Mesolimbinės dopamino neurono stimuliacijos progresavimui iki priklausomybės (2015) pakankamumas

 

Vincent Pascoli3,Jean Terrier3,Agnès Hiver

,Christian Lüscher'Informacija apie autorių krikščionišką Liuserįhttp://www.cell.com/templates/jsp/_style2/_marlin/images/icon_email.pngRašykite autoriui Christian Lüscher

DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2015.10.017

Pabrėžia

• Dopamino neuronų savęs stimuliavimas sukelia sinaptinį plastiškumą NAc, vairavimo atkrytį

• Dopaminas yra pakankamas sukelti kompulsinį vartojimą

• Neuronai orbitofrontalinėje žievėje yra pernelyg lengvi pelėms, kurios yra atsparios bausmėms

• OFC chemogenetinis slopinimas sumažina kompulsinį savęs stimuliavimą

Santrauka

Veiksniai, lemiantys perėjimą nuo pramoginių narkotikų vartojimo prie priklausomybės, iš esmės nežinomi. Nebuvo ištirta, ar dopamino (DA) pakanka šiam procesui sukelti. Čia mes naudojame optogenetinę ventralinio tegmentalinės srities (VTA) DA neuronų savistimuliaciją, kad selektyviai imituotume priklausomybę sukeliančių vaistų apibrėžtumą. Visos pelės lengvai įgijo savęs stimuliaciją. Po kelias savaites trukusio abstinencijos, kartu su potraukiu sužadinimo aferentų į D1 receptorius ekspresuojančiuose branduolio branduolio (NAc) neuronuose, buvo pastebėtas žymės sukeltas recidyvas. Kai pelės turėjo patirti lengvą elektrinį pėdos smūgį, kad gautų stimuliaciją, vienos sustojo, o kitos atkakliai. Atsparumas bausmei buvo susijęs su padidėjusiu nervų aktyvumu orbitofrontalinėje žievėje (OFC), o chemogenetinis OFC slopinimas sumažino kompulsyvumą. Kartu šie rezultatai rodo, kad stimuliuojant VTA DA neuronus, atsiranda elgesio ir ląstelių priklausomybės požymiai, rodantys pakankamą indukciją ir ligos progresavimą.

Įvadas

Priklausomybė yra liga, kuri vystosi keliais etapais (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diagnozė nustatoma, kai rekreacinis naudojimas tampa priverstinis, išlieka nepaisant neigiamų pasekmių. Nors pagrindinė priklausomybės hipotezė teigia, kad piktnaudžiavimo narkotikai sukelia ligą, nes jie pernelyg padidina dopamino (DA) koncentraciją smegenyse, neaišku, ar šios sistemos paleidimo pakanka pereiti nuo rekreacinio naudojimo prie priklausomybės (Di Chiara ir Bassareo, 2007, Volkow ir Morales, 2015). Patvirtinantys DA hipotezės apie narkotikų stiprinimą įrodymai buvo sukaupti per kelis dešimtmečius ir priklauso nuo pradinio vaistų poveikio. Pavyzdžiui, priklausomybę sukeliantys vaistai sumažina medialinio priekinių smegenų pluošto, pluošto takų, tarp kurių, be kita ko, didėjančią DA projekciją nuo vidurinių smegenų, intrakranijinės savęs stimuliacijos (ICSS) slenkstį (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al. 1979). Farmakologiniai ir pažeidimų tyrimai nustatė mezokortikolimbinę DA sistemą kaip šios grandinės kilmę (Wise ir Bozarth, 1982). Devintojo dešimtmečio pabaigoje tiesioginis ekstraląstelinės DA koncentracijos matavimas, naudojant mikrodializę, patvirtino, kad priklausomybę sukeliantys vaistai turi bendrą savybę sukelti DA bangą (Di Chiara ir Imperato, 1980). Tai paskatino pasiūlymą dėl priklausomybę sukeliančių narkotikų mechaninės klasifikacijos (Lüscher ir Ungless, 1988).

Daug mažiau žinoma, kaip šie pradiniai narkotikų vartojimo padariniai palengvina perėjimą prie priklausomybės. Buvo apsvarstyti nuo DA nepriklausomi mechanizmai, nes priklausomybę sukeliantys vaistai turi kitų farmakologinių tikslų. Pavyzdžiui, kokainas ne tik slopina DA transporterį (DAT), bet ir jungiasi prie SERT (serotonino transporteris) ir NET (norepinefrino transporteris), kad sumažintų serotonino ir norepinefrino reabsorbciją, atitinkamai padidindamas visų pagrindinių monoaminų (Han ir Gu, 2006, Tassin, 2008). Panašūs rūpesčiai gali būti taikomi ir kitiems psichostimuliatoriams. Be to, teigiama, kad opiatai yra bent jau pradiniame etape nuo DA nepriklausomi (Badiani ir kt., 2011, Ting-A-Kee ir van der Kooy, 2012). DA hipotezė taip pat buvo ginčijama remiantis genetiniais pelių modeliais, kur, sutrikus DA sistemai, vis dar buvo akivaizdžios kai kurios narkotikų adaptacijos formos. Pvz., DAT nokautinės pelės savarankiškai vartoja kokainą (Rocha ir kt., 1998) ir panaikindamos DA sintezę nei farmakologiškai (Pettit ir kt., 1984), nei genetiškai (Hnasko ir kt., 2007), nepavyko užkirsti kelio savarankiškam narkotikų vartojimui. arba sąlyginės vietos pirmenybė. Geresnis šių transgeninių pelių apibūdinimas ir dvigubų monoamininių transporterių generavimas leido išspręsti kai kuriuos iš šių problemų (Rocha, 2003, Thomsen ir kt., 2009), tačiau DA pakankamumas sukelti kardinalius priklausomybės požymius nėra žinomas. Norėdami apeiti nespecifiškumo klausimus, mes nusprendėme leisti pelėms savarankiškai stimuliuoti VTA DA neuronus taikant optogenetinį metodą.

