Dopaminas pagyvina atlygį, skatindamas pojūčių sukeltą sužadinimą branduoliuose (2014)

Įvadas

Dopamino projekcija iš ventralinio tegmentalio zonos (VTA) į NAc yra esminė neuroninės grandinės sudedamoji dalis, skatinanti atlygį ieškantį elgesį (Nicola, 2007). Jei NAc dopamino funkcija sumažinama eksperimentiškai, gyvūnai mažiau linkę gauti atlygį (Salamone ir Correa, 2012) ir dažnai nesugeba atsakyti į atlygio ir nuspėjamojo \ tDi Ciano et al., 2001; Yun ir kt., 2004; Nicola, 2007, 2010; Saunders ir Robinson, 2012). Šie trūkumai atsiranda dėl tam tikro atlygio ieškojimo komponento sutrikimo: padidėja vėlavimo pradėti požiūrį elgesys, o požiūrio greitis, gebėjimas surasti tikslą ir atlikti būtiną operacinį elgesį, reikalingą norint gauti atlygį, ir gebėjimą nekenkia atlygiui (Nicola, 2010). Dopaminas turi skatinti požiūrį, įtakodamas NAc neuronų aktyvumą, tačiau šios įtakos pobūdis lieka neaiškus. Didelė dalis NAc neuronų yra susijaudinęs arba slopinamas už atlygį nuspėjamų užuominų (Nicola ir kt., 2004a; Roitman ir kt., 2005; Ambroggi ir kt., 2008, 2011; McGinty ir kt., 2013), ir sužadinimai prasideda prieš prasidedant paplitęs požiūris į elgesį ir prognozuoja vėlavimą pradėti judėjimą (McGinty ir kt., 2013). Todėl ši veikla turi savybių, reikalingų nuo dopamino priklausomam signalui, skatinančiam nukreiptą požiūrį, tačiau ar tai daroma, nežinoma.

Dviejų struktūrų neuronai, kurie siunčia glutamaterginius aferentus į NAc, BLA ir nugaros medialinį PFC (Brog ir kt., 1993), jaudina atlygį nuspėjantys signalai (Schoenbaum ir kt., 1998; Ambroggi ir kt., 2008), ir grįžtamasis bet kurios iš šių struktūrų inaktyvavimas (Ambroggi ir kt., 2008; Ishikawa ir kt., 2008) arba VTA (Yun ir kt., 2004) sumažina užuominų sukeltų sužadinimo mastą NAc. Šie stebėjimai rodo, kad NAc užuominų sukeltus sužadinimus skatina glutamaterginiai įėjimai, tačiau be NAc dopamino net ir šių stiprių sužadinimo įėjimų nepakanka, kad padidėtų signalų sukeltas šūvis. Tačiau ši išvada menka. Daugelį NAc neuronų slopina signalai (Nicola ir kt., 2004a; Ambroggi ir kt., 2011) ir nežinoma, ar sužadinimas ar slopinimas yra svarbesni norint suaktyvinti artėjimo elgesį. Be to, VTA inaktyvavimas gali sumažinti diskriminacinio dirgiklio (DS) sukeltą sužadinimą keliais nuo dopamino nepriklausomais mechanizmais: sumažėjusiu užuominų kodavimu BLA ir PFC, kurie gauna projekcijas iš VTA.Swanson, 1982); sumažintas GABAerginių VTA neuronų, kurie projektuojasi į NAc, deginimas (Van Bockstaele ir Pickel, 1995); arba sumažėjęs glutamato išsiskyrimas iš dopaminerginių neuronų (Stuber ir kt., 2010). Galiausiai, kadangi VTA inaktyvavimas sumažina ne tik NAc DS sukeltą šaudymą, bet ir DS sukeltą artėjimo elgesį (Yun ir kt., 2004), DS sužadinimas gali būti antraeilis, o ne būtina kryptingo judėjimo sąlyga.

Norėdami tiesiogiai patikrinti NAc dopamino vaidmenį šaudant signalais, sukūrėme naują zondą, skirtą naudoti besielgiantiems graužikams: centrinę injekcijos kaniulę supančią apskritą elektrodų masyvą, leidžiantį vienu metu registruoti vieneto šaudymo aktyvumą ir dopamino receptorių antagonistų infuziją. į tarpląstelinę erdvę, supančią įrašytus neuronus (du Hoffmann ir kt., 2011 m). Šis susitarimas leidžia nustatyti sąsajas tarp dopamino receptorių aktyvavimo, NAc neuronų uždegimo ir atlygio siekiančio elgesio: jei NAc dopamino receptorių blokada slopina ir užuominų sukeltus signalus, ir metodo inicijavimą, tai būtų tvirtas įrodymas, kad neuronų atsakas priklauso nuo endogeninio dopamino ir kad šis signalas reikalingas artėjančiam elgesiui.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnai.

Penkiolika Long-Evan žiurkių patinų (275–300 g atvykus) buvo paimta iš Charles River ir laikomi atskirai. Praėjus savaitei po jų atvykimo, žiurkės buvo laikomos keletą minučių kasdien 3 dienas, kad jos priprastų prie eksperimentuotojo. Po pripratimo žiurkėms buvo skirta ribota dieta – 13 g žiurkių maisto per dieną. Ad libitum maistas buvo tiekiamas 7 dienas po operacijos, po kurios gyvūnams vėl buvo taikoma ribota dieta. Gyvūnų procedūros atitiko Nacionalinių sveikatos institutų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą ir buvo patvirtintos Alberto Einšteino medicinos koledžo institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto.

Operacinės kameros.

Visi elgesio eksperimentai ir elgesio treniruotės vyko pagal užsakymą pagamintose plexiglas kamerose (40 cm kvadrato, 60 cm aukščio). Jie buvo metalinėse spintose, kurios tarnavo kaip Faradėjaus narvai; spintelės buvo išklotos akustinėmis putomis, o baltas triukšmas buvo nuolat leidžiamas per tam skirtą garsiakalbį, kad būtų sumažintas išorinio triukšmo girdėjimas kameroje. Operacinės kameros buvo aprūpintos atlygio talpykla vienoje sienoje su ištraukiamomis svirtimis abiejose jos pusėse. Indo įėjimo ir išėjimo laikui išmatuoti buvo naudojamas fotospindulys per priekinę talpyklos dalį. Elgsenos kontrolės sistemos (Med Associates) laiko skiriamoji geba buvo 1 ms.

DS užduotis.

Gyvūnai buvo mokomi atlikti DS užduotį pagal procedūras, panašias į tas, kurios buvo naudojamos anksčiau (Nicola ir kt., 2004a,b; Ambroggi ir kt., 2008, 2011; Nicola, 2010; McGinty ir kt., 2013). Du užuominos buvo pateiktos po vieną: atlygį nuspėjantis DS arba neutralus stimulas (NS). Garsinius signalus sudarė sirenos tonas (kurio dažnis keitėsi nuo 4 iki 8 kHz per 400 ms) ir pertraukiamas signalas (6 kHz tonas įjungtas 40 ms, išjungtas 50 ms); tam tikro tono priskyrimas DS arba NS buvo atsitiktinai suskirstytas žiurkėms. Intertrial intervalai (ITI) buvo pasirinkti atsitiktinai iš sutrumpinto eksponentinės pasiskirstymo, kurio vidurkis yra 30 s ir daugiausia 150 s. NS visada buvo pateikiama 10 s; svirties paspaudimai NS metu buvo užfiksuoti, bet neturėjo užprogramuotų pasekmių. „Aktyvios“ ir „neaktyvios“ svirtys buvo atsitiktinai priskirtos kiekvienos žiurkės kairiajai ir dešiniajai svirtims treniruotės pradžioje ir vėliau nesikeitė. Svirties atsakas į aktyvią svirtį DS metu nutraukė signalą, o pirmasis paskesnis talpyklos įvedimas sukėlė 10 % sacharozės atlygį į talpykloje esantį šulinį. DS pristatymai, kurių metu gyvūnas nereagavo, buvo nutraukti po 10 s. Atsakymai ITI metu (tarp užuominų pateikimų) ir atsakymai ant neaktyvios svirties buvo įrašyti, tačiau už juos nebuvo suteiktas atlygis. Gyvūnai buvo mokomi atlikti DS užduotį, kol jie reagavo į > 80% DS ir <20% NS per 2 valandų treniruotes.

