Hipocretinas (oreksinas) palengvina atlygį, sumažindamas jo transporterio dinorfino priešvėžinį poveikį ventraliniam tegmentalui (2014)

Johnas W. Muschampas,^a,1 Jonathanas A. Hollanderis,^b Jennifer L. Thompson,^c George'as Vorenas,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Teodoras M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paulius J. Kenny,^b ir William A. Carlezon, Jr.^a

Autoriaus informacija ► Informacija apie autorių teises ir licencijas ►

Hipokretinas (oreksinas) ir dinorfinas yra neuromoduliatoriai, kurie vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant poveikį ir motyvaciją. Oreksinas yra svarbus atlygis ir susijęs su narkotikų paieškomis, tuo tarpu dinorfinas sukelia neigiamą nuotaiką ir yra susijęs su depresija. Atsižvelgiant į šį priešingą poveikį, pranešimai apie tai, kad abu peptidai yra ekspresuojami tuose pačiuose neuronuose ir yra pagrindiniai, yra priešintuityvūs. Čia mes pademonstruojame, kad oreksinas ir dinorfinas yra kartu ekspresuojami toje pačioje sinapsinėje pūslelėje ir kad ši kolokalizacija daro didelę įtaką atlygiui, narkotikų vartojimui ir impulsyviam elgesiui. Tai, kad oreksinas užgožia į depresiją panašų antidinaminį dinorfino poveikį, smarkiai keičia tai, kaip mes matome funkcinį oreksino vaidmenį smegenyse.

Hipokretinas (oreksinas) ir dinorfinas yra neuropeptidai, turintys priešingą poveikį motyvuotam elgesiui. Oreksinas yra susijęs su susijaudinimo ir atlygio būsenomis, o dinorfinas - į depresines panašias būsenas. Mes parodome, kad nepaisant priešingų veiksmų, šie peptidai yra supakuoti į tas pačias sinapsines pūsleles pagumburyje. Sutrikęs oreksino veikimas užtemdo teigiamą šoninės pagumburio (LH) stimuliacijos poveikį, pašalina kokaino sukeltą impulsyvumą ir sumažina kokaino vartojimą savarankiškai. Kartu sutrikę dinorfinų funkcijos panaikina šiuos elgesio pokyčius. Mes taip pat parodome, kad oreksinas ir dinorfinas daro priešingą poveikį veninio pagrindinės srities (VTA) dopamino neuronų sužadinamumui, kuris yra svarbus oreksino turinčių neuronų taikinys, ir kad vidinis VTA oreksino antagonizmas sukelia sumažėjusį savarankiško kokaino vartojimą ir LH savęs stimuliaciją. kuriuos panaikina dinorfinų antagonizmas. Mūsų išvados nustato unikalų ląstelių procesą, kurio metu oreksinas gali uždengti šerdį gavusio dinorfino atlygio slenkstį keliantį poveikį ir tokiu būdu veikti leistinai, kad palengvintų atlygį.

Orexin ir Dynorphin yra pernešėjai.

Naudodami fluorescencinę mikroskopiją patvirtinome, kad oreksinas ir dinorfinas yra ekspresuojami tuose pačiuose pelės šoniniuose, perkalikiniuose ir dorsomedialiniuose pagumburio neuronuose.18) (Pav 1A). Neuronų, kurie išreiškia kelis siųstuvus, egzistavimas buvo aprašytas kitose smegenų grandinėse ir tai gali būti neuronų pagrindas filtravimo mechanizmams, kuriais kartu ekspresuojami neurotransmiteriai išsiskiria esant skirtingam šaudymo greičiui (19). Tačiau naudodamiesi EM mes nustatėme, kad oreksinas ir dinorfinas yra kolokalizuoti toje pačioje sinapsinėje pūslelėje. Daugiausia pakavimo atvejų buvo pastebėta nemielinant varikozinius aksoninius procesus, kai imuninis žymėjimas buvo rastas pūslelėse ar šalia jų. Neuroninių ląstelių kūnuose reikšmingas ženklinimas buvo susijęs su Golgi kompleksu, tuo tarpu nė vieno nebuvo rasta gretimuose branduoliuose (Pav 1 B ir C). Dendrituose taip pat buvo abiejų peptidų ženklinimas, susijęs su pūslelėmis, ir tai rodo galimą šių siųstuvų išsiskyrimą dendritu. Nedidelis skaičius mikrostruktūrinių profilių užfiksuotų aksonų galus, pažymint abu peptidus, esančius didelėse (∼100 nm) pūslelėse, esančiose asimetrinių sinapsių atpalaidavimo zonoje (Pav 1 B ir C), pateikdama išvadą, kad oreksinas ir dinorfinas veikia kaip tarpiniai siųstuvai ir kad normaliomis sąlygomis jie išsiskiria kartu, o ne skirtingai, kaip ląstelių šaudymo dažnis.