Naujausi tyrimai parodė, kad DA neuronų suaktyvėjimas vidurinėse smegenyse gali sukelti pirmenybę vietai (Tsai ir kt., 2009) arba sustiprinti instrumentinį elgesį (Adamantidis ir kt., 2011, Witten ir kt., 2011, Kim ir kt., 2012, Rossi ir kt., 2013, McDevitt ir kt., 2014, Ilango ir kt., 2014). Nors šis selektyvus DA takų aktyvinimas patvirtina intrakranijinės savistimuliacijos (ICSS) tyrimus, atliktus daugiau nei prieš 30 metų, apibrėžiant atlygio sistemą (Fouriezos ir kt., 1978), tačiau jie nepasiekia demonstruodami vėlyvosios stadijos adaptacinio elgesio indukciją, kuri apibrėžia priklausomybę, taip pat nenustatė pagrindinių neuronų adaptacijų. Čia mes naudojome optogenetinę manipuliaciją ne tik tam, kad galėtume tiesiogiai patikrinti fazinio DA signalizavimo pakankamumo kriterijų pradedant armatūrą, bet ir išbandyti perėjimą prie priklausomybės.

Ryškus vėlesnių ligos etapų pastebėjimas yra tas, kad net ir vartojant labiausiai priklausomybę sukeliančius vaistus, tik dalis vartotojų tampa priklausomi (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Nepaisant neigiamų pasekmių, narkomanai ir toliau vartos narkotikus (žr. Amerikos priklausomybės ligų draugijos „Priklausomybės apibrėžimas“, DSM5, Amerikos psichiatrų asociacija, 2013), paprastai susiję su socialiniais ir psichologiniais pralaimėjimais, kurie dažnai vėluoja laiku. Panašiai graužikams maždaug vienas iš penkių gyvūnų, įsigijusių kokaino, galiausiai priskiriamas priklausomiems (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; bet žr. George et al., 2014). Nepaisant neigiamų pasekmių, narkotikų vartojimo atkaklumas taip pat gali būti modifikuotas graužikams, į vartojimo grafiką įtraukiant paprastą aversinį stimulą. Nors žmogaus liga yra sudėtingesnė, bausmės susiejimas su vartojimu yra paprastas pagrindinio priklausomybės komponento modelis.

Čia naudojome švelnų pėdų šoką, kad įvertintume jo poveikį savarankiškam kokaino, sacharozės ir optogenetinės savęs stimuliacijos vartojimui. Toliau tiriame, ar DA neuronų savęs stimuliacija gali sukelti du priklausomybę sukeliančius elgesius, susijusius su naudojimu, susijusiu su vartojimu, ir kompulsyvumą, susijusį su vartojimu, nepaisant neigiamų pasekmių, ir apibūdinti su šiais elgesiais susijusį nervinį plastiškumą.

rezultatai

VTA DA Neurono savęs stimuliavimo įsigijimas

 

Norint kontroliuoti DA neuronų aktyvumą, mes įšvirkštėme Cre-indukuojamą adeno susietą virusą (AAV) su dvigubo pluošto apverstu atviru skaitymo rėmeliu (DIO), kuriame buvo „ChR2“ sulietas su sustiprintu geltonuoju fluorescuojančiu baltymu (eYFP) (Atasoy ir kt., 2008, Brown ir kt., 2010) į DAT-Cre pelių VTA. Be to, optinis pluoštas buvo skirtas nukreipti į VTA („ChR2“, Žr. Eksperimentinės procedūros). . \ T „ChR2“ ekspresija buvo patvirtinta bendrai lokalizavus eYFP su tirozino hidroksilaze (TH), fermento, reikalingo DA sintezei (figūra 1A). 

Pirma, norint nustatyti lazerio stimuliacijos protokolą, pelės buvo įdėtos į operanto dėžę, kur jos galėjo paspausti aktyvųjį svirtį, kas suveikė daugybė lazerio stimuliacijų, kurios buvo įvairios (1, 2, 8, 32, 60 arba 120 serijų). du užsiėmimai. Norėdami imituoti fazinį šaudymo modelį (Hyland ir kt., 2002, Mameli-Engvall ir kt., 2006, Zhang ir kt., 2009), paprastai sukeliamus natūralaus atlygio (Schultz, 1998), naudojome sprogimo stimuliaciją. Vieną seriją sudarė penki lazeriniai 4 ms impulsai, esant 20 Hz dažniui, ir jis buvo pakartotas du kartus per sekundę. Mes nustatėme, kad pelės pritaikė savo svirties paspaudimo elgseną kaip lazerinės stimuliacijos pliūpsnių funkciją, taip kontroliuodamos bendrą gautų serijų skaičių (figūra 1B). Šis elgesys priminė savarankiškų vaistų vartojimą, kai buvo keičiama dozė vienai infuzijai (Piazza ir kt., 2000). Vėlesniems eksperimentams pasirinkome administruoti 30 serijų per svirties paspaudimą, gaunant pusę maksimalaus serijų skaičių (figūra 1B). Norėdami imituoti DA padidėjimo vėlavimą, kuris paprastai pastebimas, kai vaistai vartojami į veną (Aragona ir kt., 2008), mes vėlavome lazerinę stimuliaciją 5 sekundėmis ir 10 sekundžių pridėjome mirksinčią užuominą (figūra 1C).

