elgesio skirtumo prieš bandymą. Tada optinis kondicionavimas buvo atliktas suporuojant optinę stimuliaciją su viena fiksuota kamera. Net ir tada, kai kondicionavimui buvo naudojama viena iš kamerų, TH-Cre pelės nuolat ir labai išvengė buvimo optiškai kondicionuotoje kameroje kondicionavimo metu ir po bandymo (S6 B-E). Statistinė analizė patvirtino reikšmingą TH-Cre pelių buvimo laiko sumažėjimą optiniu būdu kondicionuojamoje kameroje po bandymo, palyginti su WT pelių buvimo laiku (S6F).
Tada bandėme nustatyti DA receptorių potipius, susijusius su šiuo aversyviu elgesiu, specialiai slopindami kiekvieną DA receptorių (Pav 4 ir S7). Mes suprojektavome ir patvirtinome lentiviralinius vektorius, turinčius trumpą plaukų žnyplės RNR (shRNA), būdingą kiekvienam DA receptoriui, su konstitucine mCherry ekspresija. Praėjus trims savaitėms po to, kai į veną buvo įšvirkšta lentivirusinė medžiaga, patikima mCherry išraiška buvo lokalizuota NAc (Pav 4B). Efektyvus kiekvieno receptoriaus mRNR ekspresijos išjungimas buvo patvirtintas kiekybine realaus laiko PCR analize (S7 pav.A). Be to, matuojant baltymų kiekį per Western blotą, nustatyta, kad kiekvienos lentiviruso injekcijos selektyviai sumažino savo tikslinį baltymų produktą, nepaveikdamos kito DA receptoriaus potipio ekspresijos (Pav 4C ir S7 B-G). ShD1R ir shD2R ekspresuojantys lentivirus sumažino jų tikslinio baltymo lygį atitinkamai 46.2 ± 1.1% ir 38.4 ± 4.9%, lyginant su kontrolinio viruso lygiu (Pav 4C). Šie rezultatai patvirtino, kad lentiviraliniai vektoriai, ekspresuojantys D1R ir D2R specifines shRNA, selektyviai ir pakankamai slopino jų tikslines RNR ir sumažino atitinkamų baltymų produktų kiekį. Mes taip pat patvirtinome, kad VTA neaptikta mCherry viruso sukeltos ekspresijos, neįskaitant galimybės, kad lentivirusinis tarpininkaujamas shRNA tiesiogiai paveikė VTA.
Naudodami šiuos lentivirus, turinčius šRNR, išbandėme, kokio tipo DA receptorius buvo atsakingas už aversyvų elgesį, kurį sukelia DA neuronų optogenetinis inaktyvavimas. Į dvišalę NAc kartu su AAV-DIO-Arch į THR Cre pelių kairiąją VTA įšvirkštėme shRNA turinčią lentivirusą arba kontroliuojame virusą. Optinis pluoštas taip pat buvo įterptas virš VTA (Pav 4A). Kai trijų kamerų CPA bandymas buvo atliktas praėjus trims savaitėms po operacijos, TH-Cre pelėms, švirkščiamoms lenti: shD1R-mCherry, vis dar buvo aiškios CPA prieš optinę stimuliaciją suporuotą kamerą, palyginamą su TH-Cre pelėmis, suleistomis su kontroliuoti lentivirusą (lenti: mCherry). Priešingai, TH-Cre pelės, švirkščiamos lenti: shD2R-mCherry neparodė aiškios CPA kondicionavimo metu (Pav 4D). Išskirtinis TH-Cre pelių, švirkščiamų lenti, mokymosi deficitas: shD2R-mCherry buvo dar labiau pagrįstas aversyvaus mokymosi posttest analize (Pav 4E). Šie rezultatai rodo, kad DA neuronų inaktyvacijos sąlygota vieta, kuriai būdingas elgesys, buvo išskirtinai sukeltas per D2R, o ne per D1R, NAc.