 

Pav. 1.

Oreksinas ir dinorfinas yra pernešėjai pagumburio neuronuose. (A, tolimieji kairieji) Ryškio lauko fotomikrografijoje parodytas pagumburio plotas, tiriamas dėl oreksino (raudonos) ir dinorfinų (žaliosios) imunoreaktyvumo. (A, dešinieji) Sujungtas dviejų kanalų vaizdas ...

„Dynorphin“ blokada panaikina atlygio slenkstį padidinantį „Orexin“ blokados poveikį.

Norėdami ištirti šio unikalaus siųstuvo išraiškos modelio funkcinę reikšmę, mes ištyrėme, ar oreksino ir dynorfinų signalizacijos sutrikimai gali paveikti sudėtingą elgesį, atspindintį normalią ir abejotiną motyvaciją. C57BL / 6 pelėms, išmokytoms atlikti intrakranijinę savęs stimuliaciją (ICSS), sustiprintą šonine hipotalaminės (LH) stimuliacija (20), OX blokada₁Rs N- (2-metil-6-benzoksazolil) -N ″ -1,5-naftiridin-4-il-karbamidas (SB334867) šviesos fazėje sukėlė nuo dozės priklausomą atlygio slenksčio padidėjimą (Pav 2A; vienkartinis dozės ANOVA matavimas dozei: F_3,12 = 4.44, P <0.02). ICSS slenksčių padidėjimas atspindi gydymo sukeltą stimulo naudingo poveikio sumažėjimą, kuris yra panašus į depresiją, rodantis sumažėjusį jautrumą atlygiui (20). Šis poveikis neatsirado dėl sedacijos ar kitų nespecifinių elgesio sutrikimų, nes nepakito ICSS reakcija (Pav 2B; vienkartinis dozės ANOVA matavimas dozei: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Pav. 2.

Oreksino blokados atlygio slenkstį didinantis poveikis panaikinamas dinorfinų blokada. (A) Oreksino signalizacijos blokada OX₁R SB334867 (0 – 30 mg / kg, ip) padidina atlygio ribas ICSS teste, nurodydamas sumažėjusį atlygį. Šis poveikis ...

SB334867 sąlygotas atlygio slenksčių padidėjimas buvo užkirstas kelią išankstiniu gydymu nor-binaltorphiminu (norBNI). [Dviejų krypčių pakartotinės priemonės ANOVA vaistui (tarp tiriamųjų faktoriaus) × SB dozės (tiriamųjų faktoriaus atžvilgiu) sąveika: F_3,24 = 3.98, P <0.01], kuris sukelia ilgalaikę dinamorfinų veiksmų blokadą KOR (10). Šie duomenys leidžia manyti, kad praradus signalus apie oreksiną, paaiškėja latentinio dinorfino latentinis antirecialinis poveikis. Vien tik NORBNI administravimas nesumažino atlygio slenksčių. Nors šis poveikis gali būti susijęs su unikalia norBNI ir kitų prototipinių KOR antagonistų farmakodinamika (10), tai taip pat gali nurodyti, kad procesai, moduliuojantys smegenų atlygio grandinių aktyvumą, yra pertekliniai arba kad fazinis vien tik oreksino tono padidėjimas (kurio netenkina šerdies pavidalo dinorfinas) yra nepakankamas, kad perduotų atlygio signalą iš stimuliacijos vietos šoniniame pagumburyje. Šios išvados iš pradžių gali atrodyti nesuderinamos su kitų asmenų, tiriančių SB334867 ant ICSS slenksčio, darbu tamsiuoju etapu (21). Tačiau yra nemažų įrodymų, kad sumažėjęs oreksino funkcija gali turėti pasekmių, kurios priklauso nuo to, ar gyvūnai tiriami jų šviesos, ar tamsiosios fazės metu. Pvz., Maistas ir vanduo išlaiko savo teigiamą poveikį oreksino KO pelėms, kai bandymai atliekami tamsiosios fazės metu, bet ne šviesos fazės metu (22), laikas, kai atlikome visus savo elgesio testus.

