PASTABOS: CRF yra neuromediatorius / hormonas, kuris klasiškai siejamas su mūsų reakcija į stresą ir antinksčių žievės aktyvavimu. Priklausomybių tyrimai nustatė, kad tai yra pagrindinis dalyvis įgyjant priklausomybes, priklausomybės recidyvą ir nutraukimo simptomus. Šis tyrimas ištyrė CRF vaidmenį priklausomybei nuo maisto ir priverstiniam valgymui. Guss ką? Tai turi tuos pačius vaidmenis su priverstiniu valgymu, kaip ir su priklausomybe nuo narkotikų. Atkreipkite dėmesį, kad gyvūnai nebuvo nutukę, todėl nutukimas nevaidino jokio vaidmens. Daugiau įrodymų, kad elgesio priklausomybės, įskaitant pornografiją, turi tuos pačius mechanizmus kaip ir priklausomybė nuo narkotikų.
VISAS STUDIJŲ APŽVALGA: CRF sistemos įdarbinimas tarpininkauja „Dark Side Of Compulsive Eating“
Proc Natl Acad Sci US A. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.
Paskelbta internete 2009 Nov 9. doi: 10.1073 / pnas.0908789106
Pietro Cottone,a,b,c,d,1,2 Valentina Sabino,a,b,c,d,1 Marisa Roberto,a,c,d Michal Bajo,e Lara Pockros,a Jennifer B. Frihauf,a,c,d,f Eva M. Fekete,a,c,d Luca Steardo,g Kenner C. Rice,h Dimitri E. Grigoriadis,i Bruno Konti,d,e George F. Koob,a,c ir Eric P. Zorrillaa,c,d,2
Šis straipsnis buvo minimas kiti PMC straipsniai.
Abstraktus
Dieta, skirta kūno svoriui kontroliuoti, apima nepriteklius nuo skanių maisto produktų, kurie gali paskatinti kompulsinį valgymą. Šis tyrimas rodo, kad žiurkėms, ištrauktoms iš pertraukos prie skanių maisto produktų, atsinaujinusiai patekus į skonį, atsiranda skanus maistas, o afektinė ištrauka - panaši būsena, kuriai būdingas kortikotropino išskyrimo faktorius-1 (CRF1) receptorių antagonistų-grįžtamąjį elgesį, įskaitant hipofagiją, motyvacinį trūkumą, kad būtų galima gauti mažiau skanių maisto produktų, ir anksiogeninį elgesį. Pasitraukimą lydėjo padidėjusi CRF ekspresija ir CRF1 elektrofiziologinis jautrumas centriniame amygdalos branduolyje. Siūlome įdarbinti anti-atlygį išskiriančią CRF-CRF1 Sistemos, pašalinus iš skanių maisto produktų, analogiškų abstinencijai nuo piktnaudžiaujamų vaistų, gali paskatinti skanių maisto kompulsinį atranką, sveikesnių alternatyvų subalansavimą ir neigiamą emocinę būseną, kai užkertamas kelias skanus maistas.
Nutukimo ir valgymo sutrikimų, panašių į priklausomybę nuo narkotikų, formas galima apibūdinti kaip lėtines recidyvuojančias sąlygas su kintančiais abstinencijos periodais (ty dietomis, kad būtų išvengta „uždraustų“ skanių maisto produktų) ir recidyvo (ty, kompulsinis, dažnai nekontroliuojamas, didelio mitybos lygis) maisto produktai), kurie nepaisant neigiamų pasekmių tęsiasi (1). Nors gerai žinomi skanių maisto produktų teigiami stiprinimo požymiai (2, 3), mažiau dėmesio buvo skiriama jų neigiamoms \ t4-6), ty padidėjusi elgsenos atsako tikimybė, atsirandanti pašalinus aversinį stimulą (pvz., skanių maisto produktų vartojimas, siekiant sumažinti neigiamas emocines būsenas). Pertraukiamieji piktnaudžiavimo narkotikų vartojimo didinimo ciklai gali palaipsniui sukelti „emocinę priklausomybę“, pastebėtą kaip būtinybę didesniems ir (arba) reguliaresniems vaistinio preparato kiekiams palaikyti, kad būtų išlaikytas tam tikras emocinis nustatymo taškas, taip pat neigiama emocinė būsena nutraukus gydymą. narkotikų vartojimas (7, 8). Toks afektinis pasitraukimas gali išlaikyti naudojimą ir motyvuoti atkrytį, neigiamai sustiprindamas narkotikų vartojimo tęstinumą ir atnaujinimą (7, 8).
