Priekinis Endokrinolis (Lausanne). 2017; 8: 216.
Paskelbta internete 2017 Aug 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† ir Vincent Paillé1,*†
Abstraktus
Perinatalinis motinos suvartojimas sunkaus maisto padidina vaikų nutukimo riziką. Tai siejama su pertekliu skaniu maistu, kuris vartojamas jo hedoniniam turtui. Pagrindinis mechanizmas, jungiantis perinatalinę motinos mitybą ir palikuonių pirmenybę riebalams, vis dar menkai suprantamas. Šiame tyrime siekiame ištirti motininių riebalų ir (arba) didelio cukraus kiekio dietos poveikį [Vakarų dieta (WD)] nėštumo metu ir laktacijos metu, už atlygį, kontroliuojantį žiurkių palikuonių maitinimą nuo gimimo iki lytinės brandos. Mes atlikome ilgalaikį WD ir Control palikuonių stebėjimą trimis kritiniais laikotarpiais (vaikystėje, paauglystėje ir suaugusiųjų amžiuje) ir sutelkėme dėmesį į tai, kaip ištirti perinatalinės skonio dietos poveikį (i) riebalų pasirinkimui, (ii) genų ekspresijos profiliui ir (iii) neobranatominių / architektūrinių mesolimbinių dopaminerginių tinklų pokyčių. Mes parodėme, kad WD šėrimas, apribotas perinataliniu laikotarpiu, turi aiškią ilgalaikę įtaką homeostatinių ir hedoninių smegenų grandinių organizavimui, bet ne riebalų pasirinkimui. Mes parodėme specifinį riebalų pasirinkimo periodą, kurį mes siejame su specifiniais smegenų molekuliniais parašais. Iš WD šeriamų užtvankų palikuonių vaikystėje stebėjome riebalų pirmenybę, susijusią su aukštesne pagrindinių geno ekspresija, dalyvaujančia dopamino (DA) sistemose; paauglystėje abiejų grupių riebalų pirmenybė, laipsniškai mažinama WD grupės 3 dienų tyrimo metu ir susieta su sumažėjusiu pagrindinių genų, dalyvaujančių DA sistemose, ekspresija, galinčia pasiūlyti kompensacinį mechanizmą jų apsaugai. dėl didelio riebalų poveikio; ir galiausiai suaugusiems, pirmenybė teikiama riebalams, kurie buvo identiški kontrolinėms žiurkėms, bet buvo susiję su esminiais geno, susijusio su γ-amino-sviesto rūgšties tinklu, serotonino receptoriais ir polisialinės rūgšties – NCAM priklausomu hipotalamo remodeliavimu. Iš viso šie duomenys atskleidė, kad motinos WD, apsiribojus perinataliniu laikotarpiu, neturi ilgalaikio poveikio energijos homeostazei ir riebalų pasirinkimui vėliau, nors įvyko stiprus hipotalamo homeostatinio ir atlygio kelio, susijusio su valgymo elgesiu, permainas. Norint suprasti šių grandinių rekonstrukcijos svarbą, reikės atlikti papildomus funkcinius eksperimentus.
Įvadas
Ankstyvoji gyvenimo aplinka ir įvykiai dabar gerai pripažįstami, kad vėliau gyvenime prisidėtų prie sveikatos ir ligų polinkio.1-3). Metabolinio įspaudimo koncepcija buvo pasiūlyta apibūdinti, kaip perinatalinio laikotarpio mitybos ir hormoninės aplinkos pokyčiai gali paskatinti palikuonius nutukimu ir su juo susijusias patologijas vėliau. Svarbus mūsų atsitiktinio gyvenimo būdo klausimas yra per didelis maisto perteklius, kurį lemia tankus maisto vartojimas. Iš tiesų, tokiems maisto produktams patekusiems į motiną patekusiems asmenims kyla didesnė rizika susirgti nutukimu ir metaboliniu sindromu (4, 5). Daugelis tyrimų parodė, kad motinos didelės riebalų dietos (HFD) per nėštumą ir žindymą turi ilgalaikį poveikį palikuonių metabolizmui (6-8). Be būdų, susijusių su medžiagų apykaitos reguliavimu, smegenų atlygio sistemos taip pat atlieka svarbų vaidmenį šėrimo elgsenoje (9, 10). Mesolimbinė dopamino (DA) neurotransmisija, intensyviai tiriama atlyginimų ir priklausomybės kontekste, keičiasi dėl abiejų žmonių dietos sukelto nutukimo (11-13) ir gyvūnai (14-16). DA projekcijos didele dalimi vystosi po gimdymo (17), todėl jų vystymąsi gali paveikti ankstyva mityba. Per pastaruosius kelerius metus bandymai su graužikais parodė, kad motinos HFD vartojimas didina hedoninį maitinimą palikuonims (18, 19). Nors šis stebėjimas susijęs su kai kuriais DA sistemos funkcijos pakeitimais (20-22), yra nedaug duomenų apie premijų teikimo būdų ankstyvojo gyvenimo metu21). Be to, ar ir kaip nėra, kaip dokumento, kaip perinatalinis mitybos stresas gali paveikti ne DA signalizavimo sistemos, pvz., GABA (y-aminobutiric rūgšties) sistemą, dalis. Iš tiesų, GABA neuronai, atrodo, vaidina pagrindinį vaidmenį atlygio ir pasipiktinimo. Ventralinis tegmental area (VTA) GABA neuronai gauna panašų įvesties modelį iš skirtingų smegenų sričių (23), ir neseniai atliktos optogenetinės elgsenos studijos pabrėžia pagrindinį VTA GABA vaidmenį kondicionuojamoje vietoje.24) ir atlygio užpildymo elgesį (25). „Nucleus accumbens“ (NAc) daugiausia sudaro GABAerginio vidutinio spyglių neuronų projekcija ir veikia kaip limbinė – variklio sąsaja, integruojanti iš limbinės sistemos kylančius signalus ir paverčiant juos veiksmais per išvestis į Ventral pallidum (VP) ir kitus motorinius efektus (26). Galiausiai, hipotalamas, kurį sudaro daugybė GABA jungčių LH (27) ir lanko branduolys, integruoja bado ir sotumo signalus (10).
Šio tyrimo tikslas - nustatyti motinos vakarinės mitybos (WD) patekimo į žiurkių palikuonis poveikį nuo gimimo iki lytinės brandos (i) riebalų pirmenybei (ii) DA sistemos genų ekspresijos profiliui, GABAerginės sistemos ir hipotalamo plastikumui. ir iii) tuo pačiu laikotarpiu apie mezolimbinių dopaminerginių tinklų neuroanatominius / architektūrinius pokyčius. Todėl, vertindami išilginį tyrimą (nuo nujunkymo, P25, lytinio brandumo, P45 ir suaugusiųjų, P95), mes įvertinome motinos WD poveikį kūno svorio augimui ir riebalinio audinio vystymuisi palikuonims, kurie po nujunkymo buvo reguliariai auginami. Kartu atlikome riebalų pasirinkimo testą, po kurio buvo atlikta maisto produktų suvartojimo, pasirinkimo ir motyvacijos reguliavimo sistemų žymenų atrankos specialioji transkriptominė analizė ir vėlesnė pagrindinių komponentų analizė. Mūsų rezultatai gerokai praturtino naujausius rezultatus, orientuotus į DA sistemos mitybos programavimą.
