Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 balandis; 300 (4): R876 – R884.
Paskelbta internete 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstraktus
Anksčiau mes pranešėme, kad insulino skyrimas į hipotalamo ląstelių branduolį sumažina sacharozės motyvaciją, vertinamą savarankiškai atliekant žiurkėms. Kadangi centrinės nervų sistemos (CNS) aktyvacijos modelis kartu su sacharozės savarankišku vartojimu nebuvo įvertintas, šiame tyrime mes matavome c-Fos ekspresiją kaip neuronų aktyvacijos indeksą. Pagal fiksuoto santykio (FR) arba progresuojančio santykio (PR) grafiką ir C-Fos imunoreaktyvumo išraišką CNS surengėme žiurkes, kad jos sukurtų sacharozę. Mes stebėjome unikalią c-Fos ekspresiją medialinėje hipotalamoje (lenktiniuose, paraventrikuliniuose, retrocheminiuose, dorsomedialiniuose ir ventromediniuose branduoliuose), susijusią su PR veikimo pradžia, ir c-Fos ekspresiją šoninėje hipotalamoje ir lovos branduolyje. stria terminalis, kartu su FR veikimo pradžia. c-Fos ekspresija padidėjo ir FR, ir PR žiurkių branduoliuose. Mūsų tyrime pabrėžiama tiek hipotalaminės energijos homeostazės grandinės, tiek limbinės grandinės svarba atliekant maisto atlygio užduotį. Atsižvelgiant į medialinės hipotalamos vaidmenį atliekant energijos balanso reguliavimą, mūsų tyrimas rodo, kad ši grandinė gali prisidėti prie atlygio reguliavimo didesniame energijos homeostazės kontekste.
buvo nustatyta, kad mezolimbinė dopaminerginė (DA) grandinė, įskaitant ventralinį tegmentalinį plotą (VTA), ir projekcijos į striatumą ir žievės vietas, atlieka svarbų vaidmenį motyvuojant ar atlyginant daugelio piktnaudžiavimo narkotikų klasių aspektus (13, 22-24, 26, 48). Naujausi mūsų laboratorijos ir kitų tyrimų rezultatai rodo, kad ši grandinė taip pat vaidina svarbų vaidmenį motyvuojant ar atlyginant maisto aspektus. Funkcinę ir anatominę sąveiką su grandinėmis, reguliuojančiomis energijos homeostazę, rekomenduoja pranešimai apie maisto atlygio moduliavimą pagal gyvūnų mitybos būklę (10, 14, 16, 43). Atlygio moduliavimas, įskaitant atlygį už maistą pagal mitybos ar medžiagų apykaitos būklę, labai priklauso nuo nervų ir endokrininių signalų, įskaitant insuliną (15), leptinas (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melanino koncentravimo hormonas (MCH) (45) ir orexin (5, 7): pastaraisiais metais buvo pakankamai įrodytas šių signalų receptorių buvimas, biocheminis ir ląstelių efektyvumas bei šių signalų in vivo ar elgesio veiksmingumas centrinėje nervų sistemoje (CNS).
Išplėstinė limbinė grandinė taip pat parodė, kad ji atlieka svarbų vaidmenį maitinant ir maitinant maistą (2, 19, 28). Tačiau yra papildomų CNS svetainių. Pažymėtina, kad šoninis hipotalamas (LH) jau seniai žinomas kaip vietovė, kuri vykdo maitinimo ir savęs stimuliavimo elgesį (4, 31). Oxxerginiai neuronai ir leptino signalizacija LH yra laikomi svarbiais šėrimui ir maitinimui (5, 29, 30). Neseniai pastebėjome, kad insulinas, skiriamas arba į trečiąjį smegenų skilvelį, arba į hipotalamo (ARC) lankinį branduolį, gali sumažinti savarankišką sacharozės kiekį, tačiau insulino įvedimas į VTA arba branduolį accumbens neturėjo jokios įtakos šiam specifiniam atlygio paradigmui (15). Taigi, atrodo, kad daugybė hipotalaminių vietų gali atlikti svarbų vaidmenį motyvuotame maisto ieškojime ir įgijime, ir tai atitinka, galima teigti, kad hipotalaminiai regionai yra aktyviai susiję su maisto savarankišku vartojimu. Norint išbandyti šią hipotezę, mes užfiksavome c-Fos ekspresiją žiurkių CNS, sukauptų sacharozės savarankiško paradigmoje, po fiksuoto santykio (FR) mokymo arba po progresyvių santykių (PR) mokymo, griežtesnės užduoties įvertinti motyvaciją (20).
MEDŽIAGOS IR METODAI
Dalykai.
Tiriamieji buvo Albino žiurkių patinai (325–425 g) iš Simonseno (Gilroy, CA). Žiurkės buvo laikomos ant chow ad libitum. Jie buvo palaikomi 12:12 val. Šviesos ir tamsos ciklu, įjungus šviesą 6 val., Ir buvo mokomi bei išbandomi nuo 7 val. Iki vidurdienio, po valgio ir po absorbcijos. Visos žiurkėms atliktos procedūros atitiko Nacionalinio sveikatos instituto gyvūnų priežiūros gaires ir buvo patvirtintos VA Puget garso sveikatos priežiūros sistemos Tyrimų ir plėtros komiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo pakomitečio.