Kanuliuotų mikroelektrodų matricos.

Po pradinio mokymo žiurkėms buvo implantuotos kaniuliuotos mikrogardelės, susidedančios iš aštuonių volframo mikrolaidų elektrodų, supančių centrinę mikroinjekcijos kreipiamąją kaniulę. Jie buvo sukonstruoti ir sumontuoti pagal užsakymą pagamintuose mikro diskuose, kaip aprašyta anksčiau (du Hoffmann ir kt., 2011 m). Visiškai sukant pagal laikrodžio rodyklę varomojo sraigto elektrodai ir kaniulė buvo perkelta į ventraliai 300 μm (be zondų sukimosi), todėl galėjome įrašyti iš kelių unikalių to paties gyvūno neuronų populiacijų.

Norint implantuoti kaniulių matricas, žiurkės buvo paruoštos operacijai ir įdėtos į stereotaksinį instrumentą, kaip aprašyta anksčiau (du Hoffmann ir kt., 2011 m; McGinty ir kt., 2013). Anestezija buvo sukelta ir palaikoma izofluranu (0.5–3%). Gyvūnai gavo antibiotiką (Baytril) prieš pat operaciją ir 24 valandas po operacijos. Kanaliuotos matricos buvo implantuotos abipusiai į nugaros NAc šerdį (1.4, 1.5 mm priekyje ir 6.5, 1 mm į šoną nuo bregmos ir 10, XNUMX mm į vidurį nuo kaukolės). Elektrodai ir mikropavaros buvo pritvirtinti prie kaukolės kauliniais varžtais ir dantų akrilu, o į kreipiamąsias kaniules buvo įkišti vieliniai obturatoriai taip, kad obturatorių galai būtų lygūs su kreipiamųjų kaniulių galais. Po operacijos galvos oda buvo gydoma Neo-Predef, kad būtų išvengta infekcijos, o gyvūnams buvo leista XNUMX savaitę pasveikti prieš pradedant eksperimentus. Analgezijai po operacijos gyvūnams buvo skirta XNUMX mg/kg nesteroidinio vaisto nuo uždegimo ketoprofeno.

Narkotikai.

SCH23390 ir raclopridas buvo įsigyti iš Sigma. Bandymų dienomis vaistai buvo šviežiai paruošti, ištirpinant juos 0.9% steriliame fiziologiniame tirpale. Vaistai buvo skiriami 1.1 μg SCH233390 dozėmis 0.55 μl fiziologinio tirpalo vienoje pusėje ir 6.4 μg rakloprido 0.8 μl fiziologinio tirpalo vienoje pusėje. SCH233390 ir raclopridas buvo infuzuoti atitinkamai per 12 ir 17.5 min. Bandomaisiais eksperimentais nustatėme, kad dvišalės 12 minučių trukmės racloprido infuzijos turėjo reikšmingą, bet trumpalaikį poveikį DS atsako santykiui. Taigi, norėdami pailginti poveikį, padidinome racloprido infuzijos trukmę taip, kad jo farmakologinio poveikio laikinas profilis būtų panašus į SCH23390. Per įrašymo seansą buvo atlikta tik viena dvišalė arba vienpusė injekcija (viena sesija per dieną). Visi gyvūnai gavo bent vieną dvišalę vieno antagonisto injekciją ir vieną (arba kelias) vienpuses antagonisto injekcijas. Kai kurių vienašalių antagonistų eksperimentų metu mes kartu infuzavome fiziologinį tirpalą kaip nešiklio kontrolę priešais pusrutulį, kuris gavo antagonistą.

Mikroinjekcijos ir įrašymo procedūra.

Aparatas, skirtas vienu metu mikroinjekcijai ir įrašymui, buvo aprašytas anksčiau (du Hoffmann ir kt., 2011 m). Įrašymo kabelis, vedantis iš galvos stadijos, baigėsi 24 kanalų elektriniame komutatoriuje su centrine skyle (Moog), kuris perduodavo signalus į elektrofiziologinę registravimo sistemą. Du švirkštai buvo sumontuoti viename švirkšto pompoje, esančiame už kameros; skysčių linijos iš švirkštų vedė į dviejų kanalų skysčio sukimosi mechanizmą (Instech Laboratories), sumontuotą virš komutatoriaus. Skysčių linijos nusileido nuo sukimosi per komutatoriaus angą, ėjo išilgai įrašymo kabelio ir baigėsi dviem 33 dydžio mikroinjektoriais.

Prieš įrašymo seansą mikroinjektoriai buvo užpildyti vaisto tirpalu ir įkišti į gyvūno kreipiamąsias kaniules. Mikroinjektoriaus antgaliai išsikišo 0.5, 670 mm už kreipiamųjų kaniulių, kad mikroinjektoriaus galas būtų žemiau elektrodų antgalių ir ~ XNUMX μm nuo kiekvieno elektrodo centro. Prieš užpildant vaistu, skysčio linijos ir mikroinjektoriai buvo užpildyti mineraline alyva, o alyvos ir vandens sąsajos lygis buvo pažymėtas, kad būtų lengviau. post-hoc patvirtinimas, kad vaistas buvo suleistas. Galiausiai galvos stadija buvo prijungta prie gyvūno, o skysčio linijos buvo tvirtai pritvirtintos prie įrašymo kabelio, kad mikroinjektoriai būtų vietoje visą eksperimento laiką. Taip paruoštiems gyvūnams buvo leista atlikti DS užduotį ne trumpiau kaip 45 min. pradinį laikotarpį, kurio metu buvo registruojama nervinė veikla; tada buvo nuotoliniu būdu įjungtas švirkšto pompa, kad vaistai būtų suleisti į smegenis. Sušvirkštus nereikėjo tvarkyti gyvūno ar atidaryti kameros durelių, o elgesio seansas tęsėsi nepertraukiamai pradiniu, infuzijos ir poinfuzijos laikotarpiais.

Neuroninės įtampos signalai buvo įrašyti su galvos stiprintuvu (vienetinis stiprinimas), sustiprinti 10,000 379 kartų ir suskaitmeninti naudojant komercinę aparatinę ir programinę įrangą (Plexon). Mes užfiksavome iš 38 neuronų per 15 įrašymo / injekcijos seansus 38 žiurkių. Iš 7 seansų 31 buvo atmesti dėl prasto elgesio prieš injekciją arba dėl to, kad nebuvo galima patikimai izoliuoti neuronų. Taigi, mūsų nervų analizė buvo sutelkta į 322 įrašymo / injekcijos seansą, per kuriuos įrašėme iš 12 gerai izoliuotų neuronų 150 žiurkių. Po kiekvieno įrašymo/įpurškimo seanso elektrodų masyvas turintis mikrodravas buvo pastumtas ∼ XNUMX μm (pusė mikropasukimo varžto apsisukimo), kad elektrodai būtų judinami ventraliai ir įrašytų iš naujos neuronų populiacijos. Jei buvo pastebėta nedaug neuronų (arba jų nebuvo), masyvas buvo stumiamas kas antrą dieną, kol buvo aptikti neuronai.

Analizė.

Duomenys buvo suskirstyti į laikotarpius prieš injekciją, po injekcijos ir atsigavimo laikotarpius, kurie atitinkamai buvo apibrėžti kaip 45 min. prieš antagonistų infuziją, 40 min., pradedant nuo injekcijos pabaigos, ir paskutinės 33 min (2000 s) kiekvieną seansą (kuri iš viso truko 2–3 val.). Laikotarpis po injekcijos atitinka laiką, per kurį narkotikai turi didžiausią poveikį elgsenai, kai jie švirkščiami abipusiai (Pav 1C).

 

1 pav.

Dopamino receptorių antagonistų poveikis DS metodo elgesiui. A, DS užduoties schema. B, DS (oranžinė) ir NS (mėlyna) atsako santykio mediana (taškas) ir viduriniai kvartiliai (vertikalios linijos) visų elgesio seansų laikotarpiu prieš injekciją ...