Per 12 dienų iš eilės pelėms buvo leista maksimaliai 80 kartų per 2 val. Pelės greitai padidino lazerio stimuliacijos greitį ir pasiekė 80 lazerinių stimuliacijų (LS) iki pirmosios sesijos valandos pabaigos (1 paveikslaiD ir 1E). Skirtumas tarp aktyviosios ir neaktyvios svirties buvo greitai įsigytas, o aktyvių svirčių skaičius padidėjo atitinkamai didėjant fiksuotam santykiui (FR1, 2, 3).1 paveikslaiF ir 1G). Kontroliniuose eksperimentuose, kuriuose buvo naudojamos DAT-Cre- pelės arba pelės, išreiškusios ChR2 y-aminobutirūgšties (GABA) neuronuose (GAD-Cre + pelės, nukreiptos į VTA slopinančius neuronus), savęs stimuliavimo greitis buvo mažas ir nuolat mažėjo sesijų metu. Tai taip pat taikoma dviems Cre + gyvūnams, kur post hoc patvirtinimas parodė, kad VTA nebuvo užkrėsta ChR2-eYFP (neparodyta). Be to, nebuvo aptikta aktyvios ir neaktyvios svirties diskriminacija (S1 skaičiaiA ir S1B).

Mes pastebėjome, kad DAT-Cre + pelės dažniau paspaudžiamos į aktyviąją svirtį nei reikia lazeriniam stimuliavimui. Iš tiesų tokie „beprasmiški“ aktyvios svirties paspaudimai sudarė daugiau nei 30% visų aktyvių svirčių paspaudimų (S2 paveikslasA) ir įvyko - kaip sesijos progresavo - daugiausia tarp lazdos ir lazerio stimuliacijos pradžios (S2 skaičiaiB ir S2C). Šis savitas elgesys atsirado įsigijimo metu ir gali atspindėti impulsinius atsakymus.

Apskritai, sprogimo aktyvumas VTA DA neuronuose stipriai reaguoja į svorį.

 

Kokaino VTA DA Neurono savęs stimuliavimas

Norėdami patikrinti, ar VTA DA neuronų savistimuliacija priklauso nuo tų pačių smegenų grandinių, kurias nukreipia priklausomybę sukeliantys vaistai, kad sustiprintų elgesį, prieš pat savistimuliacijos seansus švirkšdavome kokainą į pilvaplėvės ertmę (nemokama prieiga prie lazerio 45 min.). figūra 2A). Pradžioje gerai treniruoti gyvūnai spaudė maždaug 400 kartų, kad pagal FR85 tvarkaraštį per 45 minutes gautų 3 LS. Įšvirkštus kokaino, efektyvumas, priklausomai nuo dozės, žymiai sumažėjo iki maždaug 30 LS 100 svirties paspaudimų su didžiausia doze (figūra 2B). Ši okliuzija buvo ryškiausia per pirmąsias 30 sesijos minučių, atspindinčių vaisto farmakokinetiką (figūra 2C). Šis eksperimentas rodo, kad stiprinimas, naudojant optogenetinę savitą stimuliaciją ir stiprinant kokainą, sudaro pagrindines neuronų grandines.

Synaptic plastiškumas, susijęs su ieškojimu pasitraukus

Norint toliau palyginti optogenetinę savistimuliaciją su priklausomybę sukeliančiais vaistais, mes paklausėme, ar po kelių savaičių nutraukimo pelės atsinaujins po VTA DA neuronų savistimuliacijos. Kadangi su narkotikų vartojimu susijęs narkotikų ieškojimas yra nusistovėjęs atkryčio modelis (Epstein ir kt., 2006, Soria ir kt., 2008, Bossertas ir kt., 2013), peles vėl įdėjome į operanto kamerą praėjus 30 dienų po paskutinio stimuliacijos seansas, kai aktyvus svirties paspaudimas dabar sukėlė žiburio šviesą be lazerinis stimuliavimas (figūra 3A). Tvirtas bandymas, susijęs su ieškojimu, kurį parodo didelis aktyvių svirčių paspaudimų rodiklis, buvo matomas tik pelėms, turinčioms eYFP-„ChR2“ VTA DA neuronuose (DAT-Cre +, bet ne DAT-Cre-pelės, figūra 3B).

Ankstesni tyrimai parodė priežastinį ryšį tarp su ženklu susijusio atkryčio ir sinapinio plastiko, kurį sukėlė kokainas DA D1R ekspresuojančių NAc neuronų potipyje (Pascoli, Terrier et al., 2014). Todėl, norėdami įvertinti šį sinapsinį plastiškumą, mes sukūrėme DAT-Cre peles, sukryžiuotas „Drd1a-tdTomato“ pelės, kad nustatytų vidutinio dydžio smailių neuronų (MSN) potipį NAc. Vietoj ieškojimo testo buvo paruošti NAc griežinėliai, kuriuose D1R-MSN buvo raudoni, kontrastuojantys su žaliais pluoštais iš VTA DA neuronų, užkrėstų flox-ChR2-eYFP (figūra 3C). Visų ląstelių pleistrų spaustukų įrašai ex vivo atskleidė ištaisantį srovės įtampos santykį AMPAR sukeltoms postsinapsinėms srovėms (AMPAR-EPSC) ir padidėjusį AMPAR / NMDAR santykį (3 paveikslaiD3R-MSN, bet ne D1R-MSN. Panaši išvada, gauta anksčiau, atsisakius savarankiško kokaino vartojimo, parodė, kad kartu trūksta GluA2 ir AMPAR turinčių GluA2, atskirai įvedant į D2R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 1).

