Optogenetika atskleidžia, kad kokaino sukeltas elgesio jautrinimas (2) sukelia dopamino D2014 receptorius ekspresuojančius akmeninius vidutinius spygliuočius neuronus.

Eiti į:

Abstraktus

Buvo pasiūlyta ilgalaikė narkotikų sukelta adaptacija branduolio akumuliatoriuose (NAc), kad prisideda prie priklausomybės nuo narkotikų vartojimo. Čia mes panaudojome optogenetinį metodą, norėdami ištirti NAc terpės nervinius neuronus (MSN), ekspresuojančius dopamino D2 receptorius (D2Rs), įjautrinant kokainą. Adeno-susiję virusiniai vektoriai, koduojantys channelrhodopsin-2 (ChR2), buvo perduoti į D2R-Cre transgeninių pelių NAc. Tai leido selektyviai fotostimuliuoti D2R-MSN NAc. D2R-MSN sudaro vietines slopinimo grandines, nes D2R-MSN fotostimuliacija sukėlė slopinančias postsinapsines sroves (IPSC) kaimyninėse MSN. NAc D2R-MSN fotostimuliacija in vivo įtakos neturėjo nei kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos pradžia, nei jos išraiška. Tačiau fotostimuliacija nutraukus narkotikų vartojimą susilpnino kokaino sukeltos elgsenos sensibilizaciją. Šie rezultatai rodo, kad NAc D2R-MSNs vaidina pagrindinį vaidmenį nutraukiant sukeltą plastiškumą ir gali sukelti atkrytį nutraukus piktnaudžiavimą narkotikais.

Raktiniai žodžiai: optogenetika, vidutinio stiprumo neuronai, dopamino D2 receptoriai, kokainas, narkomanija

Įvadas

Dopamino (DA) signalizavimas yra susijęs su atlygio tikėjimu ir tikslu nukreiptu elgesiu (Išminčius, 2004; Goto ir Grace, 2005; Berridge 2007). Viena iš gerai žinomų dopaminerginių sutrikimų patologijų yra priklausomybė nuo narkotikų (Robinson ir Berridge, 1993, 2003). Pakartotinai veikiant priklausomybę sukeliančioms medžiagoms, molekuliniame ir ląstelių lygyje DA mezolimbiniame kelyje atsiranda adaptaciniai pokyčiai; tai gali sukelti priklausomybę nuo narkotikų, kuris yra lėtinis, pasikartojantis sutrikimas, kai, nepaisant rimtų neigiamų pasekmių, vis dar egzistuoja kompulsyvus narkotikų vartojimo ir narkotikų vartojimo elgesys (Thomas et al., 2008; Baik, 2013). Taigi mezolimbinėje dopaminerginėje sistemoje vykstančių modifikacijų apibūdinimas yra labai svarbus norint suprasti priklausomybę nuo narkotikų.

Dopamino D1 receptoriai (D1R) ir D2 receptoriai (D2R) yra stipriai ekspresuojami striatumos vidutinio smaigalio neuronuose (MSN). Buvo pasiūlyta, kad ilgalaikis vaisto sukeltas adaptacija vidurinės žarnos sąnario srityje, geriau žinomas kaip „nucleus cumbens“ (NAc), prisideda prie priklausomybės, taip pat narkotikų paieškos ir atkryčio elgesio vystymosi (Lobo ir Nestler, 2011; Smith et al., 2013). Dopaminerginiai ląstelių kūnai iš veninės pagrindinės srities daugiausia inervuoja NAc. Daugiau nei 95% ląstelių, esančių NAc, yra MSN, gaunančios sužadinamuosius duomenis iš keturių pagrindinių smegenų regionų: prefrontalinės žievės, hipokampo ventralinio subkulvio, bazolateralinės amigdalos ir thalamus (Sesack and Grace, 2010; Lüscher ir Malenka, 2011). NAN viduje esančius MSN galima suskirstyti į dvi pagrindines subpopuliacijas: tiesioginio kelio MSN, išreiškiančio D1R, ir išsikišantys tiesiai į smegenų vidurinę smegenų sritį, ir netiesioginio kelio MSN, išreiškiančio D2R, ir išsikišančio į ventrinį palidumą (Kreitzer ir Malenka, 2008; Sesack ir malonė, 2010; Lüscher ir Malenka, 2011; Smith et al., 2013). Kadangi MSN yra GABAergic, MSNs neuronų aktyvacija slopins jų pasroviui taikinius, kurie taip pat yra GABAergic (Chevalier ir Deniau, 1990). Todėl D1R-MSN aktyvinimas sužadins smegenų vidurinės smegenų dalies neuronus, o tai prisideda prie su atlygiu susijusio elgesio reguliavimo (Lüscher ir Malenka, 2011; Bocklisch ir kt. 2013).

Neseniai atlikti tyrimai su genetiškai modifikuotomis pelėmis, kurios specifiškai apibūdina Cre rekombinazę ląstelių tipui, atskleidė skirtingą D1R-MSN ir D2R-MSN vaidmenį priklausomybės nuo kokaino srityje. Tokios pelės įgalina specifinį toksinų, optogenetinių zondų ar DREADD (dizainerių receptorių, kuriuos aktyvina išskirtinai dizainerio vaistas) genetinį taikymą, selektyviai manipuliuodami D1R-MSN arba D2R-MSN. Šis požiūris lėmė tam tikrą sutarimą dėl MSN vaidmens priklausomybę sukeliančiame elgesyje: D1R-MSNs, matyt, skatina priklausomybę sukeliantį elgesį, tuo tarpu D2R-MSN nėra siūlomas joks specifinis vaidmuo (ar slopinantis vaidmuo) kuriant narkotikų sukeltą priklausomybės elgesį. (Hikida ir kt., 2010; Lobo ir kt. 2010; Ferguson ir kt. 2011; Bock ir kt. 2013). Kokaino poveikis, matyt, sukelia sinapsines modifikacijas ir genų ekspresijos pokyčius abiejose MSN populiacijose (Lobo ir kt. 2010; Lobo ir Nestleris, 2011; Grueter ir kt. 2013). Nors atrodo, kad D1R-MSN ir D2R-MSN vaidina priešingą vaidmenį priklausomybės nuo kokaino sąlygojamoje veikloje, tikslus D2R-MSN vaidmuo nėra aiškus.

Anksčiau buvo įrodyta, kad D2R nokautuotoms (KO) pelėms būdingas įprastas sensacinis kokaino sukeliamas jautrinimas ir elgesys su kokainu, o D2R nebuvimas sukelia tik nedidelį jautrumo sumažėjimą (Baik et al. 1995; Chausmer ir kt., 2002; Sim ir kt., 2013). Tačiau streso poveikis nutraukiant narkotikų vartojimą slopina kokaino sukeltos elgsenos sensibilizaciją, taip pat kokaino ieškojimo ir atkryčio elgesį D2R KO pelėse (Sim et al. 2013). Specifinis D2R sunaikinimas NAc neturi įtakos nei baziniam lokomotoriniam aktyvumui, nei kokaino sukeltai elgsenos sensibilizacijai, tačiau suteikia streso gebėjimą slopinti kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos išraišką (Sim et al., Sim. 2013). Šie duomenys tvirtai rodo, kad D2R blokada NAc nesukelia kliūčių kokaino sukeltam sensibilizacijai. Greičiau atrodo, kad NAX D2R vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant streso sukeltas sinapsines modifikacijas nutraukimo metu, dėl kurio padidėja kokaino ieškojimo ir atkryčio elgesys (Sim et al., 2013).