Extrahypothalamic kortikosropino atpalaidavimo faktoriaus (CRF) smegenų streso sistemos yra linkusios dalyvauti pereinant nuo narkotikų vartojimo priklausomybei, kurios metu piktnaudžiaujamų narkotikų vartojimas tampa vis labiau motyvuotas dėl šių neigiamų, o ne teigiamų sustiprinimo mechanizmų. CRF vaidina motyvaciškai svarbų vaidmenį kiekvienam pagrindiniam piktnaudžiavimo vaistui, įskaitant alkoholį, nikotiną, kokainą, opiatus, amfetaminus ir tetrahidrokanabinolį, nutraukimo sindromuose.7, 8). Analogiškai, pakartotinai pertraukiamų, išplėstų prieigos prie labai skanių maisto produktų ciklų hipotezės sukėlė CRF sistemos neuroadaptacijas, panašias į tas, kurios buvo pastebėtos priklausomybės nuo narkotikų modeliuose (4, 5, 9).
rezultatai
Dėl pertrūkių išplėstos prieigos prie skanių maisto produktų palaipsniui sumažėja mažiau pageidaujamų dietų, kai nėra skanių maisto produktų, ir pagyrimo patiekalų perkaitimas atnaujinus patekimą (10-12). Išbandyti hipotezę, kad CRF1 sistemose tarpininkaujama šiems maitinimo pritaikymams, žiurkių \ tn = 20) kasdien kiekvieną savaitę buvo suteikta ad libitum chow dieta (Chow / Chow), arba 5 dienų (C fazė) buvo suteikta karvė ad libitum, po to 2 paros metu buvo labai skanus, cukrus. ) (pamatyti S1 už dietos grafiką ir S2 mitybos tvarkaraščio poveikį maistui ir kūno svoriui). Po 7 savaitės dietos ciklo, žiurkės gavo nepeptidinį CRF1 R121919 (0, 5, 10 ir 20 mg / kg, sc) receptorių antagonistas lotyniškos formos \ t13). Gydymas buvo atliktas 1 h, prieš pereinant nuo skanios dietos į karvę arba iš karvės į skanią dietą. R121919 priklausomai nuo dozės sumažėjo skanus dietos suvartojimas ir padidėjęs pašaro suvartojimas Chow / Palatable žiurkėms (dietos fazė × dietos planas × vaisto dozė: F3,54 = 7.25, P <0.001), nekeičiant ėduonies kontrolės. R121919 sumažėjo labai skanios dietos vartojimas atnaujinus galimybę mėgautis skaniu maistu (P fazė) (Pav 1A). Nepriklausomuose testuose CRF1 receptorių antagonistas padidino mažiau skanių čiaučių suvartojimą Chow / Palatable žiurkėse, ištrauktas iš skanios dietos (C fazė)Pav 1B). Taigi, sumaišydami tiek čiauos hipofagiją, tiek skanius maisto produktus, R121919 susilpnino įsiurbimo ciklo amplitudę (skirtumas tarp suvartojimo per pirmąjį skanus P etapą ir pirmąjį pasitraukimą iki chow C fazės: dietos tvarkaraštis × vaisto dozė: F3,54 = 7.25, P <0.001) (Pav 1C). Remti laipsnišką CRF-CRF įdarbinimą1 R121919 nesumažino skoningo maisto suvartojimo po vienkartinės dietos ar padidino karvių suvartojimą per pirmąjį išgėrusį maistą (žr.S3).
Ištraukimas iš pertraukos, išplėstos prieigos prie skanių maisto produktų taip pat gali padidinti nerimo elgesį (11). Išbandyti hipotezę, kad CRF1 receptoriai yra susiję su neigiamais emociniais elgesio požymiais, kurie seka pasitraukimą iš skanių maisto produktų, žiurkėms buvo duodama R121919 (0, 20 mg / kg, sc, 1-h apdorojimas prieš gydymą) ir ištirtas tarp tiriamųjų.14), 5 – 9 h po to, kai buvo perjungta nuo skanios dietos į chow. Transporto priemonėje gydomos Chow / Palatable žiurkės turėjo mažiau atviros rankos laiko, nei kontroliuojama chow-šėrimo, atspindinčios anksiogeninį poveikį, nutraukus 7 savaitės dietos ciklą (Pav 2A), poveikis dar nebuvo pastebėtas tik po dviejų pašalinimo ciklų (S4). Išankstinis gydymas R121919 (20 mg / kg, dozė, moduliuojanti tiek geriamojo maisto persivalgymą, tiek sušlapimo) užblokavo atviros rankos tyrimą Chow / Palatable žiurkių dozėmis, kurios nekeičia plius labirintą. Dietos tvarkaraštis × dozė: F1,43 = 7.25, P <0.02; Pav 2Kairė). R121919 vartojimas nepakeitė bendrojo aktyvumo, išmatuoto kaip uždaros rankenos. Todėl R121919 užblokavo padidėjusį nerimo panašų elgesį, susijusį su nutraukimu, išplėstine prieiga prie skanių maisto produktų, nekeičiant kontrolės elgesio, o tai rodo, kad reikia įdarbinti CRF.1 sistemas.
