Jonathanas P. Fadokas, 1,2, 2 Tavisas MK Dickersonas, 2 ir Richardas D. PalmiterisXNUMX*
J Neurosci. Autoriaus rankraštis; pasiekiama PMC 2010 kovo 9 d.
Paskelbta galutine redaguota forma:
J Neurosci. 2009 rugsėjo 9 d.; 29(36): 11089–11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1 Neurobiologijos ir elgesio magistrantūros studijų programa, Vašingtono universitetas, Sietlas, WA 98195
2 Biochemijos katedra ir Howardo Hugheso medicinos institutas, Vašingtono universitetas, Sietlas, WA, 98195
*Susirašinėti reikia adresu: Richard D. Palmiter, HHMI ir Biochemijos katedra, Box 357370, Vašingtono universitetas, Sietlas, WA 98195. El. [apsaugotas el. paštu]
Leidėjo galutinė redaguota šio straipsnio versija yra nemokama J Neurosci
Žr. kitus PMC straipsnius, kuriuose cituojamas paskelbtas straipsnis.
Abstraktus
Dopaminas (DA) yra susijęs su daugeliu elgesio būdų, įskaitant motorinę funkciją, pažinimą ir atlygio apdorojimą; tačiau DA vaidmuo apdorojant baimę išlieka dviprasmiškas. Norint ištirti DA vaidmenį su baime susijusiame mokymesi, dopamino trūkumo (DD) pelės buvo išbandytos baimės sustiprintoje baimės paradigmoje. DA sintezė gali būti atkurta DD pelėms, skiriant 3, 4-dihidroksi-L-fenilalaniną (L-Dopa), todėl galima įvertinti baimės apdorojimą, kai DA yra išeikvota arba pilna. DD pelėms baimės sustiprinto išgąsčio nebuvo, tačiau jį buvo galima atkurti suleidus L-Dopa iš karto po baimės kondicionavimo. Selektyvus virusų sukeltas DA sintezės atkūrimas ventralinėje tegmentalinėje srityje visiškai atkūrė baimės mokymąsi DD pelėse, o DA sintezės atkūrimas DA neuronams, projektuojantiems į bazolateralinę migdolinį kūną, atkūrė trumpalaikę atmintį, bet ne ilgalaikę atmintį ar jautrumą smūgiams. Taip pat parodome, kad DA D1 receptoriai (D1R) ir į D2 panašūs receptoriai yra būtini nuo užuominos priklausomam baimės mokymuisi.
Šie radiniai rodo, kad DA, veikiantis kelis receptorių potipius keliuose tiksliniuose regionuose, palengvina baimės atminties stabilizavimą.
Raktiniai žodžiai: dopaminas, baimė, baimės sukeltas nustebimas, migdolinis kūnas, dopamino D1 receptorius, dopamino D2 receptorius
Įvadas
Neuromoduliatorius DA yra svarbus su atlygiu susijusiam mokymuisi ir narkotikų paieškos elgesiui (Schultz, 2002; Wise, 2004), o kaupiami įrodymai rodo, kad DA taip pat gali būti svarbus su baime susijusiam mokymuisi (Lamont ir Kokkinidis, 1998; Guarraci ir kt. ., 1999; Guarraci ir kt., 2000; Pezze ir Feldon, 2000; Vidurinių smegenų DA neuronai projektuoja limbines smegenų sritis, svarbias baimės mokymuisi, o DA lygis šiose smegenų srityse didėja per aversinius įvykius (Abercrombie ir kt., 2001; Kalivas ir Duffy, 2004; Doherty ir Gratton, 2006; Inglis ir Moghaddam , 1989). Be to, kai kurie vidurinės smegenų DA neuronai padidina savo šaudymo dažnį, kad padidėtų aversiniai dirgikliai ir nuspėjamieji signalai (Guarraci ir Kapp, 1995; Horvitz, 1997; Joshua ir kt., 1999). Be to, buvo įrodyta, kad DA palengvina ilgalaikį potenciją, pagrindinį nervinį atminties koreliaciją, srityse, kurios yra svarbios mokymuisi baimės srityje, pvz., hipokampe ir migdoliniame kūne (Bissiere ir kt., 1999; Lemon ir Manahan-Vaughan, 2000; Swant). ir Wagneris, 2008).
Nepaisant pažangos, padarytos siejant DA neuronų fiziologiją su baime, tikslus DA ir jo giminingų receptorių vaidmuo su baime susijusiame mokymesi lieka neišspręstas. Įrodyta, kad į D1R panašių antagonistų injekcijos sistemiškai arba į migdolinį kūną blokuoja su baime susijusio mokymosi įgijimą ar išraišką; tačiau kiti parodė, kad šie vaistai neturi jokio poveikio (Guarraci ir kt., 1999; Greba ir Kokkinidis, 2000; de Oliveira ir kt., 2006). Be to, įrodyta, kad į D1R panašūs agonistai sustiprina arba nedaro įtakos baimės sąlygojimui (Guarraci ir kt., 1999; Greba ir kt., 2000; Inoue ir kt., 2000; de Oliveira ir kt., 2006). Analogiški neatitikimai buvo nustatyti atliekant tyrimus, kuriuose naudojami į D2R panašių receptorių agonistai arba antagonistai (Guarraci ir kt., 2000; Greba ir kt., 2001; Ponnusamy ir kt., 2005; de Oliveira ir kt., 2006). Šie neatitikimai gali atsirasti dėl elgesio metodologijos, nuo dozės priklausomo švirkščiamų vaistų poveikio arba farmakologinių medžiagų pasirinkimo skirtumų. Pavyzdžiui, DA receptorių antagonistai labai skiriasi savo selektyvumu, todėl kai kurie tyrimai gali selektyviau antagonizuoti D2 receptorius, kiti gali labiau antagonizuoti D2, D3 ir D4 receptorius (Missale ir kt., 1998).
Norėdami išsiaiškinti DA vaidmenį su baime susijusiame mokymesi, naudojome peles, neturinčias DA (DD pelės), taip pat peles, neturinčias nei D1R, nei DA D2 receptorių (D2R), ir išbandėme jas baimės sukeltoje nustebimo paradigmoje. Baimės sukeltas išgąsdinimas yra Pavlovo baimės sąlygojimo paradigma, kai neutralus dirgiklis padidina akustinio išgąsčio atsaką po susiejimo su smūgiu kojose (Koch, 1999). Baimės sukeltas išgąstis yra ideali paradigma šiems tyrimams, nes tai nepriklauso nuo šąlančio elgesio vertinimo, kurį sunku išmatuoti hipoaktyvioms DD pelėms (Zhou ir Palmiter, 1995). Kadangi DD peles galima tirti esant DA išeikvotai arba pilnai DA, jos suteikia idealią galimybę ištirti DA vaidmenį mokymosi ir atminties formavime. Be to, naudojant viruso sukeltą Cre rekombinazės tiekimą, DA signalizacija gali būti selektyviai atkurta į specifinius tikslinius regionus, pakartotinai suaktyvinant DD pelių Th alelį (Hnasko ir kt., 2006). Atrankinis DA atkūrimas konkrečiose tikslinėse srityse leidžia įvertinti smegenų sritis, reguliuojamas DA signalizacijos baimės kondicionavimo metu.
Medžiagos ir metodai
Gyvūnai ir gydymas
DD pelės buvo sukurtos taip, kaip aprašyta (Hnasko ir kt., 2006). Trumpai tariant, DD (Thfs/fs; DbhTh/+) pelės turi du neveikiančius tirozino hidroksilazės (Th) alelius, kurie buvo inaktyvuoti įterpus atsparumo neomicinui (NeoR) geną, kurį riboja lox P vietos, į pirmąjį Th geno introną. . Šios pelės taip pat turi vieną nepažeistą dopamino β-hidroksilazės (Dbh) alelį ir vieną Dbh alelį su tiksliniu Th geno įterpimu. Kontroliniai gyvūnai turi bent vieną nepažeistą Th alelį ir vieną nepažeistą Dbh alelį. Nedopaminerginių katecholaminų kiekis yra normalus DD gyvūnams, o visų katecholaminų kiekis yra normalus kontroliniams gyvūnams (Zhou ir Palmiter, 1995; Szczypka ir kt., 1999). Pelės buvo laikomos mišraus C57BL/6 X 129/Sv genetinio fono. Dėl sunkios hipofagijos DD pelėms kasdien (ip) buvo švirkščiama 50 mg/kg L-Dopa, kurios tūris buvo 33 μl/g (Zhou ir Palmiter, 1995), pradedant maždaug nuo 10 dienos po gimdymo. Šios injekcijos atkuria DA funkciją. 8–10 valandų (Szczypka ir kt., 1999). Buvo aprašytos D1R išmušimo (KO) ir D2R KO pelės (Drago ir kt., 1994; Kelly ir kt., 1997). Abi padermės buvo palaikomos C57BL/6 fone. Dėl D1R KO pelių augimo sulėtėjimo jos buvo nujunkytos keturias savaites, o po to šeriamos sudrėkintu maitinimu, kad būtų skatinamas augimas. Visų gyvūnų genotipas buvo nustatytas naudojant PGR analizę. Pelių patinų ir patelių elgsenos tyrimai buvo atlikti nuo 2 iki 5 mėnesių amžiaus. Visos pelės buvo laikomos pagal 12:12 (šviesa: tamsos) ciklą kontroliuojamoje temperatūroje su maistu (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) ir vandeniu ad libitum. Visi elgesio eksperimentai buvo atlikti šviesos ciklo metu. Visos pelės buvo gydomos pagal Nacionalinių sveikatos institutų ir Vašingtono universiteto institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto nustatytas gaires.