Čia mes panaudojome optogenetiką, norėdami toliau įvertinti NAc D2R-MSN vaidmenį kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijoje. Naudodamiesi smegenų pjūviais, mes pastebime, kad D2R-MSN fotostimuliacija suaktyvina vietines slopinamąsias grandines NAc, apimančias kaimyninius MSN. NAc D2R-MSN fotostimuliacija in vivo neturi įtakos nei kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos inicijavimui, nei raiškai. Tačiau pakartotinis NAc D2R-MSN aktyvinimas narkotikų nutraukimo laikotarpiu susilpnina kokaino sukeltą priklausomybės elgesį. Mūsų rezultatai rodo, kad NAc D2R-MSNs vaidina pagrindinį vaidmenį nutraukiant sukeltą plastiškumą ir gali sukelti atkrytį nutraukus piktnaudžiavimą narkotikais.

medžiagos ir metodai

Pelės

D2-Cre BAC transgeninės pelės C57Bl / 6 fone buvo gautos iš MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). Atlikdami elgesio eksperimentus, pakratų draugai, neturintys D2-Cre transgeno, buvo naudojami kaip D2-Cre pelių kontrolė. Pelės buvo laikomos specialiame barjeriniame patogene, kuriame nėra patogenų, esant pastovioms temperatūros ir drėgmės sąlygoms, laikantis 12-h šviesos, 12-h tamsaus grafiko. Gyvūnų priežiūra ir tvarkymas buvo vykdomas pagal Korėjos universiteto ir KIST institucinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetų patvirtintus standartus.

Viruso vektorių paruošimas

„pAAV-EF1a-DIO-hChR2“ (H134R) -EYFP-WPRE dosniai pateikė Karlas Deisserotas (Stanfordo universitetas). AAV paruošimui HEK293T ląstelės buvo auginamos DMEM terpėje su antibiotikais ir FBS. Dieną prieš transfekciją keturios plokštelės, esančios po 90% santakos iš 10-cm indų, buvo dedamos ant penkių 15-cm indų ir inkubuojamos 18 – 22 h arba iki 60 iki 70% santakos. HEK293T ląstelės buvo transfekuotos pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ ir pHelper, naudojant jetPEI transfekcijos reagentą (QBiogene). DNR / DMEM / PEI kokteilis buvo sumaišytas su virpesiu ir inkubuotas kambario temperatūroje 20 min. Po inkubacijos transfekcijos mišinys buvo dedamas į kiekvieną 15 cm indą. Transfekuotos ląstelės buvo surinktos 48 h po transfekcijos ir inkubuotos su 0.5% natrio deoksicholatu (Sigma; D6750) ir 50 vienetais / ml benzonazės nukleazės (Sigma; E1014) 37 ° C temperatūroje 1 h. Pašalinus ląstelines šiukšles centrifuguojant 3000 x g 15 min, supernatantas buvo filtruojamas per 0.45 mm PVDF filtrą (Millipore). AAV-DJ dalelių valymas buvo atliktas naudojant HiTrap heparino afiniteto kolonėles (GE Healthcare). AAV koncentracijai buvo naudojami „Amicon ultra-15“ išcentrinių filtrų blokai su 100,000 molekulinės masės riba. Koncentruotas virusas, padalintas į dalis ir užšaldytas saugojimui –80 ° C temperatūroje. Galutinė viruso koncentracija buvo 3 ~ 6 × 1012 viruso dalelių mililitre kiekviename AAV.

Stereotaksinis įpurškimas ir optinio pluošto įdėjimas

Gyvūnai buvo anestezuojami ip injekcijomis 1.6 µl Zoletil ir 0.05 µl ksilazino (Rompun, Bayer) 31 g kūno svorio ir sudedami į stereotaksinį aparatą (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Virusams švirkšti buvo naudojama 2 dydžio švirkšto adata, skirta 0 µl viruso dvišaliu būdu įpilti į NAc 1.7 ° kampu (AP +1.3; ML ± 4.5; DV −0.1) 10 ul / min greičiu. Po injekcijos adata buvo palikta vietoje 1.25 minučių, prieš ją lėtai ištraukiant. Optinio pluošto kanilę implantavimui sudarė cirkonio gaubtelis (4.5 mm skersmens ir 200 mm ilgio) ir plokščias optinio pluošto galas (2 µm skersmens). Šviesolaidinės kanulės implantavimas į NAc, siekiant apšviesti D0-MSN, buvo atliktas iškart po virusų injekcijos. Optinio pluošto kaniulės implantavimo koordinatės buvo 1.7 ° kampas (AP +1.35; ML ± 4.2; DV −3) nukreipiant NAc. Siekiant padėti inkaruoti optinį pluoštą, du sraigtai buvo pritvirtinti prie kaukolės, esančios optinio pluošto kaniulės implantacijos vietos gale. Norėdami pritvirtinti šviesolaidinę kaniulę ant kaukolės, ant kaukolės paviršiaus, esančio aplink kaniulės pagrindą, buvo uždėta „C&B Superbond“ („Sun Medical“). Sukietėjus „C&B Superbond“, kaniulė buvo paleista iš laikiklio ir aplink kaniulę bei varžtus buvo uždėtas dantų cementas („Poly-F“, „Dentsply“). Norint uždaryti pjūvį aplink kankuliavimo vietą, buvo naudojami Vetbond audinių klijai (7003449 M, 5). Po implantacijos pelėms 12 dienas iš eilės buvo švirkščiama po oda antibiotikų (enrofloksacino, 5 mg / kg, kas 24 val.) Ir nuskausminimo (karprofeno, 3 mg / kg, kas XNUMX val.).

In vivo fotostimuliacija

200 µm pleistro laidas buvo prijungtas prie chroniškai implantuojamo optinio pluošto išorinės dalies, naudojant įvorę. Optinės skaidulos per FC / PC adapterį buvo pritvirtintos prie mėlynojo lazerio diodo (473 nm, MBL-III 473-150 mW), o šviesos impulsai buvo generuojami per stimuliatorių (BNC 575). Fotostimuliuojant ChR2 ekspresuojančius neuronus, stimuliavimo paradigma buvo 20 Hz dažnis, 5 ms impulso trukmė ir 2 – 5 mW šviesos galios. Iš pleistro laido skleidžiama šviesos galia buvo matuojama naudojant galios matuoklį (PM100D) su S121C šviesos jutikliu.

Elgesio analizė

Elgesio eksperimentai buvo atlikti su pelių D2-Cre pelėmis 11 – 13 savaičių amžiaus, išskyrus pelėms, kurioms buvo atlikta elektrofiziologinė analizė, kurios buvo 5 – 6 savaičių amžiaus. Su amžiumi suderintos D2-Cre ir Cre neigiamos kontrolės pelės buvo sušvirkštos su virusu ir laikomos atskirai, ir joms buvo leista aklimatizuotis narve iki elgesio tyrimo. Kiekvienos manipuliacijos metu pelės buvo perkeltos į eksperimentinį kambarį 60 min. Iki eksperimento pradžios, kad būtų galima priprasti ir sumažinti stresą (eksperimento kambario ryškumas buvo 70 liuksai). Kiekvienas eksperimentinis aparatas buvo nuvalytas 70% etanoliu tarp eksperimentų, kad būtų pašalintos visos galimos kvapo žymės.

Kokaino sensibilizacija

Norėdami pradėti sensibilizuoti kokainą, pelės buvo pripratintos prie fiziologinio tirpalo injekcijų (ip) 3 iš eilės dienų, o po to švirkščiamos su fiziologiniu tirpalu arba kokainu (15 mg kg-1, ip) 5 iš eilės. Pelėms buvo įšvirkšta į pilvaplėvės ertmę kokaino hidrochloridas (Johnsonas Mattney, Edinburgas, JK), ištirpintas fiziologiniame tirpale (0.9% NaCl), arba fiziologiniame tirpale, naudojant 30 G adatą. Iškart po kiekvienos injekcijos pelėms buvo patikrintas horizontalus lokomotorinis aktyvumas atviro lauko kameroje 30 min. Išmatuoti fotostimuliacijos poveikį sensibilizacijos inicijavimui ir išraiškai (5 pav.) (3 pav​​​5), 5) pelėms buvo suteikta mėlyna šviesa dvišaliu būdu per dvigubus šviesolaidinio tvirtinimo laidus ant NAc keturiems 3-min laikotarpiams per 30 min seansus namų narvuose. Ant skaidulinio optinio kaniulio, esančio pelės kaukolėje, pataisos virvelės buvo pašalintos, o pelėms buvo suteikta bent 10 minutė poilsio. Po to pelėms buvo suleista kokaino arba druskos tirpalo (coc 1d-coc 5d). Pradėjus sensibilizaciją, kokainas 14 dienomis buvo nutrauktas be fiziologinio tirpalo injekcijos. Per šį nutraukimo periodą fotostimuliacija nebuvo taikoma. Po to elgesio jautrinimo kokainui išraiška buvo sušvirkšta įšvirkščiant vaisto dozę (10 mg kg-1, ip) po NAc fotostimuliacijos, kaip parodyta 1 paveiksle Figūra5A.5A. Išmatuoti fotostimuliacijos poveikį kokaino vartojimo laikotarpiu (6 pav.) (Figure6), 6pelėms buvo atliktas tas pats sensibilizacijos protokolas, kaip aprašyta aukščiau (6 pav.) 5)) išskyrus fotostimuliaciją. Pradėjus sensaciją dėl kokaino, fotostimuliacija buvo taikoma NAc per parą 1 h per visą 14 dienų vartojimo periodą. Po 14 vartojimo nutraukimo dienos visoms pelių grupėms buvo sušvirkščiama kontrolinė kokaino dozė (10 mg kg-1).