Išstūmimas iš pertraukos, išplėstos prieigos prie skanių maisto produktų taip pat gali sukelti motyvacinį trūkumą, kad būtų galima gauti mažiau pageidaujamą mitybą - galimą hipohedoniško elgesio indeksą (10). Analogiškai, reaguojant į mažiau pageidaujamus skonio stipriklius, taikant progresyvaus armatūros planus, anksčiau buvo naudojamas indeksuojant vaisto vartojimo nutraukimo metu pastebėtus motyvacinius trūkumus (15). Nustatyti CRF dalyvavimą1 R121919 įtaką žiurkių, vartojusių maistą, veiksmingumą išbandėme, norint gauti jų mažiau pageidaujamą karvę pagal progresyvaus santykio grafiką. Ankstesnių išvadų patvirtinimas (10), su transporto priemone gydomomis „Chow / Palatable“ žiurkėmis buvo mažesnė motyvacija dirbti, kad būtų gautas mažiau skanus viščiukas, kurį atspindi sumažėjęs lūžio taškas ir sumažėjęs bendras atsakas, palyginti su Chow / Chow žiurkėmis (10) (S5). Išankstinis R121919 gydymas (20 mg / kg, dozė, veiksminga didinant česnako hipofagiją, mažinant skanius maisto hiperfagijas ir mažinantis anksiogeninį elgesį) selektyviai sumažino progresuojančio santykio našumą žiurkėms, kurių dozė buvo neveiksminga. (lūžio taškas: dietos tvarkaraštis × vaistas: F1,15 = 8.17, P <0.02; iš viso atsakymų: Dietos tvarkaraštis × Vaistas: F1,15 = 9.14, P <0.01; Pav 2B, kairėn). Atsižvelgiant į alternatyvų aiškinimą, kad R121919 palengvino veikimą Chow / Palatable žiurkėse, sumažindamas postestestinį pasotinimą, R121919 blokavo trūkumus atsakydamas į 5 min. F1,15 = 2.55, P <0.05) (Pav 2B Teisė). Todėl CRF1 receptorių antagonistas nuvertino progresuojančio santykio motyvacinį trūkumą, reaguojant į mažiau pageidaujamus skonio stipriklius, kurie pasireiškia gyvūnams, kurie buvo ištraukti iš pertrūkių, išplečiant prieigą prie labai skanių maisto produktų.
Norint išbandyti hipotezę, kad pasitraukimas iš skanių maisto produktų gali suaktyvinti su stresu susijusį extrahipalalaminį CRF sistemą, CRF mRNR ir peptido koncentracija centrinėje amygdalos branduolyje buvo išmatuota pagal kiekybinę realaus laiko PCR ir RIA. Žiurkės 7 savaitės buvo dietos ciklo metu arba nuolat pamaitintos. Po anestezijos ir dekapitacijos, ištraukiant iš ir po atnaujintos prieigos prie skanios dietos, buvo surinkti smegenų štampai iš centrinės branduolio. Išgėrus skanius maisto produktus Chow / Palatable žiurkėse, penkių kartų padidėjo CRF mRNR ekspresija centrinėje amygdalos branduolyje, lyginant su Chow / Chow žiurkėmis (Pav 3A). Ir atvirkščiai, CRF mRNR sugrįžo į panašius į kontrolinius lygius, atnaujindama prieigą prie skanių maisto produktų (F2,19 = 6.97, P <0.01). CRF iRNR išraiška centriniame migdolos branduolyje nepakito, kai Chow / gurkšnios žiurkės buvo ciklizuojamos tik vieną kartą (Chow / Chow vs. Chow / Palatable: 5.5 ± 2.2 prieš 6.3 ± 1.7 ns), palaikant progresuojantį CRF CRF1 mitybos istorija, o ne ūminis dietos poveikis. Be to, CRF mRNR ekspresija nepasikeitė branduolio accumbens, prefrono žievės ar salų žievės, remdama regioninį specifiškumą atradimams (S6). Įdomu tai, kad hipotalamo paraventriculiniame branduolyje ar cirkuliuojančiame kortikosterone, Chow / Palatable žiurkėms, nebuvo pastebėta jokių reikšmingų CRF mRNR ekspresijos pokyčių.Fig. S6 ir S7), nurodant hipotezę, kad amygdalaro pokyčiai, o ne hipotalaminiai, CRF streso sistemos priartėjo prie elgesio adaptacijų. Be to, CRF peptidų imunoreaktyvumas centrinėje branduolio amygdalos dalyje, paimtoje iš skanios dietos, buvo 70% didesnis nei gyvulių pašaruose, bet grįžo į chow-šėrimo kontrolinius lygius su prieiga prie skanios dietos (F2,24 = 4.01, P <0.01) (Pav 3B). Taigi, geriamojo maisto pašalinimas suaktyvino su stresu susijusį CRF peptidų sistemą centrinėje amygdalos branduolyje, analogiškai nustatant vaistų ir etanolio ištraukimo modelius (7, 8). Kadangi atsinaujinusi prieiga prie skanių maisto produktų sumažino centrinės CRF sistemos aktyvumą centrinėje amygdalos branduolyje, kur CRF aktyvacija yra susijusi su nerimu (16), šie rezultatai taip pat rodo, kad skanūs maisto produktai gali įgyti neigiamų stiprinančių savybių, mažindami neigiamas abstinencijos pasekmes (17).