Sacharozės savęs administravimas.
Procedūros buvo pagrįstos mūsų paskelbta metodika (15) ir buvo atlikti su šėrusiomis žiurkėmis. Eksperimente buvo trys etapai: automatinis formavimas, kad būtų pradėtas mokymas, FR mokymas ir laipsniškas santykių (PR) mokymas naudojant Richardsono ir Roberto PR algoritmą (38). PR algoritmas reikalauja 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX ir tt) svirtis paspaudžia, kad sesijos metu būtų galima gauti atlygį.38). Žiurkės buvo apmokytos savarankiškai vartoti 5% sacharozę (0.5 ml atlygį), tiekiamą į skysčio lašą. Operantų dėžės, valdomos „Med Associates“ (Gruzija, VT) sistema, turėjo dvi svirtis, tačiau tik viena svirtis (aktyvi, įtraukiama svirtis) suaktyvino infuzinį siurblį. Įrašytos ir kitos svirties (neaktyvios, stacionarios svirties) presai. Kaip matėme anksčiau, neaktyvios svirties spaudinių skaičius buvo labai mažas (mažesnis nei 10 presai / sesija). Sacharozės tirpalas buvo tiekiamas į skysčio lašą, skirtas vartoti per burną (Med Associates, St. Albans, VT). Pradinis mokymas buvo vykdomas 1-h sesijų metu pagal nuolatinį sutvirtinimo grafiką (FR1: kiekvienas svirtis buvo sustiprintas). Kiekviena sesija prasidėjo su aktyvios svirties įdėjimu ir baltos namų apšvietimo apšvietimu, kuris liko visą sesiją. 5-tonas (2900 Hz, 20 dB virš fono) ir šviesa (7.5 W baltos spalvos šviesa virš aktyvios svirties) diskretus junginys su kiekvienu atlygio pristatymu, o 20-s laikas baigėsi nuo sacharozės pristatymo. FR mokymai vyko 10 dienoms; stabilus atsakas pasiekiamas iki penktosios sesijos. PR mokymas buvo vykdomas maksimaliai 3 h / parą 10 dienoms. PR sesijos pasibaigė po 30 min. Aktyvios svirties paspaudimo atsakymo, tuo metu namo šviesa buvo automatiškai išjungta ir aktyvi svirtis buvo įtraukta; žiurkės buvo paimtos iš kamerų ir grįžo į savo narvų narvus. „Sustabdymo laikas“, apie kurį pranešta Lentelė 2 reiškia laiką, kai sistema buvo išjungta; todėl paskutinis aktyvios svirties presas būtų įvykęs 30 min. prieš sustojimo laiką. Elgesio duomenys (Lentelė 2) yra vidurkiai sesijos 6-10 FR mokymui ir. \ t sesijos 1-9 PR mokymui. Kontroliuojamos žiurkės buvo paimtos iš būsto patalpos ir patalpintos į švarią operacinę kamerą su namų apšvietimu 60 min, procedūrų patalpoje, kad būtų imituotos sacharozės savarankiškai vartojančių žiurkių patirties ir patirties. Jie neturėjo nieko valgyti ar gerti operantų dėžėse ir neturėjo prieigos prie svertų.
Paskutinę dieną žiurkės buvo įdėtos į kameras pagal mokymo dienas ir buvo laikomos kamerose 90 minučių, po to jos buvo pašalintos anestezijai, perfuzijai ir vėlesnei imunohistochemijai. Kontrolinės žiurkės taip pat buvo įvestos į procedūrinę patalpą ir 90 minučių buvo laikomos švarioje operantų kameroje, per treniruočių dienas, po to jos buvo anestezuotos ir perfuzuotos. Iškart po paskutinės 90 minučių sesijos žiurkės buvo giliai anestezuojamos įkvėpus izoflurano ir perpilamos 0.9% NaCl, po to šaltu 4% paraformaldehido tirpalu. Anestezijos ir eutanazijos laikas buvo pagrįstas žinomu c-Fos baltymo smailės ekspresijos laiko intervalu 90–120 min. Po įvykio. Taigi c-Fos išraiška atspindėtų CNS aktyvaciją pradedant elgesio užduotį, o ne dėl to, kad gyvūnai patyrė užduotį ir vartojo sacharozę. Smegenys kelias dienas buvo pašalintos ir po to sutvirtintos paraformaldehidu; po to jie buvo dedami į 20% sacharozės-PBS, po to jie buvo dedami į 30% sacharozės-PBS tirpalą. Smegenys buvo suskaidytos ant kriostato („Leica CM 3050S“ kriostatas) imunohistocheminei analizei.
c-Fos imunohistochemija ir kiekybinis nustatymas.