1 pav 

Atrankiniai fotostimuliacijos vidutinio smaigalio neuronai branduolio akumuliatoriuose. (A) Selektyvi ChR2 ekspresija NAc D2R neuronuose, perduodant AAV-DIO-ChR2-EYFP virusinius vektorius. mastelio juostos: fono paveikslėlis, 1 mm: įdėklas, 200 µm. (B) Konfokalūs vaizdai ...
2 pav 

D2RCre-MSN fotostimuliacija skatina vietines slopinamąsias grandines. (A) Konfokusinis gyvo NAc pjūvio vaizdas, kuriame yra dažais užpildytas neuronas, kuris neišreiškia ChR2, ir gretima ląstelė (rodyklės galvutė), kuri ekspresuoja ChR2 ir kurią būtų galima fotostimuliuoti. (B) IPSC ...
3 pav 

NAc ląstelių savybės. (A) Dviejų fotonų fluorescencinis neuronų, užpildytų Alexa 594, vaizdas. (A1) parodo neuroną iš ChR2 + / AP grupės, tuo tarpu (A3) rodo neuroną iš ChR2− / IPSC grupės. (A2) ir (A4) yra didelio padidinimo atvaizdai iš ...
4 pav 

NAc NAX optogenetinio aktyvavimo in vivo poveikis baziniam lokomotoriniam aktyvumui. () D2 Cre pelių, įšvirkštų į NAc su AAV-DIO-ChR2-EYFP, sagittalinis vaizdas, po kurio buvo implantuota optinio pluošto kaniulė. 473 nm mėlynos šviesos stimuliacija ...
5 pav 

D2-MSN aktyvacijos poveikis sensibilizuojant kokainą. (A) Eksperimento schema D2-MSN foto-stimuliacijai inicijuojant ir išreiškiant jautrinimą kokainui. Mėlynos šviesos apšvietimas (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) buvo pristatytas keturiems ...
6 pav 

D2-MSN aktyvacijos nutraukimo metu kartotinis kokaino poveikis. (A) Eksperimentinė D2-MSNs stimuliavimo schema nutraukiant kokaino vartojimą. Mėlynos šviesos apšvietimas (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) buvo pateiktas aštuonis 3-min laikotarpius ...

Imunofluorescencinė ir konfokalinė lazerio mikroskopija

Norėdami gauti imunofluorescenciją, pelės buvo anestezuojamos Zoletil (Virbac, 1.6 µl / g, į pilvaplėvės ertmę) ir 0.05 µl / g Rompun (Bayer) ir perfuzijos būdu filtruojamos-sterilizuotos 0.1 M PBS, po to fiksuojamos naudojant 4% paraformaldehido / PBS tirpalą (Sigma). Tada smegenys buvo pašalintos ir po to fiksuotos 4 h su fiksuojančiu ledu šalčiu, kaip aprašyta aukščiau. Tada smegenys buvo dehidratuotos 30% sacharozės / 0.1 M PBS 2 dienomis. Tada smegenys buvo užšaldytos ir paruoštos kriostatu (Leica CM 40, Vokietija) 1900 μm storio iš eilės vainikinės pjūviai. Sekcijos (40 µm) buvo užblokuotos 1 h 0.1 M PBS, turinčiame 5% normalaus ožkos serumo ir 0.2% Triton X-100, ir inkubuotos su triušio polikloniniu anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) CX. Po plovimo su PBS, turinčiu 4% Triton X-0.2, mėginiai buvo inkubuojami 100 h kambario temperatūroje su Alexa Fluor 1 ožkos anti-triušio IgG (568: 1; molekuliniai zondai, Eugene, OR, JAV) ir 500 µl / ml 0.2, 4-diamidino-6-fenil-indolo HCl (DAPI; Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) PBS, kuriame yra 2% normalaus ožkos serumo ir 1% Triton X-0.2. Kaip neigiama kontrolė mėginiai buvo inkubuoti tik su DAPI ir tik antriniu antikūnu. Skyriai buvo tiriami naudojant C100 Plan Apo × 1 / 40 vandens konokalinio lazerinio skenavimo sistemą (LSM 1.4, Zeiss, Berlynas, Vokietija).

Elektrofiziologija ir fotostimuliacija akumuliacinių branduolių skiltelėse

Pelės buvo naudojamos eksperimentams 4 savaites po viruso injekcijos, kad būtų pasiekta optimali ChR2-EYFP ekspresija. Po to pelės buvo anestezuojamos ir buvo nukenksmintos, kad būtų paruošti ūminiai smegenų pjūviai. Smegenys buvo greitai pašalintos ir nedelsiant supilstytos į ledą pjaustant tirpalą, kuriame yra (mM) 250 sacharozės, 26 NaHCO.3, 10 D-gliukozė, 3 mioinozitolis, 2.5 KCl, 2 Na-piruvatas, 1.25 NaH2PO4, 0.5 askorbo rūgštis, 1 Kynurenic rūgštis ir 7 MgCl2 kuris buvo išpūstas su 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Vainikinės smegenų pjūviai (250 µm storio), kuriuose yra NAc, buvo paruošti naudojant vibratomą (Leica VT 1200 S), o po to inkubuojami dujiniame dirbtiniame smegenų skilvelyje (ACSF), turinčiame (mM): 11 D-gliukozės, 125 NaCl, 25 NaHCO.3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 1.25 MgCl2 ir 2.5 CaCl2 34 ° C temperatūroje prieš įrašydami. Tada pjūviai buvo perkelti į panardinimo registravimo kamerą, kurioje O2sočiųjų ACSF tirpalas buvo nuolat perteklinis. NAc ir VTA ląstelės buvo vizualizuotos naudojant 2-fotono mikroskopą („Olympus FV1000 MPE“, Tokijas, Japonija), aprūpintą 25X vandens panardinimo lęšiu ir infraraudonųjų spindulių DIC optika. Viso ląstelių pleistro spaustukų įrašai buvo gauti iš NAc ląstelių su Multiclamp 700B stiprintuvu ir Digidata 1440A skaitmeniniu įtaisu (Molecular Devices, LLC). Duomenys buvo paimti naudojant „pCLAMP 10.2“ programinę įrangą ir toliau analizuojami naudojant „Clampfit 10.2“ programinę įrangą (Molecular Devices, LLC). Pataisos elektrodai su atsparumu tarp 3 – 5 MΩ buvo užpildyti vidiniu tirpalu, kuriame (mM): 130 K-gliukonatas, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA ir 10 Na2- fosfokreatinas, kurio pH sureguliuotas iki 7.3, naudojant 1 N KOH. Bicukulinas (10 µM) buvo išteptas smegenyse, kad blokuotų GABA receptorius.