Medžiagos ir metodai
Etikos ataskaita
Visi eksperimentai buvo atlikti vadovaujantis vietinės gyvūnų gerovės komiteto, ES (Direktyva 2010 / 63 / ES), Instituto National de la Recherche Agronomique (Paryžius, Prancūzija) ir Prancūzijos veterinarijos departamento gairėmis.A44276). Eksperimentinį protokolą patvirtino institucinis etikos komitetas ir užregistruotas pagal nuorodą APAFIS 8666. Buvo imtasi visų atsargumo priemonių siekiant sumažinti stresą ir gyvūnų skaičių, naudojamą kiekvienoje eksperimentų serijoje.
Gyvūnai ir dietos
Gyvūnai buvo laikomi 12 h / 12 h šviesos / tamsos cikle 22 ± 2 ° C temperatūroje su maistu ir vandeniu ad libitum. Trisdešimt dvi moterys Sprague-Dawley žiurkės (kūno svoris: 240 – 290 g) 1 (G1) nėštumo dieną buvo įsigytos tiesiogiai iš Janvier (Le Genest Saint Isle, Prancūzija). Žindymo ir žindymo laikotarpiu 5 buvo atskirai laikomi 0 arba jiems buvo duodama kontrolinė dieta (CD) (16% jautienos riebalai ir 21% sacharozė) arba WD (30% jautienos riebalai ir 16% sacharozė). (žr. lentelę. \ t Table1: 1: dietos sudėtis kcal iš ABdiet Woerden, Nyderlandai). Gimimo metu pakratų dydis buvo pakoreguotas iki aštuonių kūdikių vienam kūdikiui, naudojant 1: 1 vyrų ir moterų santykį. 12 iš 16 užtvankų laikėme su kiekvienos grupės 4 patinėliais ir 4 moterimis. Atjunkymo metu (P21), CD ir WD užtvankos gimę palikuonys iki eksperimento pabaigos buvo laikomi standartiniu būdu (skaičiai (Fig. 1A, B) .1A, B). Kūno svoris buvo užregistruotas gimimo metu ir po to kiekvieną dieną 10: 00 am iki P21 (nujunkymo). Po nujunkymo ir iki eksperimento pabaigos žiurkės buvo įvertintos kiekvieną 3 dieną. Pateikiame tik vyrų palikuonių duomenis. Moteriškos žiurkės buvo naudojamos kitam tyrimui (1 paveikslas) (Pav .11).
Elgesys (dviejų butelių pasirinkimas)
Buvo tiriami trys kritiniai vystymosi laikotarpiai (P21 - P25: jaunikliai, P41 - P45: paaugliai ir P91 - P95: jauni suaugusieji). 24 vyrų jaunikliai (n = 12 kiekvienai grupei) buvo atsitiktinai atrinkti ir patalpinti į atskirą narvą, kad būtų galima atlikti dviejų butelių pasirinkimo testą (XNUMX pav.) (Figūras1A, B) 1A, B) (28-30). Šis bandymas buvo naudojamas konkrečiai tiriant patrauklumą riebalų skoniui, išskiriant jį iš saldaus skonio ir kiek įmanoma labiau iš kalorijų suvartojimo. Iš tiesų, 1% kukurūzų aliejaus tirpalo vartojimas susijęs tik su 0.09 kcal / ml vartojimu. Po vienos dienos pripratimo prie dviejų butelių buvimo, bandymas buvo atliktas per 2 dienas P25 ir 4 dienų P41 ir P91 metu (pav. (Figure1A) .1A). Išsamiau, nujunkymo metu (P21), 24 jaunikliai buvo laikomi atskirai 2 dienoms (pav. (Figure1A): 1A): 1 diena, 2 įpročio fazė, žiurkėms buvo suteiktas dviejų butelių laisvas pasirinkimas tarp 1% kukurūzų aliejaus emulsijos 0.3% ksantano guma (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, Prancūzija) ir ksantano gumos tirpalas ( 0.3%). P41 ir P91, 24 kūdikiai buvo naudojami, o dviejų butelių laisvas pasirinkimas buvo pasiūlytas tris dienas iš eilės. Ksantano gumos tirpalo ir skonio tirpalo (kukurūzų aliejaus 1%) suvartojimas buvo užregistruotas kasdien 11: 00 am 3 dienoms (P45 ir P95). Dviejų butelių padėtis buvo kasdien apversta, kad būtų išvengta padėties pirmenybės šališkumo. Riebalų pirmenybės balas buvo apskaičiuotas kaip „riebalų tirpalo“ kiekio santykis su visu 24 h suvartotu kiekiu. Visoms elgsenos testams visos žiurkės buvo laikomos standartine chow dieta.
Audinių rinkimas ir kraujo mėginių ėmimas
Kitą dieną po dviejų butelių laisvo pasirinkimo bandymo dienos, pusė žiurkių (n = 6 kiekvienai grupei) buvo greitai eutanazuota nuo 09:00 iki 12:00 ryto CO2 įkvėpimas. Kraujas surenkamas į mėgintuvėlius su EDTA („Laboratoires Léo SA“, St Quentin en Yvelines, Prancūzija) ir centrifuguojamas esant 2,500 XNUMX g 15 min. esant 4 ° C. Plazma buvo užšaldyta -20 ° C. Organai ir individualus retroperitoninis riebalų depas buvo išskaidyti ir įvertinti. Smegenys greitai pašalintos ir dedamos į smegenų matricą (WPI, Sarasota, FL, JAV žiurkė 300 – 600 g). Pirmiausia buvo išskaidytas hipotalamas [pagal Paxinos atlaso koordinates: –1.0 iki −4.5 mm nuo Bregmos (31)], tada kiekvienam žiurkui buvo gauti du koroniniai 2 mm storio griežinėliai NAc lygiu ir kitas VTA lygiu. Dešiniuoju ir kairiuoju NAc ir dešiniuoju bei kairiuoju VTA (keturi mėginiai iš vieno gyvūno) mėginiai buvo greitai gauti naudojant du skirtingus biopsijos štampus (Stiefel Laboratories, Nanterre, Prancūzija) (4 mm skersmuo NAc ir 3 mm) vidurinės smegenų). Mėginiai buvo užšaldyti skystame azoto sluoksnyje ir laikomi -80 ° C temperatūroje tolesniam genų ekspresijos nustatymui TaqMan mažo tankio masyvu (TLDA).
Kitos žiurkės (n = 6 kiekvienai grupei) buvo giliai anestezuoti pentobarbitaliu (150 mg / kg ip) ir perfuzuoti transkardine fiziologine fiziologinio tirpalo perfuzija, po to lediniu 4% paraformaldehidu fosfato buferyje (PB), pH 7.4. Smegenys buvo greitai pašalintos, panardintos į tą patį fiksatorių 1 valandą 4 ° C temperatūroje ir galiausiai 25–24 valandas laikytos 48% PB sacharozėje. Tada smegenys buvo užšaldytos izopentane -60 ° C temperatūroje ir galiausiai buvo laikomos -80 ° C temperatūroje iki naudojimo. NAc, hipotalamus ir VTA kriostatu (Microm, Microtech, Francheville, Prancūzija) buvo supjaustyti į 20 µm serijinius vainikinius pjūvius. Kiekvienai smegenų sričiai buvo atliktos dvi ar trys 10 stiklinių stiklelių serijos, kuriose buvo 4–6 atkarpos. Kiekvienos stiklinės stiklelio serijinės dalys yra išdėstytos 200 µm atstumu (XNUMX pav.) (Pav .66).