Naudojome nustatytą metodiką imunoreaktyvaus c-Fos baltymo kiekybiniam nustatymui smegenų skyriuose (12). C-Fos ekspresijai buvo atliktas pradinis kokybinis viso smegenų ekranas. Ant sienos montuojami 12-μm viso smegenų koroniniai profiliai buvo plaunami 3 kartus PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Po to 1 h sekcijos buvo užblokuotos kambario temperatūroje PBS, kuriame yra 5% normalios ožkos ar asilų serumo. Po to sekcijos buvo plaunamos kelis kartus PBS ir inkubuojamos per naktį 4 ° C pirminiuose antikūnų tirpaluose, pagamintuose PBS. Sekcijos tris kartus plaunamos PBS, o po to kambario temperatūroje tamsoje inkubuojamos antrinio antikūno tirpale, pagamintame PBS, esant 1 h. Vėliau sekcijos vėl plaunamos PBS ir sumontuotos ir uždengtos Vectashield kieto rinkinio tvirtinimo terpėje (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Skaitmeniniai sekcijų vaizdai buvo įsigyti naudojant „Nikon Eclipse E-800“ fluorescencijos mikroskopą, prijungtą prie „Optiphot“ fotoaparato ir naudojant „Image Pro Plus“ („Media Cybernetics“, „Silver Spring“, MD) programinę įrangą.
Vėliau mes sutelkėme dėmesį į ribotą skaičių sričių, rodančių akivaizdų skirtumą tarp sąlygų, kiekybinio nustatymo ir neuronų fenotipų. Konkrečiai, mes sutelkėme dėmesį į branduolį accumbens branduolį ir lukštą (NAc); stia terminalo (aBNST, pBNST) priekinis ir užpakalinis lova; medialiniai hipotalaminiai regionai [ventromedialinis branduolys (VMH), dorsomedialinis hipotalamas (DMH), paraventrikulinis branduolys (PVN), retrochiasmatinė sritis (RCh) ir ARC]; šoninis hipotalamas (LH), įskaitant nugaros ir ventralinius regionus ir periforninį (peF) plotą; VTA; smegenų kamienas [žemesnis alyvuogių, hipoglosalų (nXII) branduolys vienišam traktui, šoninis retikulinis branduolys ir C1 / A1 adrenalino / noradrenalino branduoliai]. Atrankos būdu suderinti 12-μm skyriai buvo vertinami pagal C-Fos išraišką ir kiekybinį nustatymą suderintose sekcijose ir regionuose, remiantis Paxinos ir Watson atlasais (34). Prašau pažiūrėk Lentelė 1 specifinėms stereotaksinėms koordinatėms. Tyrimų pagrindinis dėmesys buvo skirtas kiekvienos elgesio užduoties palyginimui su atitinkama kontrole (PR vs KLR; FR vs FRC). Siekiant optimizuoti galimus skirtumus pagal elgseną ir kontrolines sąlygas, analizei buvo atrinkti PR ir FR grupių smailės. Tokiu būdu buvo analizuojamos 4 / 12 PR ir 3 / 12 FR žiurkės: Šios žiurkės turėjo aktyvų svirtį (pirminis elgesio galutinis taškas), kuris buvo didesnis nei vienas standartinis nuokrypis virš jų atitinkamos elgsenos grupės vidurkio. Taip pat buvo išanalizuota kontrolinių žiurkių (5 KLR ir 3 FRC žiurkių, esančių procedūrų patalpoje tuo pačiu metu kaip FR arba PR žiurkės) pogrupis. Papildoma trijų žiurkių grupė buvo paimta per FR procedūrą („FRext“), kad imituotų pridėtinę PR procedūros trukmę (ty iš viso 20 dienų, kai PR žiurkės imamos per FR ir tada PR), siekiant įvertinti, ar: FR ir PR skirtumai atsirado dėl elgesio užduoties arba procedūros trukmės. FRext smegenys nebuvo analizuojami ir sistemingai tiriami, tačiau specifiniai dominantieji regionai buvo ištirti su kitomis keturiomis grupėmis, kad būtų galima atlikti lyginamąjį kiekybinį nustatymą, kaip nurodyta konkrečiai rezultatuose.
Kiekybiniam nustatymui (padidinus 40 ×) buvo atrinkti atlaso atitikimo regionai. „ImagePro Plus“ programinė įranga („Media Cybernetics“) buvo panaudota norimo ploto vaizdui fiksuoti. Skaičiuojant buvo apibrėžta teritorija, nustatyta teigiamų ląstelių skaičiaus riba. Toks pats plotas ir fonas (slenkstis) buvo naudojami sekcijoms iš atitinkamų eksperimentinių grupių, o programinės įrangos teigiamų ląstelių skaičiavimas (kiekybinis) buvo atliktas tose pačiose sesijose visoms eksperimentinėms grupėms, kad būtų išvengta sesijos pokyčių fone. Statistinės analizės tikslais skaičiai buvo paimti iš atskirų žiurkių tik tuo atveju, jei atitinkami arba išsamūs sekcijos per kiekvieną plotą (kaip apibrėžta Lentelė 1) buvo prieinami; duomenys apie konkrečią sritį nebuvo paimti iš žiurkės, jei toje srityje buvo neužbaigtas dvišalis atstovavimas.
Kokybinė dvigubo žymėjimo imunofluorescencinė analizė.