Norint įvertinti, ar kiti į D2 panašūs receptoriai yra svarbūs baimės mokymuisi, D2R KO pelėms buvo skiriamas į D2 panašus antagonistas etiklopridas (Sigma, St. Louis, MO) po 0.5 mg/kg (ip). Etiklopridas buvo ištirpintas 0.9, 10% fiziologiniame tirpale ir jo galutinis tūris buvo 2 μl / g. DXNUMXR laukinio tipo (WT) pelėms buvo sušvirkšta nešiklio.
Aparatūra
Garsą slopinančios išgąsčio kameros (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) buvo naudojamos išankstinio impulso slopinimui, išgąsčio atsakams ir baimės sukeltam išgąsdymui matuoti. Stulbinamiems atsakams buvo paimti 65 1 msek rodmenys, pradedant nuo pulso pradžios. Norint išmatuoti atsaką į pėdos smūgį, buvo paimta 500 1 msek rodmenų, pradedant nuo šoko pradžios. Didžiausia atsako amplitudė buvo naudojama apskaičiuoti išankstinio impulso slopinimą, išgąsčio atsaką, baimės sukeltą išgąstį ir šoko reaktyvumą. Balto triukšmo garsą skleidė aukšto dažnio garsiakalbis, esantis kameros lubose. Foninis garsas buvo palaikomas pastoviu 65 dB lygiu. Garso lygis buvo matuojamas decibelais (A skalė), naudojant garso lygio skaitytuvą (RadioShack, Fort Worth, TX). Stulbinančio atsako rodmenų vientisumui užtikrinti buvo naudojamas kalibravimo įrenginys (San Diego Instruments, San Diego, CA). 8 vatų lemputė buvo sumontuota ant užpakalinės dėžutės sienelės, skirta naudoti kaip signalą.
Paleidimo reakcijos kreivės
Po 5 minučių pripratimo gyvūnams buvo atlikta septynių bandymų serija su didėjančiu garso lygiu: nuo 80 iki 120 dB, su 30 sekundžių ITI. Ši serija buvo pristatyta 10 kartų, iš viso 70 bandymų. Visuose bandymuose, išskyrus nulinius bandymus, kuriuose nebuvo garso, garso impulsas buvo 40 msek.
Priešpulsinis slopinimas
Gyvūnams buvo suteiktas 10 minučių pripratimo laikotarpis, po kurio tiriamiesiems buvo atlikti 5 40 ms, 120 dB, vien pulso bandymai. Tada pelėms buvo atlikta 50 bandymų, kurių metu buvo atliktas tik stulbinantis pulsas, vienas iš trijų išankstinio impulso bandymų (5, 10 ir 15 dB virš fono) arba nulinis bandymas, kuriame nebuvo jokio akustinio stimulo. Tarpinis intervalas (ITI) buvo vidutiniškai 15 sek. (5–25 sek. diapazonas). Stulbinantį bandymą sudarė 40 ms, 120 dB baltojo triukšmo impulsas. Išankstinio impulso bandymus sudarė 20 ms trukmės 70, 75 arba 80 dB intensyvumo išankstinis impulsas, kuris prieš 40 ms 120 dB impulsą buvo 100 ms. Išankstinis impulso slopinimas buvo apskaičiuotas kiekvienam priešpulso lygiui, naudojant šią formulę: % slopinimas = [(vidutinis išgąsčio atsakas prieš impulsą / vidutinis išgąsčio atsakas, kai buvo atliktas tik pulsas) × 100]. DD pelės buvo tiriamos, kai DA buvo išeikvota, praėjus 18–24 valandoms po L-Dopa injekcijos.
Baimės sukeltas nustebimas (7 dienų paradigma)
1 dieną (pradinė padėtis), po 5 minučių pripratimo, pelėms buvo atlikta pseudoatsitiktinė 20 bandymų serija, tolygiai padalyta tarp signalo ir be signalo sąlygų. Atliekant bandymus be užuominos, gyvūnams buvo pateiktas 40 ms 105 dB akustinis impulsas. Atliekant signalų bandymus, gyvūnams buvo pateiktas 10 sekundžių šviesos signalas, kuris kartu baigėsi 40 ms 105 dB impulsu. ITI vidutiniškai buvo 120 sek (diapazonas nuo 60 iki 180 sek.).
Treniruotės vyko 2, 4 ir 6 dienomis. Po 10 minučių pripratimo pelėms buvo parodyta 10 signalų šviesos, kuri kartu baigėsi 0.2 mA, 0.5 sek. ITI vidutiniškai buvo 120 sek (diapazonas nuo 60 iki 180 sek.). Bandymo seansai įvyko 3, 5 ir 7 dienomis ir buvo identiški pirmiau aprašytai pradinei sesijai. DD pelėms buvo išeikvota DA, praėjus 18–24 valandoms po paskutinės L-Dopa injekcijos, pradinio lygio, treniruočių ir bandymų metu. L-Dopa buvo švirkščiama po treniruočių, kaip nurodyta figūrų legendose. Baimės sukeltam nustebimui apskaičiuoti buvo naudojama ši formulė: %potencija = [(atsakymų vidurkis bandymų metu / atsakymų vidurkis bandymų be užuominos – 1) × 100].
Baimės sukeltas nustebimas (3 dienų paradigma)
Šios paradigmos 1 ir 3 dienos (pradinė padėtis ir bandymas) buvo identiškos aprašytoms 7 dienų baimės sukeltos nuostabos paradigmai. 2 dieną (treniruotės) pelės gavo 30 porų 10 sekundžių šviesos signalo su 0.2 mA, 0.5 s. ITI vidurkis buvo 120 sek (diapazonas nuo 60 iki 180 sek.). DD pelių DA buvo išeikvota pradinio lygio, treniruočių ir bandymų metu.
Trumpalaikė atmintis
Pradinės ir bandymo sesijos buvo identiškos aprašytoms 7 dienų paradigmai. 2 dieną, po 5 minučių pripratimo, pelėms buvo duota 30 porų 10 sekundžių šviesos, kuri kartu baigėsi 0.5 sekundės 0.2 mA smūgiu. ITI vidutiniškai buvo 120 sekundžių (nuo 60 iki 180). Po treniruotės pelės buvo patalpintos į savo namų narvus 10 minučių prieš bandymą. Trumpalaikė atmintis buvo įvertinta naudojant tą pačią formulę, kuri buvo naudojama baimės sustiprintam nustebimui.
Šoko jautrinimas
Reakcija į be signalo būseną trumpalaikės atminties pradinės padėties ir bandymų seansų metu buvo apskaičiuota kiekvienam gyvūnui, o jautrumui šokui apskaičiuoti buvo panaudota ši formulė: %sensibilizacija = [(vidutinis išgąsčio atsakas bandymo metu / vidutinis išgąsčio atsakas pagal pradinį- 1) × 100].
Cre rekombinazės sukeltas Th geno funkcijos atkūrimas
Izofluranu (1.5–5%) anestezuotos pelės buvo dedamos į stereotaksinį instrumentą (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Th geno funkcijai atstatyti ventralinėje tegmentalinėje srityje rekombinantinis AAV1-Cre-GFP virusas (titras 1.2 × 1012 dalelių/ml) buvo sušvirkštas abipusiai į ventralines vidurines smegenis (koordinatės mm: 3.5 už Bregmos, 0.5 šoninės linijos , 4.5 ventralinis į Bregmą; 0.5 μl/pusrutulis). Specifiniam BLA DA atkūrimui Rekombinantinis CAV2-Cre virusas (titras 2.1 × 1012 dalelių/ml) buvo sušvirkštas abipusiai (koordinatės mm: 1.5 už Bregmos, 3.25 šoninės iki vidurinės linijos, 5 ventralinės nuo Bregmos; 0.5 μmifere) . Buvo paskelbti išsamūs abiejų virusinių vektorių aprašymai (Hnasko ir kt., 2006; Zweifel ir kt., 2008). Virusai buvo švirkščiami per 10 minučių, naudojant 32 dydžio švirkšto adatą (Hamilton, Reno, NV), pritvirtintą prie mikroinfuzijos pompos (WPI, Sarasota, FL).