Diskusija
Striatume tyrimai parodė, kad GsD1R palengvina jo šaudymą, o G aktyvinimasisujungtas D2R rezultatas slopina degimo efektyvumą (25). Acatsižvelgiant į DA receptorių ekspresijos specifiškumą, DA neuronų faziniai šaudymai dažniausiai aktyvuoja tiesioginį kelią per D1R, tuo tarpu trumpalaikis DA neuronų šaudymo sumažėjimas daugiausia skatina netiesioginio kelio kompetenciją per D2R (3, 26). Remiantis šiuo reguliavimo mechanizmu, buvo pasiūlyta, kad DA neuronų atsilikimas reaguojant į aversinius stimulus daugiausia apdorojamas per netiesioginį kelią ir sukelia aversyvų elgesį (3). Naujausi tyrimai parodė, kad netiesioginio kelio sinapsinio perdavimo blokavimas trukdo įveikti aversinį elgesį, kurį sukelia elektros smūgis (15) ir kad šis sutrikimas atsirado dėl D2R tarpininkaujančio signalo perdavimo slopinimo (16). Be to, optinis D2R ekspresuojančių MSN reguliavimas netiesioginiame kelyje sukelia elgesio vengimą (27). Tačiau, kadangi DA neuronai parodo ir sustiprintus, ir slopinančius šaudymus, reaguojant į aversinius stimulus, ir todėl, kad smegenyse vienu metu apdorojama kita su šokais susijusi sensorinė informacija, dar reikia išsiaiškinti, ar DA neuronų nutildymas gali tiesiogiai sukelti aversinę reakciją ir mokymąsi, ir ar ši reakcija yra reguliuojama per D2R ekspresuojančius MSN netiesioginiame kelyje.
Šiame tyrime naudojome DA neuronų šaudymo optogenetinę kontrolę dviejuose elgsenos testuose: tamsos kambario pirmenybės teste ir trijų kamerų CPA bandyme. Mūsų optogenetinė manipuliacija parodė veiksmingą DA neuronų šaudymo slopinimą VTA ir DA lygių reguliavimą NAc. Tikslus DA neuronų šaudymo optogenetinis inaktyvavimas tik tuo laikotarpiu, kai gyvūnai pasiliko kondicionuotoje kameroje, aiškiai sukėlė aversyvią reakciją ir mokymąsi, parodydami, kad trumpalaikis DA slopinimas tiesiogiai sukėlė pasyvų vengimą. Be to, šis tyrimas parodė, kad D2R tarpininkaujamas signalo apdorojimas yra pagrindinis veiksnys, skatinantis šią aversinę reakciją ir mokymąsi.
Nors mūsų duomenys parodė, kad D1R neturėjo jokio poveikio elgsenos eksperimentams, kad sukeltų CPA, keli tyrimai parodė, kad DA neuronų fazinis šaudymas reikalingas baimės atsakams ir aversiniam mokymuisi (28, 29). Šis skirtumas yra dėl eksperimentinio nustatymo; ty, mūsų optinis požiūris neleido signalizuoti per aktyvuotus DA neuronus sukelti aversyvų elgesį, nurodant, kad inaktyvavus DA neuronus buvo pakankamas aversyvaus elgesio ir mokymosi skatinimui. Aktyvuoto DA šaudymo, kurį sukelia aversyvūs dirgikliai, funkcija ir signalo apdorojimas turėtų skirtingą indėlį į aversyvų elgesį iš čia studijuojamų ir ateityje.
DA neuronai taip pat projektuoja daugelį kitų regionų, įskaitant mPFC, amygdala ir hipokampus. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad optogenetinis šoninių habenulų neuronų aktyvavimas, nukreipiantis į DA neuronus VTA, gali sukelti aversyvų elgesį, ir šie DA neuronai daugiausia ir konkrečiai nukreipti į mPFC (30), nors jų optogenetinis gydymas buvo kitoks nei dabartiniame tyrime, nes jų optogenetinė stimuliacija buvo pratęsta visai kondicionavimo sesijai. Kadangi buvo pranešta, kad dopaminerginis įėjimas į mPFC aktyvuojamas ne tik aversiniais stimulais, bet ir lėtiniu stresu (31, 32), yra įmanoma, kad jų nuolatinis mPFC-projektuojančių DA neuronų aktyvavimas būtų suvokiamas kaip signalai iš labai įtemptos aplinkos; ir dėl to, kad susikaupė įtemptas kondicionavimas, gyvūnai elgtųsi su kondicionuotu kameru. Priešingai, mes slopinome DA neuronų deginimą tik tuo metu, kai gyvūnai liko kondicionuotoje kameroje. Mūsų elgsenos eksperimentų, naudojant laikui pritaikytą kondicionavimą, rezultatai parodė, kad staigus DA signalo slopinimas būtų suvokiamas kaip staigus aversinis įvesties rezultatas, dėl kurio greitai reagavo į aversą.