 

 

 

Savęs stimuliavimas nepaisant bausmės

Medžiagų naudojimas, nepaisant neigiamų pasekmių, yra anoher lemiamas priklausomybės bruožas (žr. DSM5 apibrėžimą, Amerikos psichiatrų asociacija, 2013). Nustatyti žiurkių modeliai (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), kur kokaino savęs vartojimo grafike įvestas elektros smūgis slopina kokainą kai kurių gyvūnų vartojimas. Po 12 dienų pradinio poveikio (įgijimo) pelėms buvo leista atlikti tris papildomus seansus su FR3, tačiau su mažesne seanso pertrauka (maks. 60 min. Arba 40 apdovanojimų). Šie trys seansai buvo pagrindas vėlesniems keturiems seansams, kai kas trečia lazerio stimuliacija buvo sujungta su pėdos smūgiu (500 ms; 0.2 mA), numatytu nauju ženklu (figūra 4A). Pėdos smūgio intensyvumas ir trukmė buvo pakoreguoti taip, kad visiškai atsilaisvintų svirtį, kad būtų užtikrintas sacharozės atlygis (taip pat žr. Toliau pateiktus duomenis). Bausmės grafikas lėmė du priešingus elgesio atsakymus (figūra 4B). Kai kurios pelės greitai nustojo reaguoti, kai buvo įvesta bausmė (vadinama „jautria“), tuo tarpu kitos toliau reagavo, kad gautų didžiausią lazerinių stimuliacijų skaičių, ir gali būti laikoma „atsparia“ bausmei. Dvi bausmių sesijos pabaigoje atsirado dvi gyvūnų grupės.figūra 4C). „Atsparios pelės“ išlaikė lazerinių stimuliacijų skaičių (mažesnis nei 20% sumažėjimas), o „jautrios pelės“ sumažino savęs stimuliavimą daugiau nei 80%. Šiais kriterijais negalima priskirti tik vieno gyvūno (pilkųjų taškų). Šis stebėjimas rodo, kad priverstinis sprogimo aktyvumas, kurį sukelia VTA DA neuronų savęs stimuliavimas, yra pakankamas, kad sukeltų vartojimo atkaklumą nepaisant neigiamų pasekmių pelių frakcijoje. Kaip kontrolė nepriklausomoje pelių grupėje, kuri nustatė atsparumą ar jautrumą bausmei, susijusiai su savęs stimuliacija, nocicepcija buvo vertinama naudojant uodegos plyšio tyrimą. Tarp jautrios ir atsparios karštu vandeniu nugręžtos uodegos vėlavimo skirtumo nenustatyta (S3 paveikslas).

Toliau paprašėme post hoc, ar kokia nors konkreti savęs stimuliavimo etapo savybė galėjo numatyti pasipriešinimą bausmei. Jautrios ir atsparios pelės padarė lygiavertį aktyvios ir neaktyvios svirties paspaudimų skaičių pradinės sesijos metu, ir visos pelės pasiekė didžiausią 80 LS (S4 skaičiaiA ir S4B), panašiu laiku (S4 skaičiaiA ir S4C). Nors nereikalingos aktyvios svirties spaudos dalis vėl nesiskyrė dviejose paprogramėse (4 paveikslaiD ir S4D), beprasmiškų pelių paspaudimų skaičius prieš prasidedant lazerio stimuliacijai tapo gerokai didesnis prieš įsigijimo sesijas (4 paveikslaiE ir S4E). Kai šis elgesys išsivystė įgijimo metu, jis kartu su įgimtu impulsyvumu (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014) gali prisidėti nustatant pasipriešinimą bausmėms. Be to, 11 dieną buvo atliktas progresyvaus santykio bandymas, siekiant įvertinti optogenetinės stimuliacijos motyvaciją (Richardson ir Roberts, 1996). Atsparių pelių lūžio taškas statistiškai nesiskyrė nuo jautrių pelių (S4 paveikslasF).