Biocheminės plazmos analizės
EDTA plazma, surinkta P25, P45 ir P95 žiurkėms, buvo naudojama plazmos gliukozės, NEFA (neesterifikuotų riebalų rūgščių), insulino ir leptino matavimui. Gliukozė ir NEFA buvo išmatuoti naudojant kolorimetrines fermentines reakcijas su specifiniais rinkiniais (gliukozės ir NEFA PAP 150 rinkiniai, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Prancūzija). Hormonai buvo tiriami naudojant specifinius ELISA rinkinius pagal gamintojo instrukcijas insulino ir leptino (žiurkės / pelės insulino ELISA rinkinys, žiurkės leptino ELISA rinkinys, Linco Research, St. Charles, MO, JAV).
Imunohistochemistry
Stiklinės plokštelės su serijinėmis VTA ir NAc sekcijomis pirmą kartą buvo užblokuotos 3 – 4 h ir po to inkubuotos per naktį 4 ° C temperatūroje su šių antikūnų mišiniu: pelės anti-NeuN (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, JAV) ir triušio anti-TH (1: 1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, JAV). Po inkubacijos su pirminiais antikūnais ir paskui plaunant PB, sekcijos buvo inkubuojamos antrinių antikūnų mišinyje: Alexa 488 konjuguotas asilo anti-pelės IgM ir Alexa 568 konjuguotas asilo anti-triušio IgG (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, JAV) 2 h. Sekcijos buvo sumontuotos superfrostu ir aukso skaidres (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV), džiovintos oru ir padengtos ProLong ™ Gold antifade reagentu (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV).
TH Neuronų skaičius VTA
Kiekvienai žiurkei TH-teigiamos ląstelės buvo skaičiuojamos kaip aprašyta anksčiau (32) trimis skirtingais VTA rostrokaudiniais lygiais: trečiojo nervo išėjimo (atstumas, lyginant su Bregma: -5.3 mm), 200 µm rostral ir 200 µm caudal iki šio lygio lygiu (Figūras6A) .6A). Kairėje ir dešinėje pusėje buvo gautas skaitmeninis paveikslas, apimantis visą VTA iš pagalbinio terminalo trakto, medialiai į kraštinę mesencephalon sieną, naudojant x 40 didinimą NanoZoomer-XR skaitmeniniame skaidrių skaitytuve C12000 (Hamamatsu, Japonija). Kiekvienai sekcijai buvo paimta linija aplink VTA perimetrą. Ribos buvo pasirinktos išnagrinėjus ląstelių formą ir remdamasi Paxinos ir Watson atlasu. Dopaminerginis neuronas buvo apibrėžiamas kaip NeuN (+) / TH (+) imunoreaktyvus ląstelių kūnas su aiškiai matomu branduoliu. Naudojant NIH Image J programinę įrangą (ląstelių skaitiklių papildinį), NeuN (+) / TH (+) ląstelės buvo suskaičiuotos pagal du skirtingus asmenis, kurie nežinojo apie gyvūnų grupes. Skirstomųjų ląstelių skaičiavimo klaidos buvo ištaisytos naudojant Abercrombie formulę (32), kur N = n[t/(t + d)] (N = bendras langelių skaičius; n = suskaičiuotų ląstelių skaičius; t = pjūvio storis; ir d = ląstelės skersmuo), o šis korekcijos koeficientas buvo 0.65. Duomenys išreiškiami kaip vidutinis [NeuN (+) / TH (+) kairėje ir dešinėje VTA] ± SEM.
TH pluošto tankis NAc
TH baltymų kiekis NAc dopaminerginiuose nervų galuose buvo apskaičiuotas pagal anatominę TH imunizuotų sekcijų analizę. TH pluošto tankis buvo kiekybiškai įvertintas trimis savavališkais lygiais išilgai NAc rostrokaudinės ašies (Bregma 2.20, 1.70 ir 1.20 mm) (pav. (Figure6B) .6B). Trumpai tariant, skaitmeninis vaizdas, apimantis visą striatum ir NAc, gautą naudojant x 40 didinimą NanoZoomer-XR skaitmeniniame skaidrių skaitytuve C12000 (Hamamatsu, Japonija). Konkrečiai NAc, aplink visą branduolį buvo nubrėžta linija, skirta nustatyti optinio tankio (OD) matavimo plotą (1 paveikslas) (Figure6B) .6B). Gauta reikšmė buvo normalizuota pagal OD reikšmę, išmatuotą iš tos pačios sekcijos, kuri buvo paimta iš tos pačios dalies korpuso skritulio, kuris buvo nudažytas TH imunochemijai, naudojant NIH Image J programinę įrangą. Duomenys išreiškiami kaip OD santykio vidurkis (trijų sekcijų corpus callosum OD reikšmė NAc / OD) ± SEM.
Genų ekspresija, kurią atlieka TLDA ir TaqMan
Naudojant NucleoSpin RNA / baltymų rinkinį (Macherey-Nagel, Hoerdt, Prancūzija), RNR buvo išskirta iš užšaldytų NAc, VTA praturtintų mėginių ir hipotalamo. Bendra RNR buvo perduota DNazei virškinti pagal gamintojo instrukcijas, kiekis buvo įvertintas pagal 260 / 280 nm UV absorbciją, o kokybė buvo įvertinta naudojant Agilent 2100 Bioanalyzer sistemą, tada apskaičiuotas RNR vientisumo numeris (RIN). Mėginiai su RIN žemiau 8 buvo atmesti. Vienas mikrogramas visos RNR buvo atvirkštinės transkripcijos į cDNR, naudojant didelės talpos RT rinkinį (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), bendrą 10 µl tūrį.
Kaip aprašyta anksčiau (33), TLDA yra „384“ šulinėlių mikrocheminė kortelė, kurioje galima atlikti 384 vienu metu realaus laiko PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Mes naudojome specialiai sukurtą TLDA, skirtą įvairioms genų šeimoms, susijusioms su plastikumu ir maisto suvartojimo reguliavimu, padengti. Kiekviena pasirinktinė kortelė buvo sukonfigūruota kaip 2 × 4 pavyzdžių pakrovimo linijos, kuriose yra 2 × 48 reakcijos kameros (nuoroda: 96a). Nustatytas 92 genas (lentelė S1 papildomoje medžiagoje) ir buvo tiriami keturi buitiniai genai (18S, Gapdh, Polr2a ir Ppia). Realaus laiko PCR buvo atliktas naudojant „Life Technologies TaqMan“ reagentus ir veikia ABI Prism 7900HT sekos aptikimo sistemoje (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Neapdoroti fluorescencijos duomenys buvo surinkti per PCR, naudojant SDS 2.3 programinę įrangą (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kuri toliau generavo slenksčio ciklus Ct, automatiškai nustatydama pradinę ir ribinę vertę. Filtruojant naudojant „ThermoFisher“ debesį „App“ („ThermoFisher“, JAV), kad būtų diskriminuojami klaidingi PCR veiksmai, mėginiai buvo atlikti n = 6 (n = 5 WD grupei, esant P25). Tada duomenys buvo analizuojami naudojant „ThermoFisher Cloud App“ („ThermoFisher“, JAV), kad būtų galima palyginti. Santykinis genų ekspresijos (RQ) kiekybinis įvertinimas buvo pagrįstas lyginamuoju Ct metodu, naudojant lygtį RQ = 2−ΔΔCt, kur ΔΔCt vienam geno tikslui buvo jo paties Ct variacija, atimama iš kalibratoriaus mėginio ir normalizuota endogenine kontrole. Būtent mes nustatėme stabiliausią namų ūkio geno naudojimą, naudodami geNorm algoritmą (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, JAV). Tarp keturių buitinių genų, Gapdh buvo apibrėžiamas kaip endogeninė kontrolė NAc ir hipotalamams, o Ppia - VTA, ir tai galioja visiems trijų analizuojamų laikotarpių mėginiams. Grafinis genų ekspresijos atvaizdavimas buvo sukurtas rankiniu būdu, norint priskirti vieną spalvą 10% padidėjimui genų ekspresijai, palyginti su CD grupe. Pažymėta žvaigždute pažymėta reikšminga variacija, naudojant neparametrinį Wilcoxon pasirašytą rango testą.