DA neuronai taip pat projektuojasi į amygdalą, regioną, kuris labai prisideda prie baimės atsako. Iš tiesų, DA signalizacija amygdaloje buvo susijusi su baimės atsaku ir baimės atminties įgijimu (33, 34). Savo tyrime DA neuronų žymėjimas VTA nustatė DA neuronų, nukreiptų į BLA, rinkinį, tačiau šių projekcijų apimtis buvo daug mažesnė nei prognozuojama NAC. Nors negalėjome atmesti subtilaus amygdala prognozuojamo DA signalo poveikio mūsų stebėtam aversiniam elgesiui, pagrindinis mūsų neuronų optogenetinio inaktyvavimo poveikis turėtų būti NAc, nes mūsų eksperimentai su konkrečiu D2R išjungimu NAc labai sumažėjo aversyvus elgesys. Ateityje atliekami tyrimai, susiję su konkrečiu DA signalizavimu, yra reikalingi norint išsiaiškinti grandinių pločio DA neuronų poveikį aversiniams stimulams ir baimės kondicionavimui.
Medžiagos ir metodai
Dalykai.
Tirozino hidroksilazė :: IRES-Cre (TH-Cre) pelės (EM: 00254) (18) buvo gauti iš Europos pelės mutantų archyvo. Visi eksperimentiniai gyvūnai buvo perkelti į C57BL / 6J padermę daugiau nei 10 kartoms. Pelės buvo poruotos su C57BL / 6J WT pelėmis ir laikomos standartiniame 12-h šviesos / 12-h tamsiame cikle, o maistas ir vanduo buvo ad libitum. Cre+ ir Cre- Eksperimentams buvo naudojamos pelės iš tų pačių vadų (3 – 6 mo amžiaus). Visi bandymai su gyvūnais buvo patvirtinti Osaka Bioscience instituto gyvūnų tyrimo komitete pagal bandymus su gyvūnais.
Elgesio bandymai.
Visų elgesio bandymų metu pelės buvo sujungtos su optiniu pluoštu ir leido judėti visame aparate. Pelių judėjimas buvo stebimas taip, kad jie galėtų judėti be jokių kliūčių, net kai jie buvo sujungti su optiniu pluoštu ant galvos. Pelės padėtis buvo aptikta vaizdo kameroje, kuri buvo sustabdyta per elgesio aparatą ir analizuojama pagal užsakymą pagal programą „Labview“.
Tamsiai kambario pirmenybės testas.
Testui pritaikytas pagal užsakymą pagamintas elgesio aparatas sudarytas iš tamsios patalpos (15 × 9.5 cm) ir ryškios atviros erdvės (15 × 11 cm). Tamsoje patalpoje buvo sienų, grindų ir stogo, kurie visi buvo nudažyti juodomis spalvomis ir įėję (4.5 cm ilgio) į atvirą šviesią erdvę. Atviras ryškus plotas buvo suformuotas kaip elipsė ir turėjo metalo grotelių grindis ir skaidrias sienas be stogo. Prieš bandymą visos pelės buvo prijungtos prie 10 min aparate. Testą sudarė trys sesijos: ankstyvoje 1 dienos pusėje (pretest: 5 min) pelėms buvo leista ištirti visą aparatą. Nuo 1 dienos pabaigos iki 4 dienos (iš viso: 35 min), pelės gavo optinę stimuliaciją, kai jie liko tamsoje patalpoje. 5 dieną tamsiai kambario pirmenybė buvo išbandyta be optinės stimuliacijos (posttest: 5 min; S1E).
Trijų kamerų CPA bandymas.
Tyrime naudojamas trijų kamerų kondicionavimo vietos pasirinkimo / CPA aparatas sudarytas iš dviejų kamerų (10 × 17 cm) ir jungiamojo koridoriaus. Testą sudarė trys sesijos. 1 diena (pretest: 15 min): Pelėms buvo leista laisvai tyrinėti visą aparatą. Pelės, kurios vienoje kameroje liko 1.5 kartus ilgiau, nei kitos, nebuvo įtrauktos į bandymą. Dienos 2 ir 3 (kondicionavimas: kiekvienas 15 min.): Pelės gavo optinę stimuliaciją, kai jie liko šviesos poroje. Šviesos poros kameros pasirinkimas buvo subalansuotas. 4 diena (posttest: 15 min): Bandymas buvo atliktas tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir bandymo metu (S6A).