Kokaino atsparumas bausmei, bet ne sacharozei

Norint patikrinti, ar vartojimo paradigma, nepaisant kenksmingų pasekmių, kartu su impulsų svirties paspaudimu, taip pat gali numatyti priverstinį priklausomybę sukeliančio narkotiko vartojimą, naujai pelių grupei 12 dienų buvo skiriama kokaino. Eksperimentiniai parametrai, leidžiantys savarankiškai vartoti kokainą, buvo nustatyti iki 80 kokaino infuzijų per 4 val. Įsigijimo metu ir iki 40 infuzijų per 2 val. Per tris pradines sesijas prieš keturias bausmės sesijas (5 paveikslaiA ir S5A). Vėlgi, po kokaino atlyginimo ir elektros smūgių atsirado dvi grupės. Iš tiesų, 5 iš 22 pelių buvo klasifikuojamos kaip atsparios (mažiau nei 20% sumažėjimas nuo pradinio lygio), o 17 buvo jautrus (daugiau nei 80% sumažėjimas) ir vienas gyvūnas nukrito tarp 13 (19 infuzijos XNUMX dieną).figūra 5B). Tada ieškojome elgsenos nuspėjamų pasipriešinimo bausmėms. Tarp šių dviejų grupių infuzijų skaičius, infuzijos greitis ir aktyvių ar neaktyvių svirtų skaičius nesiskyrė (S5 skaičiaiB – S5D), o lūžio taškai buvo panašūs (S5 paveikslasE). Skirtingas buvo beprasmių paspaudimų pasiskirstymas aktyvios svirties metu. Per pirmuosius keturis užsiėmimus nereikalingų svertų presai reguliariai sumažėjo ir rezistentinėse, ir jautriose pelėse, o įsigijimo pabaigoje tik jautrios pelės išlaikė šį elgesį (5 paveikslaiC ir 5D ir S5F). Priešingai, atsparios pelės didino bendrą beprasmiškų svirtinių presų skaičių (5 paveikslaiC ir S5D), ypač paskutinį laiko tarpą (figūra 5D). Nors kokybiškai panašus į anksčiau atliktą stebėjimą, atliktą su DA neuronų optogenetine stimuliacija (žr. Aukščiau), beprasmiškų presų klasterizacija per ankstyvą laiką nebuvo pastebėta su kokainu, greičiausiai dėl lėtesnio kinetikos, kuria vaistas padidėjo DA lygis. Nepaisant to, panašios išvados gali būti padarytos remiantis tuo pačiu bereikalingo svertų spaudos pasiskirstymo evoliucija per trumpą laikotarpį prieš „vidinį DA bangos aptikimą“. Taigi mūsų pastebėjimai rodo, kad bereikalingų aktyvių svirtinių presų pasiskirstymas numato narkotikų vartojimą nepaisant neigiamų pasekmių.

Galiausiai mes pakartojome eksperimentą su ad libitum maitinamomis pelėmis, kurios galėjo paspaudžiant už sacharozės atlygį. Įvedus bausmę, visos pelės nustojo savarankiškai vartoti sacharozę (figūra 5E), parodydamas, kad šis grafikas slopino nepagrįsto natūralaus atlygio suvartojimą, bet leido nustatyti priklausomybę sukeliančio narkotiko ar stiprių DA neuronų stimuliacijos kompulsinį suvartojimą.

Kartu šie rezultatai rodo, kad VTA DA savęs stimuliacija yra pakankama, kad sukeltų kompulsyvumą, kaip rodo atsparumas bausmėms pelių pogrupyje (68%). Panašiai, po kokaino SA, kai kurios pelės tapo atsparios bausmėms (23%), kurios niekada nebuvo po sacharozės SA (figūra 5F).

 

 

 

Ląstelių koreliacija dėl atsparumo bausmėms  

Norėdami nustatyti smegenų sritį, kuri, nepaisant neigiamų pasekmių, gali kontroliuoti sprendimą išlikti savarankiškai, pirmiausia stebėjome bendrą „neuronų aktyvumą“, suskaičiavę neuronų, kuriuose bausmės sesija sukėlė greito ankstyvojo geno cFos išraišką, skaičių 15 skirtingų regionų. Pelės buvo intrakardiškai perfuzuotos PFA praėjus 90 minučių po paskutinės bausmės sesijos pabaigos. Kontrolinėse grupėse dalyvavo naivūs gyvūnai, taip pat pelės, jungiamos prie jautrių ar atsparių pelių, siekiant kontroliuoti galimą painų gautų smūgių skaičiaus poveikį.

Nors daugumoje pasirinktų regionų cFos-teigiamų neuronų skaičius buvo didžiausias nuo atsparių pelių griežinėliais, palyginti su naivų pelių griežinėliais, atsirado dviejų tipų atsakai, iš kurių pavyzdys yra prelimbinė žievė (PL) ir šoninė OFC. PL mes nustatėme panašų cFos teigiamų ląstelių padidėjimą rezistentinėse pelėse ir jų jungiamosiose kontrolėse, o OFC šis padidėjimas buvo matomas tik atsparioje, o ne atitinkamoje pelkėje.6 paveikslaiA ir 6B). Norint įvertinti šį skirtumą, visi duomenys buvo normalizuoti iki naivių gyvūnų ekspresijos lygio. Tada santykis buvo apskaičiuotas tarp atsparios per jautrios, padalintos iš judėjimo, kad jis būtų atsparus sukimui į jautrią (santykiscfos = (R / S) / (YR / YS), figūra 6B). Ši procedūra nustatė cingulinę žievę, OFC ir VTA kaip regionus, kurie yra suaktyvinti atsparios, bet ne jautriose pelėse ir kur buvo nedaug skirtumų abiejose jungo kontrolinių grupių grupėse (iš tikrųjų panašūs mažai cFos teigiami neuronai jungoje) . Surasti VTA nenuostabu, nes tai yra lazeriu stimuliuojamų neuronų sritis. Tai atitinka ankstesnę ataskaitą, rodančią, kad ChR2 stimuliacija sukelia cFos aktyvaciją (Lobo ir kt., 2010, Van den Oever ir kt., 2013). Mažas santykiscfos buvo aptiktas regionuose, kuriuose aktyvumas buvo panašus jautriai ir atspariai (pvz., CeA ir PAG). Santykiscfos taip pat buvo nedidelis, kai aktyvinimas buvo lyginamas su dideliu skirtumu tarp išjungtų valdiklių (pvz., PL, figūra 6C apibendrintam santykiuicfos duomenys). Panašios cFos ekspresijos rezistentinėse ir sukilusiose rezistentėse pelėse greičiausiai buvo skatinamos pėdų sukrėtimų skaičiumi ir mažai susiję su atsparumu bausmei. Apskritai, didelis santykiscfos OFC rodo, kad nervų veikla šiame regione siejama su pasipriešinimu bausmei ir todėl gali skatinti perėjimą prie priklausomybės.