Atskirų vienetų išskyrimas buvo atliktas neprisijungus prie neprisijungusio rūšiavimo (Plexon), naudojant pagrindinių komponentų analizę. Į vėlesnes analizes buvo įtraukti tik tie įrenginiai, kurių bangos formos buvo aiškiai apibrėžtos (> 100 μV), kurios aiškiai skyrėsi nuo triukšmo lygio (<20–50 μV). Interspike intervalų pasiskirstymas ir kryžminės korrelogramos buvo naudojamos siekiant užtikrinti, kad atskiri įrenginiai būtų gerai izoliuoti vienas nuo kito ir nuo foninio triukšmo (programinė įranga „Neural Explorer“; Nex-Tech). Patvirtintų smailių laiko žymos buvo analizuojamos naudojant pasirinktines procedūras R programinės įrangos aplinkoje. Perstimulus laiko histogramos, sudarytos aplink DS ir NS, 50 ms laiko juostose, buvo naudojamos kiekybiškai įvertinti ir aptikti signalų sukeltus sužadinimus 2 paveikslaiA, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88Air And1010A – C. Norint nustatyti, ar neuronas turėjo reikšmingą DS sukeltą sužadinimą, Puasono tikimybės pasiskirstymo funkcija buvo apskaičiuota 10 s pradiniam laikotarpiui prieš kiekvieną signalą. Neuronas buvo laikomas DS sužadintu, jei jo vidutinis smailių skaičius viršijo viršutinį 99 % pasikliautinąjį bazinio šūvių dažnio pasiskirstymo intervalą vienoje ar keliose 50 ms dėžėse nuo 50 iki 200 ms po signalo pradžios. Neuronams, turintiems reikšmingą DS sukeltą sužadinimą pradiniu laikotarpiu iki injekcijos, buvo gautas vidutinis šaudymo dažnis per 50 ms binų laiką, užfiksuotą iki DS ir NS pradžios, kiekvienam periodui kiekvienoje sesijoje, o vidutinis ir mediana (Fig. 2C–E, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) buvo lyginami neuronų šaudymo dažniai. Kadangi neuronus su statistiškai aptinkamu NS sužadinimu beveik visada taip pat sužadino DS [neparodyta, bet pranešta anksčiau (Ambroggi ir kt., 2011)], išanalizavome visų neuronų, turinčių reikšmingą DS atsaką, NS atsakus. Jei nenurodyta kitaip, visi statistiniai palyginimai buvo naudojami neurono Wilcoxon reitingo sumos testai.

 

2 pav.

DS sukeltas sužadinimas numato tolesnį atlygio siekimo elgesį ir užkoduoja artumą prie svirties. A, 145 neuronų, turinčių reikšmingą sužadinimą, histogramos prieš injekciją prieš injekciją, suderintos su DS (oranžinis pėdsakas) arba NS (mėlynas pėdsakas) pradžia. ...

 

3 pav.

Neuronų pavyzdžiai rodo, kad D1 ir D2 antagonistai sumažina DS sukeltą sužadinimą. Rastrai ir atitinkamos histogramos rodo keturių skirtingų DS sužadintų neuronų, suderintų su DS pradžia, sudegimą. Duomenys yra iš paskutinių 40 bandymų prieš pat pradžią ...

 

4 pav.

Dvišalės dopamino antagonisto injekcijos poveikis užuominų sukeltam sužadinimui numato elgesio poveikį kiekvienu bandymu. A, C, Neuronų kodavimo žiurkės delsos, kad pasiektų tų pačių parodytų neuronų svirtį, analizė. ...

 

5 pav.

D1 receptorių aktyvinimas reikalingas DS sukeltam sužadinimui. A, Peri-įvykio laiko histogramos, suderintos su DS pradžia neuronams, turintiems reikšmingą DS sukeltą sužadinimą prieš injekciją. Pėdsakai ir debesys rodo vidutinį ± SEM šaudymo greitį ...

 

6 pav.

D2 receptorių aktyvinimas yra būtinas DS sukeltam sužadinimui. A, Peri-įvykio laiko histogramos, suderintos su DS atsiradimu neuronams, turintiems reikšmingą DS sukeltą sužadinimą laikotarpiu prieš racloprido injekciją. DS sukeltas sužadinimas buvo sumažintas dvišaliais ...

 

7 pav.

D1 receptorių aktyvinimas nereikalingas NS sukeltam sužadinimui. A, Peri-įvykio laiko histogramos, suderintos su NS pradžia neuronams, turintiems reikšmingą DS sukeltą sužadinimą prieš injekciją. Šios populiacijos visiškai sutampa, taigi tie patys neuronai ...

 

8 pav.

D2 receptorių aktyvinimas yra būtinas NS sukeltam sužadinimui. A, Peri-įvykio laiko histogramos, suderintos su NS pradžia neuronams, turintiems reikšmingą DS sukeltą sužadinimą prieš injekciją. NS sužadinimas sumažėjo dvišalėmis ir ipsilateralinėmis sąlygomis ...

 

10 pav.

Fiziologinio tirpalo infuzija neturi įtakos DS ar NS sukeltam sužadinimui, todėl norint palaikyti pradinį degimo greitį, nereikia aktyvuoti nei D1, nei D2 receptorių. A, fiziologinio tirpalo infuzijos metu užfiksuotas vienas DS sužadintas neuronas. Sutartys yra identiškos toms ...

Dėl 4 pav, mes nustatėme, ar dvišalės antagonisto injekcijos poveikis delsai pasiekti svirtį buvo koreliuojamas su antagonistų poveikiu DS sukelto sužadinimo dydžiui. Pirma, kiekviename tyrime apskaičiavome vidutinį šaudymo greitį nuo 100 iki 400 ms po DS pradžios visiems įrašytiems neuronams, kurie prieš dvišalę antagonistų infuziją pasižymėjo reikšmingu DS sužadinimu. Toliau kiekvienam neuronui apskaičiavome Spearmano rango koreliacijos koeficientą, lygindami DS sukelto sužadinimo dydį ir žiurkės delsą pasiekti svirtį atitinkamų bandymų metu. Šios koreliacijos buvo pavaizduotos histogramose 4 pavB,D. Į šią analizę buvo įtraukti visi DS tyrimai; jei gyvūnas nepaspaudė svirties, tam bandymui buvo priskirta 10 s (maksimali užuominos pateikimo trukmė) delsa. Mes apskaičiavome šiuos koreliacijos koeficientus prieš injekciją, kaip apibrėžta aukščiau; mes pratęsėme laikotarpį po injekcijos 1000 s, kad gautume platesnį latencijos mėginį bandymuose, kuriuose gyvūnai reagavo po dvišalės infuzijos. Norėdami įvertinti atskirų koreliacijų reikšmingumą, naudojome dviejų uodegų asimptotiką t-apytikslis, nes tikslus p reikšmė negali būti apskaičiuota, kai rango duomenyse yra lygiųjų. Tada mes panaudojome suporuotus Wilcoxon testus, kad palygintume koreliacijos koeficientų pasiskirstymo medianas prieš ir po antagonisto infuzijos.

Kadangi NAc neuronų pradinis šaudymo dažnis yra žemas, o apatinės pasikliautinojo intervalo ribos labai dažnai siekia nulį, slopinimą daug sunkiau aptikti ir kiekybiškai įvertinti nei sužadinimą. Taigi, be aukščiau aprašytos procedūros, kuri buvo naudojama sužadinimui aptikti, taip pat naudojome imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) analizę – jautresnį metodą, kad kiekybiškai įvertintume tikimybę, kad šaudymo dažnis iš eilės 50 ms laiko juostose po signalo pradžios. skyrėsi nuo šaudymo dažnio prieš 10 s. Ši analizė buvo atlikta atskirai prieš injekciją ir po injekcijos. Kiekvienai dėžei apskaičiavome plotą po ROC kreive (AUC); 0.5 AUC reikšmės nerodo jokio skirtumo nuo pirminio šaudymo, o vertės, artimesnės 0 arba 1, rodo didesnę tikimybę, kad neuronas bus atitinkamai slopinamas arba sužadintas. Siekiant nešališkai pavaizduoti postcue nervinį aktyvumą visoje įrašytų neuronų populiacijoje, buvo apskaičiuoti šaudymo dažniai ir AUC reikšmės 50 ms dėžėms; Siekiant išlyginti duomenis, dėtuvės buvo pastumtos 10 ms, kad būtų galima skaičiuoti AUC. Tada išlygintos AUC reikšmės buvo nubraižytos kaip šilumos žemėlapiai su 10 ms skiriamąja geba (kiekviena vertė atspindi AUC per kitas 50 ms) 5 paveikslaiB, , 66B, , 77B, , 88Bir And1010D,E.