Imunohistochemistry
Po anestezijos 50 mg/ml natrio pentobarbitalio (0.2–0.3 ml vienam gyvūnui) pelėms buvo perfuzuojama fosfatiniu buferiniu tirpalu, po to 4% paraformaldehidu fosfatiniu buferiniu tirpalu. Išpjaustytos smegenys buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu per naktį, apsaugotos nuo krio 30% sacharozės fosfatiniu buferiniu tirpalu, o po to greitai užšaldytos izopentane. Laisvai plūduriuojančios vainikinės sekcijos (30 μm) buvo imuniniu būdu nudažytos pelės anti-TH (1:1000, Chemicon) arba triušio anti-TH (1:2000, Chemicon) antikūnais. Imunofluorescencija buvo pasiekta naudojant Cy2 arba Cy3 konjuguotus IgG antrinius antikūnus (1:200, Jackson ImmunoResearch). Dažytos sekcijos buvo sumontuotos ant stiklelių, uždengtos ir nufotografuotos vertikaliu šviesaus lauko mikroskopu (Nikon).
Statistinė analizė
Atliktos analizės apėmė pakartotines priemones ir vienpusį ANOVA, Fišerio post-hoc ir Stjudento t testus, kaip nurodyta rezultatuose. Statistinė analizė atlikta naudojant Statistica programinę įrangą (Statsoft, Talsa, Oklahoma).
Rezultatai
DD pelėms būdingas nepakitęs akustinis išgąsčio atsakas ir normalus priešpulso slopinimas
Baimės sukeltam nustebimui reikia nepažeistos akustinės išgąsčio reakcijos ir sensomotorinio blokavimo. Norint nustatyti, ar akustinis išgąsčio atsakas pasikeičia nesant DA, buvo išmatuotas DA nuskriaustų DD pelių (18–24 val. po L-Dopa) atsakas į kelis decibelų garso lygius ir lyginamas su kontrolinėmis grupėmis (1A pav.). Pakartotiniai matavimai ANOVA neparodė pagrindinio genotipo poveikio ir reikšmingos sąveikos tarp genotipo ir garso lygio.
1 pav
DA yra labai svarbus norint išmokti baimės sukelto nustebimo. A, Akustinis kontrolinių (n = 10, juodi kvadratai) ir DD pelių (n = 10, atviri kvadratai) atsakas į skirtingą garso intensyvumą. Atsakymai pateikiami savavališkais vienetais. B, Išankstinio impulso slopinimas buvo išbandytas naudojant 3 skirtingus išankstinio impulso intensyvumus kontrolinėse (n = 10, juodos juostos) ir DD pelėse (n = 10, atviros juostos). Žvaigždutės žymi p<0.05, kartotiniai matai ANOVA. C, schema, iliustruojanti 7 dienų baimės sukeltą nuostabos paradigmą. Pradinėmis ir bandymo dienomis pelėms pseudoatsitiktiniu būdu buvo parodyta 10 signalų be signalo (40 ms trukmės 105 dB stulbinančio impulso pateikimas) ir 10 signalų bandymų (10 sekundžių šviesos signalas, kuris baigiasi kartu su bauginimo impulsu). įsakymas. Treniruočių dienomis pelės gavo 10 porų 10 sekundžių šviesos signalo, kuris kartu baigėsi 0.5 sekundės trukmės, 0.2 mA pėdos smūgiu. Mokymasis buvo vertinamas bandymo dienomis kaip potencingumo procentas, kai bandoma užuomina, lyginant su bandymais be signalo. D, DD pelėms (n = 10, atviros juostos), kurioms buvo suteikta L-Dopa praėjus 3 valandoms po treniruotės (2 ir 4 dienos), nepavyko išmokti (1 ir 2 bandymai). Tačiau, kai DD pelėms buvo sušvirkšta iškart po treniruotės (6 diena), jos patyrė didelį baimės sukeltą išgąstį (3 bandymas). Žvaigždutės žymi p<0.05, kartotiniai matai ANOVA. E, Reaktyvumo smūgiams matavimai treniruočių metu (kontrolė n=10, juodos juostos; DD n=10, atviros juostos). Atsakymai pateikiami savavališkais vienetais. F, schema, iliustruojanti 3 dienų baimės sukeltą nuostabos paradigmą, naudojamą kritiniam laikotarpiui, kuriuo DA yra svarbus, nustatyti. Visos 30 užuominų ir šoko porų buvo duotos vieną treniruočių dieną, o DD pelės buvo gydomos L-Dopa iš karto, praėjus 1 valandai arba 3 valandoms po treniruotės. G, tik kontrolinės (n = 8, vientisos juodos juostos, C) ir DD pelės, kurioms buvo sušvirkšta iškart po treniruotės (n = 7, vertikalios juostelės, 0 val.), bandymo dieną buvo sukeltas baimės. Šis baimės sustiprinto išgąsčio lygis buvo žymiai didesnis nei DD pelėms, kurioms L-Dopa buvo duodama 1 valandą (n = 6, įstrižinės juostelės) arba 3 valandas (n = 6, atviros juostos) po treniruotės. Žvaigždutės žymi p<0.05, lyginant su pradine, Fišerio post-hoc. Visos pateiktos vertės yra vidurkiai ± SEMDA išeikvotas DD ir kontrolinės pelės taip pat buvo tiriamos pagal išankstinio impulso slopinimo paradigmą, kuri dažniausiai naudojama sensorinio variklio valdymo trūkumams nustatyti. Priešpulso slopinimas buvo sustiprintas DD pelėms (1B pav.; pakartotiniai matavimai ANOVA, genotipas: F1, 18=5.37; p<0.05; reikšmingo genotipo pagal išankstinio impulso lygio sąveiką nenustatyta). Šie duomenys rodo, kad DD pelėms netrūksta išgąsčio atsako arba nesumažėja sensomotorinių blokavimo mechanizmų, kai DA yra išeikvota, ir patvirtina jų naudojimą baimės sukeltuose nustebimo eksperimentuose.
Dopaminas yra būtinas kritiniu metu, norint išmokti baimės sukelto nustebimo
Norint nustatyti, ar DA yra būtina norint išmokti baimę skatinančios užduoties, DD ir kontrolinėms pelėms buvo taikoma 7 dienų baimės sustiprinta išgąsčio paradigma (1C pav.). DD pelės buvo apmokytos ir išbandytos DA išeikvotoje būsenoje. Tiriant praėjus 24 valandoms po treniruotės, kontrolinės pelės po vienos treniruotės pasireiškė baimės sustiprintu išgąsčiu, kuris nebuvo pastebėtas DD pelėms (1D pav.; pakartotiniai matavimai ANOVA, genotipas, F1, 18 = 7.4590, p < 0.05). Net ir po papildomos treniruotės DD pelėms nepavyko išreikšti baimės sukelto nustebimo, o kontrolinės pelės ir toliau reiškė tvirtą mokymąsi. Įdomu tai, kad davus L-Dopa iškart po treniruotės 6 dieną, DD pelėms pasireiškė baimės sustiprintas išgąsdinimas, kuris buvo žymiai didesnis nei pradinis (vienpusis ANOVA F1, 18=9.1999, p<0.01) ir nesiskyrė nuo kontrolinių lygių. 1D pav.). DD ir kontrolinių pelių reaktyvumas šoko treniruočių dienomis reikšmingai nesiskyrė tarp genotipų bet kurią treniruočių dieną, o tai rodo, kad DD pelių mokymosi trūkumas atsirado ne dėl nesugebėjimo pajusti pėdos smūgio (1E pav.). Norint apibūdinti kritinį laiko langą. DA veiksmui papildomas tyrimas pakeitė L-Dopa vartojimo laiką. DD ir kontrolinėms pelėms buvo surengta treniruotė, kurią sudarė 30 šviesos šoko porų (1F pav.), tada iš karto, praėjus 1 valandai arba 3 valandoms po treniruotės, buvo sušvirkšta L-Dopa, o jos buvo išbandytos po 24 valandų. DD pelės, kurioms buvo sušvirkšta iš karto po treniruotės, bandymo dieną išreiškė stiprų baimės sukeltą išgąstį, panašų į kontrolinės grupės, tuo tarpu DD pelėms, kurioms buvo sušvirkšta L-Dopa praėjus 1 valandai arba 3 valandoms po treniruotės, nesimoko (1G pav.; kartotinės priemonės ANOVA; gydymas × seansas F3, 23=5.1032, p<0.01). Šie duomenys rodo, kad DA yra būtinas per ribotą laikotarpį norint mokytis baimės sukeltoje netikėtumo paradigmoje. Tačiau DA nėra būtina norint išreikšti baimių atmintį, nes DD gyvūnai visada buvo tiriami nesant DA. Be to, DA nebuvimas nesumažina šoko reaktyvumo.