Norėdami išbandyti hipotezę, kad žiurkėms, ištrauktoms iš skanių maisto produktų, gali būti padidėjęs jautrumas CRF1 γ-aminovo rūgšties (GABA) signalizacijos antagonistinis moduliavimas centrinėje amygdalos branduolyje, kuris atsiranda per etanolio ištraukimą (18), ištyrėme R121919 poveikį GABAerginiam amygdalos neuronų centrinio branduolio perdavimui griežinėliais. Vyriškos Wistar žiurkės (n 14) 7 savaitės buvo dietos ciklai ir nukrito po to, kai buvo persijungta į mažiau skanius česnakus. Bazinis GABAerginis perdavimas centrinėje amygdalos sinapso branduolyje nesiskiria nuo dietos istorijos (n = 23 ląstelės) visuose stimulo intensyvumuose, naudojamuose GABA inhibuojantiems postinaptiniams potencialams (IPSP) sukelti. Tačiau 20 min superfuzija su R121919 (1 μM) sukėlė didesnį sukeltos GABA sumažėjimą.A-SPSP centrinėje Chow / Palatable žiurkių neuronų neuronų branduolyje (M ± SEM: 30 ± 6%, n = 9 ląstelės), negu chow-šėrimo kontroliniuose mėginiuose (M ± SEM: 12 ± 6%, \ t P <0.05, n = 11 ląstelės) (Pav 4). Po 30 min. Išsklaidymo laikotarpio abiejų grupių IPSP sugrįžo į panašius bazinius lygius. Todėl, atsižvelgiant į amygdala CRF-CRF pernelyg aktyvinimą1 etanolio pašalinimo metu (žr.18) žiurkės su dietiniu ciklu padidino jautrumą CRF slopinamajam poveikiui1 receptorių antagonistas centrinėje amygdala GABAerginės transmisijos branduolyje.
Diskusija
Kolektyviniai rezultatai suteikia funkcinių įrodymų, kad pertraukos, išplėstos prieigos prie skanių maisto produktų istorija sukelia progresyvias, motyvaciniu požiūriu svarbias neuroadaptacijas, susijusias su strrahiniu ekstrapiralaminiu CRF-CRF1 sistemas. Konkrečiai, selektyvus CRF1 R121919 receptorių antagonistas diferencijuotai ir selektyviai paveikė mitybos ciklo žiurkių šėrimą, didindamas reguliarų chow vartojimą ir sumažindamas labai geriamo maisto vartojimą po to, kai jis buvo atnaujintas. CRF1 receptorių antagonistas taip pat selektyviai blokavo padidėjusį nerimo požymį ir motyvacinį trūkumą reaguojant į mažiau pageidaujamą karvę, kuri buvo pastebėta pasitraukus iš skanios dietos. Panaikinus prieigą prie skanios dietos, padidėjo CRF genas ir peptidų ekspresija centrinėje amygdalo branduolyje, kurie buvo pašalinti iš naujo. Be to, su žiurkėmis vartojamos žiurkės padidino jautrumą CRF slopinančiam poveikiui1 GABAerginio transmisijos receptorių antagonistas centrinėje amygdalos branduolyje, o tai rodo, kad amygdalos CRF-CRF1 sistema. Gėriamo maisto perkaitimas atnaujinus prieigą, gali atsirasti dėl padidėjusio CRF sistemos aktyvinimo, kurį sukėlė neseniai baigtas pasitraukimo laikotarpis, kaip padidėjusi CRF ekspresija ir elektrofiziologinis jautrumas CRF.1 receptorių blokada centrinėje amygdalos branduolyje. CRF1 priešingai, prieš pradedant vartoti maistą, prieštaraujama pradiniam vis dar buvusiam CRF-CRF1 sistemos pašalinimo nutraukimas. Trumpas skanaus maisto persivalgymo laikas, kitaip matomas neapdorotiems gyvūnams (10) gali atspindėti laiką, per kurį normalizuojasi CRF peptido ekspresija, atpalaidavimas ir poveikis, kai tik vėl gaunama prieiga prie skanių maisto produktų, kaip matyti šiame tyrime. Taigi, periodiškai valgant skanius mitybos produktus, smegenų atlyginimų sistemose gali atsirasti alostatinis poslinkis, įdarbinant anti-atlygio CRF-CRF1 sistemos centrinėje branduolio dalyje.