NAc ląstelės, ekspresuojančios ChR2-EYFP, buvo fotostimuliuotos LED šviesos šaltiniu (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Mėlyna LED lemputė buvo toliau filtruojama ir silpninama filtro kubeliu, kuriame įrengtas sužadinimo filtras (470 – 495 nm); šviesos blyksniai (10 ms trukmė, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) buvo pristatyti į smegenų pjūvį per objektyvo 25X objektyvą 5 – 40 Hz dažniais. Eksperimento pogrupyje foto srovės buvo matuojamos ChR2 ekspresuojančiose ląstelėse, reaguojant į 2 trukmės šviesos blyksnius.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± sem ir buvo analizuojami su dvipusiais studentais ttestas arba atlikus dvipusę dispersijos analizę, po kurios seka Bonferroni post-hoc testas. A Pvertė <0.05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.

rezultatai

Atrankiniai fotostimuliacijos vidutinio smaigalio neuronai branduolio akumuliatoriuose

Norėdami nustatyti NAc D2R-MSN vaidmenį priklausomybės nuo kokaino sąlygose, mes panaudojome optogenetinį metodą NAc D2R neuronų stimuliavimui. Norint selektyviai kontroliuoti D2R-MSN aktyvumą NAc šviesoje, virusiniai vektoriai, koduojantys AAV-DIO-ChR2-EYFP, stereotaksiniu būdu buvo sušvirkšti į D2R-Cre BAC transgeninių pelių NAc. 4 savaites po viruso injekcijos NAc buvo pastebėta tvirta ChR2-EYFP ekspresija (pav. (Figure1A) .1A). ChR2 raiškos specifiškumas D2R-MSNs buvo patvirtintas atliekant konfokalinę imunofluorescencijos analizę: YFP pažymėto ChR2 raiška buvo kartu lokalizuota kartu su D2R NAc (pav. (Figure1B), 1B), parodant, kad ChR2 buvo ekspresuojamas DcNUMXR ekspresuojančiuose neuronuose NAc.

Nors toks požiūris buvo naudojamas kituose tyrimuose (pvz., Lobo ir kt. 2010), virusų injekcijos procedūrų informacija įvairiose laboratorijose skirsis, todėl svarbu dokumentuoti optogenetinę kontrolę mūsų specifinėmis eksperimentinėmis sąlygomis. Mes įvertinome ChR2 funkcinę išraišką atlikdami visos ląstelės pleistro spaustuko įrašus iš MSN NAc skiltelėmis. MSN buvo identifikuoti pagal: (1) santykinai hiperpolarizuotą ramybės membranos potencialą (RMP), paprastai daugiau neigiamą nei –80 mV; (2) įprastas AP šaudymo modelis reaguojant į taikomus srovės impulsus; (3) ilgą pirmojo AP suveikimo latenciją srovės impulso metu; (4) nėra įtampos „sumažėjimo“ hiperpoliarizacijos metu, kurią sukelia hiperpolarizacijos suaktyvinta katijonų srovė (Ih); ir (5) palyginti nedideli jų ląstelių kūnai (Chang ir Kitai, 1985; O'Donnell ir Grace, 1993; Le Moine ir Bloch, 1996; Taverna ir kt. 2008). Mėlyna šviesa (470 nm) buvo naudojama visame regėjimo lauke (0.78 mm)2), tuo metu, kai įtampa užfiksuoja MSN esant laikomajam potencialui –69 mV. Kai kurie MSN išreiškė ChR2, akivaizdu kaip YFP fluorescencija jų somatoje (rodyklės fig. 1C1, C3). Tokie neuronai turėjo didelę foto srovę, o ryškesni šviesos dirgikliai sukėlė didesnius foto sroves (pav. (Pav. 1D) .1D). Ryšys tarp fotoelektrinės smailės amplitudės ir šviesos intensyvumo (3 pav.) (Pav. 1E) 1E) turėjo pusės maksimalų šviesos jautrumą 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 ir maksimalią 1.16 ± 0.16 nA smailės amplitudę (vidurkis ± sem, n = 4).

Esant srovės gnybtų sąlygoms, MSN, išreiškiantys ChR2, patikimai reagavo į AP, reaguodami į šviesos impulsų traukinius (10 ms trukmė; pav. Pav. 1F) .1F). Tokiomis sąlygomis šviesos intensyvumas yra didesnis nei 0.1 mW / mm2 pakako sukelti AP (6 pav.) („1G“, „1G“, n = 5). AP buvo patikimai iššaukiami esant fotostimuliacijos dažniui iki 20 Hz, o esant 40 Hz - šviesos sukeltos reakcijos susumuotos, kad sukeltų ilgalaikę depoliarizaciją, kuri buvo mažiau efektyvi išprovokuojant AP (pav. 1F, G).

D2R-MSN fotostimuliacija skatina vietines slopinamąsias grandines

Norėdami ištirti D2R-MSNs aktyvumą vietinėse grandinėse NAc, mes fotostimuliavome presinapsinį MSN, išreiškiantį ChR2, matuojant postsinapsinius atsakus ChR2 neigiamais MSN (pav. (Figure2A) .2A). Paveikslėlyje parodytas neuronas Figure2A2A neišreiškia ChR2, kaip rodo EYFP fluorescencijos nebuvimas, taip pat trumpalaikio fotoaparatų, tokių kaip parodyta paveiksle, nebuvimas Figūra1D.1D. Tačiau kai postsinapsiniai MSN buvo laikomi −69 mV potencialu, 10 ms trukmės šviesos blyksniai iššaukė išorines sroves po 9.0 ± 0.42 ms latentinio periodo (pav. („2B“, „2B“, n = 15). Norint nustatyti šių reakcijų pobūdį, postsinapsinės membranos potencialas buvo kinta nuo –99 mV iki –39 mV, o veikė šviesos blykstė (pav. (Figure2C) .2C). Šviesos sukeltos reakcijos kinta atsižvelgiant į membranos potencialą (3 pav.) (Pav. 2D, 2D, n = 6) ir pakeitė jų poliškumą esant –81 ± 3.4 mV. Atsižvelgiant į tai, kad mūsų joninėmis sąlygomis chloridų jonų pusiausvyros potencialas yra –80 mV, šviesos indukuojamas išorines sroves gali sukelti chlorido srautas, kurį sukelia postsinapsinis GABAA receptoriai. Norėdami išbandyti šią galimybę, GABAA receptoriaus antagonistas bicukulinas (10 µM) buvo pridėtas prie išorinio tirpalo. Šis vaistas visiškai užblokavo šviesos sukeltą atsaką (3 pav.) (Figure2B), 2B), patvirtindami, kad šviesos sukeltos reakcijos buvo GABAerginės slopinančios postsinapsinės srovės (IPSC).

Remiantis jų atsakymais į fotostimuliaciją, MSN, iš kurių mes įrašėme, gali būti klasifikuojami į vieną iš 4 grupių: (1) ląstelės, išreiškiančios pakankamą ChR2 kiekį, kad sudegintų AP, reaguodamos į fotostimuliaciją (ChR2 + / AP), kurios buvo aprašytos aukščiau; (2) ląstelės, ekspresuojančios nedidelį kiekį ChR2, kurios, reaguodamos į šviesą, parodė sub-slenksčio depoliarizaciją (ChR2 + / No AP); (3) tyliosios ląstelės, neturinčios ChR2 ekspresijos, tačiau gavusios šviesos sukeltus IPSC iš presinapsinių MSN, išreiškiančių ChR2 (ChR2- / IPSC); ir (4) ChR2 neigiamos ląstelės, kuriose nebuvo IPSC, reaguojant į kitų MSN fotostimuliaciją (ChR2 - / IPSC nėra). Santykinė ląstelių dalis kiekvienoje iš šių kategorijų parodyta 1 paveiksle Figūra2E2E (n = 53). Apskritai, beveik pusė ląstelių (45.3%) išreiškė ChR2 (grupių (1) ir (2) suma). Nei viename iš mūsų užfiksuotų MSN nebuvo fotoaktyviųjų srovių ir IPSC, reaguojant į fotostimuliaciją; Tai rodo, kad D2R teigiami MSN nedaro vidinės įtakos NAc tos pačios ląstelės populiacijai.