D1R būtinas baimės sukeltam nustebimui
Norėdami ištirti, kurie DA receptoriai yra būtini baimės sukeltam nustebimui, pirmiausia išanalizavome D1R KO peles. D1R KO ir kontrolinės laukinio tipo (WT) pelės buvo išbandytos keliais išgąsčio pulso intensyvumo lygiais, kaip aprašyta DD pelėms (2A pav.). Nebuvo reikšmingo skirtumo tarp D1R KO ir WT pelių jokiu tirtu garso lygiu, o tai rodo, kad D1R KO pelių akustinis išgąsčio atsakas yra nepakitęs. Sutikdami su ankstesniais tyrimais, D1R KO pelėse stebėjome nepažeistą išankstinio impulso slopinimą (Ralph-Williams ir kt., 2002). Išbandžius 7 dienų baimės sustiprintą išgąsčio paradigmą, D1R KO pelėms nepavyko išreikšti mokymosi nė vieną iš bandymo dienų (2B pav.; pakartotiniai matavimai ANOVA genotipas × bandymo diena F3, 48=6.28; p<0.01), o WT. 2 ir 3 bandymo dienomis pelėms buvo reikšmingas baimės sustiprintas išgąstis (p<0.05 ir p<0.01, kontrolinė pradinė linija, atitinkamai, palyginti su 2 ir 3 testu, Fisher post-hoc). D1R KO pelėms buvo didesnis šoko reaktyvumas nei WT per visas tris treniruočių dienas (2C pav.; pakartotinės priemonės ANOVA, genotipas F1, 16=10.18; p<0.01; reikšmingo genotipo × treniruotės dienos nepastebėta). Taigi, nors D1R KO pelių reakcija į pėdų smūgį buvo didesnė, palyginti su WT pelėmis, net po 3 dienų treniruotės jos žymiai sumažino baimės sukeltą nuostabą. Šie duomenys rodo D1R KO gyvūnų mokymosi sutrikimą ir įpareigoja D1R tarpininkaujant DA poveikiui nuo užuominos priklausomoje baimės sąlygoje. 2 pav. D1R KO pelėms labai pablogėjo mokymasis. A, D1R WT (n = 9, juodi kvadratai) ir KO (n = 9, atviri kvadratai) pelių akustinis išgąsčio atsakas. B, 7 dienų baimės sukeltos nuostabos paradigmos su D1R pelėmis rezultatai. D1R WT pelėms (n = 9, vientisos juodos juostos), bet ne D1R KO pelėms (n = 9, atviros juostos), 3 bandymo dieną buvo sukelta baimė. Žvaigždutės žymi p<0.01, lyginant KO su WT, Fisher po hoc. C, smūgio reaktyvumo matavimai. D1R KO pelės (n = 9, atviros juostos) turi didesnį atsaką į pėdų smūgį nei WT (n = 9, vientisos juostos). Žvaigždutės žymi p<0.05, kartotiniai matai ANOVA. Visos nurodytos reikšmės yra vidurkiai ± SEM. Išgąsdinimo ir reaktyvumo į šoką atveju skaičiai pateikiami savavališkais vienetais.
D2R KO pelėms baimės sukeltas išgąstis yra nepakitęs, tačiau reikia kitų į D2 panašių receptorių
Norint ištirti, ar D2 tipo receptoriai yra būtini baimės sukeltam išgąsdinimui, D2R KO ir WT pelėms buvo atlikti išgąsčio atsako ir baimės sustiprinto išgąsčio testai. WT ir D2R KO pelės turi lygiavertį išgąsčio atsaką visais tirtais dB lygiais, o tai rodo, kad D2R KO pelių akustinis išgąsčio atsakas yra nepažeistas (3A pav.). Panašiai kaip D1R KO pelės, mes pastebėjome, kad D2R KO pelės turi nepakitusią išankstinį impulso slopinimą (Ralph-Williams ir kt., 2002). Išbandžius 7 dienų baimės sukeltą išgąsčio paradigmą, tiek WT, tiek D2R KO pelėms visas 3 bandymo dienas buvo lygiavertis baimės sukeltas išgąstis (3B pav.), o reaktyvumas šoko grupėse nesiskyrė (3C pav.). Šie duomenys rodo, kad D2R nėra būtinas norint išmokti baimės sukelto nustebimo.
3 pav
D2R KO pelės turi nepakitusią baimės sustiprintą išgąstį. A, D2R WT (n = 8, juodi kvadratai) ir KO pelių (n = 8, atviri kvadratai) akustinis išgąsčio atsakas. B, 7 dienų baimės sukeltos nuostabos paradigmos su D2R pelėmis rezultatai. Tiek WT (n = 8, vientisos juostos), tiek KO (n = 8, atviros juostos) pelėms buvo būdingas didelis baimės sukeltas išgąsčio lygis. C, Reaktyvumo smūgiams matavimai treniruotės metu (WT, n=8, vientisos juostos; KO, n=8, atviros juostos). D, WT ir D2R KO pelėms (kiekviena n = 11) buvo taikoma 3 dienų baimės sukelta išgąsčio paradigma. D2R KO pelėms prieš treniruotę buvo sušvirkštas etiklopridas (0.5, 0.01 mg / kg), o bandymų metu jos neišreiškė baimės sustiprinto nustebimo. Žvaigždutės žymi p<2, KO, palyginti su WT, Fisher post-hoc. Visos nurodytos reikšmės yra vidutinės ± SEM. Atsakymai į išgąstį ir reaktyvumą į šoką pateikiami savavališkais vienetais. Ankstesni tyrimai parodė, kad į D2000 panašių antagonistų skyrimas sistemiškai arba tiesiai į migdolinį kūną sumažina sąlyginę baimę (Guarraci ir kt., 2001; Greba ir kt., 2005; Ponnusamy ir kt., 2). Norint ištirti jų ir mūsų rezultatų neatitikimą, D2R KO pelėms buvo skiriamas į D0.5R panašus antagonistas etiklopridas (3, 24 mg / kg; tiekiamas ip), prieš treniruojantis pagal 2 dienų baimės sukeltą nuostabos paradigmą. Išbandžius 3 valandas po treniruotės, WT pelėms, kurioms buvo sušvirkšta transporto priemonė, pasireiškė stiprus baimės sustiprintas išgąsdinimas, o pelėms, kurioms buvo sušvirkštas etiklopridas, D1R KO, mokymasis nepasireiškė (20D paveikslas; pakartotiniai matai ANOVA genotipas × F7.5698 diena, 0.05 = 1, p < 2). . Šie rezultatai rodo, kad be D2R, į DXNUMX panašių DA receptorių šeimos narys, bet ne DXNUMXR, yra būtinas baimės sukeltam nustebimui.
Trumpalaikė atmintis yra sutrikusi DD ir D1R KO pelėms
DA reikalingas per vieną valandą po treniruotės, kad išmoktų baimės sukeltą nuostabą. Šių eksperimentų metu ilgalaikė atmintis dėl baimės sukelto išgąsčio buvo ištirta praėjus 24 valandoms po treniruotės. Mes nusprendėme patikrinti, ar DA taip pat reikalinga trumpalaikei atminčiai. DD gyvūnams ir kontrolei buvo taikoma 2 dienų paradigma, kuri išbandė trumpalaikę atmintį praėjus 10 minučių po treniruotės (4A pav.). Bandymo dieną buvo įvertintas jautrumas smūgiams ir trumpalaikė atmintis. Trumpalaikė atmintis buvo apibrėžiama kaip nuo signalo priklausomas išgąsčio reakcijų padidėjimas, o jautrumas smūgiams yra nuo konteksto priklausomas akustinio išgąsčio atsako po kojos smūgio stiprinimas, nepriklausomas nuo signalo (McNish ir kt., 1997; Richardson, 2000; Risbrough ir kt. al., 2008). DD pelėms buvo žymiai mažesnis jautrumas smūgiams nei kontrolinės (4B pav., p<0.05; Stjudento t testas). Panašiai kontrolinės pelės parodė tvirtą trumpalaikę atmintį, kurios nebuvo DD pelėms (4B pav., p<0.05, DD palyginti su kontrole, Stjudento t testas). Šie duomenys rodo, kad DA reikalinga trumpalaikei ir ilgalaikei baimės sukelto išgąsčio atminčiai. Be to, DA yra būtinas nuo konteksto priklausomam baimės mokymuisi, kaip nustatyta jautrinant šoką. Šie duomenys taip pat patvirtina ankstesnę išvadą, kad DA reikalingas kritiniu laikotarpiu, kad stabilizuotųsi baimės sąlygojamos atminties pėdsakai. 4 pav. Trumpalaikė atmintis ir jautrumas smūgiams priklauso nuo DA. A, elgesio paradigmos dizainas. 1 dieną buvo gauti pradiniai išgąsčio atsakai. 2 dieną pelės gavo visas 30 lazdelių ir šoko porų, o po to buvo grąžintos į savo namų narvą 10 minučių prieš bandymą. B, kontrolinės pelės (n = 10, juodos juostos) turi žymiai didesnį jautrumą smūgiams ir baimės sukeltą išgąstį, palyginti su DD (n = 10, atviros juostos). Žvaigždutės žymi p<0.05; Studento t testas. C, WT (n = 7, juodos juostos) ir D1R KO (n = 7, atviros juostos) pelių jautrumas smūgiams yra nepakitęs. Tik WT trumpalaikės atminties testo metu išgąsdino baimę. Žvaigždutės žymi p<0.05, KO, palyginti su WT; Studento t testas. D, WT (n = 8, juodos juostos) pelės turi žymiai didesnį jautrumą smūgiams nei D2R KO (n = 8, atviros juostos). Baimės sukeltos WT ir D2R KO pelių lygiai yra panašūs. Žvaigždutės žymi p<0.05, KO, palyginti su WT; Studento t testas. Visos nurodytos vertės yra vidurkiai ± SEMT Norint ištirti, kurie receptorių potipiai tarpininkauja DA vaidmeniui trumpalaikėje atmintyje ir jautrinant šoką, D1R ir D2R KO pelės buvo išbandytos pagal tą pačią paradigmą kaip ir DD pelės. D1R KO pelių trumpalaikės atminties lygis buvo žymiai mažesnis nei WT pelių (4C pav., p<0.05; Stjudento t testas); tačiau nebuvo reikšmingo skirtumo tarp D1R KO ir kontrolinių pelių jautrumo šokui lygių, o tai rodo, kad nuo konteksto priklausomas mokymasis buvo nepakitęs. D2R KO pelių jautrumo smūgiams lygis buvo žymiai mažesnis nei WT (4D pav., p<0.05; Studento t testas), tačiau reikšmingo skirtumo tarp WT ir KO pelių trumpalaikės atminties lygių nebuvo.