Dvigubai paženklintai imunohistochemijai iš žiurkių buvo paimtos smegenų dalys, kuriose nustatytas c-Fos kiekis. Kadangi nenorėjome trikdyti gyvūnų elgesio, jie nebuvo iš anksto apdoroti kolchicinu, kad būtų optimizuota peptidinių neuromediatorių vizualizacija. Todėl neuronų fenotipų, suaktyvintų atliekant savęs administravimo užduotį, vizualizacija buvo ribota. Tačiau norint pradėti aktyvintų neuronų fenotipų vertinimą daugelyje CNS vietų, skaitmeniniai vaizdai (gauti taip, kaip aprašyta aukščiau esančiame skyriuje) buvo daromi didinant 20 ×, 40 × arba 60 × (kaip parodyta paveikslų legendose). . Dvigubo dažymo procedūra glutamato dekarboksilazei (GAD), tirozino hidroksilazei (TH), CRF, neuropeptidui Y (NPY), su Agouti susijusiam peptidui (AgRP) ir triptofano hidroksilazei buvo panaši į c-Fos imunoreaktyvumo tyrimą. savo, išskyrus tai, kad c-Fos-Ab ir vieno iš kitų pirminių antikūnų mišinys buvo naudojamas inkubacijai per naktį 4 ° C temperatūroje; taip pat abu antriniai antikūnai buvo tame pačiame tirpale ir inkubuoti 1 valandą tamsoje kambario temperatūroje. Oreksino tyrimui buvo naudojamas 20 minučių 50% etanolio plovimas prieš blokavimo etapą. Norint nustatyti tinkamą pirminių antikūnų praskiedimą, buvo atlikti pradiniai optimizavimo tyrimai. Naudoti pirminiai antikūnai buvo triušio anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) ir pelės anti-c-Fos (1: 800) (abu iš „Santa Cruz Biotechnology“, Santa Cruz, CA); pelių anti-GAD (1: 1,000 1), pelių anti-tirozino hidroksilazės (500: 1) ir avių anti-triptofano hidroksilazės (visos iš Chemicon, Temecula, CA); triušio anti-CRF (500: 1) (dovana iš Dr. Wylie Vale, Salk institutas, Kalifornija); triušio anti-NPY (1,000: 1 1,000), triušio anti-AGRP (1: 5,000 3) ir ožkos anti-oreksino A (488: 1 500) - visi iš „Phoenix Pharmaceutical“ (St. Joseph, MO). Naudoti antriniai antikūnai buvo Cy1 konjuguotas ožkų prieš triušis arba pelė (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), „Alexa Fluor 2,500“ ožkos anti-pelės arba triušio ar asilo prieš avį IgG („Molecular Probes“, „Eugene“, OR) ; visi antriniai antikūnai praskiesti santykiu 488: 1. c-Fos / MCH dvigubas imuninis dažymas buvo tiriamas nuosekliai; pirma, MCH (500: 5 pirminio antikūno, Millipore) su Alexa-1-ožkos anti-triušio (500: 3) antriniu antikūnu. Objektai buvo užblokuoti 20% normalaus ožkos serumu ir nudažyti anti-c-Fos (50: XNUMX) ir cyXNUMX-ožkos anti-triušiais kaip antriniais antikūnais. MCH tyrimui buvo naudojamas XNUMX minučių XNUMX% etanolio plovimas prieš blokavimo etapą.
Statistinės analizės.
Grupės duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± SE tekstuose, lentelėse ir paveiksluose. Reikšmė apibrėžiama kaip P ≤ 0.05. Statistiniai palyginimai atliekami tarp eksperimentinių grupių (FR prieš PR) arba tarp eksperimentinių grupių ir atitinkamų kontrolinių grupių (PR prieš PRC; FR prieš FRC), naudojant neporinius Studentų t-testas. Pearsono koreliacijos koeficientai tarp aktyvių svirtelių paspaudimų ir c-Fos raiškos skirtinguose smegenų regionuose, taip pat c-Fos raiškos koreliacija tarp įvairių smegenų regionų vienodomis eksperimentinėmis sąlygomis buvo apskaičiuoti naudojant „StatPlus: mac LE“ statistinės analizės programą, skirtą „Mac OS“ versijai. 2009 m. - „AnalystSoft“. Mes tikrinome linijines koreliacijas (Pearsono R statistiniai duomenys) tarp c-Fos ekspresijos įvairiuose CNS regionuose. Taip pat išnagrinėjome koreliaciją tarp c-Fos ekspresijos skirtinguose aktyvintuose CNS regionuose ir elgesyje. Šiems koreliacijoms buvo naudojami FR ir PR duomenys iš žiurkių, kuriems buvo atliktas c-Fos kiekis.
REZULTATAI
c-Fos kiekybinis įvertinimas.