Statistinė analizė
Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SEM lentelėse ir paveiksluose. Mann-Whitney neparametrinis testas buvo naudojamas kūno svorio analizei įvairiais laiko taškais, riebalų parinktimis ir OD santykiu, gautu iš imunohistochemijos.
Norint įvertinti 3 dienų riebalų parinkčių reikšmę, kiekvienai dienai atlikome stulpelių statistinę analizę. Kiekvienai grupei riebalų tirpalo ir kontrolinio tirpalo vartojimas buvo išbandytas naudojant neparametrinį Wilcoxon'o pasirašyto rango testą. Palyginome pirmenybės vidutinę vertę su hipotetine 50% verte (raudona raudona linija). Reikšmingi pokyčiai buvo pažymėti raudona žvaigždute. Mes naudojome tą patį testą qPCR RQ vertės analizei; palyginome vidutinę RQ vertę su hipotetine 1 verte. Žymiai pažymėta žvaigždute (pav. \ T (Pav .44).
Atliekant plazmos mėginių analizę, atlikome ne parametrinį Mann ir Whitney testą. TH-teigiamų ląstelių skaičius buvo išanalizuotas dvipusiu ANOVA ir p vertė buvo apskaičiuota. Dėl atliktų bandymų įvairovės, Bonferroni post-hoc korekcija buvo taikoma tik po šio bandymo. Statistinė analizė atlikta naudojant „Prism 6.0“ programinę įrangą („GraphPad Software Inc.“, „La Jolla“, CA, JAV).
Pirmą kartą 130 parametrais (TLDA, elgesys ir plazmos duomenys) buvo atliekamas nepatvirtintas PCA kiekvienam smegenų biopsijos (VTA, NAc ir hipotalamui) laiko taškui, kad būtų vaizduojama bendra duomenų rinkinio struktūra (ty trys pasauliniai PCA). per laiko tašką). PCA gali būti apibrėžiama kaip ortogoninė duomenų projekcija į apatinę erdvinę erdvę, taigi, prognozuojamų duomenų dispersija yra maksimaliai padidinta subpacyje. Pirmiausia išskyrėme ne išreikštus ar šiek tiek išreikštus genus (pav. \ T (Figure5) .5). Atskirtų PCA sklypų palikuonių iš WD paduodamų užtvankų ir palikuonių vertės atsirado skirtingose PCA sklypuose, kad būtų galima vizualizuoti, ar šios dvi eksperimentinės grupės yra gerai atskirtos be priežiūros PCA komponentų. Ši analizė atskiria genų grupes, kurios yra skirtingai ekspresuojamos tarp dviejų palikuonių grupių. Vėliau sutelkti PCA buvo atlikti skirtinguose mRNR žymeklių klasteriuose: plastiškumas (ląstelių adhezija, citozelonas, neurotrofinis faktorius, sinaptogenezė ir transkripcijos reguliavimas), DA kelias, GABAerginis kelias, epigenetiniai moduliatoriai (histono dezacetilazė ir histono acetilo transferazė). Šie tiksliniai PCA leidžia vienu metu vizualizuoti gimdyvių mitybos ir kai kurių žymenų bei koreliacijų tarp specifinių šeimos genų koreliaciją. Analizuojant PCA ir koncentruotą PCA, buvo panaudota kokybinė skalė: +++: labai geras atskyrimas; ++: geras atskyrimas su vienu žiurkiu neteisingoje PCA atskyrimo pusėje; +: gana geras atskyrimas su dviem žiurkėmis (viena iš kiekvienos grupės) neteisingoje pusėje, -: nėra aiškaus atskyrimo.
rezultatai
Kūno svoris ir augimas
Motinos WD vartojimas nėštumo metu (nuo G1 iki G21) kūdikių kūno svorio gimimo metu nepaveikė (žr. (Figure2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g prieš WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (pav (Fig. 2A, B) .2A, B). Kūno svorio padidėjimas nuo gimimo iki nujunkymo buvo 21% didesnis iš WD užsikrėtusių palikuonių, nei CD palikuonių, kurių kūno svoris buvo gerokai didesnis nujunkant po gimdymo, kilusių iš WD užtvankų (36.19 ± 0.90 g prieš 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (pav (Figure2C) .2C). Nuo nujunkymo iki eksperimento pabaigos (P95) žiurkės buvo šeriamos standartine vištienos dieta ir kūno svoris palikuonims iš WD užtvankų buvo didesnis nei iš CD užtvankų palikuonių. Išsamiau: paauglystės metu (P39) (skaičiai (Figūras2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g prieš WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 ir ties P93 (jaunas suaugęs žmogus) (fig (Fig. 2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g prieš WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormonai ir metaboliniai žymenys skirtingu laiku
Plazmos leptinas, insulinas, gliukozė ir NEFA koncentracijos buvo matuojamos P25, P45 ir P95. Visų amžiaus grupių WD palikuonių plazmos gliukozės, NEFA ir leptino kiekiai statistiškai nesiskyrė nuo CD palikuonių (lentelė (Table2,2, n = 6 grupei). Mes pastebėjome reikšmingą riebalų nusėdimo padidėjimą (retroperitoninės riebalų masės santykis) palikuonims, auginamiems tik W 25p = 0.0327, Manno ir Whitney testas).
Perinatalinio WD poveikis riebalų pasirinkimui nuo nujunkymo iki suaugusiųjų
Siekiant ištirti WD poveikį riebalų pasirinkimui, augimo metu naudojome dviejų butelių pasirinkimo paradigmą trimis skirtingais laiko taškais. Šis tyrimas buvo naudojamas konkrečiai tiriant riebalų skonio pirmenybę, vengiant kiek įmanoma didesnio jo metabolizmo poveikio. Mes parodėme, kad „papildomo“ kalorijų suvartojimo skirtumai (P25, P45 ir P95) nėra statistiškai reikšmingi tarp grupių (skaičiai S1A – C papildomoje medžiagoje). Be to, 1% kukurūzų aliejaus tirpalo suvartojimo skirtumas padidina kalorijų kiekį 1% WD žiurkėms P25 (WD: 4.9% vs CD: 3.9% suvartotų kalorijų) ir 0.5% CD žiurkėms P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% suvartotų kalorijų (skaičiai S1D – F papildomoje medžiagoje). P25, CD patelių jaunikliai neturi pirmenybės riebalams (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); priešingai WD žiurkėms pirmenybė teikiama riebalams (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 po Wilcoxon pasirašyto rango testo, raudona žvaigždutė). Be to, tarp dviejų grupių yra statistinis skirtumas p = 0.0347 (Manno ir Whitney testas, juoda maišos etiketė) (XNUMX pav (Pav .33A).