DA atkūrimas bazolaterinėje migdolinėje dalyje yra pakankamas, kad būtų galima trumpalaikė atmintis
Bazolaterinis migdolinis kūnas yra labai svarbus norint įgyti nuo užuominos priklausančią baimės atmintį (Maren, 2003; Maren ir Quirk, 2004; Sigurdsson ir kt., 2007). Be to, yra įrodymų, rodančių svarbų DA vaidmenį palengvinant bazolaterinės migdolinės dalies funkciją (Rosenkranz ir Grace, 2002; Bissiere ir kt., 2003; Marowsky ir kt., 2005). Norint ištirti, ar DA bazolateralinėje migdolinėje dalyje reikalingas baimės sukeltam išgąsdymui, DD ir kontrolinėms pelėms buvo sušvirkšta abipusiai CAV2-Cre vektorius į bazolateralinę migdolinę dalį (5A pav.). Šis vektorius retrogradiškai pernešamas iš injekcijos vietos į DA neuronus, kur atkuria Th geno aktyvumą (Hnasko ir kt., 2006). Imunohistochemija atskleidė, kad TH buvo CAV2-Cre sušvirkštų DD pelių bazolateraliniame migdoliniame kūne (5J pav.), tačiau jo nebuvo nugaros juostoje ir branduolyje (5G pav.). TH pirmiausia buvo atkurtas nedideliam skaičiui neuronų uodeginėse ventralinės tegmentinės srities dalyse (5D pav.). Sušvirkštose DD pelėse paprastai buvo mažiau nei 10 TH teigiamų ląstelių 30 μm pjūvyje, o tai atitinka nedidelį migdolą projekcuojančių DA neuronų skaičių, aprašytą literatūroje (Ford ir kt., 2006; Lammel ir kt.). , 2008; Margolis ir kt., 2008).
5 pav
Regionui būdingas endogeninės TH ekspresijos atkūrimas DD pelėse. A, schema, iliustruojanti bazolaterinio migdolinio kūno (BLA) gelbėjimo eksperimentų injekcijos koordinates. DD (n = 7) ir kontrolinės (n = 7) pelės buvo sušvirkštos abipusiai į BLA su CAV2-Cre vektoriais (0.5, 1 uL / pusrutulyje). B, schema, iliustruojanti ventralinės tegmentinės srities (VTA) gelbėjimo eksperimentų injekcijos koordinates. AAV0.5-Cre-GFP buvo švirkščiamas abipusiai (7, 10 uL / pusrutulyje) į DD (n = 2001) ir kontrolinių pelių (n = 4) VTA. Skaičiai pritaikyti iš Paxinos ir Franklin, 40. C–E. TH dažymo vainikinėje pjūvėje palyginimas (4x padidinimas), rodantis virusu sušvirkštos WT kontrolės, BLA sušvirkštos DD ir VTA sušvirkštos DD ventralines vidurines smegenis. C, TH imunohistochemija kontrolinėse vidurinėse smegenyse rodo DA neuronų buvimą VTA ir substantia nigra pars compacta (SNpc; pažymėta rodykle). D, BLA išgelbėtos DD pelės VTA turėjo nedaug TH teigiamų neuronų. Įdėklas yra 10 kartų padidintas langelio regionas, rodantis TH ekspresiją somoje ir procesuose. E, VTA išgelbėtos DD pelės turėjo TH ekspresiją daugiausia VTA. Atkreipkite dėmesį, kad SNpc nėra TH dažymo (pažymėta rodykle). F – H, vainikinė pjūvis (XNUMX kartus padidinimas) iš kontrolinių WT virusu sušvirkštų kontrolinių, BLA išgelbėtų ir VTA išgelbėtų DD pelių, rodančių TH ekspresiją nugariniame striatum ir nucleus accumbens. F, WT virusu sušvirkšta kontrolė turi TH ekspresiją visoje nugaros dalyje (pažymėta rodykle) ir ventraliniame striatum. G, BLA išgelbėtų DD pelių striatumoje TH ekspresijos neaptikta. H, VTA išgelbėtos DD pelės turi TH ekspresiją nucleus accumbens, o tik nugarinėje juostoje dažymas yra menkas (pažymėtas rodykle). I–K, vainikinis pjūvis (XNUMX kartų padidinimas), rodantis TH ekspresiją virusu sušvirkštų WT kontrolinių, BLA išgelbėtų ir VTA išgelbėtų DD pelių BLA.
Pelėms, kurioms buvo sušvirkštas bazolaterinis migdolinis kūnas, buvo taikoma 3 dienų baimės sustiprinta išgąsčio paradigma. Trumpalaikė atmintis ir jautrumas smūgiams buvo įvertinti praėjus 10 minučių po treniruotės, o ilgalaikė atmintis dėl baimės sukelto išgąsčio buvo įvertinta praėjus 24 valandoms po treniruotės (6A pav.). Įdomu tai, kad bazolaterinės amygdala sušvirkštoms DD pelėms buvo atkurta tik trumpalaikė atmintis. Trumpalaikės atminties lygis buvo toks pat kaip kontrolinių, tačiau ilgalaikės atminties (p<0.05; Stjudento t testas) ir jautrumo smūgiams (p<0.05; Stjudento t testas) lygiai buvo žymiai mažesni nei kontrolinių. Treniruotės metu šoko reaktyvumo lygiai buvo vienodi tarp grupių (kontrolė: 1613±333, palyginti su BLA išgelbėtomis DD: 1758±260). Šie duomenys rodo, kad DA projekcijos į bazolateralinę migdolinę dalį, kylančios daugiausia iš ventralinės tegmentinės srities uodeginio aspekto, yra pakankamos trumpalaikei baimės atminčiai įgyti, tačiau DA projekcijos į kitas žievės ar limbines smegenų sritis greičiausiai yra būtinos kontekstinis mokymasis ir ilgalaikis baimės atminties pėdsakų stabilizavimas. 6 pav. Basolaterinės migdolinės dalies (BLA) išgelbėtos DD pelės atkūrė trumpalaikę atmintį, o ventralinės tegmentinės srities (VTA) išgelbėtos DD pelės visiškai atkūrė mokymąsi. A, Virusu sušvirkštoms WT kontrolei (n = 7) ir BLA išgelbėtoms DD pelėms (n = 7) buvo taikoma 3 dienų baimės sustiprinta nustebimo paradigma. Kairėje, BLA išgelbėtų pelių jautrumas šokui yra žymiai mažesnis. Vidutinė trumpalaikė atmintis (STM) buvo atkurta iki kontrolinio lygio BLA išgelbėtose pelėse. Teisingai, ilgalaikės atminties (LTM), įvertintos praėjus 24 valandoms po treniruotės, BLA išgelbėtose pelėse nėra. B, WT kontrolės (n = 10) ir VTA išgelbėtų DD pelių (n = 7) rezultatai 3 dienų baimės sukeltos nuostabos paradigmoje. Kairėje VTA išgelbėtų DD pelių jautrumas šokui reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolinės. Viduryje ir dešinėje STM ir LTM atminties lygiai buvo tokie pat kaip ir VTA gelbėjimo pelių kontrolė. Žvaigždutės žymi p<0.05, gelbėjimo ir kontrolės, Stjudento t-testas. Visos nurodytos vertės yra vidurkiai ± SEM
Mokymuisi pakanka atstatyti TH į ventralinės tegmentinės srities DA neuronus
Yra dvi pagrindinės DA grandinės, kylančios iš ventralinių vidurinių smegenų; mezostrialinė grandinė, pirmiausia kylanti iš substantia nigra pars compacta, ir mezokortikolimbinė grandinė, pirmiausia kilusi iš ventralinės tegmentinės srities. Mezokortikolimbinė grandinė plačiai nukreipta į smegenų branduolius, kurie, kaip žinoma, yra svarbūs nuo užuominos priklausomam baimės sąlygojimui, įskaitant bazolaterinę migdolinę dalį (Bjorklund ir Dunnett, 2007; Lammel ir kt., 2008). Ištirti, ar reikalingas išsamesnis mezokortikolimbinio DA atstatymas ilgalaikei atminčiai ir šoko jautrinimui; DD ir kontrolinės pelės buvo sušvirkštos abipus AAV1-Cre-GFP vektoriaus į ventralinę tegmentinę sritį, kad specifiškai aktyvuotų endogeninį Th geną (5B pav.).