Norint nustatyti sisteminio SB334867 ir norBNI vartojimo poveikį ICSS, atskira pelių grupė buvo implantuota LH stimuliuojančiais elektrodais ir VTA kreipiančiomis kaniulėmis. Dėl SB334867 mikroinfuzijos į VTA žymiai padidėjo atlygio slenkstiai, tai rodo sumažėjusį atlygio jautrumą. Nors vienas VTA vidinis norBNI neturėjo įtakos ICSS slenksčiams, jis blokavo vėlesnės SB334867 infuzijos slenkstį didinantį poveikį (Pav 2C; vienpusiai pakartotiniai narkotikų ANOVA matai: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Nors intrakranijinės vaistų infuzijos linko šiek tiek sumažinti maksimalų atsako greitį, lyginant su sisteminėmis vaistų injekcijomis, šis poveikis nepasiekė statistinio reikšmingumo (Pav 2D; vienpusiai pakartotiniai narkotikų ANOVA matai: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsyvumą reguliuoja Orexin ir Dynorphin perdavimas.

Impulsyvumui būdingas nepakankamas atlygio siekiančio elgesio slopinimo trūkumas, o didelis impulsyvumas yra bendras daugelio psichinių ligų požymis (23). Piktnaudžiavimo narkotikai, įskaitant kokainą, taip pat gali paskatinti impulsyvumo padidėjimą, kuris, kaip manoma, skatina priklausomybę (24). Atsižvelgdami į pagrindinį šerdį gavusio oreksino ir dinorfino vaidmenį kontroliuojant jautrumą LH stimuliuojančiam poveikiui ICSS testo metu, mes hipotezavome, kad šių dviejų neuropeptidų sąveika gali įtakoti pradinį impulsyvumą ir kokaino sukeltą tokio elgesio deficitą. Graužikų impulsyvumą galima išmatuoti išmatuojant priešlaikinius atsakus atliekant 5 pasirinktos serijos reakcijos laiko užduotį (5-CSRTT) (25), gyvūnų modelį, analogišką nepertraukiamo efektyvumo bandymui, naudojamą tiriant žmonių dėmesį. Priešlaikinis atsakas į šį testą normaliomis sąlygomis paprastai būna silpnas, o jį sustiprina vaistai, kurie padidina DA pernešimą (26). Mes panaudojome 5-CSRTT, norėdami ištirti oreksino – dinorfinų sistemos indėlį į spontanišką ir kokaino sukeltą impulsyvų elgesį. SB334867, skiriamas atskirai, dar labiau sumažino spontaniškų priešlaikinių reakcijų skaičių jau dabar (Pav 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Šie sumažėjimai įvyko nesant poveikio atsako tikslumui (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), granulių išgavimo latencija (F_3,21 = 0.91, P = 0.44) arba atliktų stimulų tyrimų skaičius (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), nurodant, kad jie atsirado ne dėl pablogėjusio budrumo ar variklio galimybių. Tačiau skiriant norBNI, SB334867 poveikis priešlaikiniam reagavimui panaikino (Pav 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), leidžia daryti prielaidą, kad neinstitucinis dinorfinų perdavimas yra esminis dalykas tarpininkaujant šiam antiimpulsiniam poveikiui. Pateiktas atskirai arba kartu su SB334867, „NorBNI“ nedarė jokio poveikio atsako tikslumo rodikliams (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), vėlavimas (F_3,18 = 3.09, P > 0.06) arba atliktų stimulų tyrimų skaičius (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Išankstinis gydymas SB334867 taip pat užkirto kelią dvigubam padidėjusiam priešlaikiniam atsakui, kurį sukėlė kokainas (Pav 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Šie duomenys pateikia įrodymų, kad oreksino neurotransmisija gali reguliuoti impulsyvų elgesį tiek bazine, tiek kokaino stimuliuojamomis sąlygomis, jautriai reaguojant į dinorfinus.