Kaip matėme anksčiau, aktyviųjų svirtinių presų skaičius buvo gerokai didesnis PR ir FR efektyvumui (Lentelė 2), o sacharozės premijų skaičius buvo didesnis FR veiklos metu. PR žiurkių sesijos trukmė buvo apie 90 min. (Sustabdymo laikas - 30). Lentelė 3 išvardijami c-Fos imunoreaktyvūs ląstelių skaičiai visuose CNS regionuose, kuriuose buvo atlikta kiekybinė analizė. FR ir PR žiurkių c-Fos ekspresijos modelis apibendrintas Pav 1. Buvo reikšmingas medialinio hipotalamo (MHį- ARC, PVN, RCh, DMH ir VMH kompozicija) žiurkių, užsiimančių PR svirtimi, palaikančia sacharozę, bet bendras žiurkių aktyvavimas su FR svirtimi spaudžiant sacharozę, palyginti su atitinkamomis kontrolėmis. PR žiurkių medialinėje hipotalamoje šis aktyvavimas įvyko PVM, ARC ir VMH (Pav 2). FR svirtis, bet ne PR svirtis, buvo susijusi su reikšmingu aktyvavimu LH (pagrįsta daugiausia aktyvavimu periforninėje zonoje). Aktyvios svirties presai ir hipotalaminė c-Fos ekspresija buvo palyginamos tarp FRext ir FR grupių (MHį, 946 ± 26 ir 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 ir 186 ± 10; LHį, 468 ± 79 ir 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 ir 173 ± 15), rodo, kad FR ir PR grupių ekspresijos modelio skirtumas yra susijęs ne su mokymo / patirties trukme, bet su instrumentinės užduoties pobūdžiu. FR grupėje reikšmingai padidėjo C-Fos ekspresija BNST, stebėta tiek aBNST, tiek pBNST. Tiek FR, tiek PR svirtis buvo susieta su padidėjusiais c-Fos-imunopozitiniais neuronais NAc korpuse; c-Fos skaičiai buvo žymiai padidėję NAc šerdyje iš žiurkių, užsiimančių FR svirtimi, su n-reikšminga tendencija didinti c-Fos ekspresiją žiurkėms, veikiančioms PR svirtį. C-Fos nebuvo padidintas VTA su PR užduotimi, nors FR užduotyje pastebėta nežymi didėjimo tendencija. Galiausiai, c-Fos reikšmingai padidėjo hipoglosaliniame (galvos nervo XII) branduolyje, kuris buvo skirtas PR, bet ne FR.
c-Fos ekspresija buvo pastebėta kituose CNS regionuose, įskaitant amygdalą ir smegenų žievę (Pav 3). Tačiau ekspresija buvo stebima tiek kontrolinėmis sąlygomis, tiek kartu su PR ir FR užduotimis, o tai rodo, kad nespecifiniai procedūros aspektai (tvarkymas, judėjimas į procedūrų kambarį) galėjo sukelti šią aktyvaciją. Kiekybinis įvertinimas šiuose regionuose nebuvo atliktas. Taip pat buvo pastebėtas aktyvavimas smegenų kamieno regionuose, išskyrus nXII, bet atsirado kartu su kontrolinėmis ir su užduotimis susijusiomis sąlygomis, taip pat rodo, kad tai yra vaidmuo nespecifinio susijaudinimo ar elgesio aktyvavime.
Mes išbandėme koreliacijas tarp c-Fos raiškos skirtinguose CNS regionuose. Sujungę svirtį spaudžiančių grupių duomenis, radome neigiamą koreliaciją tarp c-Fos išraiškos LH ir VMH; taigi VMH suaktyvėjimas buvo susijęs su sumažėjusiu bendru LH (Pearsono R, -0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Be to, mes pastebėjome reikšmingą teigiamą koreliaciją tarp c-Fos ekspresijos periferiniame LH regione ir VTA (Pearsono R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), atitinkantis žinomą monosynaptinį ryšį tarp šių dviejų regionų (žr. Diskusijų nuorodą. 2 ir 13). Mes nustatėme reikšmingą neigiamą koreliaciją tarp c-Fos ekspresijos VTA ir NAc apvalkalo, nesvarbu, ar jie buvo išbandyti atskirai dėl FR veikimo (Pearsono R, -0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) arba PR veikimui (Pearsono R, -0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), atitinkantis žinomus abipusius įėjimus tarp striatalo regionų iki materia nigra ir VTA (2, 13). Mes taip pat išbandėme koreliacijas tarp c-Fos raiškos skirtinguose CNS regionuose ir elgesio. Sujungę svirtį spaudžiančių grupių duomenis, pastebėjome reikšmingą teigiamą koreliaciją tarp c-Fos ARC ir aktyvių svirties paspaudimų (Pearsono R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Sacharozės suvartojamų neuronų identifikavimas ir sacharozės motyvacija.
Smegenų kamiene, c-Fos teigiami neuronai neturėjo teigiamo imunodažiavimo TH, greičio ribojančio fermento epinefrino ir norepinefrino (ir dopamino); taigi, šie katecholaminerginiai neuronai neatsirado FR ar PR užduočių. Tačiau kai kurie c-Fos teigiami neuronai parodė teigiamą imuninę spalvą triptofano hidroksilazei, nurodydami, kad serotonino neuronų populiacija buvo aktyvuota. Kaip parodyta Pav 4, ARC, c-Fos-teigiami ląstelių kūnai buvo apsupti AGRP-dažytų pluoštų, ir buvo stebėtas panašus NPY pluošto / c-Fos imuninės spalvos modelis (neparodyta). PVM, c-Fos-teigiami neuronai pasirodė esąs CRF-teigiami neuronai, tačiau kolokalizacija nenustatyta (duomenys nerodomi). Pav 5 rodo imuninę spalvą tiek oreksinui, tiek MCH LH. Oxxin neuronai aptikti tiek dLH, tiek peLH. Nors mes stebėjome MCH-teigiamus neuronus pLH, iš esmės nebuvo kolokalizacijos su c-Fos tame LH regione. Tačiau mes stebėjome c-Fos kolokalizaciją oreksino teigiamuose neuronuose, esančiuose pLH (Pav 6, viršų) ir labai ribota c-Fos kolokalizacija su MCH vLH (Pav 6, dugnas). Reikėtų dar kartą pabrėžti, kad tiek lokalizacija, tiek kolokalizacija su c-Fos gali būti nepakankamai įvertintos tokių peptidų neurotransmiterių, kaip CRH, atžvilgiu, nes žiurkės nebuvo gydytos kolchicinu. Galiausiai, branduolyje accumbens šerdyje ir apvalkale (Pav 7), buvo pastebėtas ir FR, ir PR žiurkių c-Fos kartu su GAD, sintetinis neurotransmiterio GABA fermentas. VTA buvo tvirtas TH; tačiau c-Fos teigiami neuronai buvo retai stebimi ir neatrodo, kad jie tik suskirstytų į TH.