 

 

 

Plastiškumas atsparumui bausmei  

Norėdami nustatyti padidėjusio neuronų aktyvumo OFC pelių, priešinančių bausmę, substratą, mes paruošėme PL ir L-OFC skiltis 24 val. Po paskutinės bausmės sesijos, kad patikrintume vidinį sužadinamumą. Šie du regionai buvo pasirinkti dėl labai skirtingo c-Fos raiškos modelio ankstesniuose eksperimentuose. Neuronų jaudrumas buvo kiekybiškai įvertintas suskaičiavus veikimo potencialų (AP) skaičių, sukeltą injekuojant vis didesnius srovės kiekius (nuo 0 iki 600 pA) visos ląstelės įrašuose. Šie įrašai parodė, kad atsparių pelių PL (ir jų jungo kontrolė) piramidiniuose neuronuose yra ilgalaikis hipo sužadinimas, palyginti su jautriomis ar naiviomis pelėmis (figūra 7A). Įrašytų neuronų atminimo membranos potencialas (RMP) eksperimentinėse grupėse nesiskyrė (figūra 7B). Šie rezultatai tvirtai rodo, kad neuronų sužadinamumas PL tiesiogiai siejasi su gautų sukrėtimų skaičiumi, o galbūt ne sprendimu pasipriešinti bausmei. Tai greičiausiai atspindi neigiamą grįžtamąjį ryšį, kurį sukėlė neuronų sužadinimas, kurį anksčiau sukėlė pėdų sukrėtimai. Priešingai, L-OFC neuronai buvo labiau sužadinami tik atsparios pelės. Neuronų pelių sužadinimas nepastebėjo nei naivių pelių neuronų sužadinamumas, todėl buvo išvengta paties pėdos šoko poveikio.7 paveikslaiC ir 7D). Šis padidėjęs OFC neuronų aktyvumas greičiausiai yra cFos išraiška ir gali sukelti atsparumą bausmei.

 

Kompulsyvumo mažinimas OFC chemogenetiniu slopinimu 

Norėdami patikrinti priežastingumo ryšį tarp padidėjusio OFC neuronų sužadinimo ir atsparumo bausmėms, mes išreiškėme slopinamąjį DREADD (dizainerių receptoriai, kuriuos aktyvuoja išskirtinai dizainerių vaistai: CamKIIα-hM4D) DAT-Cre + pelių OFC piramidiniuose neuronuose (figūra 8A). Ūminiuose OFC sluoksniuose CNO (klozapino-N-oksido) vonios pritaikymas sukėlė lėtą išorinę srovę, kuri greičiausiai buvo perduodama GIRK kanalais, o tai buvo pakeista bariu (Ba2+), nespecifinis kalio kanalų blokatorius (figūra 8B). CNO taip pat perkėlė įvesties / išvesties kreivę į dešinę (figūra 8C). DAT-Cre + pelės, užkrėstos AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry OFC (figūra 8D) įgyta DA neuronų savistimuliacijos paradigma, po kurios seka du nuoseklūs blokai su bausmės grafiku, pirmasis dalyvaujant CNO, o antrasis - be CNO. Du blokai buvo nutraukti 6 dienomis be bausmės (figūra 8E). Pirmosios bausmės bloko pabaigoje, dalyvaujant CNO, tik 5 iš 16 pelių buvo atsparios (figūra 8F, kairysis skydelis). Priešingai, be OFC slopinimo, per antrąjį bausmės laikotarpį 14 iš 16 buvo klasifikuojami kaip „atsparūs“ (8 paveikslaiF, dešinysis skydelis ir 8G). Kitaip tariant, atsparių pelių frakcija buvo žymiai mažesnė, esant CNO, palyginti su pirmuoju 34 pelių, anksčiau išbandytų tomis pačiomis sąlygomis, grupe (tarp grupių palyginimas, figūra 8H) ir tapo panaši į pirmąją kohortą be CNO (grupės viduje). Galiausiai, devynioms pelėms, kurios pasikeitė nuo jautrios iki atsparios, CNO nemodifikavo uodegos sulėtėjimo latentinio įterpimo į karštą vandenį (figūra 8Aš).

Kartu šis eksperimentas parodo, kad OFC piramidinių neuronų aktyvumas skatina tęsti savęs stimuliavimą, nepaisant neigiamų pasekmių, kurios yra esminis perėjimo prie priklausomybės graužikams bruožas.

Diskusija 

Neseniai pasiūlytame priklausomybės modelyje išskiriami trys ligos progresavimo etapai: atsitiktinis pramoginių narkotikų vartojimas, paskui intensyvesnis, nuolatinis, eskaluojamas narkotikų vartojimas ir galiausiai priverstinis vartojimas, susijęs su kontrolės praradimu (Piazza ir Deroche-Gamonet, 2013; bet žr. George ir kt., 2014). Mūsų tyrimas rodo, kad VTA DA neuronų stimuliacija yra pakankama, kad ši progresija vyktų gana greitai.

Imituojant natūraliai atsirandantį sprogimo modelį, efektyvus DA išsiskyrimas yra sukeliamas tiksliniuose VTA regionuose, tokiuose kaip NAc (Bass ir kt., 2010). Todėl DA lygis NAc greičiausiai reguliuoja savistimuliaciją, taip pat, kaip graužikai patys skiria kitą kokaino ar heroino infuziją, kai DA koncentracija nukrenta žemiau slenksčio (Wise ir kt., 1995). Tai patvirtina ir mūsų pastebėjimas, kad kokainas, suleistas ip, gali užkirsti kelią savistimuliacijai. Taigi DA neuronų savistimuliacija yra labai panaši į vaisto vartojimą savarankiškai, nors jo kinetika tikrai greitesnė už bet kokią farmakologinę medžiagą, įskaitant kokainą, kaip rodo skirtingas atsako dažnis, pastebėtas šiame tyrime.