 

Pav. 3.

Impulsyvus elgesys, kurį reguliuoja oreksino ir dinorfino pusiausvyra. (A) SB334867 susilpnina priešlaikinius atsakus pagal 5-CSRTT žiurkės variklio impulsyvumo modelį. Buvo atlikti tikslumo matai, vėlavimas išgauti maisto granules ir praleistų tyrimų skaičius ...

Dynorphin tarpininkauja sumažinus kokaino savireguliaciją OX₁„R-Null“ pelės.

Yra impulsyvių asmenų pažeidžiamumas dėl priklausomybės, o hipotezuojama, kad kokaino sukeliamas impulsyvumo padidėjimas prisideda prie priklausomybės atsiradimo (23, 27). Be to, oreksino ir dinorfinų perdavimas buvo savarankiškai susijęs su kokaino ir kitų narkotikų piktnaudžiavimo narkotikų teikiamos naudos reguliavimu (28-32). Mes iškėlėme hipotezę, kad sąveika tarp oreksino ir dinorfinų perdavimo gali tiesiogiai kontroliuoti narkotikų vartojimą. Norėdami ištirti šią galimybę, mes ištyrėme intraveninį kokaino vartojimą genetiškai modifikuotoms pelėms, neturinčioms OX₁R (OX₁R^{- / -}). Šio genotipo pelėms pačiam skiriama daug mažiau kokaino, vartojant įvairias dozes (0.1 – 1 mg / kg vienai infuzijai), tačiau jos nekeičia reagavimo į maistą pagal tą patį sustiprinimo grafiką (33), teigdama, kad kokaino vartojimo sumažėjimas nėra antrinis požymis, susijęs su elgesio sutrikimais. Negana to, OX₁R^{- / -} Maždaug per tris pradinius kokaino vartojimo seansus pelėms buvo parodytas normalus kokaino vartojimo būdas, tačiau vėliau greitai sumažėja kokaino vartojimas (33). Mes patvirtinome šį fenotipą vartodami 0.3 mg / kg dozę vienai infuzijai, tai rodo, kad signalizuojama per OX₁R vaidina svarbų vaidmenį nustatant ir palaikant kokaino savitarnos elgesį [Pav 4; dvipusis pakartotinis matavimas ANOVA, Genotipas (tarp tiriamųjų faktoriaus) × Gydymas narkotikais (tiriamųjų faktorius): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Kaip ir išankstinis gydymas norBNI, pelėms, kurioms suteiktas SB334867, atstatė normalų ICSS ir impulsyvų elgesį, taip pat iš dalies atstatė kokaino savavaliavimą OX₁R^{- / -} pelėms, pateikdamas unikalų pavyzdį, kai elgesio trūkumas, atsirandantis dėl genetinės abliacijos, atliekant vienos neurotransmiterio sistemos funkciją, yra išgelbėtas blokuojant kitą. Šie duomenys rodo, kad OX₁R^{- / -} pelėms, neabejingi dinorfino veiksmai susilpnina puikias kokaino savybes ir taip sumažina vaisto vartojimą savarankiškai. Įdomu tai, kad OX₁R^{+ / +} (kontrolinės) pelės, norBNI netikėtai sumažino kokaino savarankišką vartojimą. Vienas iš galimų šio poveikio paaiškinimų yra tas, kad dinorfinas, kurį išskiria neoreksinų neuronai, pavyzdžiui, vadinamieji „tiesioginiai“ striatonigralinės terpės nerviniai neuronai, turi priešingą poveikį kokaino vartojimui ir iš tikrųjų gali palengvinti teigiamą kokaino poveikį. Dviejų KOR populiacijų, turinčių priešingą kokaino vaidmenį, egzistavimas taip pat paaiškintų, kodėl norBNI tik iš dalies panaikino OX nustatytus kokaino vartojimo elgesio trūkumus.₁R KO pelės. Arba KOR antagonizmas sumažina neigiamą ar stresinį kokaino vartojimo nutraukimo poveikį (34), kurie prisideda prie narkotikų vartojimo įpročių (17). Nepaisant to, šie duomenys leidžia manyti, kad į depresinį panašų dinorfino poveikį vyrauja nesant nepažeistam oreksino signalui, dėl kurio kokaino poveikis yra sumažėjęs, o oreksino poveikis palengvina kokaino poveikį, pailgindamas jo trukmę, jei nėra signalizavimas dinamorfinu.