DISKUSIJA
Šiame tyrime mes naudojome tiesioginio ankstyvojo geno, c-Fos, ekspresiją, kad įvertintume ūminio CNS aktyvacijos, siejamos su sacharozės savarankiško svirties paspaudimu, modelį, kaip santykinai nereikalingą užduotį (FR) arba palaipsniui sudėtingesnė užduotis, kuri, kaip manoma, atspindi motyvuotą atlygio, pvz., sacharozės, paiešką ir stiprią limbinės grandinės (22, 24, 49) (PR). Hipotalaminiai aktyvacijos modeliai skyrėsi tarp dviejų užduočių: FR užduotyje dominavo LH / limbinis aktyvavimas ir PR užduotyje vyraujanti medialinė hipotalaminė / limbinė aktyvacija (žr. Pav 1). Tam yra keletas galimų priežasčių. Pirma, šios paradigmos gali „susieti“ kaip kokybiškai skirtingas CNS patirtis. Žiurkės, apmokytos FR veikloje, tikisi, kad veikla bus lengva, didelė. Prognozuojama, kad naudingas maistas turėtų turėti didelę įtaką FR žiurkių c-Fos modeliui. Akivaizdus kokybinis aktyvinimo modelio skirtumas rodo, kad antroji galimybė - kad PR gyvūnai turi daugiau patirties su užduotimi - yra mažiau tikėtina, ir tai patvirtino mūsų C-Fos matavimas žiurkių, kurie gavo 20 FR sesijas, hipotalamoje , kuri parodė panašią į FR grupę, o ne PR grupę. Abi šias galimybes galima išbandyti sistemingai didinant FR mokymo sunkumą ir vertinant CNS aktyvacijos pokyčius, tokiu atveju būtų galima numatyti kokybinį aktyvinimo modelio pokytį. Tačiau, nors mokymų patirtis gali neatsižvelgti į CNS aktyvinimo modelį, vidutinis sacharozės atlygių skaičius sesijoje gali: PR užduotis gali būti tiesiog išmokta kaip „mažiau naudinga“ patirtis, ir tai gali būti funkcionaliai susieta su LH aktyvacijos stoka. Taigi, CNS aktyvinimo modelis sesijos pradžioje gali atspindėti interoceptinę būseną, pvz., Sąlyginės vietos paradigmos: aktyvacijos limbinėse grandinėse stiprumas yra susietas su mokymusi ir motyvacija. Mes stebėjome c-Fos ekspresijos kintamumą FRC gyvūnų medialinėje hipotalamoje. Ypač PVM ribose šis variabilumas gali būti užmaskuoti aktyvavimą FR žiurkėse, dėl kurių pastebėta padidėjusių c-Fos ir FRC žiurkių tendencija (Lentelė 3). Tačiau bendrasis medinis hipotalaminis aktyvavimas FR ir FRC gyvūnams nesiskyrė.
Pažymėtina, kad nors mūsų tikslas buvo nustatyti CNS svetaines, kurios prisideda prie elgesio pradžios, laikinoji skiriamoji geba yra šiek tiek apsvarstyta. Kaip aptarta toliau, dabar suprantama, kad skirtingų instrumentinių ar operantinių elgesio sudedamųjų dalių komponentai yra skirtingų neuronų populiacijų aktyvinimo (13, 23, 33, 49). Negalime visiškai atmesti galimybės, kad aktyvinimas dėl labai skubaus baro paspaudimo ar atsipalaidavimo gali šiek tiek prisidėti prie mūsų pastebėtų aktyvinimo modelių. Mūsų išvados suteikia pagrindą tolesniam specifinių CNS vietų vaidmenų tyrimui įvairiuose savianalizės užduoties aspektuose ar komponentuose, ir tokiems tyrimams, kitų tiesioginių ankstyvųjų genų matavimui su skirtingais „įjungimo“ ir „išjungimo“ laikais.36) bus labai naudinga.
Koreliacijos, kurias mes nustatėme c-Fos ekspresijoje tarp skirtingų smegenų regionų, palaiko žinomą funkcinį hipotalaminių ir pirminių limbinių regionų ryšį šiam konkrečiam atlygio uždaviniui, pvz., Tarp LH ir VMH, ir tarp LH ir VTA periforninio regiono. (žr. diskusijų nuorodas. 2 ir 13). Mes taip pat išnagrinėjome koreliacijas tarp c-Fos ekspresijos skirtinguose aktyvuotuose regionuose ir elgesį. C-Fos koreliacija ARC ir aktyvios svirties presuose atitinka gerai apibrėžtą ARC aktyvumo įtaką maistui (1); su ankstesniu stebėjimu, kad insulino injekcija į ARC sumažino sacharozės savarankišką \ t15); su ankstesniais pranešimais apie kritinį ARC ir jo endorfininių neuronų vaidmenį įsigyjant ir vykdant savarankišką kokaino vartojimą (40-42); ir su nustatytomis ARC prognozėmis NAC (17). Taigi, ARC gali vaidinti pagrindinį vaidmenį motyvuotame elgesyje ieškant ir gaunant daugybę apdovanojimo stimulų, įskaitant, bet neapsiribojant, maistą. Galiausiai, mes pastebėjome reikšmingą PVM ir VMH aktyvavimą su PR sacharozės ieškojimu. Tai atitinka gerai apibūdintus šių medialinių hipotalaminių branduolių vaidmenis reguliuojant maistą, tiesiogiai sujungiant su ARC ir nustatant ryšius su limbine grandine (1, 27, 37).