Ši reakcijų į šviesą klasifikacija rodo, kad ChR2 + / No AP ląstelių (grupė 2) ir ChR2− / No IPSC ląstelių (grupė 4) fotostimuliacija nesukurs jokių elektrinių signalų, galinčių prisidėti prie grandinės veiklos. Taigi, norėdami apibrėžti fotostimuliacijos poveikį grandinės funkcijai, mes išsamiai apibūdinome „ChR2 + / AP MSN“ (grupė 1) savybes, kurios generuos AP, kai NAc yra fotostimuliuojamas, ir „ChR2− / IPSC“ langelius (grupė 3), kurie yra postsinapsiniai ChR2 + / AP MSN atžvilgiu, nes gauna šviesos sukeltus IPSC. NaCr ChR2 + / AP ir ChR2− / IPSC ląstelės buvo identifikuotos kaip nugaros neuronai (pav. (Figure3A) .3A). Šiose dviejose grupėse reikšmingų neuronų morfologinių ar elektrofiziologinių savybių skirtumų nebuvo. Pavyzdžiui, tų dviejų grupių neuronų somatos buvo panašaus dydžio (5 pav.) (Figure3B) .3B). Be to, jų RVP (−83.0 ± 1.7 vs. −85.0 ± 1.8 mV; vidurkis ± sem; n = 10, pav Pav. 3C)) ir įėjimo varžos (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, pav Pav. 3D)) taip pat nebuvo skirtingi (p > 0.05 dviejų uodegų studentų t- bandymas), o jų AP šaudymo modeliai, reaguojant į srovės impulsus (5 pav 3E, F) taip pat buvo panašūs (p > 0.05 dviejų uodegų studentų t-testas, n = 6). Apibendrinant galima pasakyti, kad DcNUMXR-MSN fotostimuliacija NAc suaktyvina vietines slopinamąsias grandines su postsinapsiniais neuronais, kurie yra labai panašūs į D2R-MSN, bet neišreiškia D2R.

NAc D2R-MSN optogenetinė stimuliacija, sukeliant jautrinimą dėl kokaino

Toliau mes ištyrėme in vivo NAc D2R-MSN fotostimuliacija. Kadangi D2R-MSN fotostimuliacija nugaros striatumoje sumažina lokomotorinį aktyvumą (Kravitz et al., 2010), mes pradėjome apibūdindami akumuliatorių D2R-MSN aktyvacijos poveikį bazinei lokomotorinei veiklai. Tuo tikslu D2R-Cre pelėms buvo įšvirkščiamas DIO-AAV-ChR2-EYFP virusas į NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). Tada D2R-MSN buvo fotostimuliuoti mėlyna šviesa (473 nm, 5 ms impulso trukmė, 20 Hz), perduodama į NAc per optinę skaidulą. Fotostimuliai buvo naudojami per keturis 3-min trukmės periodus per 50 min sesiją, kai pelės buvo laikomos lokomotorinio aktyvumo registravimo kameroje (pav. (Figure4A) .4A). Lygiagrečiai kaip kontrolinės, ne Cre-WT vados pelėms buvo panašiai įšvirkštas virusas ir jos buvo apšviestos mėlyna šviesa. D2-Cre (+) NAc-ChR2 pelėms buvo nustatytas panašus arba šiek tiek padidėjęs bazinio lokomotorinio aktyvumo lygis, palyginti su kontrolinėmis D2R-Cre (-) NAc-ChR2 pelėmis (pav. 4B, C). D2R-MSN fotostimuliacija pelėms D2-Cre (+) NAc-ChR2 pelėms smarkiai sumažino lokomotorinį aktyvumą, kuris atsistatė sustabdžius šviesos stimulą (pav. (Figure4B) .4B). Kontrolinių D2R-Cre (-) NAc-ChR2 pelių tokio poveikio nepastebėta (pav. 4B, C), nurodant, kad fotostimuliacijos padarinius sukėlė ChR2 aktyvacija, o ne galimas nespecifinis poveikis, pavyzdžiui, smegenų audinio kaitinimas. Todėl mūsų duomenys parodė, kad D2R-MSNs fotostimuliacija NAc sukėlė lokomotorinio aktyvumo sumažėjimą.

Šie rezultatai patvirtino mūsų sugebėjimą kontroliuoti D2R-MSN aktyvumą NAc srityje in vivo. Vėliau pasinaudojome šia galimybe, norėdami ištirti D2R-MSN aktyvumo įtaką sensibilizuojančiam elgesiui pakartotinai vartojant kokainą. Jautrumas elgesyje reiškia procesą, kuris leidžia iš pradžių paveikti psichostimuliatorius, pvz., Kokainą, kad padidintų vėlesnių vaistų ekspozicijos gebėjimą stimuliuoti lokomotorinę veiklą. Šį procesą galima suskirstyti į iniciacijos ir išraiškos fazes: iniciacija apibūdina tiesioginius nervinius įvykius, sukeliančius elgesio sensibilizaciją (Vanderschuren ir Kalivas, 2000; Sim ir kt., 2013), nors išraiška yra žinoma kaip ilgalaikė elgesio plastiškumo forma, kuri išlieka po narkotikų nutraukimo (Vanderschuren ir Kalivas, 2000; Sim ir kt., 2013). Todėl mes ištyrėme kokaino sukeltą elgesio sensibilizaciją atliekant pakartotines intraperitonealines (ip) kokaino injekcijas, o optogenetika buvo naudojama norint kontroliuoti D2R-MSNs NAc aktyvumą kiekvienoje iš šių fazių.

Po pripratimo prie fiziologinio tirpalo injekcijos per 3 dienas pelėms buvo švirkščiamas kokainas (15 mg / kg) 5 iš eilės ir lokomotoriniai atsakai buvo registruojami 30 min po kiekvienos injekcijos (pav. (Figure5A) .5A). Fotostimuliai buvo pristatyti per 30 min seansus prieš kokaino injekciją, painiodami 3 min apšvietimo periodus su 5 min laikotarpiais, kai šviesa buvo išjungta (pav. (Figure5A) .5A). Atsižvelgiant į tai, kad D2R-MSN fotostimuliacija NAc sumažina bazinio lokomotorinio aktyvumo rodiklį (pav. (Figure4), 4), kad būtų išvengta galimo elgesio reakcijos į kokaino injekciją, fotostimuliai buvo pristatyti prieš pat kokaino vartojimą.

Abi kontrolinės D2-Cre (-) NAc-ChR2 pelės ir D2-Cre (+) NAc-ChR2 pelės pastebimai padidino lokomotorinį aktyvumą reaguodamos į pakartotines kokaino injekcijas (pav. (Figure5B), 5B), nurodant sensibilizacijos pradžią. NAc neatitinkantis D2R-MSNs fotostimuliacija neturėjo įtakos elgesio sensibilizacijos inicijavimui, nes kokaino sukeltas elgesio sensibilizavimas buvo panašus D2-Cre (+) NAc-ChR2 pelėms ir kontrolinėms D2-Cre (-) NAc-ChR2 pelėms.

Po to, kai buvo sujaudinta elgsena, kartojant tokias kokaino injekcijas (15 mg / kg) 5 dienomis, vaistas buvo nutrauktas 14 dienoms, o sensibilizacijos pasireiškimo laipsnis buvo tiriamas, užginčant pelėms mažesnę kokaino dozę (10 mg). /kilogramas). Jautrumo išraiška yra ilgalaikė elgesio plastiškumo forma, kuri išlieka po narkotikų nutraukimo (Steketee ir Kalivas, 2011; Sim ir kt., 2013). Norint ištirti D2R-MSN vaidmenį sensibilizuojant, NAc buvo fotostimuliuota prieš pat kokaino vartojimą (pav. (Figure5A) 5A) ir sensibilizacija buvo išmatuota kaip kokaino injekcijos sukeltas lokomotorinis aktyvumas.

Abiejose su kokainu apdorotose pelių grupėse - D2-Cre (-) NAc-ChR2 pelėse (D2-Cre (-) :: coc-coc) ir D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+)): : coc-coc) - padidėjo jautrinimas rutine ekspresija (3 pav.) (Figure5C) .5C). Kokaino stimuliuojamos lokomotyvo pokyčių laikas taip pat buvo panašus tarp dviejų grupių (1 pav.) (Pav. 5C), 5C), nepastebėta reikšmingo skirtumo tarp dviejų grupių. Šie du fotostimuliacijos eksperimentai kartu rodo, kad D2R-MSN aktyvacija NAc neturi įtakos kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos inicijavimui ar išraiškai.