P45 ir P95 abiejose grupėse yra didelis riebalų pasirinkimas, ty žymiai skiriasi nuo teorinės 50% vertės (P45, CD: 80.68 ± 2.2%). p = 0.0005 ir WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; esant P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 ir WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 po Wilcoxon pasirašyto rango testo, raudona žvaigždutė) (XNUMX pav (Figure3A) .3A). Abiejų grupių reikšmės nebuvo išskiriamos po vienos skonio pateikimo dienos (P45 p = 0.7857 ir ties P95 p = 0.9171 Manno – Whitney testas) (pav (Pav .33A).
Norėdami žinoti, kaip žiurkės reguliuoja jų riebalų vartojimą laikui bėgant, pakartojome riebalų pateikimą tris dienas iš eilės P45 ir P95 (skaičiai (Fig. 3B, C) .3B, C). Įdomu, kad P45, tik vyrai iš WD užtvankų palaipsniui prarado riebalų tirpalo pirmenybę (Figūra3B) 3B) (trečioji diena: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 po Wilcoxon pasirašyto rango testo). Tačiau 95 dienų bandymo metu visi gyvūnai, būdami P3 (suaugusio amžiaus), pirmenybę teikė riebalams be evoliucijos (XNUMX pav.) (Pav .33C).
Apibendrinant, šiame modelyje, ankstyvame etape (vaikystėje), mes stebėjome riebalų naudojimą žiurkėms, maitinamoms WD užtvankomis, kurių paauglystės metu per tam tikrą laiką buvo palaipsniui nepageidaujama. Mes stebėjome, kad tarp dviejų žiurkių grupių nesiskyrė jokio skirtumo.
Smegenų plastiškumo ir GABA grandinių remodeliavimosi hipotalamoje ir apdovanojimuose molekulinis parašas
Norint nustatyti, ar motinos WD vartojimas nėštumo ir žindymo laikotarpiu daro įtaką palikuonių hipotalamui ir atlyginimų keliams, mes matavome santykinį įvairių smegenų plastiškumo, smegenų modeliavimo ir neuronų grandinių žymenų, susijusių su maisto vartojimu ir epigenetiniu reiškiniu, išraišką. reguliavimo institucijų. Mes panaudojome TLDA, kad galėtume analizuoti jų gausumą skirtingose smegenų srityse (ty, hipotalamoje, VTA ir NAc) (lentelė S1 papildomoje medžiagoje) per tris laikotarpius. Atranka buvo atlikta po dviejų butelių pasirinkimo testų P25, P45 ir P95 (pav. (Figure1) 1) šešiems vyrams, gimusiems iš WD užsikrėtusių užtvankų, ir šešiems vyrams, gimusiems iš CD maitinamų užtvankų.
P25 hipotalamoje penki genai iš trylika skirtingų kategorijų rodė žymiai mažesnį mRNR ekspresijos lygį, daugiausia plastiškumo žymenų ir GABA žymenų, svyruojančių nuo –20% (Gfap) iki –40% (Gabra5), vaikus iš WD šeriamų patelių, palyginti su žiurkėmis iš CD maitinami užtvankos. Atlygio kelio biopsijose (VTA ir NAc) du genai parodė statistiškai aukštesnius mRNR ekspresijos lygius (D2R ir Gabra1), ty DA signalizavimo ir GABA receptorius ir vieną geną, mažesnę ekspresiją (Hcrtr2) (ty, oreksino 2 receptorių), NAc , o keturi genai parodė žymiai didesnį mRNR ekspresijos lygį (Map2, Gabara1, Hcrtr1 ir Hcrtr2) (ty, plastiškumo žymenis, GABA receptorius ir serotoninerginius receptorius) VTA (pav. (Pav .44).
P45 hipotalamoje penki trys skirtingų kategorijų genai parodė mažesnį mRNR ekspresijos lygį nuo –20% (Fos) iki –50% (FosB) WD šertiems patelėms, palyginti su žiurkėmis iš CD maitinamų užtvankų. P45 atlyginimų takų biopsijose keturi genai parodė aukštesnį mRNR ekspresijos lygį (Gfap, Dat, Cck2r ir Kat5) ir du genus, mažesnes ekspresijas (Fos ir FosB) NAc, o trys genai parodė mažesnį mRNR ekspresijos lygį (Arc, FosB ir Th) ir vienas genas yra aukštesnis (Gabrg2) VTA.
P95 hipotalamoje 20 genai iš 13 skirtingų kategorijų rodė aukštesnį mRNR ekspresijos lygį nuo + 20 iki + 40% (Syt4 iki Gjd2) ir 3 genai parodė mažesnę mRNR ekspresiją (FosB, D1r ir Gabarb1) kūdikiams iš WD užkrėstų užtvankų, lyginant su žiurkėmis iš CD maitinamų \ t P95 atlyginimų takų biopsijose 12 genai pasižymėjo didesniu mRNR ekspresijos lygiu, svyruojančiu tarp + 20 ir + 40% (Syn1 iki Hcrt1) ir 1 geno, mažesnės ekspresijos (Th) NAc, 6 genai parodė aukštesnį mRNR ekspresijos lygį (Ncam1 , Gja1, Gjd2, Gabra5, Htr1a ir Htr1b) ir 6 genai parodė mažesnį mRNR ekspresijos lygį (Cntf, Igf1, Fos, Socs3, Gabrb2 ir Hdac3) VTA.
Tada atlikome tris nepatvirtintus PCA, atitinkančius tris smegenų biopsijas, naudojant visus kiekybinius parametrus (ty plazmos dozę, elgesio duomenis ir mRNR ekspresijos variacijas). Aiškus dviejų grupių atskyrimas buvo gautas tik P95 NAc ir VTA (lentelė Nr. \ T (Table33).
Pagal PCA koreliacijos ratą ir TLDA duomenis (atstovaujantį daugumą šiame PCA įtrauktų kintamųjų), mes apibrėžėme genų šeimas, kurios galėtų būti atsakingos už segregaciją ir vykdė tikslinį PCA (skaičiai (Fig. 5A, B, 5A, B). Koncentruota PCA atskleidė, kad P25 DA žymenys NAc ir plastikumo žymenys hipotalamoje gali atskirti dvi palikuonių grupes (lentelė (Table33 santrauka). Tokia diskriminacija nebuvo gauta P45. Tačiau tokia pati P95 analizė parodė, kad skirtingi GABA sistemos žymenys NAc ir hipotalamoje, taip pat plastikumo žymenys (hipotalamoje, NAc ir VTA) ir epigenetiniai reguliatoriai (tik NAc) padeda atskirti dvi gyvūnų grupes ( Pav (Figūra5; 5; Lentelė Table33).
Ši analizė atskleidžia ilgalaikę perinatalinės dietos įtaką GABAerginiams žymenims, taip pat plastikumui ir epigenetiniams žymenims tiek homeostatiniame, tiek atlyginimų keliuose, susijusiuose su šėrimo elgesiu.