Mes nustatėme didelę neigiamą koreliaciją tarp c-Fos ekspresijos VTA ir NAc apvalkalo, nepriklausomai nuo to, ar jis buvo testuotas FR ar PR. Buvo šiek tiek stebėtina, kad stipresnis VTA aktyvumas nebuvo pastebėtas kartu su PR arba FR sacharozės savarankišku vartojimu (palyginti su atitinkamais kontroliniais preparatais). Galbūt ši išvada atspindi mūsų matavimo laiką, sutelkiant dėmesį į galimas CNS vietas, veikiančias užduoties pradžioje, dėl kurių šie gyvūnai buvo gerai apmokyti. Tai atitiktų Schultzo pastabas ir disertacijas.44), kad dopamino neuronų aktyvavimas yra netikėtų dirgiklių ar atlygių žymeklis, ir šis aktyvinimas mažėja kartu su mokymu. Tačiau įrodyta, kad striatyvaus dopamino išsiskyrimas sacharozės metu treniruotiems gyvūnams pasireiškia kaip labai tikslus ir laikinas diskretiškas įvykis (39). Taigi, galima pastebėti, kad pastebėtos tendencijos būtų labai reikšmingos didesnėje tyrimo grupėje (ty daugiau statistinės galios). Mes stebėjome NAc aktyvaciją kartu su FR ir PR sacharozės vartojimu. Pranešama apie NAc neuronų aktyvavimą ir slopinimą, susijusią su instrumentinio atlygio atlikimu, ir aktyvacijos / aktyvumo modelis priklauso nuo mokymo ir aplinkos, ir yra susijęs su skirtingais elgesio komponentais (pvz., Orientacija, požiūris, suvartojimas).6, 33, 50). Kaip aptarta pirmiau, c-Fos matavimai neįtrauktų tokio specifinio aktyvumo. „Carlezon“ pasiūlė, kad „atlygis“ daugiausia siejamas su NAc neuronų, ty vidutinių smailių neuronų, aktyvumo sumažėjimu (3). Tai neatitinka mūsų pastabų - iš esmės pagerėjo NAc c-Fos, lyginant su gydymo kontrolėmis ir c-Fos teigiamais neuronais, kolokalizuotais su GAD, atitinkančiais vidutinių spyglių neuronų (GABAergic) aktyvaciją, tačiau mes ne specialiai įvertinome NAc neuronų „slopinimą“ “. NAc aktyvinimas ir slopinimas gali atsirasti instrumentinių užduočių metu, tiek anatominiu, tiek laiko specifiškumu. Šio tyrimo požiūriu galima daryti išvadą, kad NAc dalyvauja instrumentinės sacharozės paėmimo pradžioje, o NAc branduolys prisideda prie motorinio aktyvavimo ir NAc korpusas prisideda tiek prie motorinio, tiek motyvacinio užduoties aspektų.
Mes taip pat stebėjome abiejų pagrindinių BNST regionų (priekinės ir užpakalinės) aktyvavimą FR žiurkėse. BNST yra limbinės grandinės dalis, kuri moduliuoja neuroendokrininius atsakus į pakartotinius stimuliavimo patyrimus (8, 9) ir didesnėje prasme yra susijęs su mokymosi apie pasikartojančius stimulus mokymu. Nors jo vaidmuo išsiaiškintas visapusiškai, atsižvelgiant į pakartotinius streso patirties atvejus, mūsų išvados rodo platesnį BNST vaidmenį: BNST gali keisti CNS atsakus į pasikartojančius teigiamus, taip pat neigiamus ar stresinius stimulus. Kadangi mes stebėjome šį aktyvavimą FR pradžioje, bet ne PR, veiklos, BNST įdarbinimas gali būti susietas su padidėjusiu FR mokymų sacharozės atlygiu. Mūsų stebėjimas, kad nėra tiesioginio CRF neuronų aktyvinimo, rodo, kad instrumentinis atsakas į sacharozę nėra pagrindinis veiksnys; tačiau c-Fos ekspresija kituose PVM neuronuose atitinka įtampos grandinės moduliavimą (46). Iš tikrųjų Ulrich-Lai ir kolegos pranešė, kad naudojant kitą mitybos / maitinimo paradigmą, sacharozės suvartojimas moduliuoja PVM funkciją (47). Galiausiai, mes stebėjome hipoglosalinio nervo branduolio aktyvaciją kartu su PR, bet ne FR efektyvumu. Tai galima tik spėlioti; viena galimybė yra tai, kad sacharozės skonio reikšmė gali būti padidėjusi žiurkėms, kurios suvartoja mažiau sacharozės.