Šie rezultatai turi įtakos ne tik kompulsiniams valgymui, bet ir apskritai motyvacijai. Pakartotinis hedoninių sistemų aktyvavimas sukėlė priešininkui panašius procesus smegenyse (ty įdarbinti CRF1 grandinės), kurios skiriasi nuo paprasto funkcijų praradimo už atlygio siųstuvų sistemas. Tokios tarpinstitucinės neuroadaptacijos (19) taip pat atsiranda perėjus prie priklausomybės nuo visų pagrindinių narkotikų \ t7, 8). Šiame tyrime apibendrinant ne narkotikų stimulus galima daryti išvadą, kad motyvaciniai procesai gali sutrikdyti asmenis, kurie laikui bėgant kartoja kontrastus hedoninių stimulų intensyvumui (20). Adaptyviai tokie procesai gali pakeisti maisto ieškojimą ir maistingumą daug energijos reikalaujančiuose maisto produktuose, kuriuose gausu daug atlygio, tuo pačiu nuvertinant pastangas gauti mažiau energijos turinčių, mažai atlyginančių maisto produktų (ar ne maisto produktų). pašarų sąnaudos (pvz., plėšrūnų poveikis, ribotas laiko ir energijos resursas). Tačiau šiandieninėje aplinkoje tie patys procesai gali paskatinti nutukimą skatinančių maisto produktų vartojimą mažiau skanių, bet galbūt maistingesnių alternatyvų sąskaita.
Taigi, priklausomybės pokyčiai CRF1 sistemos gali padėti vairuoti (i) energijos suvartojamų skanių maisto produktų suvartojimas, \ tii) nepakankamai vartojamos sveikesnės alternatyvos irIII) susijusi neigiama emocinė būsena, kuri atsiranda, kai neleidžiama patekti į skanius maisto produktus (4, 5, 10-12, 17). Pagal žmogaus būklę, CRF sistemos aktyvinimas gali paskatinti nutukimo ir su tuo susijusių mitybos sutrikimų, taip pat kitų neigiamų ciklinės abstinencijos motyvacinių pasekmių, susijusių su skaniu maistu, atsinaujinimą.
Medžiagos ir metodai
Dalykai.
Vyriškos Wistar žiurkės (n 155, 180 – 230 g, 45 dienų senumo) buvo gautos iš Charles River, o 19 h: 10.5 h: 8 h atvirkštinio apšvietimo ciklą (12 h X). : 12 h žibintai išjungiami), drėgmės (10%) ir temperatūros kontroliuojamas (00 ° C) vivariumas. Žiurkėms buvo suteikta galimybė patekti į kukurūzų grūdus [Harlan Teklad LM-60 Dieta 22: 485% (kcal) angliavandeniai, 7012% riebalai, 65% baltymai, metabolizuojama energija 13 cal / 21 g] ir vandeniui ad libitum 341 savaitę prieš eksperimentų pradžia. Eksperimentinės procedūros laikomasi Nacionalinių sveikatos vadybos laboratorijų laboratorijų gyvūnų priežiūros ir naudojimo institutų (NIH leidinio numeris 100 – 1, patikslintas 85) ir „Laboratorinių gyvūnų priežiūros principai“ (http://www.nap.edu/readingroom / Bookslabrats) ir patvirtino Scripps tyrimų instituto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.
Narkotikai.