TH ląstelių patvirtinto transkripto analizės imunohistochemija
Kadangi mes stebėjome tam tikrus TH mRNR skirtumus NAc ir VTA įvairiais vystymosi laikotarpiais, mes siekėme šiuos rezultatus koreguoti su TH imuninės spalvos. TH / NeuN teigiamų ląstelių skaičius buvo analizuojamas VTA, kuriame yra dopaminerginių ląstelių kūnai, o TH imunodinaminio OD OD buvo kiekybiškai įvertintas nervų galuose, esančiose NAc. TH (+) ląstelės buvo mažiau gausios WD VTA, lyginant su tik P45 CD žiurkėmis. (Fig. 6A, C, E; 6A, C, E; Pav S2A papildomoje medžiagoje). Per tris laikotarpius nebuvo reikšmingos sąveikos tarp sekcijos ir TH / NeuN kiekybinio įvertinimo (P25 p = 0.9991, P45 p = 0.9026 ir P95 p = 0.9170). Tik esant P45, buvo gautas statistinis skirtumas tarp dviejų palikuonių grupių (p = 0.0002) (pav (Figure6E) .6E). Be to, mes stebėjome, kad THT imuninės spinduliuotės spinduliuotėje OD nesiskyrė P25 ir P45 tarp dviejų grupių (OD santykio reikšmės P25: 1.314 ± 0.022 CD ir 1.351 ± 0.026 WD, p = 0.2681; OD santykio vertės esant P45: 1.589 ± 0.033 CD, o 1.651 ± 0.027 WD, p = 0.1542). Tačiau reikšmingas TH nervų galūnių OD sumažėjimas buvo nustatytas NAc grupėje iš WD grupės esant P95 (OD santykio reikšmės esant p95: 1.752 ± 0.041 CD, o 1.550 ± 0.046 WD), p = 0.0037) (pav (Fig. 6B, D, F; 6B, D, F; Pav S2B papildomoje medžiagoje).
Diskusija
Šiame tyrime hipotezėme, kad motinos perinatalinis pernelyg didelis mitybos poveikis turės įtakos energijos vartojimo homeostazei, maisto pasirinkimui ir palikuonių maitinimosi būdų kūrimo programai. Mes išsamiai ištyrėme motinos WD suvartojimo poveikį nuo gimimo iki nujunkymo GABA, serotonino ir DA trajektorijose specifiniuose smegenų plotuose (VTA, NAc ir hypothalamus) palikuonių, nuo vaikystės iki pilnametystės. Mūsų rezultatai rodo, kad riebalų ir saldus turinčios dietos naudojimas, griežtai apribotas perinataliniu laikotarpiu, turi įtakos ankstyvo riebalų pirmenybei (vaikystei) palikuonims, siejamai su genų ekspresijos profilio pokyčiais ir neuroanatominiais / architektūriniais mesolimbikos pokyčiais. dopaminerginiai tinklai. Tačiau, kai palikuonys buvo laikomi chow dieta, mes stebėjome paauglių WD žiurkėms laipsnišką patrauklumą riebalų atžvilgiu, kuris buvo koreliuojamas su sumažėjusia DA sistemos genų ekspresija ir nedideliu TH-teigiamų neuronų sumažėjimu VTA. . Vėliau gyvybės riebalų grupių grupėse pirmenybė buvo nevienoda, nors žiurkėms iš WD šeriamų užtvankų buvo nustatytas svarbus GABAerginių tinklų ir hipotalamo energijos homeostazės tinklo plastiškumas (pav. (Pav .77).
Pirmasis perinatalinio-WD vartojimo poveikis, kurį pastebėjome šiame tyrime, yra padidėjęs palikuonių kūno svoris atjunkymo metu, bet ne gimimo metu. Iš tiesų, WD grupės gyvūnai čiulpimo laikotarpio pabaigoje įgyja 21% daugiau svorio nei CD. Ankstesni tyrimai davė prieštaringų rezultatų, susijusių su gimdos svorio pokyčiais, atsiradusiais iš WD šeriamų užtvankų: didesnis kūno svoris (19, 34), mažesnis kūno svoris (18, 21, 35) arba jokio skirtumo (6, 22). Mūsų duomenys atitinka neseniai atliktą meta regresijos analizę (36) atlikta su 171 eksperimentiniais leidiniais, kurie parodė, kad motinos HFD poveikis neturi įtakos palikuonių gimimo svoriui, bet laktacijos pabaigoje sukėlė padidėjusį kūno svorį. Didesnis WD palikuonių kūno svoris greičiausiai atspindi pieno sudėties ir (arba) pieno gamybos pokyčius, kurie buvo parodyti ankstesniuose leidiniuose (37, 38). Atsižvelgiant į didesnį kūno svorį, WD palikuonių retroperitoninis riebalų santykis žindymo laikotarpio pabaigoje buvo gerokai didesnis nei CD palikuonių (P25, lentelė) Table2), 2), kuris taip pat atitinka ankstesnius tyrimus (18, 21). Tačiau didesnis PKNUMX ir P45 adiposity išliko, o kiti metaboliniai parametrai, kaip insulinas, NEFA ir gliukozės plazma, grupėse nesiskyrė. Mūsų rezultatai parodė, kad be aiškios motinos nutukimo nėštumo ir žindymo laikotarpiu, dieta pati savaime nėra pakankama, kad sukeltų ilgalaikius metabolinius efektus palikuonims (22, 39, 40).
Buvo pranešta, kad perinatalinis HFD vartojimas teigiamai koreliuoja su palikuonių pirmenybe skaniam maistui (41). Mūsų tyrime atlikome išilginį tyrimą, kurio tikslas - išbandyti riebalų pirmenybę palikuonims, kurie yra nujunkyti į reguliarią karvę.
Perinatalinio WD poveikis vaikystei (po nujunkymo)
Graužikai kūdikiai valgo kietą maistą 19 – 20 dienas po gimimo (42) kai jų smegenų atlygio takai dar nėra brandūs (17). Todėl buvo labai įdomu ištirti jų labai anksti riebalus ir koreguoti ankstyvą pirmenybę su smegenų transkriptais. Po nujunkymo mes stebėjome riebalų pirmenybę WD palikuonims, kurie nebuvo įrodyti CD žiurkėse. Tai atitinka kitus pranešimus, rodančius ryšį tarp perinatalinio mitybos ir skanių maisto produktų preferencijų ir mažo pirmenybės riebalams ankstyvame amžiuje kontrolinėms žiurkėms (43).
Pasaulinis PBS neleido diskriminuoti kūdikių grupės dėl motinos dietos tame amžiuje. Tačiau, kai buvo atliktas tikslinis PCA, apribotas DA žymenimis, mes gavome gerą grupių atskyrimą. Iš tiesų, WD kūdikiams yra akivaizdžiai padidėjęs D2 receptorių mRNR ekspresija NAc. Šis postinaptinis D2 viršsprogimas NAc gali būti iš dalies susijęs su didesne riebalų motyvacija (44). Keli kiti transkriptai WD kūdikiams yra modifikuoti, lyginant su CD jaunikliais, pvz., Padidėja alfa 1 GABAA subvienetas NAc ir VTA, ir alfa 5 GABAA subvieneto sumažėjimas hipotalamoje, kuris rodo, kad šiuose branduoliuose yra reorganizuojami GABAA receptoriai.
Perinatalinio WD poveikis paauglystei
P45 pirmoje pateikimo dieną mes stebėjome abiejų grupių panašų didelio riebalų pasirinkimą, tačiau įdomu, kad po pakartotinio pateikimo WD žiurkės palaipsniui prarado susidomėjimą riebalais. Paauglystė yra kritinis neurobevacinio reorganizavimo laikotarpis, būtinas pažintiniam kognityviniam apdorojimui (45), ir įvairūs tyrimai parodė, kad riebalų dietos poveikis kognityviniam poveikiui yra \ t46-48). Šis rezultatas akivaizdžiai prieštarauja ankstesniam Muhlhauslerio grupės darbui (21, 35), kuriose jaunų žiurkių (6 savaičių) rezultatai buvo akivaizdūs. Tačiau jų leidiniuose eksperimentinė paradigma buvo kitokia, nes žiurkės turėjo laisvą prieigą tiek prie standartinės, tiek nuodugnios maisto, nuo nujunkymo iki aukos (6 savaitės).