NAc D2R-MSN fotostimuliacija nutraukiant vaisto vartojimą

Lėtinis stresas, atsirandantis nutraukus narkotikų vartojimą po pakartotinio kokaino ekspozicijos, pasirenkamas nuo D2R priklausantis adaptacijos mechanizmas, kontroliuojantis streso sukeltą kokaino ieškojimo ir elgesio su atkryčiu padidėjimą, atsižvelgiant į sinapsinio plastiškumo pokyčius NAc (Sim et al. 2013). Tai rodo, kad narkotikų vartojimo nutraukimo mechanizmai skiriasi nuo tų, kurie sukelia sensibilizaciją dėl narkotikų. Todėl mes toliau ištyrėme, ar D2R-MSNs NAc fotostimuliacija kokaino vartojimo nutraukimo metu daro įtaką kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos išraiškai.

Sužadinus elgesio jautrinimą pakartotinai injekuojant kokainą, kaip aprašyta aukščiau, D2-Cre (-) ir D2-Cre (+) pelės buvo padalytos į dvi grupes 14 dienos nutraukimo laikotarpiui: vienai grupei kasdien buvo imamas mėlynos šviesos stimuliavimas. NAc 1 h (3 min × 8 kartus), o kitos grupės nebuvo (pav. (Figure6A) .6A). Kartotinis NAX D2R-MSN fotostimuliavimas kokaino vartojimo metu neturėjo įtakos sensibilizacijos raiškai D2-Cre (-) :: coc-coc pelėms (pav. (Figure6B) .6B). Atvirkščiai, D2-Cre (+) :: coc-coc pelėms sensibilizacijos išraišką reikšmingai susilpnino pakartotinė fotostimuliacija nutraukiant vaisto vartojimą (pav. (Figure6B), 6B), nors kokaino sukeltos judėjimo stimuliacijos laikas nepakito (1 pav.) (Figure6C) .6C). Taigi NAc D2R-MSNs fotostimuliacija nutraukiant narkotikų vartojimą sumažino kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos išraišką (kokainas × foto-stimuliavimo sąveika) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, pav Fig. 6B) .6B). Šie duomenys rodo, kad D2R-NAc MSN aktyvavimas narkotikų nutraukimo metu daro įtaką kokaino paieškai ir atkryčio poelgiams.

Diskusija

Nemažai įrodymų rodo, kad kokaino sukelta sensibilizacija elgesyje yra susijusi su padidėjusiu dopaminerginiu perdavimu mezokortikolimbinėje sistemoje, apimančioje ventralinę pagrindinę sritį, prefrontalinę žievę ir branduolio akumuliatorius (NAc). Visų pirma, elgesio sensibilizacijos išraiškos fazei būdingas nuolatinis hiperreakcija į vaistą nutraukus vaisto vartojimą, kuri yra susijusi su adaptacijos mechanizmų kaskadomis (Kalivas ir Duffy, 1990; Robinson ir Berridge, 1993; Kalivas ir kt. 1998), kurie galėtų prisidėti prie priverstinio potraukio narkotikams (Robinson ir Berridge, 1993; Kalivas ir kt. 1998; Steketee ir Kalivas, 2011). Buvo pasiūlyta, kad kokaino sukelti NAc molekulinio, ląstelinio ir elgesio plastiškumo pokyčiai, kartu su DA receptorių signalizavimu MSN, gali reguliuoti priklausomybę nuo narkotikų sukelto elgesio (Lobo et al. 2010; Schmidtas ir Pierce'as, 2010; Ferguson ir kt. 2011; Pascoli ir kt. 2011; Bocklisch ir kt. 2013; Grueter ir kt. 2013).

Naujausi tyrimai su genetiškai modifikuotomis pelėmis, kurios sąlygiškai ekspresuoja Cre rekombinazę, atskleidė D1R-MSN arba D2R-MSN vaidmenį priklausomybės nuo kokaino srityje. Optogenetinis NAc D1R-MSN aktyvinimas po pakartotinio kokaino vartojimo 6 dienomis padidina lokomotorinį aktyvumą, o D2R-MSN aktyvinimas, kaip pranešama, neturi jokio poveikio (Lobo ir kt. 2010). Šie duomenys rodo, kad pakartotinis kokaino poveikis padidina NAc išsiskyrimą D1R-MSN. D1R ekspresuojančių MSN slopinimas stabligės toksinu (Hikida et al., 2010) sumažina kokaino sąlygotą vietos pasirinkimą (CPP), o kokaino CPP pokyčių nepastebėta panaikinus D2R-MSN sinapsių perdavimą (Hikida et al., 2010). D1R-MSN optogeninis aktyvinimas nugaros striatumoje sukelia nuolatinį sustiprėjimą, o D2 receptorius ekspresuojančių neuronų stimuliavimas sukelia trumpalaikes bausmes (Kravitz et al., 2012). Neseniai atliktame tyrime taip pat pranešta, kad D2R-MSN slopinimas naudojant chemikogenetinį metodą padidina motyvaciją gauti kokainą, o optogenetinis D2R-MSN aktyvinimas slopina kokaino vartojimą savarankiškai (Bock et al. 2013). Kita vertus, Bocklisch ir kt. (2013) pranešė, kad NAc projekto D1R-MSNs į VTA, konkrečiai į VAB GABAerginius neuronus, o D2R-MSN neprojektuoja tiesiogiai prie VTA. Ši grandinė reiškia, kad optogeninis D1R-MSN aktyvinimas suardo DA neuronus, o tai galiausiai sustiprina kokaino sukeltą priklausomybės elgesį (Bocklisch ir kt. 2013).

Nepaisant tariamai paprasto šių dviejų MSN populiacijų organizavimo, faktas, kad MSN gauna daug įėjimų ir turi skirtingus išėjimus iš / į kitas smegenų sritis, taip pat formuoja vietines grandines tarp MSN ir kitų klasių interneuronų, gaunamas D1R- MSN ir D2R-MSN gali sukelti sudėtingas ir skirtingas molekulines, ląstelines ir elgesio pasekmes.

Anksčiau buvo įrodyta, kad D2R prisideda prie sinapsinių modifikacijų, atsirandančių nutraukiant narkotikų vartojimą, ir tai sustiprina recidyvą ieškant kokaino, nedarant įtakos pradiniam narkotikų įsigijimui ar narkotikų paieškai (Sim et al. 2013). Dabartiniai duomenys rodo, kad D2R-MSNs fotostimuliacija NAc sukelia bazinio lokomotorinio aktyvumo sumažėjimą. Lobo ir kt. (2010) nenustatė jokių judėjimo pokyčių, kai buvo suaktyvintas bet kuris MSN potipis, tačiau jie tikrino tik bendrą lokomotorinį aktyvumą, o ne nagrinėjo tiesioginius bazinio lokomotorinio aktyvumo atsakus į fotostimuliaciją. Kravitz ir kt. (2010) taip pat nustatė, kad optogenetinis D2R-MSN aktyvinimas nugaros striatumoje taip pat sumažina lokomotorinį aktyvumą. Taigi, mūsų duomenys yra pirmieji, įrodantys, kad bazinio lokomotorinio aktyvumo slopinimą sukelia NAc D2R-MSNs fotostimuliacija, ir pirmieji, kurie sistemiškai ištyrė bazinio lokomotorinio aktyvumo laiką šių neuronų fotostimuliacijos metu.