Toliau kiekybiškai įvertinome, ar AUC vertės, apskaičiuotos nepersidengiančiose 50 ms dėžėse, atspindi reikšmingą šaudymo skirtumą. Kiekvienai dėžutei pirmiausia sugeneravome 10,000 0.05 įkrovos AUC reikšmių, atsitiktinai sumaišę išankstinį pradinį suaktyvinimo dažnį ir suaktyvinimo dažnį atitinkamoje postune. Tada nustatėme dvipusę tikimybę, kad tikroji AUC reikšmė buvo paimta iš įkrovos reikšmių pasiskirstymo; jei tikimybė buvo <XNUMX, mes laikėme, kad šaudymas šiukšliadėžėje labai skiriasi nuo išankstinio pradinio lygio. Galiausiai, mes suskaičiavome neuronų, kurių degimo dažnis kiekvienoje dėžėje buvo žymiai didesnis arba mažesnis už išankstinį pradinį sudegimą, skaičių ir pavaizdavome šias vertes kaip visos populiacijos dalis (Fig. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 99B,D, , 1010F,G).

 

9 pav.

Neuroninis aktyvumas, suderintas su atlygio įvedimu į talpyklą, nepaveikia ipsilateralinio ar priešingo D1 arba D2 antagonisto injekcijos. A, C, ROC AUC reikšmės apskaičiuojamos ir rodomos, kaip aprašyta 5 pavB, išskyrus tai, kad laiko juostos yra ilgesnės (200 ms) ir sulygiuotos ...

Norėdami palyginti sužadintų ar slopintų neuronų proporcijas prieš injekciją ir po injekcijos, naudojome duomenų mažinimo metodą. Pirma, mes apskaičiavome 50 ms dėžių dalį nuo 0 iki 1 s po signalo pradžios, kai kiekvienas neuronas parodė reikšmingą sužadinimą arba slopinimą. Tada palyginome šias frakcijas prieš injekciją ir po injekcijos su suporuotu Wilcoxon testu. Neuronai, kurie neparodė reikšmingos moduliacijos jokioje dėžėje tiek prieš injekciją, tiek po injekcijos, nebuvo įtraukti į šią analizę ir nebuvo įtraukti į diagramas, rodančias reikšmingų dėžučių vidutinę dalį (taškų ir ūsų diagramos kiekvienos dalies dešinėje pusėje). Fig. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 1010F,G). Ši procedūra pašalino didelės neuronų populiacijos įtaką be jokio aktyvumo skirtumo tarp lango po DS ir pradinio prieš DS; ši populiacija mažai domina, tačiau ji suteikia daug nulinių reikšmių, kurios nukreipia vidutinį reikšmingų dėžučių skaičių link 0 ir užstoja reikšmingų dėžučių dalies sumažėjimą ir padidėjimą po infuzijos.

Panašios analizės buvo atliekamos su vartojimu susijusiam padegimui, įvykusiam po įvedimo į atlygio talpyklą. Gyvūnai buvo linkę likti talpykloje ilgiau nei 5 s; todėl, norėdami užfiksuoti šiuos gana ilgus laiko intervalus, rezultatus rodome naudodami 200 ms dėžes (Pav 9). Neuronų, kurie buvo sužadinti prieš injekciją ir po injekcijos, proporcijų palyginimo laiko langas buvo nuo 0 iki 1.5 s, o slopinimų – nuo ​​0 iki 5 s; trumpesnis analizės langas buvo naudojamas sužadinimams, nes jie buvo labiau trumpalaikiai. ROC analizės buvo atliktos Alberto Einšteino medicinos koledžo didelio našumo skaičiavimo klasteryje, naudojant pROC paketą, skirtą R.

Norėdami palyginti „pagrindinį“ šaudymo dažnį, atsirandantį ne atliekant užduoties įvykius, palyginome vidutinį šaudymo greitį 10 s dėžėse prieš kiekvieną DS prieš ir po antagonistų injekcijos. Ši procedūra funkciškai prilygsta atsitiktinei bazinio šaudymo dažnio atrankai, nes DS pateikiamos beveik vienoda tikimybe bet kuriuo elgesio seanso metu. Neuronai buvo klasifikuojami kaip turintys reikšmingą DS sukeltą sužadinimą (prieš vaisto infuziją) arba ne, o tada pradiniai šūvių dažniai prieš injekciją ir po injekcijos buvo lyginami šiose grupėse su suporuotu Wilcoxon testu.Pav 10H,I). Taip pat atlikome tiesinį pritaikymą DS sužadintam neuronams ir palyginome šios linijos nuolydį su vienybės linija (nuolydis 1).

Jei buvo atlikti keli palyginimai su duomenų pogrupiais, gautais iš to paties subjekto (Fig. 2C–E, , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p vertės buvo koreguotos Bonferroni; ty, p vertė buvo padauginta iš atliekamų palyginimų skaičiaus. Pataisyta p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, jei p < 0.05. Visi pataisymai buvo atlikti su koeficientu 3, išskyrus 2 pavC–E, kuriame koeficientas buvo 2.

Vaizdo įrašų sekimas.

Eksperimentų pogrupyje žiurkės padėtis buvo matuojama naudojant viršutinę kamerą (30 kadrų per sekundę) ir kompiuterizuotą sekimo sistemą (Cineplex; Plexon). Sistema sekė x ir y dviejų skirtingų spalvų šviesos diodų, pritvirtintų prie įrašymo galvutės stadijos, padėtis. Kaip aprašyta anksčiau (McGinty ir kt., 2013), apskaičiavome centroidą, apibūdinantį centrinį tašką tarp LED padėčių kiekvienam vaizdo kadrui. Trūksta duomenų taškų iki 10 iš eilės kadrų buvo užpildyta tiesine interpoliacija; retais atvejais, kai trūko >10 kadrų, duomenys buvo atmesti. Kiekvienam vaizdo kadrui apskaičiavome atstumų tarp centroido padėties tame kadre ir laiko lange SD ± 200 ms. Šie SD matavimai sudaro to vaizdo įrašo kadro lokomotorinį indeksą (LI). Logiškai transformuoti LI buvo pasiskirstę bimodaliai, o apatinė smailė reiškė mažai judesių arba visai nejudančių epochas, o viršutinė smailė – judėjimą (Drai ir kt., 2000). Tada mes pritaikėme dvi Gauso funkcijas prie LI pasiskirstymo ir nustatėme judėjimo slenkstį kaip tašką, kuriame šios funkcijos sutampa mažiausiai.

Judesiai buvo apibrėžti kaip mažiausiai aštuoni iš eilės kadrai, kurių LI viršija lokomotorinį slenkstį. Norėdami nustatyti judėjimo pradžios laiką, analizę apribojome DS bandymais, kurių metu gyvūnas vis dar buvo signalo pradžioje, ir tada apskaičiavome delsą nuo signalo pradžios iki pirmojo kadro, kuriame LI viršijo judėjimo slenkstį (Fig. 1D – F, , 22B,D). Jei bandymo metu nebuvo matuojamas judesys, to bandymo delsa buvo apibrėžiama kaip >10 s (užuominos pateikimo trukmė, Pav 1D). Panašūs rezultatai gauti, kai tokie bandymai nebuvo įtraukti į analizę (duomenys nerodomi). Tada DS-cued judesio delsos pasiskirstymas buvo sujungtas tarp žiurkių, o medianos palygintos su Wilcoxon testu. Norėdami kiekybiškai įvertinti delsą iki maksimalaus greičio ir vidutinį svirties nukreiptų judesių greitį, naudojome visus bandymus, kurie baigėsi svirties paspaudimu, net jei žiurkė judėjo DS pradžioje (Pav 1E,F).