Kartu mes matavome Dat mRNR padidėjimą NAc ir Th mRNR sumažėjimą VTA, kuris buvo patvirtintas imunohistochemijos, kuri parodė sumažintą TH (+) ląstelių skaičių WD žiurkių VTA. Po padidėjusio DA sistemos transkriptoaktinio aktyvumo nujunkymo metu, sumažėjęs aktyvumas P45 gali paaiškinti mažą domėjimąsi skaniu maistu, kurį stebėjo mūsų WD žiurkės. Taip pat reikėtų pažymėti, kad sisteminis Fos ir FosB mRNR ekspresijos sumažėjimas įvairiuose mūsų analizuojamuose branduoliuose gali būti sumažėjusios smegenų veiklos požymis po motinos WD poveikio.
Paauglių WD žiurkėms nustatyta greitesnė riebalų nepageidaujama reakcija, kuri priešinga jų ankstesniam elgesiui. „Normalios“ dietos naudojimas vaikystėje, atrodo, „apsaugo“ juos nuo pernelyg didelio riebalų pirmenybės paauglystėje. Priešingai, kai žiurkėms po nujunkymo galima laisvai patekti į nepageidaujamą maistą, kaip nurodyta nuorodoje Nr. (21, 35), jie paauglystėje rodo rimtą pirmenybę riebalams. Šis rezultatas rodo, kad 3 savaičių chow dieta po nujunkymo galėjo perprogramuoti grandines ir padaryti paauglių palikuonis mažiau jautrius ūminiam riebalų iššūkiui.
Perinatalinio WD poveikis suaugusiesiems
Suaugusios žiurkės nebegali rodyti riebalų skirtumo, net ir po pakartotinio riebalų pateikimo, kaip jau aprašyta (22, 35). Kartu mes stebėjome Th mRNR ir baltymų sumažėjimą NAc ir tendenciją mažinti Dat mRNA ekspresiją VTA. Naef ir bendradarbis (20) jau pranešė apie mažą DA sistemos aktyvumą suaugusiems žiurkėms, šeriamoms perinataliniu laikotarpiu su HFD, su nedideliu DA atsaku į amfetaminą, išmatuotą mikrodializės būdu, ir didėjančią riebalų atlygio motyvaciją (žr. lentelę, kurioje apibendrinti naujausi qPCR duomenys apie šį modelį, Lentelė S2 papildomoje medžiagoje). Vienas TH TH kiekybinio apribojimo (mRNR ir imunohistochemijos) apribojimas NAc gaunamas iš to, kad NAc ląstelės taip pat gali išreikšti Th mRNR ir baltymus, o tada galėtų šaliuoti DA pluošto kiekybinį nustatymą (49, 50). Tačiau TH imuninės spalvos panaudojimas NAc daugiausia atskleidė tankius axon terminalus, gautus iš vidurio smegenų DA neuronų (VTA ir SNc). Paprastai TH ekspresuojančius neuronus striatume ir NAc galima išskirti tik labai pažeidžiamuose gyvūnuose (51), todėl mūsų imuninės sekcijos gali būti sunkiai aptinkamos. Šiame tyrime taip pat pastebėtas stiprus mu opioidų receptorių padidėjimas NAc, kai kitos grupės, turinčios skirtingus modelius, parodė, kad žiurkių ventralinėje striatoje pasireiškė mažesnė ekspresija, veikianti HFD (laktacijos ir nėštumo metu).19, 21) arba nėra pakeitimų (35). Šie modifikacijos, matuojant tik mRNR lygiu, gali atspindėti nedidelę DA grandinių, susijusių su didesniu opioidų jautrumu, hipoaktyvumą (52), kurios tikriausiai nėra pakankamos, kad galėtume turėti įtakos elgesio bandymui, kurį atlikome. Šios prielaidos turi būti patvirtintos naudojant funkcinius metodus. Naujausiame dokumente su panašiu modeliu Romani-Perez ir kt. Nesugebėjo pastebėti reikšmingo motyvacijos padidėjimo HFD palikuonių operacinėse kondicionavimo dėžėse, tačiau pastebėjo trumpesnį latentą, kad pasiektų tikslą į kilimo ir tūpimo tako bandymo paradigmą (22). Nepaisant to, kad mūsų eksperimentinėse sąlygose nėra ilgai trunkančių riebalų, mes nustatėme, kad perinatalinės motinos WD vartojimas turi ilgalaikį poveikį kitoms smegenų grandinėms, dažniausiai tarpininkaujančioms GABA remodeliavimui NAc ir Hypothalamus. NAc yra laikomas „sensoriniu sentineliu“, skirtu vartojimui (52). Naujausi tyrimai parodė, kad maisto vartojimą slopino GABA išskiriančių LH neuronų slopinimas (53). O'Connor et al. parodė, kad NAc D1R neuronai (GABAerginiai projektuojantys neuronai) selektyviai slopina LH VGAT neuronus sustabdyti maisto vartojimą (54). Šie eksperimentai atskleidžia GABA grandinę (NAc / hipotalamus), kuris gali būti atsakingas už elgsenos atsako kontrolę. Ši ventralinė striatumo-hipotalaminė sistema papildo kitą grandinę, kurioje yra gliukozės branduolio stria terminalis GABA išskiriantis VGAT projektuojantis neuronas į glutamatą, atleidžiantis Vglut LH neuronus ir tiesioginis LH vglut2 slopinimas skatina maitinimą (55). Kita svarbi apetito reguliavimo grandinės, apimančios NAc apvalkalą, sudedamoji dalis yra GABA atleidžianti slopinanti projekcija VP (56). Šie duomenys rodo svarbų GABA signalizacijos vaidmenį sąveikoje tarp hipotalamo ir NAc, skatinant maitinimą. Mūsų tyrime mes negalėjome diskriminuoti GABA remodeliavime dalyvaujančių neuronų populiacijos ir kaip šie pakeitimai gali pakeisti tinklus. Tačiau pagrindinis GABA grandinių vaidmuo nusipelno didesnio susidomėjimo. Ypač įdomu būtų atlikti tolesnius šių GABA grandinių funkcinius eksperimentus, naudojant elektrofiziologinius metodus (57). Mes taip pat stebėjome pasaulinį mRNR transkripcijos reguliavimą 5HT1a ir 5HT1b receptoriams trijuose tiriamuose branduoliuose. Dauguma išsikišusių serotonino pluoštų atsiranda iš nugaros raumens branduolio (DRN) ir vidutinio raphe branduolio (MRN). Naujausi duomenys iš in vivo įrašai ir vaizdavimo tyrimai parodė teigiamą „5HT“ vaidmenį atlygio \ t58). 5HT pluoštai iš DRN dalyvauja impulsyvumo kontrolėje (59). 5HT1a padidėjimas VTA ir NAc gali būti kompensacinis mechanizmas, galintis kontroliuoti impulsyvumą. Hipotalamoje farmakologiniai tyrimai rodo, kad 5HT1a receptorių potipiai gali slopinti serotonino stimuliacijos sukeltą šėrimo elgseną (60, 61). Padidėjęs 5HT1a ir b receptorių kiekis hipotalamoje gali sustiprinti serotonino maitinimą slopinantį poveikį ir todėl gali būti kompensacinis mechanizmas. Šios prielaidos turi būti patikrintos atliekant tinkamus funkcinius eksperimentus.