Nors mes pasirinktinai taikome VTA DA neuronus, jų optogenetinė savistimuliacija gali turėti aktyvuotų ląstelių grupių su skirtingomis fiziologinėmis funkcijomis. Pavyzdžiui, neseniai buvo pasiūlyta, kad kai kurie DA neuronai koduotų aversiškus dirgiklius (Lammel ir kt., 2012, Gunaydin ir kt., 2014). Šios ląstelės projektuoja mPFC, o VTA DA neuronai, projektuojantys šoninį NAc apvalkalą, tarpininkauja teigiamai. (Lammel ir kt., 2012). Įdomu būtų įvertinti savistimuliaciją ir progresavimą taikant selektyvų taikymą (Gunaydin ir kt., 2014). Kadangi mūsų manipuliacijos suaktyvino visus VTA DA neuronus, lygiai taip pat, kaip kokainas veikia visus DAT ekspresuojančius neuronus, galima įsivaizduoti, kad kai kurie DA neuronai skatintų mokymąsi sustiprinti, o kiti DA neuronai vengtų mokytis. Grynasis poveikis vis tiek būtų elgesio sustiprinimas; tačiau „aversijos neuronai“ galėtų prisidėti prie priešininko proceso indukcijos (Koob, 2013, Wise ir Koob, 2014).

Po priverstinio abstinencijos pakartotinis ekspozicija kontekste paskatino ieškoti savistimuliacijos - nusistovėjusio graužikų narkotikų atkryčio modelio. Pažymėtina, kad pagrindinis neuroninis plastiškumas nesiskiria nuo to, kuris pastebėtas atsisakius kokaino vartojimo savarankiškai (Pascoli, Terrier et al., 2014). Tai papildo tyrimą, kuriame anksčiau buvo pranešta apie identišką sinapsinį plastiką VTA DA neuronuose, sukeltus per vieną optinės stimuliacijos seansą arba pirmąją priklausomybę sukeliančio vaisto injekciją (Brown ir kt., 2010). Atsiranda sinaptinių adaptacijų modelis, kuris būdingas visiems priklausomybę sukeliantiems narkotikams.

Ryškus mūsų tyrimo bruožas yra dichotomija reaguojant į aversišką stimulą, kuris yra pakankamai stiprus, kad sutrikdytų nebūtino natūralaus atlygio vartojimą visiems gyvūnams. Mūsų aplinkoje atsparios pelės neparodė žymiai didesnės motyvacijos gauti atlygį savarankiškai, o tai skiriasi nuo tyrimo su žiurkėmis atliktu kokainu (Pelloux ir kt., 2007). Tačiau elgesio veiksnys, leidžiantis įvertinti pelių atsparumą bausmėms, buvo beprasmis svirties paspaudimas 5 sekundes prieš DA neuronų stimuliacijos pradžią. Nesugebėjimas laukti atlygio įteikimo gali būti vertinamas kaip impulsyvumo žymuo (Dalley ir kt., 2011, Olmstead, 2006, Everitt ir kt., 2008, Winstanley, 2011, Leyton ir Vezina, 2014). Mus suintrigavo pastebėjimas, kad impulsyvus elgesys išsivystė tik po kelių savistimuliacijos seansų. Tai kelia galimybę, kad pasipriešinimas bausmėms (ir pažeidžiamumas priklausomybei) gali būti ne visiškai įgimtas, o vystosi priklausomybės pradinėse fazėse. Jei taip yra, tada mūsų ir kitų pastebėtą dichotomiją (Deroche-Gamonet ir kt., 2004) gali lemti ne tik genetiniai veiksniai. Tai taip pat paaiškintų, kad panaši dalis asmenų tampa priklausomi nuo genetiškai santykinai homogeniškų pelių padermių ir genetiškai tikrai įvairesnių žmonių populiacijų.

Jei pasipriešinimas bausmėms atskleidžia individualų pažeidžiamumą dėl priklausomybės, kuri, manoma, viršija 20% žmonių net vartojant kokainą (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), tai čia daug didesnė dalis. galėtų atspindėti tiesioginės ir selektyvios DA neuronų stimuliacijos galią. Kitaip tariant, selektyvi DA neuronų stimuliacija gali sukelti daug daugiau priklausomybės nei bet kuris kitas vaistas. Tai galima paaiškinti neselektyviu farmakologinių medžiagų poveikiu. Pavyzdžiui, kokaino atveju kiti monoaminai, išskyrus DA, gali vėluoti sukelti priklausomybę. Iš tiesų, serotoninas gali priešintis nuo DA priklausomam adaptyviam elgesiui, tokiam kaip atsakymas už sąlyginį atlygį, savistimuliaciją ir sąlyginį vietos pasirinkimą (Wang et al., 1995, Fletcher and Korth, 1999, Fletcher et al., 2002), palengvindamas asociaciją. užuominų į averzinius dirgiklius (Bauer, 2015, Hindi Attar ir kt., 2012). Arba skirtumas gali būti kinetikos skirtumas tarp optogenetinės savistimuliacijos ir ekstraląstelinio DA padidėjimo farmakologinės indukcijos. Tokia priklausomybės ir potencijos variacija taip pat gali egzistuoti tarp skirtingų piktnaudžiavimo narkotikų (George et al., 2014).