Histologija.

Gyvūnai buvo giliai anestezuoti Euthasol ir perfuzuoti intrakardiniu fiziologiniu tirpalu ir 4% formalinu. Nuolatinė srovė (15 μA) buvo praleidžiama per kiekvieną masyvų elektrodą ∼ 30 s, kad susidarytų pažeidimai. Smegenys buvo pašalintos ir laikomos formaline, kol buvo apdorotos. Prieš pjaustant kriostatu, smegenys buvo apsaugotos nuo šalčio, panardinant į 30% sacharozę keletą dienų. Pjūviai (50 μm) buvo nudažyti Nissl medžiagai, kad būtų galima vizualizuoti kaniulės ir elektrodų pėdsakus bei pažeidimus (Pav 11).

 

11 pav.

Histologinė antagonistų injekcijos vietų rekonstrukcija. Paveikslėlyje pavaizduotos dvi vainikinės žiurkės smegenų dalys, apimančios didžiąją dalį priekinės ir užpakalinės NAc dalies (0.8, 2.8–XNUMX, XNUMX mm priekyje nuo bregmos). Juodi taškai simbolizuoja ...

rezultatai

Mes pateikėme žiurkėms du klausos dirgiklius skirtingais intervalais, vidutiniškai 30 s: atlygį nuspėjantį DS ir NS (Pav 1A; Nicola ir kt., 2004a,b; Ambroggi ir kt., 2008, 2011; McGinty ir kt., 2013). Svirties paspaudimas DS metu nutraukė signalą, o sacharozės lašelis buvo pristatytas įėjus į atlygio talpyklą; jei gyvūnai nereagavo per 10 s, užuomina buvo nutraukta be atlygio įteikimo ir prasidėjo tarpbandinis intervalas. Atsakymai per šį intervalą ir per NS neturėjo užprogramuotų pasekmių. NS visada buvo 10 s. Dresuoti gyvūnai, kurie reagavo į daugumą DS, bet į keletą NS (Pav 1B), buvo implantuoti su kaniuliuotomis matricomis, nukreiptomis į NAc šerdį. Eksperimentų metu gyvūnai pirmą kartą atliko užduotį 45 minučių prieš injekciją, per kurią buvo registruojamas NAc nervinis aktyvumas. Tada D1 receptorių antagonistas SCH23390 arba D2/3 antagonistas raklopridas buvo infuzuojamas abipusiai arba vienpusiai į NAc; gyvūnai liko kameroje su nenumatytomis užduotimis per visą infuziją ir mažiausiai 75 minutes po jos.

Atitinka ankstesnius tyrimus (Yun ir kt., 2004; Nicola, 2010), dvišalės abiejų antagonistų infuzijos į NAc šerdį žymiai sumažino DS, į kuriuos gyvūnas reagavo, dalį (Pav 1C, tamsiai pilki pėdsakai) ir padidino delsą pradėti judėjimą, matuojant vaizdo stebėjimu seansų pogrupyje (Pav 1D, pilki brūkšniniai pėdsakai). Priešingai, vienpusės tų pačių dozių infuzijos neturėjo įtakos DS atsako santykiui (Pav 1C, šviesiai pilki pėdsakai), delsa pradėti judėjimą po DS pradžios (Pav 1D, brūkšniniai šviesiai oranžiniai pėdsakai) ir delsa pasiekti svirtį arba judėjimo greitį artėjant prie svirties (Pav 1E,F). Šie elgsenos duomenys rodo, kad NAc dopamino viename pusrutulyje pakanka elgesiui palaikyti, net jei abiejų pusrutulių D1 arba D2/3 receptorių blokada labai pablogina atsaką. Ši disociacija suteikia esminį eksperimentinį pranašumą, nes leidžia išbandyti dopamino antagonistų poveikį nervų veiklai, kai elgesys yra sutrikęs (dvišalė injekcija), o kai ne (vienpusė injekcija), taip pašalinant galimą painiavą dėl bet kokių pastebėtų pokyčių. Nervų aktyvumas po antagonistų infuzijos yra antrinis dėl elgesio pokyčių.

Mes užfiksavome iš 322 NAc neuronų per 31 įrašymo / injekcijos seansą 12 žiurkių. Maždaug 45% įrašytų neuronų buvo labai sujaudinti DS pateikimo. Šie sužadinimai pasižymėjo panašiomis savybėmis, kaip ir anksčiau (Yun ir kt., 2004; Nicola ir kt., 2004a; Ambroggi ir kt., 2011; McGinty ir kt., 2013; Morrisonas ir Nicola, 2014 m): jie buvo didesni už tuos, kuriuos sukėlė NS (Pav 2A); jie prasidėjo po trumpo delsos po signalo pradžios (∼ 120 ms) ir įvyko prieš pradedant svirties nukreiptą judėjimą (Pav 2B); ir jų dydis buvo koreliuojamas su elgesio reakcijos tikimybe, judėjimo pradžios delsa ir artumu prie svirties (McGinty ir kt., 2013; Pav 2C–E).

Dvišalė D1 arba D2/D3 antagonisto infuzija smarkiai sumažino DS sukelto sužadinimo mastą. Kaip parodyta dviejuose neuronų pavyzdžiuose (Pav 3A,C), šis poveikis buvo ryškiausias akimirksniu po infuzijos, o tai atitinka maksimalų injekcijų sukelto priartėjimo elgesio sumažėjimą (Pav 3A,C, mėlyni rastrai ir histogramos). Atsistačius elgsenos poveikiui, atsigavo ir šaudymo reakcija (Pav 3A,C, juodieji rastrai ir histogramos). Šis rezultatų modelis buvo nuoseklus visuose signalo sužadintuose neuronuose (Fig. 5A, , 66A, dvišalės histogramos ir ūsų diagramos). Patvirtindamas hipotezę, kad šie sužadinimai nustato svirties judėjimo intensyvumą, signalo sukelto sužadinimo dydis prieš injekciją numatė gyvūno delsą pasiekti svirtį (Pav 4A,C, kairėje). Po dvišalės D1 arba D2 antagonisto injekcijos šie delsos laikotarpiai buvo žymiai pasislinkę į didesnes reikšmes, dažnai tokias dideles, kad per 10 s užuominos pateikimo nebuvo jokio atsako (Pav 4A,C, kairiojo ir dešiniojo delsos skirstiniai). Stebėtina, kad nors antagonistai sumažino šūvių sukeltą šūvį, jis ir toliau numatė elgsenos reakcijos intensyvumą po injekcijos ir atsigavimo laikotarpiais (Pav 4A,C, dešinieji rastriniai brėžiniai). Šis stebėjimas rodo, kad vaisto elgsenos ir nervų poveikis buvo koreliuojamas kiekvienu bandymu: kuo didesnis dopamino antagonisto sukeltas šaudymo sumažėjimas, tuo didesnis delsimas pasiekti svirtį ir mažesnė tikimybė, kad gyvūnas išvis pasiekė svirtį.

Norėdami įvertinti šio bandymo po bandymo koreliacijos nuoseklumą, kiekvienam signalu sužadintam neuronui apskaičiavome Spearman rango koreliaciją tarp sužadinimo dydžio ir delsos paspausti svirtį. Bandymams, kurių metu nebuvo atsakymo, priskyrėme 10 s delsą; Todėl šių tyrimų delsa buvo prilyginama aukščiausiai. (Panašūs rezultatai buvo gauti, jei bandymai be DS-cued svirties atsako buvo neįtraukti į analizę; duomenys nerodomi.) Palyginę koreliacijos koeficientus laikotarpiu iki injekcijos su koreliacijos koeficientais kombinuotu laikotarpiu po injekcijos / atsigavimo, nustatėme, kad beveik visi koeficientų buvo neigiami abiem laikotarpiais. Be to, antagonistai neturėjo reikšmingo poveikio vidutiniam koeficientui arba perkėlė pasiskirstymą link dar neigiamų verčių (Pav 4B,D). Todėl ne tik signalų sužadintų neuronų populiacija patikimai prognozuoja elgesio atsako delsą, bet ir atsako latento padidėjimą, kurį sukelia antagonistas tam tikrame tyrime, tiksliai prognozuoja antagonisto poveikis signalo sukeltam sužadinimui tame bandyme. Šie rezultatai yra tvirti įrodymai, kad endogeninis dopaminas turi priežastinį vaidmenį nustatant atlygio siekiančio atsako į užuominą intensyvumą: dopaminas padidina užuominos sukeltą NAc neuronų sužadinimą, o tai savo ruožtu sukelia trumpo delsimo priartėjimą prie svirties.