 

Pav. 4.

Sumažintas kokaino savarankiškas vartojimas OX₁R KO pelės atstatomos KOR blokada. Oreksino signalizacijos pablogėjimas OX₁R dėl genetinio šio receptoriaus trynimo sumažina kokaino savaiminį vartojimą (0.3 mg / kg vienai infuzijai). Šis deficitas iš dalies yra ...

Oreksinas ir Dynorphin gali sukelti subalansuotą priešingą poveikį VTA DA neuronų jaudrumui.

Smegenų struktūros, į kurias patenka pagumburio oreksino ir dynorfinų neuronai, gali būti veikiamos abiejų peptidų, taigi gali būti daromas jų priešingas poveikis neuronų jaudrumui (35, 36). Vieno peptido poveikis vyrauja, palyginti su kitu, greičiausiai, priklauso nuo daugelio veiksnių, įskaitant santykinį kiekvieno peptido gausumą, tarpląstelinės erdvės ilgaamžiškumą ir receptorių raišką skirtingose ​​tikslinių neuronų populiacijose, taip pat nuo sąveikos tarp receptoriai ir jų tarpląsteliniai signalizacijos mechanizmai postsinapsinėse ląstelėse. Impulsyvumą ir atlygį už kokainą bent iš dalies reguliuoja DA neuronai VTA (26), žymiu pagumburio oreksino turinčių ląstelių taikiniu (37). Be to, oreksino infuzija į VTA skatina narkotikų paieškas (6). Norėdami įvertinti santykinį kiekvieno peptido indėlį į VTA neuronų aktyvumą, atlikome DA ląstelių elektrofiziologinius įrašus C57BL / 6 pelių smegenų pjūviuose, paveiktuose oreksinu ir dinorfinu, atskirai arba kartu. Kaip ir tikėtasi, naudojant atskirai, oreksinas vienodai sužadino, tuo tarpu dinorfinas turėjo tik slopinantį poveikį (Pav 5 A ir B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Užfiksuotoje DA neuronų populiacijoje dauguma reagavo į abiejų peptidų soties koncentracijas, nors maža dalis selektyviai reagavo tik į oreksiną ar dynorfiną (Pav 5B). Pažymėtina, kai abu peptidai buvo pritaikyti dvigubai reaguojančiuose neuronuose (n = 10), jokio gryno poveikio šaudymo greičiui nebuvo (Pav 5A), o tai rodo, kad priešingas kiekvieno peptido poveikis esant prisotinančioms koncentracijoms veiksmingai panaikina vienas kitą, kai jis išleidžiamas. Nepaisant oreksino buvimo, keturiuose iš 10 neuronų nustatytas pirmenybinis dinamorfino slopinimas, o vieną ląstelę oreksinas ypač sužadino (> 1.5 karto didesnis pokytis), nepaisant dinamorfino buvimo (Pav 5 A ir C). Apskritai, nors daugiau ląstelių reaguoja į oreksiną nei dynorfiną, tose ląstelėse, kurios reagavo į abu peptidus, oreksino ir dinorfinų kartu vartojant, nebuvo jokių grynųjų šaudymo greičio pokyčių, o tai rodo, kad priešingi kiekvieno peptido poveikiai buvo subalansuoti VTA DA rinkinyje. tirti neuronai.