Sacharozės ir sacharozės vartojimas turėtų būti laikomas daugiarūšės patirties, kuri laikui bėgant yra dinamiška, nes nurijimas sukeltų periferinius signalus, susijusius su sacharozės kalorijų kiekiu, taip pat įpratimu ir per sesijos alliesteziją (25). Nors mūsų tyrimuose daugiausia dėmesio skiriama periferinių endokrininių signalų, ty insulino ir leptino, poveikiui maistui atlyginti, jų poveikį gali tiesiogiai tiesiogiai perduoti siųstuvai ir neuropeptidai, kurie vaidina trumpalaikį ar ilgalaikį vaidmenį. maitinimas arba atlygis už maistą (žr. 14). Dabartiniame tyrime pateikiama tam tikra informacija; mes stebėjome kai kuriuos neuronus, kurie ekspresuoja arba MCH, ar oreksiną, du neuropeptidus, kurie yra oreksigeniški. Šie atradimai iš tikrųjų gali nuvertinti MCH arba oreksino vaidmenį maistu, nes imunocitochemija neapdorotoms žiurkėms neabejotinai apribojo abiejų šių neuropeptidų vizualizaciją. Aktyvuotų oreksino neuronų identifikavimas LH sistemoje yra suderintas su daugeliu tyrimų, kurie verčia oreksino neuronus šėrimo, maisto atlygio ir labiau apibendrinto stimulo atlygio (pvz., 5, 7, 29). Mes stebėjome peFLH oreksino neuronų aktyvaciją. Aston-Jones ir kolegos (5) išskyrė skirtingų LH oreksino neuronų grupių vaidmenis atlygio elgsenoje ir įtraukė peFLH oreksino neuronus susijaudinime, o ne atlygį per se. Taigi, mūsų išvada rodo, kad LH orexin turi vaidmuo susijaudinime, o galbūt orientacija į aktyviąją svirą arba užuominas už sacharozę.
Reikėtų apsvarstyti, ar sacharozė yra unikalus arba paplitęs kaip naudingas stimulas. Ar ankstyvo CNS aktyvinimo modelis, apie kurį pranešame čia, yra specifinis maistui, kaip stimului, ar apibendrinamas kitiems naudingiems stimulams, dar reikia nustatyti. Kaip minėta aukščiau, ypač FR užduotyje, tikėtina, kad daugelio sacharozės atlygių nurijimas turėtų medžiagų apykaitos pasekmes, hormonų išsiskyrimo moduliavimas (pvz., Cholecistokininas, grelinas, insulinas) ir periferinės bei CNS nervų aktyvacijos pokyčiai. Tikimasi, kad šie pokyčiai neturės tiesioginio vaidmens ankstyvuose CNS aktyvinimo modeliuose, kuriuos mes matavome, bet gali būti svarbūs mokantis apie sacharozės atlygį mokymo metu. Vėlgi, tokie neuropeptidai kaip oreksinas gali būti kritiškai susiję.
Mūsų tyrimas, mūsų žiniomis, yra pirmasis specifinių medialinių hipotalaminių branduolių aktyvacijos įrodymas, sacharozės savarankiško vartojimo pradžioje, įskaitant ir PVM, susijusį su homeostazės ir streso reakcija, ir ARC, kuri yra svarbi energijos homeostazei, maistinių medžiagų jutimas ir maisto suvartojimo reguliavimas. Svarbu tai, kad mes stebėjome medialinio hipotalamo ir NAc aktyvaciją kartu su PR pradžia, o tai rodo, kad tiek homeostatinė, tiek kai kurios limbinės vietos yra svarbios savarankiško sacharozės įvedimui. Papildomos limbinės grandinės vietos gali būti įdarbintos užduotyje vėliau.
Perspektyvos ir reikšmė
Nors istoriškai motyvacinio ir atlygio elgesio tyrimai labiausiai sieja CNS limbinę grandinę, sukaupta daugybė įrodymų, kurie pabrėžia kritinę funkcinę sąveiką tarp limbinio ir energijos homeostazės grandinės. Šiuo metu atliktas tyrimas rodo, kad motyvuotame darbe sacharozei gali kilti specifinių medialinių hipotalaminių branduolių svarba. Iš šio tyrimo ekstrapoliuojantys būsimi tyrimai gali įvertinti, ar reikalingas medialinio hipotalamo vaidmuo ir ar jos aktyvinimas yra susijęs su motyvuotu kitų atlygių, pvz., Piktnaudžiavimo narkotikų, ieškojimu. Be to, šio tyrimo rezultatai leidžia motyvuoti motyvuoto elgesio pokyčius kartu su pasikeitusia medialine hipotalamine fiziologija, pvz., Nutukimu.
DOTACIJOS
Šį tyrimą palaikė Nacionaliniai sveikatos priežiūros institutai DK40963. Dr Dianne Figlewicz Lattemann yra vyresnysis mokslo darbuotojas, biomedicinos laboratorijos tyrimų programa, veterinarijos reikalų departamentas Puget Sound sveikatos priežiūros sistema, Sietlas, Vašingtonas. Dr. Sipolį remia Latvijos mokslo taryba „04.1116“.
Padėka
Dėkojame dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius ir JE Blevins patarimai ir naudingos diskusijos.
NUORODOS
;