Alternatyvus šių rezultatų aiškinimas yra tas, kad sumažėjęs signalų sukeltas sužadinimas yra sumažėjusio elgesio atsako pasekmė – galbūt todėl, kad sužadinimas tik seka (arba numato) elgsenos atsaką, bet nėra jo priežastinis. Jei taip būtų, antagonistų taikymas tokiu būdu, kad jie nedarytų įtakos elgesiui, neturėtų sumažinti signalų sukelto sužadinimo. Tačiau, kaip parodyta dviejuose neuronų pavyzdžiuose (Pav 3B,D), vienašalė D1 arba D2/D3 antagonisto injekcija žymiai sumažino signalo sukelto sužadinimo mastą, nors vienašalės injekcijos nepakeitė elgesio savybių. Panašūs rezultatai buvo gauti apskaičiuojant švirkšto NAc užregistruotų signalų sukeltų sužadinimo vidurkį (Fig. 5A, , 66A, Ipsilateralinės histogramos); be to, vidutiniai duomenys rodo, kad užuominų sukelti sužadinimai neuronuose, įrašyti priešingame injekcijai NAc, nebuvo paveikti (Fig. 5A, , 66A, Kontralateralinės histogramos). Siekdami atmesti galimybę, kad užuominų sukelto sužadinimo sumažėjimą identiškai injekcijoms lėmė nedideli elgesio reakcijos tikimybės skirtumai, analizę pakartojome atmetę visus bandymus, kurių metu gyvūnas nepaspaudė svirties; buvo gauti panašūs rezultatai (duomenys nerodomi; p < 0.05 tiek D1, tiek D2 antagonistams, Wilcoxon). Šie rezultatai rodo, kad antagonistų sukeltas užuominų sukelto sužadinimo sumažėjimas greičiausiai nebus sutrikusio elgesio pasekmė.

Nors laikinosios signalo sukeliamo sužadinimo savybės buvo gana panašios tarp neuronų, slopinimai po signalo pradžios buvo įvairesni, paprastai pasireiškiantys vėliau ir ne tokie stereotipiniai laiko kursai nei sužadinimas (Fig. 5B, , 66B). Todėl slopinimų (ir tam tikru mastu sužadinimo), kurių dėmesys sutelkiamas į vieną laiko langą, analizė gali praleisti didelę signalo dalį. Be to, standartiniai statistinio aptikimo metodai negali nuosekliai nustatyti mažėjimo dėl labai mažo bazinio degimo greičio, įskaitant daugelio NAc neuronų. Norėdami apeiti šias problemas, pasirinkome visapusiškesnį metodą, pagal kurį kiekybiškai įvertinome 50 ms laiko tarpsnius kiekviename įrašytame neurone ROC AUC, atspindintį skirtumą tarp šaudymo dėžėje ir išankstinės pradinės linijos. AUC verčių šilumos žemėlapiai laiko juostose, suderinti su DS pradžia (Fig. 5B, , 66B) rodo, kad DS sukelto sužadinimo sumažėjimas po dvišalių ir ipsišalių (bet ne priešingų) D1 ir D2 antagonistų injekcijų buvo ryškus beveik kiekviename signalo sužadintame neurone ir įvyko per visą sužadinimo laiką. Priešingai, slopinimas po DS pradžios nesumažėjo. Norėdami kiekybiškai įvertinti šiuos efektus, nustatėme, ar kiekviena AUC reikšmė rodo reikšmingą skirtumą nuo pradinės vertės, apskaičiavę įkrovos p vertę, atspindinčią tikimybę, kad AUC buvo paimtas iš AUC pasiskirstymo, gauto iš atsitiktinai sumaišytų pradinės linijos ir postcue bin šūvių dažnių (žr. Metodai). Kaip rodo neuronų, turinčių reikšmingą (p < 0.05) sužadinimas arba slopinimas kiekvienoje dėžėje, suderintas su DS pradžia (Fig. 5C, , 66C, kairiosios diagramos kiekviename stulpelyje), sužadinimo, bet ne slopinimo, dalis buvo sumažinta dvišalėmis ir panašiomis antagonistų injekcijomis. Šis aiškinimas buvo patvirtintas statistiškai palyginus reikšmingai sužadintų ir slopintų šiukšliadėžių proporcijas per visą 1 sekundę po DS (Fig. 5C, , 66C, taškiniai brėžiniai). Taigi, sužadinimas po DS pradžios buvo sumažintas D1 ir D2 antagonistų injekcijomis, tačiau slopinimas nebuvo.

Iš tiesų, neuronų, rodančių reikšmingą slopinimą, skaičius padidėjo po kai kurių injekcijų tipų (Fig. 5B,C, , 66B,C). Mažai tikėtina, kad šie atsirandantys slopinimai prisidėjo prie dvišalių antagonistų infuzijų elgesio poveikių, nes jie nebuvo nuoseklūs (pvz., jie atsirado po dvišalės ir priešingos, bet ne ipsilateralinės D1 antagonisto injekcijos ir po ipsilateralinės, bet ne dvišalės D2 antagonisto injekcijos) ir todėl. jie nepaaiškina antagonistų elgesio poveikio. Be to, šie vėlyvieji slopinimai buvo ryškiausi praėjus ~ 600 ms nuo DS pradžios, o tuo metu kontrolinės būklės metu maždaug 50 % elgsenos, nukreiptos į tikslą, jau buvo pradėtos (Pav 2B). Todėl mažai tikėtina, kad atsirandantys slopinimai prisidėjo prie antagonistų sukelto artėjimo pradžios delsos padidėjimo arba atsako tikimybės sumažėjimo. Įdomu tai, kad didžioji dalis atsirandančių slopinimų pasireiškė DS sužadintuose neuronuose, dažniausiai link sužadinimo pabaigos (dvišalis D1 antagonistas: 14/17 neuronų, 82 %; ipsilateralinis D2 antagonistas: 11/16 neuronų, 69 %; Fig. 5B,C, , 66B,C), atitinka galimybę, kad juos demaskavo antagonistų sukeltas sužadinimo atsako sumažėjimas ir patvirtina hipotezę, kad DS sužadintų neuronų sudegimas yra priežastinis požiūris į elgesį.

NS pristatymai, kurie retai sukeldavo svirties paspaudimo atsakymus (Pav 1B), sukėlė nedidelį, bet nuoseklų sužadinimą tuose pačiuose neuronuose, kuriuos sužadino DS (Pav 2A). Keista, kad D1 antagonistas nesumažino NS sukeltų sužadinimo nei pagal dydį (Pav 7A) arba sužadintų neuronų skaičiumi (Pav 7B,C). Priešingai, D2 antagonisto injekcija sumažino NS sukeltų sužadinimo dydį ir skaičių (Pav 8). Nė vienas antagonistas nesumažino NS sukelto slopinimo (Fig. 7B,C, , 88B,C). Todėl tokiomis sąlygomis D1 receptorių aktyvinimas reikalingas, kad NAc neuronai sukeltų didelio masto sužadinimus, reaguodami į ryškius atlygį nuspėjančius dirgiklius, tuo tarpu D2 receptorių aktyvinimas reikalingas atsakant tiek į atlygį nuspėjančius, tiek į neutralius dirgiklius.