Šiame tyrime mes pastebėjome, kad optogenetinis D2R-MSN aktyvavimas NAc neturėjo įtakos elgesio sensibilizacijos inicijavimui ar išraiškai. Tačiau D2R-MSN fotostimuliacija narkotikų vartojimo nutraukimo laikotarpiu užtemdė kokaino sukeltos sensibilizacijos išraišką. Todėl mūsų duomenys rodo, kad D2R-MSNs pasitraukia iš tam tikro signalo, ypač per pasišalinimo periodą, kuris keičia genų raišką ar kitokias signalizacijos formas ir tokiu būdu sukelia sinapsinio plastiškumo pokyčius, sukeliančius kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos pokyčius. Kaip šie MSN naudoja tam tikras ląstelių tipo adaptacijas, kurios gali sukelti aiškias jų priklausomybės elgesio pasekmes, nežinoma. Grueter ir kt. (2013) pasiūlė, kad ΔFosB NAc diferencijuotai moduliuoja sinapsines savybes ir su atlygiu susijusį elgesį ląstelių tipui ir subregionui būdingu būdu. Neseniai Chandra ir kt. (2013) pranešė, kad pakartotinis D2R-MSN, bet ne D1R-MSN, aktyvavimas ChR2 sukėlė Tiam1 geno, baltymo, dalyvaujančio aktino citoskeleto pertvarkyme, reguliavimą, panašų į kokaino poveikį. Todėl norint suprasti mechanizmus, sukeliančius ilgalaikį vaistų sukeltos elgsenos poveikį, bus svarbu apibrėžti ląstelių selektyvųjį molekulinių įvykių indukciją šiuose MSN, kurie kontroliuoja sinapsių prisitaikymą prie pasikartojančio vaisto poveikio.

Atsižvelgiant į pasikartojantį narkotikų poveikį, buvo siūloma, kad nutraukimas vaidintų svarbų vaidmenį, nes kai kurie pokyčiai atsiranda tik praėjus kelioms savaitėms po galutinio kokaino poveikio. Tai rodo, kad susilaikymas yra svarbus tarpininkas plėtojant plastiškumą (Robinson ir Berridge, 2003; Boudreau ir Vilkas, 2005; Boudreau ir kt. 2007; Kourrich ir kt. 2007). Šie pastebėjimai kelia galimybę, kad pats nutraukimas gali sukelti NAc pokyčius, kuriuos kontroliuoja nuo D2R priklausantis signalizavimas. Mūsų rezultatas, rodantis, kad D2R-MSN aktyvavimas NAc vartojant narkotikus nutraukiant kokaino sukeltą elgesio sensibilizaciją, yra įtikinamai palaikantis šią idėją.

Anksčiau buvo įrodyta, kad pakartotinis streso poveikis nutraukiant narkotikų vartojimą slopina kokaino sukeltos elgsenos sensibilizaciją, taip pat kokaino ieškojimo ir atkryčio elgesį D2R KO pelėse (Sim et al. 2013). Todėl įdomu, kad D2R-MSN fotostimuliacija nutraukiant vaisto vartojimą taip pat mažina sensibilizacijos pasireiškimą. D2R KO pelių NAc pasikeitė streso sukeltas sinapsinis plastiškumas glutamatezinėse sinapsėse (Sim et al. 2013). Nors dar nežinoma, ar D2R MSN fotostimuliacija ar lėtinis stresas abstinencijos laikotarpiu sukelia panašius sinapsinio plastiškumo pokyčius, mūsų dabartiniai duomenys patvirtina hipotezę, kad NAc D2R-MSNs vaidina pagrindinį vaidmenį pašalinant sukeltą plastiškumą ir gali prisidėti prie nutraukus narkotikų vartojimą. Norint išsiaiškinti funkcines nervų grandines, kuriose D2R MSN dalyvauja nutraukiant vaisto vartojimą, reikės ištirti ir išanalizuoti bei palyginti D2R-MSN fotostimuliacijos ir lėtinio streso padarinius sinapsiniam plastiškumui šioje konkrečioje grandinėje.

Kitas galimas D2R ekspresuojančių MSN vaidmuo galėtų būti D1R-MSN išvesties iš NAc slopinimas. Ankstesni tyrimai rodo, kad nors MSN projektuoja ilgus aksonus į tolimus taikinius, tarp aksonų ir šoninių dyglių projekcijos neuronų dendritinių medžių (Grofová, 1975; Preston ir kt., 1980; Vilsonas ir giraitės, 1980). Tai galėtų reikšti galimą vietinį sinapsinį MSN ryšį per NAc. Tarpląstelinių projekcinių neuronų porų intraląsteliniai įrašai nustatė funkcinius slopinamuosius ryšius tarp MSN žiurkės striatumoje (Czubayko ir Plenz, 2002; Tunstall et al. 2002; Koos et al. 2004; Gustafson ir kt., 2006). Taip pat pranešta, kad sinapsės, kurias formuoja pasikartojantys papildomi MSN aksonai striatumoje, nėra atsitiktinės, D2R-MSN užmezga sinapsinius ryšius tiek su kitais D2R-MSN, tiek su D1R-MSN, tuo tarpu D1R-MSN beveik išimtinai sudaro sinapsinius ryšius su kitais. D1R-MSN (Taverna ir kt., 2008). Nors taip pat buvo pranešta apie GABAerginį sujungimą tarp vietinių pasikartojančių aksoninių šaltinių tarp kaupiamųjų MSN (Taverna et al., 2004), dar nėra aišku, ar D2R-MSN atsitiktinai sudaro vietinius mikroschemus, ar jie prisideda prie NA mikroschemų, turinčių lengvatinį ryšį, kaip tai daroma striatumoje. Mūsų duomenys rodo, kad D2R-MSN, NAc, išreiškiantys ChR2, užmezga sinapsinius ryšius su kaimyniniais MSN, kurie išreiškia D1R, ir kad D2R-MSNs tada slopina kontaktą su D1-MSN, kad modifikuotų D1R sukeltą priklausomybės elgesio skatinimą.

Pabaigoje mes parodėme, kad optogenetinis NAc D2R-MSN aktyvinimas keičia abstinencijos sukeltą plastiškumą, atsirandantį priklausomybės nuo kokaino metu. Atsižvelgiant į tai, kad nuo D2R priklausančios signalizacijos aktyvumas abstinencijos laikotarpiu atrodo kaip pagrindinis kokaino sukeltos elgsenos sensibilizacijos išraiškos reguliatorius, siūlome, kad D2R-MSN būtų svarbus ilgalaikio adaptacijos narkotikų paieškai ir atkryčiui tarpininkas. Nuo D2R priklausomo signalizacijos molekulinių substratų identifikavimas ir NAc D2R-MSN, naudojamų pakartotinai veikiant vaistams, specifinė grandinė turėtų nustatyti naujus terapinės intervencijos tikslus atkryčio metu.

Interesų konflikto pareiškimas

Autoriai teigia, kad tyrimas buvo atliktas nesant jokių komercinių ar finansinių santykių, kurie galėtų būti laikomi galimu interesų konfliktu.

Padėka

Šį darbą rėmė Korėjos nacionalinio tyrimų fondo (NRF) dotacija, kurią finansavo Mokslo, IRT ir ateities planavimo ministerija pagal „Smegenų tyrimų programą“ (Ja-Hyun Baik; stipendijos Nr. 2013M3C7A1056101) ir Bio ir medicinos technologijos. Korėjos nacionalinio mokslinių tyrimų fondo (NRF) Pasaulio klasės instituto programa (Ja-Hyun Baik; stipendijos Nr. 2013M3A9D5072550) ir Pasaulio klasės instituto (WCI) programa, kurią finansuoja Mokslo, IRT ir ateities planavimo ministerija (George'ui J. Augustine'ui). WCI 2009-003), taip pat Korėjos universiteto dotacija (Ja-Hyun Baik) ir CRP dotacija iš Singapūro Nacionalinio tyrimų fondo (George'ui J. Augustine'ui).