Kondicionavimo sesijoje optinė stimuliacija buvo sustabdyta 30 s, kai pelės tamsoje patalpoje arba šviesos poroje palaikė per 30 s, kad būtų išvengta perkaitimo. Visuose elgsenos testuose lazerio galia buvo valdoma maždaug 5 mW optinio pluošto gale.
„Vivo“ greito nuskaitymo ciklinis voltammetrija.
FSCV eksperimentai buvo atlikti taikant ankstesniuose tyrimuose aprašytą metodą (35-37). Pelės anestezuotos ketamino / ksilazino mišiniu, kaip aprašyta SI medžiagos ir metodai ir dedami į stereotaksinį rėmą. Arti ekspresuojančius DA neuronus stimuliuojantis optinis pluoštas buvo netoli stimuliuojančio elektrodo. Tuomet stimuliuojantis optrodas buvo įdėtas į VTA (iš bregmos: priekinės, užpakalinės, −3.2 mm; šoninės, 0.5 mm ir nugaros – ventralinės, 3.5 mm) ir nuleistas 0.25 mm intervalais. Anglies pluošto mikroelektrodas (300 µm ilgio) voltammetriniam įrašymui buvo nuleistas į NAc (iš bregmos: priekinis-galinis, 1.0 mm; šoninis, 1.0 mm ir nugaros – ventralinis, 3.5 mm). Voltammetriniai matavimai buvo atliekami kiekvieną 100 ms, naudojant anglies pluošto mikroelektrodą taikant trikampio bangą (–0.4 V į + 1.3 V –0.4 V, palyginti su Ag / AgCl, 400 V / s). Vėjo formos izoliacijai ir srovės stiprinimui buvo naudojamas pagal užsakymą pagamintas potenciostatas. DA išsiskyrimą sukėlė DA neuronų elektrinis stimuliavimas, naudojant 24 impulso stimuliavimą (100 µA, 5 ms trukmė, 30 Hz). 532 s pradedant 5 s prieš elektrinę stimuliaciją pradėta taikyti DA neuronų optinė stimuliacija (10 nm, ∼5 mW galia pluošto antgalyje). Anglies pluošto mikroelektrodai buvo kalibruoti tirpale su žinomomis DA koncentracijomis (0.2 µM, 0.5 µM ir 1.0 µM). Visi voltammetrijos duomenys buvo analizuojami pagal užsakymą pagal programas „Labview“ ir „Matlab“. DA lygių sumažinimas optinės stimuliacijos būdu buvo išspręstas pagrindinės sudedamosios dalies analize, naudojant DA bangos formas, gautas iš elektrinių VTA stimuliacijų atskiriant dopamino signalus (35, 36).
Statistinė analizė.
Statistinė analizė atlikta naudojant „GraphPad PRISM 5.0“ („GraphPad“ programinę įrangą). Duomenys buvo analizuojami kartojant ANOVA (Fig. 1B, , 4D,4Dir S6 D ir E) arba vienpusis ANOVA (Fig. 1C, , 3D,3D, 4 C ir Eir Fig. S4 K-M, S6Fir S7A) ir post hoc analizės buvo atliktos naudojant Bonferroni testą. Visi ženklai / stulpeliai ir juostos buvo atitinkamai vidutiniai ir ± SEM.
Kitos eksperimentinės procedūros, įskaitant viruso paruošimą ir injekciją, elektrofiziologinį įrašymą ir imunohistocheminę bei mRNR analizę, yra išsamiai aprašytos SI medžiagos ir metodai.
Padėka
Dėkojame E. Boydenui už Archo konstrukciją, R. Matsui už techninę konsultaciją lentivirusų gamybos ir valymo srityje, Y. Hayashi techninės konsultacijos duomenų analizės programavimo klausimais. Šį darbą remia Švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir mokslo ministerijos „Research Grants-in-Aid 22220005“ (į SN), 23120011 (į SY ir SN), 24700339 (į TD) ir 25871080 (į SY). Japonijos technologija ir „Takeda Science Foundation“ (SN) subsidija.
Išnašos
Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.
Šiame straipsnyje pateikiama papildoma informacija internete www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Nuorodos
;