R121919 buvo susintetintas, kaip aprašyta Chen ir kt. (21). R121919 yra didelis afinitetas (Ki = 3.5 nM) selektyvus CRF1 antagonistą, turinčią daugiau fizinių ir cheminių savybių, nei daugelis kitų CRF1 antagonistai (pvz., sumažėjęs logP ir logD, padidėjęs tirpumas vandenyje) (\ t13). Bandymams R121919 pirmą kartą buvo tirpinamas 1 M HCl (10% galutinio tūrio), po to praskiestas į galutinę 20% (masės / tūrio) 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrino (Sigma-Aldrich) terpę. NaOH iki pH 4.5. R121919 tirpalui buvo skiriamas sc (sc) 2 ml / kg tūrio.
„Ad Libitum“ dietos alternatyva.
Po aklimatacijos žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes, atitinkančias maistą, kūno svorį ir pašarų efektyvumą nuo ankstesnių 3 – 4 dienų. Vienai grupei buvo suteikta chow dieta („Chow“) ad libitum 7 dienas per savaitę (Chow / Chow), o antrajai grupei buvo suteikta karvė ad libitum kiekvieną savaitę 5, po to 2 dienų, kai buvo leista susipažinti su labai skaniais , šokolado skonio, didelės sacharozės dieta („Palatable“; „Chow / Palatable“). Skanus mityba yra mitybos požiūriu pilnas, šokolado skonio, didelės sacharozės (50% kcal), AIN-76A pagrindu pagaminta dieta, kuri yra panaši į makroelementų proporcijas ir energijos tankį iki chow dietos [TestDiet; 5TUL: 66.8% (kcal) angliavandenių, 12.7% riebalų, 20.5% baltymų, metabolizuojama energija 3.48 kcal / g; kaip 45-mg tikslumo maisto granulės, siekiant padidinti jo \ t22, 23)]. Dėl trumpumo, kiekvienos savaitės pirmieji 5 dienos (tik chow) ir paskutinės 2 dienos (chow arba skanūs pagal eksperimentinę grupę) yra nurodyti visuose eksperimentuose kaip C ir P fazės. Dietos niekada nebuvo prieinamos. Chow dieta buvo arba Harlan Teklad LM-485 dieta 7012 [65% (kcal) angliavandeniai, 13% riebalai, 21% baltymas, metabolizuojama energija 341 cal / 100 g] arba 5TUM dieta su 4-5-g ekstruduotomis granulėmis [65.5 % (kcal) angliavandenių, 10.4% riebalų, 24.1% baltymų, metabolizuojamos energijos 330 cal / 100 g; TestDiet]. Panašiai kaip ir ankstesniuose tyrimuose, šėrimo ir aukštojo labirinto eksperimentuose buvo naudojamas Harlan Teklad LM-485 chow.11), o TestDiet 5TUM chow (10) buvo panaudotas progresyviam santykiui, CRF mRNR, CRF peptidų kiekiui, kortikosterono RIA ir elektrofiziologiniams eksperimentams.
Kaip anksčiau paskelbta (10), santykinės mitybos nuostatos, apskaičiuotos kaip pirmosios dietos dienos dietos procentinė dalis (kcal), susijusios su antrąja dieta, buvo tokios: 5TUL šokolado dieta (cukrinis racionas) prieš Harlan LM-485 chow (M ± SEM pirmenybė 90.7 ± 3.6%) ir 5TUL šokolado dieta (cukraus skonio dieta) prieš 5TUM chow Diet (M ± SEM pirmenybė 91.2 ± 3.7%).
Padidėjęs plius-labirintas.
Padidintas plius labirintas buvo atliktas, kaip aprašyta Cottone et al. (24). Chow / Palatable žiurkės buvo dietos ciklo bent 7 savaites ir tada buvo iš anksto apdoroti arba su transporto priemone arba 20 mg / kg R121919 (-1 h, sc) ir išbandyti 5 – 9 h po to, kai buvo perjungtas iš skanios dietos į chow (P → C fazė. Chow / Chow kontrolinės žiurkės buvo tiriamos vienu metu tarp tiriamųjų (n = 47). Chow dieta buvo prieinama iki testavimo. Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Progresyvaus maisto stiprinimo planas.
Progresyvaus maisto stiprinimo armavimo grafikas buvo atliktas, kaip aprašyta Cottone et al. (10). Eksperimente, jei nenurodyta kitaip, gyvūnai, kurie buvo gauti ad libitum A / I chow (5 g ekstruduotų granulių) savo namuose. Maisto stiprintuvai buvo 45-mg karvių tikslumo granulės, kurių sudėtis buvo identiška ekstruzinio namo narvelių rupių dietai. Sesijos baigtos, kai subjektai nepasibaigė 14 min santykiui su paskutiniu užbaigtu santykiu, apibrėžtu kaip lūžio taškas. Chow / Palatable žiurkės buvo dietos ciklo bent 7 savaites ir tada iš anksto apdoroti R121919 (-1 h, sc) tuo metu, kai buvo perjungta nuo skanios dietos į chow (P → C fazė). Chow / Chow kontrolinės žiurkės buvo tiriamos vienu metu tarp tiriamųjų (n = 17). R121919 (0, 20 mg / kg kūno svorio, sc) dozės buvo skiriamos tiriamiesiems, subalansavus du dietos ciklus. Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Kiekybinis realaus laiko PGR.