 

Pav. 5.

Oreksinas ir dinorfinas daro subalansuotą, bet priešingą poveikį VTA DA neuronams. (A, kairėn) Taikyti kartu vartojami oreksinai ir dinorfinai nekeičia VTA DA neuronų išsiskyrimo greičio (n = 10). Taikant atskirai, dinorfinas slopino, o oreksinas buvo sužadinantis. ...

Norėdami dar labiau išsiaiškinti galimą oreksino ir dinorfinų sąveiką VTA DA neuronuose, kurie yra jautrūs ir oreksinui, ir dinorfinui, alternatyviai bandėme sustiprinti vonioje dengto dinorfino slopinamąjį poveikį gydydami SB334867 (S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) arba sustiprinti vonioje užtepto oreksino poveikį sužadinant gydymą norBNI (S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). Abiejų eksperimentų metu OX₁R ir KOR blokada nesudarė šio poveikio, todėl galima daryti išvadą, kad SB334867 ir norBNI neturi jokio poveikio nespecifiniais veiksmais. Dar svarbiau, kad šie duomenys rodo, kad kiekvieno peptido tonusui in vitro nepakanka, kad jį paveiktų mažų molekulių antagonistai, tokie kaip SB334867 ir norBNI. Ši išvada atitinka ankstesnį darbą, rodantį, kad didelių, peptidus turinčių pūslelių egzocitozė paprastai vyksta tik esant dideliam nuolatinio šaudymo dažniui, kuris paprastai nebūna pjūvio preparatuose (38).

Norėdami patikrinti, ar norBNI neturėjo įtakos elgesiui, atlikdamas „tikslinius“ veiksmus tiesiogiai OX₁Rs, toliau mes ištyrėme šio antagonisto poveikį OX₁R signalizacija. Tiksliau, mes naudojome fluorometrinio vaizdo plokščių skaitytuvo (FLIPR) analizę, kad nustatytume vonioje tepamo oreksino A, SB334867 ar norBNI gebėjimą indukuoti tarpląstelinius kalcio pereinamuosius procesus išaugintose CHO ląstelėse, ekspresuojančiose žmogaus OX.₁Rs. Nors oreksinas A sukėlė numatomą tarpląstelinio kalcio padidėjimą (EC₅₀ = 0.01 μM) ir SB334867, priklausomai nuo dozės, šį poveikį silpnino (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI nesudarė jokio poveikio nei pradiniam, nei oreksino A sukeltam tarpląstelinio kalcio padidėjimui. Tai rodo, kad norBNI poveikį VTA DA neuronų fiziologijai lemia tik siūlomi KOR signalizacijos mechanizmai, o vaistas neturi tiesioginio poveikio OX₁R (39) (S3 A-C).

Oreksino ir dinamorfino sąveika VTA reguliuoja savarankišką kokaino administravimą.

Mūsų elektrofiziologijos tyrimai rodo, kad dinaminė oreksino ir dynorfinų sąveika reguliuoja VTA DA aktyvumą ir kad VTA neuronai greičiausiai tarnauja kaip pagrindinis substratas oreksino – dinorfinų sistemos poveikiui motyvuotam elgesiui. Norėdami tiesiogiai patikrinti šią hipotezę, mes ištyrėme SB334867 infuzijos VTA viduje poveikį savarankiškai vartojamam kokainui žiurkėms. Palyginti su vidinės VTA transporto priemonės infuzija, VTA SB334867 žymiai sumažino kokaino vartojimą, kurį užblokavo norBNI (Pav 6; vienpusė ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), o tai rodo, kad prieštaraujantys dinamorfino veiksmai šioje smegenų srityje silpnina kokaino atlygį. Šie rezultatai, atrodo, skiriasi nuo tų, kurie parodė, kad nėra kokio VTA SB334867, skiriant kokainą savarankiškai, naudojant pastangų fiksuoto santykio 1 (FR1) stiprinimo grafikus (40). Tačiau keli pranešimai parodė, kad didėjant užduočių poreikiui, SB334867 efektyviau mažina narkotikų vartojimą (2, 33). Kadangi šio eksperimento žiurkės atliko didesnį pastangų FR5 grafiką, dabartiniai atradimai atitinka šią literatūrą. Šie duomenys pateikia tiesioginį įrodymą, kad oreksino ir dinorfino priešingumas VTA DA neuronų fiziologijai gali turėti reikšmingą poveikį atlygį skatinančiam elgesiui.