Apsvarstėme galimybę, kad sumažėjęs atlygio siekimo elgesys po dvišalių infuzijų galėjo atsirasti dėl nervinio proceso, susijusio su pastiprinimu arba hedoniniu atlygio apdorojimu, nutraukimo. Tokie procesai gali apimti NAc neuronų subpopuliacijas, kurios yra slopinamos arba sužadinamos vartojant sacharozę (Nicola ir kt., 2004b; Roitman ir kt., 2005; Taha ir laukai, 2005). Kadangi gyvūnai ir toliau uždirbo atlygį po vienpusės antagonistų infuzijos, galėjome nustatyti, ar neuronų aktyvumas, susijęs su atlygio vartojimu, priklausė nuo dopamino receptorių aktyvacijos. Mes ištyrėme šaudymą per 5 sekundes po to, kai gyvūnas įėjo į atlygio talpyklą, laikotarpį, per kurį atlygis paprastai vartojamas (Nicola, 2010). Naudodami ROC analizę, palyginome sudeginimą 200 ms dėžėse šiame lange su 10 s išankstine pradine linija; gautų AUC verčių karščio žemėlapiai rodo nedidelį antagonisto injekcijos poveikį tiek į vieną, tiek priešingą injekcijai (Pav 9A,C). Sužadintų ir slopintų neuronų proporcijoms antagonistai įtakos neturėjo (Pav 9B,D), tai tvirtai rodo, kad su vartojimu susiję sužadinimai ir slopinimai nepriklauso nuo dopamino. Panašūs rezultatai buvo gauti, kai atlikome tą pačią analizę naudodami 50 ms dėžes (duomenys nerodomi).

Siekdami atmesti galimybę, kad pastebėtus rezultatus lėmė koks nors kitas veiksnys, o ne antagonistas (pvz., fizinis sutrikimas, kurį sukėlė injekcija arba koks nors vaisto nešiklio komponentas), kai kuriais eksperimentais suleidome fiziologinį tirpalą. Kaip parodyta neurono pavyzdyje (Pav 10A) ir vidutiniu sužadinimo signalu sužadintuose neuronuose (Pav 10B), DS sukeltas sužadinimas nebuvo pakeistas įpurškus druskos tirpalą; NS sukeltas sužadinimas taip pat nebuvo paveiktas (Pav 10C). Be to, fiziologinio tirpalo injekcija neturėjo įtakos neuronų, turinčių reikšmingą sužadinimą ir slopinimą po DS ar NS pradžios, proporcijoms (Pav 10D–G).

Galiausiai paklausėme, ar dopamino receptorių aktyvinimas gali būti leistinas kreipiantis požiūris, nes prisideda prie pradinio NAc neuronų sudegimo greičio. Nesuderinama su šia hipoteze, nei D1, nei D2 antagonistas neturėjo reikšmingo poveikio nei DS sužadintų, nei kitų NAc neuronų pradiniam šaudymo dažniui.Pav 10H,I).

Diskusija

Šie atradimai rodo mechanizmą, pagal kurį NAc dopaminas skatina aplinkos dirgiklių sukeltą atlygio siekimo elgesį: dopamino receptorių aktyvinimas palengvina užuominų sukeltą sužadinimą, o tai savo ruožtu skatina trumpalaikį požiūrio į su atlygiu susijusius objektus inicijavimą. Šią išvadą tvirtai patvirtina pastebėjimas, kad abipusė dopamino antagonisto injekcija padidino delsą pradėti judėjimą (Pav 1D) ir sumažino signalų sukeltų sužadinimo mastą (Fig. 33​-6). Sumažėjęs signalo sukeltas sužadinimas negalėjo būti sutrikusio elgesio pasekmė, nes vienašalės injekcijos nepakeitė DS sukelto elgesio (Pav 1C – F), tačiau smarkiai sumažino DS sukeltą sužadinimą injekuotame audinyje (Fig. 3B,D, , 5,5, ,6).6). Šie sužadinimai buvo vyraujantis nervinis atsakas NAc (pasireiškia 45% užregistruotų neuronų), ir jie abu buvo prieš judėjimo pradžią.Pav 2B) ir numatomas judėjimo inicijavimo delsimas su didesniu paleidimu, kai bandymai su trumpesniu vėlavimu (Pav 2D) (McGinty ir kt., 2013; Morrisonas ir Nicola, 2014 m). Todėl užuominų sukeltas sužadinimas priklauso ir nuo dopamino, ir yra būtinas norint energingai siekti atlygio.

Mūsų rezultatai rodo, kad užuominų sukeltas sužadinimas, o ne jokia kita neuroninio aktyvumo forma NAc, greičiausiai yra svarbus signalas neuroninėje grandinėje, nustatantis į tikslą nukreiptų judesių delsą. Ši išvada išplaukia iš stebėjimo, kad antagonistai sumažino signalų sukeltą sužadinimą, nesumažindami signalų sukelto slopinimo, atlyginimo už suvartojimu susijusį šaudymą arba pradinį šūvių dažnį. Be to, bandymai, kurių metu dvišalės antagonistų injekcijos buvo veiksmingiausios mažinant sužadinimą, buvo tie, kuriuose jos sukėlė didžiausią elgesio sutrikimą (Pav 4), tvirtai prieštaraudamas galimybei, kad už elgesio poveikį buvo atsakingas koks nors kitas neaptiktas neuronų kodavimo pokytis. Todėl mūsų duomenys tvirtai sieja dopamino receptorių aktyvavimą NAc, užuominų sukelto sužadinimo mastą ir gyvūno delsą pradėti atlygio siekimą.

Ankstesnis darbas parodė, kad VTA inaktyvacija, kuri sumažino NAc signalo sukeltus sužadinimus ir slopinimą, taip pat neleido gyvūnams elgtis pagal nurodymus (Yun ir kt., 2004). Tačiau šis tyrimas nepašalino galimybės, kad šie pokyčiai buvo netiesioginis grandinės poveikis. Čia parodome, kad dopamino receptoriai, esantys įrašytuose neuronuose, yra būtini užuominų sukeltam sužadinimui, pašalinant galimybę, kad antagonistinis poveikis atsiranda dėl dopamino veikimo prieš NAc. Priešingai, nors užuominų sukeltus slopinimus sumažino VTA inaktyvacija (Yun ir kt., 2004), jų nesumažino vietinė dopamino antagonisto injekcija, todėl mažai tikėtina, kad šie slopinimai būtų tiesioginio dopamino veikimo NAc rezultatas.

D1 ir D2 antagonistų poveikis tiek DS sukeltam artėjimo elgesiui, tiek DS sukeltam šaudymui buvo nepaprastai panašus. Šie stebėjimai atitinka ilgą NAc mikroinjekcijos eksperimentų eilutę, kurioje D1 ir D2 antagonistai sukėlė beveik neatskiriamą elgesio poveikį dozėmis, panašiomis į mūsų (Hirojus ir baltas, 1991 m; Ozer ir kt., 1997 m; Koch ir kt., 2000; Eiler ir kt., 2006 m; Pezze ir kt., 2007; Lex ir Hauber, 2008; Liao, 2008 m; Nicola, 2010; Shin ir kt., 2010; Haghparast ir kt., 2012 m). Šie rezultatai kartu su kontrastu tarp antagonisto koncentracijos injekcijoje, kuri reikalinga norint stebėti poveikį (mm), ir vaistų afiniteto jų taikiniams (nm), verčia abejoti, ar vaisto poveikis yra specifinis. Nors dėl vaistų difuzijos, metabolizmo ir oksidacijos efektyvi koncentracija receptoriuose gali būti gerokai mažesnė nei suleidžiama, bendras šių procesų veiksmingumas ir trukmė nežinomi. Todėl viena formali galimybė yra ta, kad tiek elgsenos, tiek elektrofiziologinis SCH23390 ir racloprido poveikis yra abiejų vaistų, jungiančių vieną ar daugiau receptorių, kurie visiškai nesusiję su dopamino, rezultatas. Keletas veiksnių prieštarauja šiai galimybei. Signalo sukeltą požiūrį blokuoja ne tik SCH23390 ir raclopridas, bet ir plataus spektro dopamino receptorių antagonisto flupentiksolio injekcija į NAc (Di Ciano et al., 2001; Saunders ir Robinson, 2012), išjungus VTA (Yun ir kt., 2004) ir dėl NAc pažeidimo 6-hidroksidopaminu (Parkinson ir kt., 2002), kuris selektyviai naikina katecholaminergines skaidulas. Be to, dopamino reabsorbcijos blokatoriaus, D1 ar D2 receptorių agonisto arba dopamino atpalaiduojančiojo amfetamino NAc injekcija padidina tikimybę, kad bus priimtas sprendimas.Wyvell ir Berridge, 2000; Nicola ir kt., 2005; du Hoffmannas ir Nicola, 2013 m). Galiausiai, optogenetinė VTA dopamino neuronų stimuliacija (elgesys, kurį neabejotinai palaiko dopamino neuronų aktyvacija) susilpnėja į NAc įšvirkščiant SCH23390 arba raclopridą dozėmis, panašiomis į naudojamas čia (Steinberg ir kt., 2014). Sunku įsivaizduoti paprastą mechanizmą, kuris galėtų paaiškinti kiekvieną iš šių rezultatų, nenurodant, kad SCH23390 ir raclopridas blokuoja metodą, blokuodami endogeninio dopamino poveikį.