Žiurkės (n = 20) buvo laikomasi dietos ciklo 7 savaites, anestezijamos ir nukirto galvą per dvi dietos sąlygas (kiekvieno savaitinio ciklo 5 ir 7 dienos). Smegenys buvo greitai pašalintos ir smegenų matricoje išpjaustomos koronaliai, o ledo šalčio stadijoje buvo surinkti migdolos centrinis branduolys, nucleus accumbens, izoliuotos žievės ir prefrontalinės žievės smūgiai. Iš kiekvienos smegenų skylės buvo paruošta bendra RNR, naudojant standartinį RNR ekstrakcijos iš gyvūnų audinių protokolą. Tada visa RNR (1 μg) buvo atvirkščiai transkribuota esant Oligo (dT) 20 pagal gamintojo instrukcijas. Kiekybinės RT-PGR reakcijos buvo atliktos 20 μl tūrio, naudojant 0.5 μM pradmenis ir 4 mM MgCl2. Rezultatai buvo išanalizuoti antriniais išvestiniais metodais ir išreikšti savavališkais vienetais, normalizuoti pagal referencinio geno, CypA, ekspresijos lygius. Visos tam tikros sekos RT-PCR reakcijos buvo atliktos per tą pačią operaciją. Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Peptido rūgščių ekstrakcija ir CRF RIA.
Žiurkės (n = 25) buvo mitybos ciklai mažiausiai 7 savaitėms, anestezuoti ir dekapituoti per dvi dietos sąlygas (5 ir 7 dienos kiekvieną savaitės ciklą). Smegenys greitai pašalintos ir supjaustytos vainikėliais smegenų matricoje, o centrinis amygdalo štampų branduolys buvo surinktas ledo šaltame etape. Peptidų rūgščių ekstrahavimas atliktas pagal jau nustatytą procedūrą (25). Audinių CRF panašus imunoreaktyvumas buvo kiekybiškai įvertintas jautria ir specifine kietosios fazės RIA, pritaikyta iš Zorrilla et al. (26). Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Kortikosterono RIA.
Žiurkės (n = 12) buvo laikomasi dietos ciklo mažiausiai 7 savaites, o uodegos kraujas buvo imamas per dvi dietos sąlygas (kiekvieno savaitinio ciklo 5 ir 7 dienas). Kortikosterono tipo imunoreaktyvumas plazmoje buvo nustatytas naudojant RIA rinkinį pagal gamintojo instrukcijas (MP Biomedicals, Inc.) (26). Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Elektrofiziologiniai tyrimai
Griežinėlių ruošimas.
Amygdalos griežinėlių centrinis branduolys buvo paruoštas, kaip aprašyta anksčiau (27, 28) iš žiurkių (n = 7 / grupė), kurie buvo gydomi ne mažiau kaip 7 savaitėmis, anestezuoti ir 2 – 3 h dekapituoti po to, kai buvo ištraukti iš skanių maisto produktų. Smegenys buvo greitai pašalintos ir įdėtos į ledo šaltą dirbtinį cerebrospinalinį skystį (aCSF), pripildytą 95% O2 ir 5% CO2. Skiltelės buvo supjaustytos, inkubuojamos sąsajos konfigūracijoje apie 30 min., Ir visiškai panardintos ir nuolat supildytos šiltu, dujiniu aCSF. Vaistai buvo įtraukti į aCSF iš atsarginių tirpalų, kad gautų žinomas koncentracijas superfuzate. Naudojant 2 – 4 mL / min superfuzijos greitį, vaistų koncentracijos pasiekia 90% rezervuaro koncentracijos 2 min.
Elektrofiziologija.