Imunohistochemija buvo naudojama norint nustatyti, kurie DA neuronai ir kurie taikiniai atkūrė TH ekspresiją. Neišgelbėtose DD pelėse TH dažymo nėra (Hnasko ir kt., 2006). Imunohistochemija atskleidė, kad TH atkūrimas DD pelėse, kurioms buvo sušvirkšta ventralinė tegmentinė sritis, buvo labai specifinė ventralinei tegmentinei sričiai ir jos taikiniams (5E, H, K pav.). Nugaros striatum, kuris yra pagrindinis DA neuronų, kylančių iš substantia nigra pars compacta, taikinys buvo menkas TH dažymas (5H pav.), o branduolys accumbens ir bazolaterinis migdolinis kūnas turėjo tvirtą TH ekspresiją (5H pav., K).
Pelėms, kurioms buvo sušvirkšta ventralinė tegmentinė sritis, buvo taikoma ta pati 3 dienų baimės sustiprinta išgąsčio paradigma, kaip ir pelėms, kurioms buvo sušvirkštas bazolaterinis migdolinis kūnas (6B pav.). Šoko jautrinimas, trumpalaikė atmintis ir ilgalaikė atmintis buvo atkurtos iki kontrolinio lygio DD pelėse, kurioms buvo sušvirkšta pilvo tegmentinė sritis. Šoko reaktyvumas treniruočių metu tarp grupių buvo vienodas (kontrolė: 1653±268, palyginti su VTA išgelbėtu DD: 1602±198). Šie duomenys rodo, kad DA projekcijos iš ventralinės tegmentinės srities yra pakankamos, kad susidarytų trumpalaikė ir ilgalaikė baimės atmintis, taip pat nuo konteksto priklausomas šoko jautrumas.
Diskusija
Šie rezultatai rodo, kad DA reikalinga baimės sąlygojimui, matuojant baimės sukeltu nustebimu. DD pelėms nepavyko parodyti baimės sustiprinto išgąsčio, nebent DA buvo atkurta iškart po treniruotės. DD pelėms taip pat sutrikusi trumpalaikė atmintis ir jautrumas smūgiams. Svarbu tai, kad išankstinio impulso slopinimas nebuvo mažesnis DA išeikvotoms DD pelėms, o tai rodo, kad, jei nėra DA, sensomotorinis valdymas nesumažėja. Ankstesni tyrimai parodė, kad psichostimuliatoriai, kurie sustiprina DA perdavimą, gali sumažinti išankstinio impulso slopinimą (Schwarzkopf ir kt., 1992; Bubser ir Koch, 1994; Ralph ir kt., 1999; Swerdlow ir kt., 2006; Doherty ir kt., 2007) ir kiti įrodė, kad farmakologinis dopamino receptorių slopinimas sustiprina priešpulsinį slopinimą (Schwarzkopf ir kt., 1993; Depoortere ir kt., 1997). Remiantis šiais duomenimis, DD pelėms buvo nedidelis, bet reikšmingas išankstinio impulso slopinimo padidėjimas, palyginti su kontrolinėmis pelėmis. Ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad farmakologinis DA receptorių slopinimas gali sumažinti akustinį išgąsčio atsaką (Davis ir Aghajanian, 1976; Schwarzkopf ir kt., 1993). Dopamino išeikvotų DD pelių akustinės išgąsčio reakcijos reikšmingai nepasikeitė; tačiau buvo tendencija, kad atsakas sumažėjo, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, ypač esant dideliam stimulo intensyvumui, kaip ir ankstesnėse ataskaitose (Schwarzkopf ir kt., 1993).
Čia pateikti duomenys aiškiai parodo, kad DA nėra svarbi nuo užuominos priklausomai baimės atminčiai gauti ar išreikšti, nes DD pelėms bandymo sesijos metu nereikia DA, kad išreikštų baimės sustiprintą išgąstį, kuri anksčiau buvo įgyta suleidus L-Dopa iškart po to. mokymas. Be to, mūsų eksperimentai prieštarauja, kad DA būtų reikalingas pradiniam stimulų apdorojimui treniruočių metu, nes DD pelėms per visas treniruotes buvo išeikvotas dopamino. Vietoj to, mūsų duomenys rodo, kad DA yra būtina ankstyvam atminties pėdsakų stabilizavimui, nes DD pelės neišreiškia trumpalaikės atminties, o ilgalaikė atmintis matoma tik tada, kai L-Dopa skiriama nedelsiant, bet ne 1 val. mokymas. Tikėtina, kad DD pelėms sušvirkštus L-Dopa iš karto po treniruotės, atminties pėdsakai stabilizuojasi, leidžiant jai patekti į ilgalaikę formą. Aversyvūs dirgikliai sukelia ilgalaikį DA lygio padidėjimą smegenų regionuose, kurie yra labai svarbūs baimei sąlygoti, o tai leistų taip stabilizuoti baimės atmintį (Abercrombie ir kt., 1989; Kalivas ir Duffy, 1995; Doherty ir Gratton, 1997; Inglis ir Moghaddam, 1999). Remiantis mūsų duomenimis, kiti parodė, kad DA funkcijos manipuliacijos po treniruotės keičia su baime susijusią atmintį (Bernaerts ir Tirelli, 2003; Lalumiere ir kt., 2004; LaLumiere ir kt., 2005).
Mūsų išvados rodo, kad baimės sukeltam nustebimui reikalingi keli DA receptorių potipiai. D1R KO pelėms trūksta trumpalaikės ir ilgalaikės atminties dėl baimės sukelto išgąsčio, o tai rodo lemiamą šio receptorių potipio vaidmenį tarpininkaujant DA poveikiui mokantis nuo užuominos priklausomo baimės. Įdomu tai, kad nuo konteksto priklausomas baimės mokymasis D1R KO pelėse buvo nepakitęs. Šie duomenys patvirtina kitus tyrimus, rodančius, kad į D1R panašūs antagonistai susilpnina mokymąsi dėl baimės, nepaveikdami jautrumo šokui, ir parodo, kad tų eksperimentų farmakologinės manipuliacijos buvo būdingos D1R (Lamont ir Kokkinidis, 1998; Guarraci ir kt., 1999). . Šie duomenys taip pat atitinka tyrimus, įrodančius lemiamą D1R vaidmenį kitose nuo užuominų priklausančiose mokymosi paradigmose (Smith ir kt., 1998; Eyny ir Horvitz, 2003).
D2R KO buvo nepažeistas baimės sustiprintas nustebimas, tačiau jam trūko jautrumo smūgiams. Greba ir kt. (2001) parodė, kad intramigdalinis D2R antagonizmas sumažino jautrumą šokui ir padidino baimės išgąstį, tačiau nepaveikė pradinio išgąsčio ar atsako į pėdų šoką. D2R aktyvinimas sukelia ilgalaikį BLA potenciją, kuri tikriausiai būtų gyvybiškai svarbi baimės sukeltai išgąsčio atminčiai (Bissiere ir kt., 2003). Mūsų duomenys rodo, kad D2R nėra būtinas nuo užuominos priklausomam baimės mokymuisi, o šis DA receptorių potipis yra svarbus nuo konteksto priklausomam šoko jautrinimui. Sistemiškai sušvirkštus D2R KO pelėms į D2 panašų antagonistą etiklopridą prieš treniruotę, išvengta baimės sustiprinto išgąsčio; todėl tikėtina, kad kiti į D2R panašūs receptoriai, kuriuos taip pat slopina etiklopridas, yra labai svarbūs baimės sukeltam nustebimui (Sigala ir kt., 1997; Bernaerts ir Tirelli, 2003; Laviolette ir kt., 2005; Swant ir Wagner , 2006). Taigi ankstesniuose tyrimuose D2 tipo antagonistų sukeltos nuo užuominos priklausomo mokymosi sutrikimai gali būti siejami su šiais vaistais, slopinančiais kitus D2R šeimos narius.
Dėl selektyvaus endogeninio TH atstatymo ventralinėje tegmentinėje srityje buvo atkurtas DD pelių mokymasis. Imunohistochemija parodė, kad TH buvo atkurtas svarbiuose limbiniuose branduoliuose, tokiuose kaip branduolys accumbens ir bazolaterinis migdolinis kūnas, bet ne nugaros striatum. Be to, substantia nigra pars compacta buvo labai mažai TH teigiamų neuronų. Šie duomenys rodo, kad DA iš ventralinės tegmentinės srities neuronų yra svarbi baimių ir konteksto sąlygoms.