Nors negalime formaliai atmesti DA leidimo ir (arba) santykinio signalizavimo skirtumų, kurie prisidėtų prie atsparumo bausmėms nustatymo, šis scenarijus yra mažai tikėtinas, nes į tyrimą įtrauktų gyvūnų infekcijos histologinis patvirtinimas parodė, kad „eYFP-ChR2“ išraiškos visame VTA. Be to, optogenetinis stimuliavimo protokolas, skirtas DA išskyrimui, paskatino savęs stimuliavimą, kuris baigėsi nesubalansuotomis lūžio taško vertėmis, atspindinčiomis skatinamąją motyvaciją.

Kitas stebinantis rezultatas yra tas, kad elektrinių pėdų smūgių skaičius koreliuoja su PL neuronų jaudrumu. „Priklausomoms žiurkėms“ pastebėtas sumažėjęs piramidinių neuronų jaudrumas ir padidėjęs AMPAR / NMDAR santykis tų pačių ląstelių piramidiniuose neuronuose, tačiau šie tyrimai nekontroliavo elektros smūgių poveikio per se (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz ir kt., 2013, Chen ir kt., 2013). Todėl neatsiribojimą galima paaiškinti dvigubu mPFC vaidmeniu tiek sprendimų procesuose, tiek baimės integracijoje (Peters ir kt., 2009). Ir atvirkščiai, piramidinių neuronų jaudrumo pokytis infralimbiškajame žievėje koreliuoja su smūgiais pėdomis (Santini ir kt., 2008). Šie įrodymai neatmeta galimybės, kad mPFC vaidina svarbų vaidmenį priimant sprendimą dėl suvartojimo. Tačiau mūsų cFos analizė ir vidinio sužadinimo stebėjimai rodo OFC ir cingulinę žievę. Be to, neuronų sužadinimo slopinimas OFC su DREADD apsaugojo nuo atsparumo bausmėms. Šis priežastinis ryšys yra svarbus žingsnis suprantant ląstelių mechanizmus, atsakingus už perėjimą prie priklausomybės. Ateityje reikės atlikti tyrimus, kad būtų galima patikrinti, ar tai taikoma ir visam priklausomybę sukeliančių narkotikų asortimentui.

Mūsų išvados atitinka pastebėjimus, kad OFC disfunkcija gali pakenkti sprendimų dėl naudos ir naudos priėmimui (Seo ir Lee, 2010, Walton ir kt., 2010, Fellows, 2011) ir gali paskatinti priverstinį elgesį (Burguière et al., 2013 ). Žmonėms piktnaudžiavimas narkotikais buvo siejamas su sutrikusiu sprendimų priėmimu ir pakitusia OFC funkcija (Lucantonio ir kt., 2012, Gowin ir kt., 2013). Apskritai, OFC neuronų veikla tampa pagrindiniu veiksniu, lemiančiu perėjimą prie priverstinio narkotikų vartojimo (Everitt ir kt., 2007). Tai neatmeta čia ir kituose tyrimuose pastebėto narkotikų sukelto plastiškumo vaidmens sužadinimo aferentuose ant MSN (Kasanetz et al., 2010). Bus įdomu įvertinti, ar manipuliacijos, kurių tikslas yra kontroliuoti OFC jaudrumą, turi įtakos narkomanų motyvacijai.

Siūlome DA neuronų savistimuliaciją kaip galingą modelį tirti priklausomybės stadijas. Nepaisant neigiamų pasekmių, mes atkuriame pagrindinius priklausomybės nuo narkotikų komponentus, tokius kaip recidyvas, sinapsinis plastiškumas ir vartojimo atkaklumas. Nors modelis tikrai nėra tinkamas tirti konkretaus vaisto poveikį (pvz., Palyginti opioidus su psichostimuliatoriais), jis turi keletą privalumų. Tai leidžia tiksliai kontroliuoti atlygio įteikimą laiku, jis labai specifiškai aktyvina tik VTA DA neuronus, ir paskutinis, bet ne mažiau svarbus dalykas, suteikia galimybę studijuoti peles daug ilgiau nei vartojant vaistą savarankiškai. Sutelkiant dėmesį į apibrėžiantį priklausomybę sukeliančių narkotikų bendrumą, viltis yra atskleisti nervinius mechanizmus, kuriais grindžiamos ir nuo substancijos nepriklausomos priklausomybės formos (Alavi ir kt., 2012, Robbins ir Clark, 2015) ir taip prisidėti prie bendrosios narkotikų teorijos. liga. Taigi optogenetinės ligos modeliai suteikia lemiamą žingsnį norint išsamiai suprasti neuronų disfunkciją, susijusią su vėlyvomis priklausomybės stadijomis, ir padės nustatyti naujus, racionalius ligos, kurios šiuo metu negydoma, gydymo būdus.

Autoriaus įnašai  

VP, JT ir AH atliko elgesio eksperimentus, o VP atliko elektrofiziologinius įrašus ir koordinavo analizę. Tyrimą sukūrė ir parašė visi autoriai.

Padėka  

Darbas buvo paremtas Šveicarijos nacionalinio fondo ir EMTT pažangiosios dotacijos (MeSSI), Carigest SA, Ženevos akademinės draugijos ir Ženevos fondų fondo stipendijomis. JT yra MD doktorantas, mokamas Šveicarijos Konfederacijos.

 

Papildoma informacija 

Dokumentas S1. Papildomos eksperimentinės procedūros ir paveikslai S1 – S6

Lentelė S1. Statistiniai tyrimai