Mes užregistravome centrinę amygdalos neuronų branduolį su aštriais mikropipetais, naudojant nepertraukiamą įtampos arba srovės gnybtų režimą. Dauguma neuronų buvo šalia jų ramybės membranos potencialo. Duomenys buvo įsigyti su išankstiniu stiprintuvu ir saugomi vėliau analizei naudojant pClamp programinę įrangą. Farmakologiškai izoliuota GABAA receptorių sukeltos inhibitorinės postinaptinės potencialos (GABAA-IPSP) buvo sukeltas stimuliuojant lokaliai centriniame amygdalos branduolyje per bipolinį stimuliuojantį elektrodą, tuo pačiu užfiksavus glutamato receptorių blokatorius CNQX ir APV bei GABAB receptorių blokatorius CGP 55845A. Siekiant nustatyti kiekvieno langelio atsako parametrus, atlikome įvesties-išvesties protokolą. Taikyta srovių diapazonas, pradedant nuo slenksčio srovės, reikalingos IPSP iškėlimui iki įtampos, reikalingos maksimaliai amplitudei išgauti. Mes normalizavome tris lygių žingsnių stimuliavimo intensyvumą (slenkstį, pusę maksimalų ir maksimalų) kaip 1 – 3 ×. Įtaisų įtampos srovės (VI) kreivėms generuoti taip pat buvo taikomi hiperpolarizuojantys ir depolarizuojantys einamieji etapai (200-pA intervalai, 750-ms trukmė). Mes nustatėme sukeltus IPSP amplitudės ir VI atsakymus naudojant „Clampfit“ programinę įrangą. Visos priemonės buvo imtasi prieš superfuziją su selektyviu CRF1 receptorių antagonistas R121919 (1 μM), jo superfuzijos metu (20 min) ir po išplautos (30 min). Daugiau informacijos žr SI tekstas.
Statistika
Grupių palyginimams buvo naudojami studentų t-testai (dviejų grupių palyginimai) arba dispersijos analizė (ANOVA) (mažiausiai trijų grupių palyginimai), pastarieji aiškinami paprasto pagrindinio poveikio analize arba Newman-Keuls palyginimu po reikšmingų bendrojo poveikio (P <0.05). Šėrimo eksperimento duomenys buvo analizuojami naudojant trijų krypčių mišrius ANOVA su dietos tvarkaraščiu kaip tarp tiriamųjų veiksniu ir dozės bei dietos faze kaip tiriamųjų veiksniais. Didesnio eksperimento su pliusu labirintas duomenys buvo analizuojami taikant dviejų krypčių ANOVA su dietos tvarkaraščiu ir doze kaip tarp tiriamųjų. Progresyvaus santykio sustiprinimo eksperimento grafike lūžio taškas ir bendras atsakas buvo analizuojami naudojant dvipusius mišrius ANOVA su dietos tvarkaraščiu kaip tarp tiriamųjų ir doze kaip subjekto veiksniu. Atsakymo laikas per pirmąsias 5 minutes buvo analizuojamas trijų krypčių mišriomis ANOVA su dietos tvarkaraščiu kaip tarp tiriamųjų ir doze bei laiku kaip subjekto veiksniais. Elektrofiziologinių tyrimų duomenys buvo analizuojami tarp tiriamųjų ANOVA arba tiriamųjų ANOVA, prireikus pakartotinėmis priemonėmis. Duomenys iš kortikosterono RIA, analizuoti naudojant dviejų krypčių mišrią ANOVA su dietos tvarkaraščiu kaip tarp subjekto ir dietos fazės kaip subjekto veiksniu. Naudoti statistiniai paketai buvo „Instat 3.0“, „Prism 4.0“ (GraphPad), „Systat 11.0“ ir SPSS 11.5 (SPSS).
Padėkos.
Dėkojame Mike Arendei už redakcinę pagalbą, Mary Gichuhi už administracinę pagalbą, ir Bobą Lintzą, Jeanette Helfersą, Stephanie Dela Cruz ir Molly Brennan techninę pagalbą. Šį darbą palaikė Nacionalinis diabeto ir virškinimo ir inkstų ligų institutas DK70118, DK26741 ir P30DK56336; Nacionalinis piktnaudžiavimo narkotikais institutas DA023680; Nacionalinis piktnaudžiavimo alkoholiu ir alkoholizmo klausimais institutas skiria AA016731 ir AA015566; Nacionalinis neurologinių sutrikimų ir insulto paramos institutas IT32NS061847-01A2; Nacionalinis senėjimo paramos institutas AG028040; Nacionalinė širdies, plaučių ir kraujo institutas Grant HL088083; Ellisono medicinos fondas; ir Pearsono Alkoholizmo ir narkomanijos tyrimų centras. Dalis šio darbo buvo paremta Nacionalinio piktnaudžiavimo narkotikais instituto ir Nacionalinio piktnaudžiavimo alkoholiu ir alkoholizmo instituto „Intramural Research“ programomis. Tai „Scripps“ tyrimų instituto rankraščio numeris 19807.
Išnašos
Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.
Šis straipsnis yra PNAS tiesioginis pateikimas.
Šiame straipsnyje pateikiama papildoma informacija internete www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.
Nuorodos
;