Pelės, kurios selektyviai atkūrė DA bazolaterinėje migdolinėje dalyje, išreiškė trumpalaikę atmintį, bet ne ilgalaikę atmintį ar jautrumą smūgiams. Ankstesni tyrimai parodė, kad DA palengvina migdolinio kūno funkciją, pakeisdama GABAerginį slopinamąjį tonusą, ir šį poveikį lemia arba D1R, arba D2R (Bissiere ir kt., 2003; Kroner ir kt., 2005; Marowsky ir kt., 2005). Čia pateikti duomenys rodo, kad DA bazolaterinėje amygdaloje yra labai svarbi norint įgyti trumpalaikę atmintį dėl baimės sukelto išgąsčio, tačiau to nepakanka ilgalaikiam atminties stabilumui. Trumpalaikės atminties atkūrimą skatina nedidelis bazolaterinių migdolą projekcuojančių DA neuronų skaičius, sklindantis iš ventralinės tegmentinės srities. Plačiau paplitęs endogeninio TH atkūrimas ventralinėje tegmentinėje srityje išgelbėtose DD pelėse lėmė nepažeistą trumpalaikę ir ilgalaikę atmintį; todėl greičiausiai reikia atkurti TH į kitas mezokortikolimbines grandines, kad būtų sukurta ilgalaikė baimės sukelto nustebimo atmintis. Ankstesni tyrimai rodo, kad branduolys accumbens ir priekinė žievė taip pat gali būti svarbūs DA taikiniai baimės kondicionavimo metu (Kalivas ir Duffy, 1995; Murphy ir kt., 2000; Pezze ir kt., 2003; LaLumiere ir kt., 2005; Laviolette ir kt. al., 2005; Floresco ir Tse, 2007). Todėl gali būti, kad norint formuoti ilgalaikę atmintį, reikalingas DA signalizavimas branduolio branduolyje arba prefrontalinėje žievėje.
Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrime buvo panaudotas genetinių pelių modelių, farmakologijos ir regionui būdingos funkcijos gelbėjimo derinys, siekiant parodyti, kad DA reikalinga baimės sukeltam išgąsdymui, nuo signalo priklausomai baimės sąlygojamai užduočiai. Šios išvados pabrėžia svarbų šio neurotransmiterio vaidmenį už atlygio apdorojimo ribų. Be to, mūsų tyrimas rodo, kad reikia, kad DA veiktų kelis DA receptorius vienu metu keliuose smegenų regionuose, kad būtų galima sąlygoti nuo signalo priklausomą baimę. Naujausi tyrimai atskleidė, kad ventralinės tegmentinės srities DA neuronai labai skiriasi savo molekulinėmis ir fiziologinėmis savybėmis, atsižvelgiant į tikslinę vietą (Ford ir kt., 2006; Margolis ir kt., 2006; Bjorklund ir Dunnett, 2007; Lammel ir kt., 2008); Margolis ir kt., 2008). Mūsų atlikti eksperimentai, kurių metu Th genas buvo selektyviai suaktyvintas DA neuronuose, išsikišusiuose į bazolaterinę migdolinę dalį, atskleidžia, kad jie yra maža, atrinkta ventralinės tegmentinės srities neuronų populiacija, o ne DA neuronų, išsikišančių į kitus smegenų regionus, kolateralės. Mūsų duomenys kartu su tyrimais, rodančiais DA neuronų populiacijų nevienalytiškumą, pabrėžia būtinybę suprasti kiekvienos iš šių atskirų DA grandinių vaidmenį. Išplėtus žinias apie daugybę elgesio ir fiziologinių DA funkcijų, įtraukiant su baime susijusį mokymąsi, galima geriau suprasti vyraujančius su baime susijusius sutrikimus, tokius kaip potrauminio streso sutrikimas, obsesinis-kompulsinis sutrikimas ir generalizuotas nerimo sutrikimas.
Padėka
Šį tyrimą iš dalies palaikė Visuomenės sveikatos tarnyba, Nacionalinės tyrimų tarnybos apdovanojimas, T32 GM07270, Nacionalinis bendrųjų medicinos mokslų institutas ir NIH Nacionalinių bendrųjų medicinos mokslų institutų stipendija 4 R25 GM 058501-05. Dėkojame Ilene Bernstein, Lisa Beutler, Charles Chavkin ir Larry Zweifel už naudingus komentarus apie rankraštį, Albertui Quintanai už pagalbą histologijoje ir Valerie Wall už pelių kolonijų priežiūrą. Taip pat dėkojame dr. Migueliui Chillonui (Barselonos Autonomos Universiteto CBATEG vektorių gamybos padalinys) už CAV2 ir Matthew'u'ui Peru už AAV1 virusą.
Nuorodos
1. Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, Zigmond MJ. Differential effect of stress on in vivo dopamine release in striatum, nucleus accumbens, and medial frontal cortex. J Neurochem. 1989;52:1655–1658. [PubMed]
2. Bernaerts P, Tirelli E. Facilitatory effect of the dopamine D4 receptor agonist PD168,077 on memory consolidation of an inhibitory avoidance learned response in C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 2003;142:41–52. [PubMed]
3. Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. Dopamine gates LTP induction in lateral amygdala by suppressing feedforward inhibition. Nat Neurosci. 2003;6:587–592. [PubMed]
4. Bjorklund A, Dunnett SB. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 2007;30:194–202. [PubMed]
5. Bubser M, Koch M. Prepulse inhibition of the acoustic startle response of rats is reduced by 6-hydroxydopamine lesions of the medial prefrontal cortex. Psychopharmacology (Berl) 1994;113:487–492. [PubMed]
6. Davis M, Aghajanian GK. Effects of apomorphine and haloperidol on the acoustic startle response in rats. Psychopharmacology (Berl) 1976;47:217–223. [PubMed]
7. de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML. Dopamine D2 receptor mechanisms in the expression of conditioned fear. Pharmacol Biochem Behav. 2006;84:102–111. [PubMed]
8. Depoortere R, Perrault G, Sanger DJ. Potentiation of prepulse inhibition of the startle reflex in rats: pharmacological evaluation of the procedure as a model for detecting antipsychotic activity. Psychopharmacology (Berl) 1997;132:366–374. [PubMed]
9. Doherty JM, Masten VL, Powell SB, Ralph RJ, Klamer D, Low MJ, Geyer MA. Contributions of Dopamine D1, D2, and D3 Receptor Subtypes to the Disruptive Effects of Cocaine on Prepulse Inhibition in Mice. Neuropsychopharmacology. 2007;12:12.