Alternatyvi galimybė yra ta, kad antagonistai jungiasi ne tik su tiksliniais receptoriais, bet ir su netaikiniais dopamino receptoriais. Esant 10 μm ar mažesnėms koncentracijoms, raklopridas neprisijungia prie D1 tipo receptorių (Hall ir kt., 1986); didesnės koncentracijos nebuvo išbandytos. Todėl raclopridas gali būti specifinis D2/D3 receptoriams net esant mm injekcijų koncentracijoms, kurias naudojame mes ir kiti, ypač atsižvelgus į difuziją, metabolizmą ir oksidaciją. Apskaičiuota, kad SCH23390 prisijungimo prie D2 tipo receptorių konstanta svyruoja nuo 1 iki 5 μm (Bourne, 2001 m; Mottola ir kt., 2002 m); nors šios vertės rodo, kad SCH23390 jungiasi su D2/D3 receptoriais įšvirkštoje koncentracijoje, funkcinis SCH23390 veiksmingumas blokuojant į D2 panašių receptorių aktyvavimą dopaminu nežinomas. Mūsų pastebėjimas, kad raclopridas sumažino NS sukeltą sužadinimą, o SCH23390 nepatvirtino idėjos, kad vaistai veikė skirtingus receptorius, tačiau galutinai neparodo jų specifiškumo. Nepaisant to, net jei vienas ar abu vaistai blokuotų abu receptorių tipus, kad sumažintų DS sukeltą sužadinimą, tai visiškai atitiktų mūsų išvadą, kad DS sukeltam sužadinimui reikia aktyvuoti bent vieną dopamino receptorių formą. Taigi, nors vaisto specifiškumo klausimas lieka neatsakytas, šis klausimas tik nežymiai susilpnina mūsų pagrindinę išvadą, kad dopaminas palengvina užuominų metodą, padidindamas užuominų sukeltą sužadinimą.

Jei iš tikrųjų vaistai veikė konkrečiai, mūsų išvados, kad D1 ir D2/D3 antagonistai sumažino signalo sukeltą šūvį daugumoje signalo sužadintų neuronų, rodo, kad šių receptorių aktyvinimas sinergiškai sukelia sužadinimą tuose pačiuose neuronuose. Kadangi D1 ir D2 receptoriai randami iš esmės atskirtose NAc neuronų populiacijose (Albin ir kt., 1989; Gerfen ir kt., 1990), didelė dalis NAc šerdies ir apvalkalo neuronų, ekspresuojančių D1 receptorius, taip pat turi D3 receptorių mRNR (Le Moine ir Bloch, 1996), kuriuos blokuoja D2 antagonistai, įskaitant raklopridą. D1 ir D3 receptorių koekspresija suteikia galimą mechanizmą, pagal kurį dopaminas gali skatinti NAc neuronų sužadinimą dėl sinergetinio poveikio, kurį blokuotų D1 arba D2/3 antagonistai.Schwartz ir kt., 1998). Kaip alternatyva (arba papildomai), sąveika tarp D1 ir D2 (ir (arba) D3) receptorių gali vykti vietinės grandinės lygiu (Goto ir Grace, 2005; Gerfen ir Surmeier, 2011). Pavyzdžiui, dopaminas veikia D1 receptorius, kad sumažintų GABA išsiskyrimą į NAc neuronus (Nicola ir Malenka, 1997 m; Hjelmstadas, 2004 m), poveikis, galintis skatinti sužadinimą kartu su D2/D3 receptorių aktyvavimu dygliuosiuose neuronuose (Hopf ir kt., 2003 m). Pažymėtina, kad šie mechanizmai teigia, kad dopaminas nežadina NAc neuronų tiesiogiai, o padidina jų jaudrumą reaguojant į glutamaterginį įvestį; taigi jie galėtų paaiškinti, kodėl užuominų sukeltus sužadinimus blokuoja ne tik dopamino antagonistai, bet ir bazolaterinės migdolinės dalies bei prefrontalinės žievės inaktyvacija.Ambroggi ir kt., 2008; Ishikawa ir kt., 2008), kurios abi siunčia glutamatergines projekcijas į NAc (Brog ir kt., 1993).

SCH23390 ir racloprido poveikio panašumai ir skirtumai gali būti dviejų kontrastingų nervinių mechanizmų, susijusių su faziniu ir toniniu dopaminu, rezultatas. Kadangi tiek D1, tiek D2/D3 antagonistai sumažino DS sukeltą sužadinimą, bet mažesnį NS sukeltą sužadinimą, atsirandantį tuose pačiuose neuronuose, sumažino tik D2/D3 antagonistas (Fig. 8, ,9),9), atrodo, kad dopaminas skatina stimulo vertės kodavimą aktyvindamas D1 receptorius, bet palengvina atsaką į visus signalus (nesvarbu, ar jie susiję su vertingu rezultatu, ar ne) per D2/D3 receptorius. Tai gali būti dėl didesnių fazinių dopamino tranzitų, kuriuos NAc sukelia atlygį nuspėjantys nei neutralūs signalai (Phillips ir kt., 2003; Roitman ir kt., 2004). Kadangi D2/3 receptoriai turi didesnį afinitetą dopaminui nei D1 receptoriai, mažų NS sukeltų dopamino tranzitų gali pakakti aktyvuoti tik D2/3 receptorius, o atlygį nuspėjantys DS gali padidinti dopamino koncentraciją iki tokio lygio, kad suaktyvėtų D1 receptoriai. (Grace, 1991).

Arba užuominų sukelto sužadinimo mastą galima reguliuoti toniku, o ne faziniu dopaminu. Tonizuojantis dopamino kiekis gali atspindėti alternatyvią neveikimo kainą (Niv et al., 2007), tokiu būdu nustatant operanto veikimo intensyvumą. Taigi, jei pasiekiamas pakankamai aukštas tonizuojantis dopamino lygis, gali suaktyvėti pakankamai dopamino receptorių, kurie palengvintų užuominų sukeltą sužadinimą ir sumažintų atlygio siekimo metodo delsą. Panašus mechanizmas taip pat gali lemti gerai žinomą NAc dopamino indėlį atliekant nenumatytas operacines užduotis, kurioms reikia didelių pastangų (Salamone ir Correa, 2012), kai dopamino sutrikimas padidina delsą artėti prie operando (Nicola, 2010). Netiesioginiai išoriniai signalai (pvz., svirties žvilgsnis) arba vidiniai ženklai (pvz., atsirandantys dėl laiko ar alkio) gali labiau paskatinti jaudinančius NAc neuronus, kai alternatyvios išlaidos ir dopamino kiekis yra aukštas.

Apibendrinant, neatsižvelgiant į specifinį farmakologinį mechanizmą, mūsų rezultatai rodo, kad NAc dopaminas skatina už atlygį ieškantį elgesį didinant NAc neuronų sužadinimą iki svarbiausių aplinkos stimulų. Šio sužadinimo mastas nustato subjekto vėlavimą inicijuoti požiūrio atsaką. Per šį mechanizmą dopaminas reguliuoja tiek kankinamo atlygio ieškojimo jėgų ir tikimybės.

Išnašos

Nuorodos