Nuorodos

  1. Baik JH (2013). Dopamino signalizacija elgesyje, susijusiame su atlygiu. Priekyje. Neuroninės grandinės 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A. ir kt. (1995). Pelėms, kurioms trūko dopamino D2 receptorių, į parkinsonizmą panašių lokomotorinių sutrikimų. Gamta 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  3. „Berridge KC“ (2007). Diskusijos dėl dopamino vaidmens atlyginime: paskatinamojo linkėjimo atvejis. Psichofarmakologija (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF ir kt. (2013). Stiprinant netiesioginį kaupimosi kelią, padidėja atsparumas kompulsiniam kokaino vartojimui. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, DR namas, Yvon C., de Roo M. ir kt. (2013). Kokainas naikina dopamino neuronus stiprindamas GABA pernešimą ventralinėje pagrindinėje srityje. Science 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  6. „Boudreau AC“, Reimersas JM, Milovanovičius M., „Wolf ME“ (2007). Ląstelių paviršiaus AMPA receptoriai žiurkės branduolio akumuliatoriuose padidėja kokaino vartojimo metu, tačiau po kokaino vartojimo jie įsitvirtina kartu su pakitusia mitogeno suaktyvintų baltymų kinazių aktyvacija. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163 – 07.2007 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  7. „Boudreau AC“, „Wolf ME“ (2005). Elgesio sensibilizacija kokainui yra susijusi su padidėjusia AMPA receptoriaus paviršiaus ekspresija branduolio akumuliatoriuose. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252 – 05.2005 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH ir kt. (2013). Optogenetinis D1R, turinčio branduolio akumuliatorių neuronų, slopinimas keičia kokaino sąlygojamą Tiam1 reguliavimą. Priekyje. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  9. „Chang HT“, „Kitai ST“ (1985). Kaupiamųjų branduolio projekciniai neuronai: tarpląstelinio žymėjimo tyrimas. „Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Kokaino sukeltas lokomotorinis aktyvumas ir kokaino diskriminacija pelėms su dopamino D2 receptorių mutantais. Psichofarmakologija (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Dezinhibicija kaip pagrindinis procesas išreiškiant striatos funkcijas. Tendencijos Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Greitas sinapsinis perdavimas tarp striatininių dyglių projekcijos neuronų. Proc. Natl. Acad. Mokslas. JAV 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y. ir kt. (2011). Laikinas neuronų slopinimas atskleidžia priešingus netiesioginių ir tiesioginių kelių jautrinimą. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  14. Eina Y., AA malonė (2005). Branduolio kaupimosi branduolių limbinės ir žievės dopaminerginė moduliacija, nukreipta į tikslą. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  15. Grofova I. (1975). Stuburinių ir palladinių neuronų, pagrindžiančių nigrą, identifikavimas. Eksperimentinis tyrimas naudojant krienų peroksidazės aksonų pernešimą atgal. „Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB diferencialiai moduliuoja branduolio accumbens tiesioginę ir netiesioginę trajektorijos funkciją. Proc. Natl. Acad. Sci. JAV 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Palyginamosios įtampos ir srovės-gnybtų analizė grįžtamojo ryšio ir grįžtamojo sinapsinio perdavimo strijaus mikrocirkuliu in vitro. J. neurofiziolis. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Skiriami sinapsių perdavimo vaidmenys tiesioginiuose ir netiesioginiuose striatomos apdovanojimo ir bauginančio elgesio keliuose. „Neuron 66“, „896 – 907 10.1016“ / „j.neuron.2010.05.011“ [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  19. „Kalivas PW“, „Duffy P.“ (1990). Ūminio ir kasdienio gydymo kokainu poveikis tarpląsteliniam dopaminui akumuliatorių branduolyje. Sinapsė 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Sensibilizacijos vaidmuo potraukyje ir priklausomybės nuo kokaino atkryčiui. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  21. Koos T., Tepperis JM, Wilsonas CJ (2004). IPSC, kuriuos iškėlė spygliuoti ir greitai besisukantys neuronai neostriatume, palyginimas. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163 – 04.2004 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  22. Kourrichas S., Rothwellas PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Kokaino patirtis kontroliuoja dvikryptį sinapsinį plastiškumą akumuliatorių branduolyje. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859 – 07.2007 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  23. „Kravitz AV“, „Freeze BS“, „Parker PR“, Kay K., „Thwin MT“, Deisseroth K. ir kt. (2010). Parkinsoninio motorinio elgesio reguliavimas optogenetiniu būdu kontroliuojant bazinių ganglijų grandines. Gamta 466, 622 – 626 10.1038 / „nature09159“ [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  24. „Kravitz AV“, „Tye LD“, „Kreitzer AC“ (2012). Skiriami tiesioginiai ir netiesioginiai striatinkliniai neuronai. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  25. „Kreitzer AC“, „Malenka RC“ (2008). Stuburo plastiškumas ir bazinių ganglijų grandinės funkcija. Gamta 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). D3 dopamino receptorių ekspresija peptiderginiuose branduolio akumuliatorių neuronuose: palyginimas su D1 ir D2 dopamino receptoriais. Neuromokslas 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D. ir kt. (2010). Ląstelių tipui būdingas BDNF signalų praradimas imituoja optogenetinę kokaino naudos kontrolę. Science 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  28. „Lobo MK“, „Nestler EJ“ (2011). Strijaus pusiausvyros veiksnys priklausomybėje nuo narkotikų: skirtingi tiesioginio ir netiesioginio kelio vidutinio dydžio nugaros neuronų vaidmenys. Priekyje. Neuroanatas. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Narkotikų sukeliamas sinapsinis plastiškumas priklausomybėje: nuo molekulinių pokyčių iki grandinės rekonstravimo. „Neuron 69“, „650 – 663 10.1016“ / „j.neuron.2011.01.017“ [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  30. O'Donnell P., AA malonė (1993). In vitro užfiksuotų akumuliatorių šerdies ir apvalkalo neuronų fiziologinės ir morfologinės savybės. Sinapsė 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Kokaino sukeliamos sinapsinės potencijos pasikeitimas panaikina narkotikų sukeltą adaptacinį elgesį. Gamta 481, 71 – 75 10.1038 / „nature10709“ [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  32. „Preston RJ“, vyskupas GA, Kitai ST (1980). Vidutinė smaigalio neurono projekcija iš žiurkės neostriatumo: tarpląstelinis krienų peroksidazės tyrimas. „Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Narkotikų troškimo nervų pagrindas: skatinamojo jautrumo priklausomybės teorija. Brain Res. Brain Res. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Priklausomybė. Annu. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  35. „Schmidt HD“, „Pierce RC“ (2010). Kokaino sukeltos neuroadaptacijos perduodant glutamatą: galimi potraukio ir priklausomybės terapiniai taikiniai. Ann. NY Acad. Mokslas. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749 – 6632.2009.05144.x [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  36. „Sesack SR“, „Grace AA“ (2010). Kortikos-bazinių ganglijų atlygio tinklas: mikro grandinės. Neuropsichofarmakologija 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL ir kt. (2013). Dopamino D2 receptorių vaidmuo įtampos sukelto priklausomybės elgesio plastiškume. Nat. Bendruomenė. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  38. „Smith RJ“, „Lobo MK“, „Spencer S.“, „Kalivas PW“ (2013). Kokaino sukeltos adaptacijos D1 ir D2 akumuliatoriuose sukuria projekcinius neuronus (dichotomija nebūtinai yra tiesioginių ir netiesioginių būdų sinonimas). Curr. Nuomonės. Neurobiolis. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Narkotikų trūkumas: sensibilizuoja elgesį ir vėl pradeda ieškoti narkotikų. „Pharmacol“. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 red.PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Parkinsono ligos modeliuose sutrinka pasikartojančios striatuminių vidutinio smaigalio neuronų jungtys. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493 – 07.2008 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Tiesioginiai fiziologiniai įrodymai apie sinapsinį ryšį tarp vidutinio dydžio nugaros neuronų žiurkės branduolyje kaupiasi in situ. J. neurofiziolis. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Mezolimbinės dopamino sistemos neuroplastiškumas ir priklausomybė nuo kokaino. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  43. „Tunstall MJ“, „Oorschot DE“, Keanas A., „Wickens JR“ (2002). Inhibicinė sąveika tarp žiurkės striatumos esančių nervinių projekcinių neuronų. J. neurofiziolis. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  44. „Vanderschuren LJ“, „Kalivas PW“ (2000). Dopaminerginio ir glutamaterginio perdavimo pokyčiai sukeliant ir išreiškiant elgesio sensibilizaciją: kritinė ikiklinikinių tyrimų apžvalga. Psichofarmakologija (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Žiurkės neostriatumo nervinio nervo smulkiosios struktūros ir sinapsinis ryšys: tyrimas, kuriame tarpląstelinė krienų peroksidazės injekcija buvo atlikta. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]
  • Išminčius RA (2004). Dopaminas, mokymasis ir motyvacija. Nat. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Kryžiaus nuoroda]