10. Doherty MD, Gratton A. NMDA receptors in nucleus accumbens modulate stress-induced dopamine release in nucleus accumbens and ventral tegmental area. Synapse. 1997;26:225–234. [PubMed]
11. Drago J, Gerfen CR, Lachowicz JE, Steiner H, Hollon TR, Love PE, Ooi GT, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP, et al. Altered striatal function in a mutant mouse lacking D1A dopamine receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:12564–12568. [PMC free article] [PubMed]
12. Eyny YS, Horvitz JC. Opposing roles of D1 and D2 receptors in appetitive conditioning. J Neurosci. 2003;23:1584–1587. [PubMed]
13. Floresco SB, Tse MT. Dopaminergic regulation of inhibitory and excitatory transmission in the basolateral amygdala-prefrontal cortical pathway. J Neurosci. 2007;27:2045–2057. [PubMed]
14. Ford CP, Mark GP, Williams JT. Properties and opioid inhibition of mesolimbic dopamine neurons vary according to target location. J Neurosci. 2006;26:2788–2797. [PubMed]
15. Greba Q, Kokkinidis L. Peripheral and intraamygdalar administration of the dopamine D1 receptor antagonist SCH 23390 blocks fear-potentiated startle but not shock reactivity or the shock sensitization of acoustic startle. Behav Neurosci. 2000;114:262–272. [PubMed]
16. Greba Q, Munro LJ, Kokkinidis L. The involvement of ventral tegmental area cholinergic muscarinic receptors in classically conditioned fear expression as measured with fear-potentiated startle. Brain Res. 2000;870:135–141. [PubMed]
17. Greba Q, Gifkins A, Kokkinidis L. Inhibition of amygdaloid dopamine D2 receptors impairs emotional learning measured with fear-potentiated startle. Brain Res. 2001;899:218–226. [PubMed]
18. Guarraci FA, Kapp BS. An electrophysiological characterization of ventral tegmental area dopaminergic neurons during differential pavlovian fear conditioning in the awake rabbit. Behav Brain Res. 1999;99:169–179. [PubMed]
19. Guarraci FA, Frohardt RJ, Kapp BS. Amygdaloid D1 dopamine receptor involvement in Pavlovian fear conditioning. Brain Res. 1999;827:28–40. [PubMed]
20. Guarraci FA, Frohardt RJ, Falls WA, Kapp BS. The effects of intra-amygdaloid infusions of a D2 dopamine receptor antagonist on Pavlovian fear conditioning. Behav Neurosci. 2000;114:647–651. [PubMed]
21. Hnasko TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, Luquet S, Phillips PE, Kremer EJ, Palmiter RD. Cre recombinase-mediated restoration of nigrostriatal dopamine in dopamine-deficient mice reverses hypophagia and bradykinesia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:8858–8863. [PMC free article] [PubMed]
22. Horvitz JC. Mesolimbocortical and nigrostriatal dopamine responses to salient non-reward events. Neuroscience. 2000;96:651–656. [PubMed]
23. Inglis FM, Moghaddam B. Dopaminergic innervation of the amygdala is highly responsive to stress. J Neurochem. 1999;72:1088–1094. [PubMed]
24. Inoue T, Izumi T, Maki Y, Muraki I, Koyama T. Effect of the dopamine D(1/5) antagonist SCH 23390 on the acquisition of conditioned fear. Pharmacol Biochem Behav. 2000;66:573–578. [PubMed]
25. Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Midbrain dopaminergic neurons and striatal cholinergic interneurons encode the difference between reward and aversive events at different epochs of probabilistic classical conditioning trials. J Neurosci. 2008;28:11673–11684. [PubMed]
26. Kalivas PW, Duffy P. Selective activation of dopamine transmission in the shell of the nucleus accumbens by stress. Brain Res. 1995;675:325–328. [PubMed]
27. Kelly MA, Rubinstein M, Asa SL, Zhang G, Saez C, Bunzow JR, Allen RG, Hnasko R, Ben-Jonathan N, Grandy DK, Low MJ. Pituitary lactotroph hyperplasia and chronic hyperprolactinemia in dopamine D2 receptor-deficient mice. Neuron. 1997;19:103–113. [PubMed]
28. Koch M. The neurobiology of startle. Prog Neurobiol. 1999;59:107–128. [PubMed]
29. Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. Dopamine modulates excitability of basolateral amygdala neurons in vitro. J Neurophysiol. 2005;93:1598–1610. [PubMed]
30. Lalumiere RT, Nguyen LT, McGaugh JL. Post-training intrabasolateral amygdala infusions of dopamine modulate consolidation of inhibitory avoidance memory: involvement of noradrenergic and cholinergic systems. Eur J Neurosci. 2004;20:2804–2810. [PubMed]
31. LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL. Modulation of memory consolidation by the basolateral amygdala or nucleus accumbens shell requires concurrent dopamine receptor activation in both brain regions. Learn Mem. 2005;12:296–301. [PMC free article] [PubMed]
32. Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, Roeper J. Unique properties of mesoprefrontal neurons within a dual mesocorticolimbic dopamine system. Neuron. 2008;57:760–773. [PubMed]
33. Lamont EW, Kokkinidis L. Infusion of the dopamine D1 receptor antagonist SCH 23390 into the amygdala blocks fear expression in a potentiated startle paradigm. Brain Res. 1998;795:128–136. [PubMed]
34. Laviolette SR, Lipski WJ, Grace AA. A subpopulation of neurons in the medial prefrontal cortex encodes emotional learning with burst and frequency codes through a dopamine D4 receptor-dependent basolateral amygdala input. J Neurosci. 2005;25:6066–6075. [PubMed]
35. Lemon N, Manahan-Vaughan D. Dopamine D1/D5 receptors gate the acquisition of novel information through hippocampal long-term potentiation and long-term depression. J Neurosci. 2006;26:7723–7729. [PubMed]
36. Maren S. The amygdala, synaptic plasticity, and fear memory. Ann N Y Acad Sci. 2003;985:106–113. [PubMed]
37. Maren S, Quirk GJ. Neuronal signalling of fear memory. Nat Rev Neurosci. 2004;5:844–852. [PubMed]
38. Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, Fields HL. Midbrain dopamine neurons: projection target determines action potential duration and dopamine D(2) receptor inhibition. J Neurosci. 2008;28:8908–8913. [PubMed]
39. Margolis EB, Lock H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, Fields HL. Kappa opioids selectively control dopaminergic neurons projecting to the prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:2938–2942. [PMC free article] [PubMed]
40. Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE. A specialized subclass of interneurons mediates dopaminergic facilitation of amygdala function. Neuron. 2005;48:1025–1037. [PubMed]
41. McNish KA, Gewirtz JC, Davis M. Evidence of contextual fear after lesions of the hippocampus: a disruption of freezing but not fear-potentiated startle. J Neurosci. 1997;17:9353–9360. [PubMed]
42. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG. Dopamine receptors: from structure to function. Physiol Rev. 1998;78:189–225. [PubMed]
43. Murphy CA, Pezze M, Feldon J, Heidbreder C. Differential involvement of dopamine in the shell and core of the nucleus accumbens in the expression of latent inhibition to an aversively conditioned stimulus. Neuroscience. 2000;97:469–477. [PubMed]
44. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic dopaminergic pathways in fear conditioning. Prog Neurobiol. 2004;74:301–320. [PubMed]
45. Pezze MA, Bast T, Feldon J. Significance of dopamine transmission in the rat medial prefrontal cortex for conditioned fear. Cereb Cortex. 2003;13:371–380. [PubMed]
46. Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. Systemic blockade of D2-like dopamine receptors facilitates extinction of conditioned fear in mice. Learn Mem. 2005;12:399–406. [PMC free article] [PubMed]
47. Ralph RJ, Varty GB, Kelly MA, Wang YM, Caron MG, Rubinstein M, Grandy DK, Low MJ, Geyer MA. The dopamine D2, but not D3 or D4, receptor subtype is essential for the disruption of prepulse inhibition produced by amphetamine in mice. J Neurosci. 1999;19:4627–4633. [PubMed]
48. Ralph-Williams RJ, Lehmann-Masten V, Otero-Corchon V, Low MJ, Geyer MA. Differential effects of direct and indirect dopamine agonists on prepulse inhibition: a study in D1 and D2 receptor knock-out mice. J Neurosci. 2002;22:9604–9611. [PubMed]
49. Richardson R. Shock sensitization of startle: learned or unlearned fear? Behav Brain Res. 2000;110:109–117. [PubMed]
50. Risbrough VB, Geyer MA, Hauger RL, Coste S, Stenzel-Poore M, Wurst W, Holsboer F. CRF(1) and CRF(2) Receptors are Required for Potentiated Startle to Contextual but not Discrete Cues. Neuropsychopharmacology. 2008;19:19.
51. Rosenkranz JA, Grace AA. Dopamine-mediated modulation of odour-evoked amygdala potentials during pavlovian conditioning. Nature. 2002;417:282–287. [PubMed]
52. Schultz W. Getting formal with dopamine and reward. Neuron. 2002;36:241–263. [PubMed]
53. Schwarzkopf SB, Mitra T, Bruno JP. Sensory gating in rats depleted of dopamine as neonates: potential relevance to findings in schizophrenic patients. Biol Psychiatry. 1992;31:759–773. [PubMed]
54. Schwarzkopf SB, Bruno JP, Mitra T. Effects of haloperidol and SCH 23390 on acoustic startle and prepulse inhibition under basal and stimulated conditions. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993;17:1023–1036. [PubMed]
55. Sigala S, Missale C, Spano P. Opposite effects of dopamine D2 and D3 receptors on learning and memory in the rat. Eur J Pharmacol. 1997;336:107–112. [PubMed]
56. Sigurdsson T, Doyere V, Cain CK, LeDoux JE. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 2007;52:215–227. [PubMed]
57. Smith DR, Striplin CD, Geller AM, Mailman RB, Drago J, Lawler CP, Gallagher M. Behavioural assessment of mice lacking D1A dopamine receptors. Neuroscience. 1998;86:135–146. [PubMed]
58. Swant J, Wagner JJ. Dopamine transporter blockade increases LTP in the CA1 region of the rat hippocampus via activation of the D3 dopamine receptor. Learn Mem. 2006;13:161–167. [PMC free article] [PubMed]
59. Swerdlow NR, Shoemaker JM, Kuczenski R, Bongiovanni MJ, Neary AC, Tochen LS, Saint Marie RL. Forebrain D1 function and sensorimotor gating in rats: effects of D1 blockade, frontal lesions and dopamine denervation. Neurosci Lett. 2006;402:40–45. [PubMed]
60. Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, Matsumoto AM, Palmiter RD. Feeding behavior in dopamine-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:12138–12143. [PMC free article] [PubMed]
61. Wise RA. Dopamine, learning and motivation. Nat Rev Neurosci. 2004;5:483– 494. [PubMed]
62. Zhou QY, Palmiter RD. Dopamine-deficient mice are severely hypoactive, adipsic, and aphagic. Cell. 1995;83:1197–1209. [PubMed]
63. Zweifel LS, Argilli E, Bonci A, Palmiter RD. Role of NMDA receptors in dopamine neurons for plasticity and addictive behaviors. Neuron. 2008;59:486–496. [PMC free article] [PubMed]
;