Šie tinklai keičiasi su plastiškumo žymeklių modifikacijomis kaip „Ncam“ mRNR. Suaugusių žiurkių hipotalamoje mes stebėjome, kad padidėjo Ncam1 ir St8sia4 transkriptai, o tai rodo ir padidina polisialinės rūgšties (PSA) signalizaciją. PSA yra ląstelių paviršiaus glikanas, kuris moduliuoja ląstelių ir ląstelių sąveiką. Ląstelių adhezijos baltymų polializacija dalyvauja įvairiuose nuo centrinės nervų sistemos priklausančiuose procesuose, priklausančiuose nuo sintetinių savybių, ir buvo pranešta, kad tai reikalinga adaptyviam maitinimo grandinių plastikumui ūminio teigiamo energijos balanso metu (33, 62). Be to, į šį hipotalaminį plastiškumą gali būti įtraukti kiti ląstelių sąveikos ir sinaptogenezės reguliatoriai.
Apibendrinant (pav. \ T (Figure7), 7), motinos WD suvartojimas turi ilgalaikę įtaką naminių ir hedoninių grandinių organizavimui, reguliuojantiems vaikų elgesį palikuonyse. Išanalizavus tris kritinius laikotarpius, mes galėjome parodyti aiškią riebalų pirmenybės raidą, susijusią su specifiniais smegenų molekuliniais parašais. Vaikystėje riebalų pirmenybė gali būti koreliuojama su aukštesniu DA sistemos aktyvumu. Paauglystė, kuriai būdingas riebalų pirmenybės keitimas, buvo susietas su mažesne DA sistemos žymenų išraiška, nurodančia kompensacinį mechanizmą. Labai įdomus dalykas, apie kurį reikia pranešti, yra tai, kad šiame modelyje subalansuota mityba po nujunkymo gali apsaugoti paauglius žiurkes nuo kenksmingų šėrimo įpročių mažinant jų norą riebalams. Nors suaugusiųjų amžiuje abiejų grupių riebalai yra panašūs, žiurkės iš WD maitinamų užtvankų parodė didelį GABA grandinių pertvarkymą. Kokios yra šio ilgalaikio plastiškumo pasekmės? Ar pernelyg intensyvus nutukimas mitybos metu paauglystėje vėl suaktyvins šią nuobodų atlygio sistemą? Tokie klausimai galėtų būti svarbūs, kai stebima naujagimių ir Vakarų šalyse kilusių vaikų mityba.
Etikos ataskaita
Visi eksperimentai buvo atlikti vadovaujantis vietinės gyvūnų gerovės komiteto, ES (Direktyva 2010 / 63 / ES), Instituto National de la Recherche Agronomique (Paryžius, Prancūzija) ir Prancūzijos veterinarijos departamento gairėmis.A44276). Eksperimentinį protokolą patvirtino institucinis etikos komitetas ir užregistruotas pagal nuorodą APAFIS 8666. Buvo imtasi visų atsargumo priemonių siekiant sumažinti stresą ir gyvūnų skaičių, naudojamą kiekvienoje eksperimentų serijoje.
Autoriaus įnašai
JP ir PB atliko eksperimentą ir dalyvavo diskusijoje ir rašyme. TM atliko PCA ir dalyvavo diskusijose ir raštu. SN prisidėjo prie eksperimento kūrimo ir dalyvavo diskusijose. PP prisidėjo prie eksperimento kūrimo, dalyvavo diskusijose ir parašė rankraštį. VP sukūrė ir atliko eksperimentus, analizavo duomenis ir parašė rankraštį.
Interesų konflikto pareiškimas
Autoriai teigia, kad tyrimas buvo atliktas nesant jokių komercinių ar finansinių santykių, kurie galėtų būti laikomi galimu interesų konfliktu.
Padėka
Autoriai norėtų pripažinti, kad Guillaume Poupeau ir Blandine Castellano rūpinasi gyvūnais per visą tyrimą, Anthony Pagniez už pagalbą mRNR ekstrakcijoje ir TLDA, Isabelle Grit už jos pagalbą plazmos mėginių analizėje, Alexandre Benani ir Marie-Chantal Canivenc už naudingą diskusiją ir TLDA dizainą.
Išnašos
Finansavimas. Šis tyrimas buvo paremtas Loire dotacijos regionu PARIMAD (VP), LCL fondo stipendija (VP ir PP), SanteDige fondas (VP) ir INRA Metaprogram DIDIT (SN, VP, PP).
Papildoma medžiaga
Šio straipsnio papildomą medžiagą galima rasti internete adresu http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Pav. S1
Bendras energijos suvartojimas iš kukurūzų aliejaus turinčio butelio. () Kalorijų suvartojimas iš kukurūzų aliejaus buteliuko 24 h P25 šuniukams iš Vakarų dietos (WD) pašarų ir šuniukų iš kontrolinės dietos (CD) pašarų užtvankų. (B) Kalorijų suvartojimas iš kukurūzų aliejaus buteliuko 24 val. P45 (trečioji butelio bandymo diena). (C) Kalorijų suvartojimas iš kukurūzų aliejaus buteliuko 24 val. P95 (trečioji butelio bandymo diena). Skydams (A – C), duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM, statistiniai skirtumai (p > 0.05), stebint bet kokio amžiaus Manno ir Whitney neparametrinį testą. (D) Kalorijų suvartojimo procentas iš kukurūzų aliejaus butelio palyginamas su viso kalorijų suvartojimu (kukurūzų aliejaus buteliukas + standartinė chow dieta) 24 val. (E) Kalorijų suvartojimo procentas iš kukurūzų aliejaus butelio palyginamas su bendrąja kalorijų suvartojimu (kukurūzų aliejaus buteliukas + standartinė chow dieta) 24 val. (F) Kalorijų suvartojimo procentas iš kukurūzų aliejaus butelio lyginamas su bendrąja kalorijų suvartojimu (kukurūzų aliejaus buteliu + standartine chow dieta) 24 val. Skydams (D, E), duomenys išreiškiami procentais nuo bendro kalorijų kiekio, kurio statistinis skirtumas nėra (p > 0.05) buvo stebimi bet kokio amžiaus chi kvadratu su Yateso korekcija.
Pav. S2
Reprezentatyvios TH imuninės spalvos fotomikrografijos branduolių accumbens (NAc) ir ventralinio tegmental srityje (VTA) trimis skirtingais laiko taškais. () TH / NeuN imuninės spalvos fotografija VTA, -5.30 mm lygiu nuo Bregmos. Raudonasis ženklinimas skirtas „NeuN“, o žalias - „TH“. Balta rodyklė rodo trečiojo nervo išėjimą. (B) Fotografija apie TH imuninę spalvą NAc lygiu, + 1.70 mm nuo Bregmos. Žalioji etiketė skirta TH. Balta rodyklė rodo priekinę komisiją.
Lentelė S1
TaqMan mažo tankio masyvo genų sąrašas su atitinkamomis gyvybės technologijomis inventorizuoti kodai.
Lentelė S2
Išleistų duomenų apie dopamino kelio transkriptus išraiška. Raudoni simboliai atitinka vaikystės periodą, mėlyni iki paauglystės ir juodi suaugusieji. =: atitinka panašią transkripcijos išraišką tarp grupių, +: atitinka aukštesnę transkripcijos išraišką iš didelio kaloringumo dietos [šlamšto maisto, vakarų dietos (WD) arba didelės riebalų dietos (HFD)] šeriami užtvankos, ir: atitinka mažesnę transkripcijos ekspresiją kūdikiams iš didelio kaloringumo dietos (šlamšto, WD ar HFD) šerti.
Nuorodos
;