 

Pav. 6.

Oreksino ir dinorfino sąveika vartojant VTA tarpininkauja vartojant vaistą. Kokaino vartojimą savarankiškai sumažina vidinis VTA SB334867 (3 μg vienoje pusėje), tuo tarpu šį poveikį panaikina išankstinis gydymas norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Gyvūnai.

EM eksperimentuose naudotos suaugusios C57BL / 6J pelės (8 amžiaus; Džeksono laboratorija) buvo laikomos grupėse (nuo trijų iki penkių narve); tie, kurie buvo naudojami ICSS, buvo laikomi atskirai po operacijos. Suaugę patinai (350 g) „Sprague – Dawley“ žiurkės (Charles River Laboratories) buvo naudojami 5-CSRTT ir kokaino savaiminio vartojimo eksperimentuose ir buvo laikomi keturiose grupėse. Elektrofiziologiniams tyrimams naudotos suaugusios C57BL / 6J pelės (pogimdyminėmis dienomis 19 – 21) buvo laikomos grupėse (nuo trijų iki penkių narve). „OX1“^{- / -} pelės ir jų OX1^{+ / +} Paukščių draugai (amžiaus 6 amžiaus), naudojami savistabos tyrimams, buvo gauti iš Džeksono laboratorijos ir daugiau nei septynias kartas buvo sugrąžinti į C57BL / 6 peles. Šios pelės buvo laikomos grupėje (po dvi narvelyje). Visi gyvūnai buvo laikomi kontroliuojamos temperatūros sąlygomis naudojant 12-h šviesos / tamsos ciklą, o elgesio bandymai buvo atlikti 4 – 5 h į šviesos ciklą; maistas ir vanduo buvo prieinami ad libitum, jei nenurodyta kitaip. Procedūros buvo vykdomos vadovaujantis Nacionaliniais sveikatos institutais Laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovas (50) ir buvo patvirtinti McLean ligoninės, Britų Kolumbijos universiteto ir Floridos „Scripps“ institucinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetų.

Imunohistochemija ir mikroskopija.

Orexin A arba prodynorphin fluorescencija ir auksu sustiprintas auksinis imuninis žymėjimas buvo atlikti pakaitomis pelės smegenų skyriuose pagal anksčiau praneštas procedūras (51) ir apdorojami pagal standartinius EM protokolus. Tuomet atsitiktinai parinkti neidengiantys imuniniu ženklu pažymėtų audinių regionai ir nufotografuoti dalelių kiekybiniam įvertinimui naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai) (SI medžiagos ir metodai, imunohistochemija ir mikroskopija).

Elektrofiziologija.

Pipetės su pleistru (3 – 5 MΩ) buvo užpildytos 143 mM kalio gliukonatu, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (esant 7.2 pH) ir 270 – 280 mM. Duomenys buvo gauti 20 kHz dažniu ir filtruojami 2 kHz dažniu naudojant „pClamp 10.0“ programinę įrangą (Molecular Devices). Įgiję visos ląstelės konfigūraciją, ląstelės buvo įtampos rišamos esant −70 mV ir tam tikros įtampos pakopos (250 ms, nuo −60 iki −130 mV, atliekant 10-mV žingsnius) buvo aptiktos hiperpolarizacija (I_h) srovių. I_h buvo nustatytas kaip srovės pokytis tarp ∼30 ms ir 248 ms, pritaikius įtampos žingsnį. Vidinis VTA DA neuronų aktyvumas buvo matuojamas srovės-spaustuko režimu. Eksperimentai prasidėjo, kai buvo pasiektas stabilus pradinis šaudymo greitis; paskui substratai buvo užpilami 5 min ir vėliau išplauti dirbtiniu cerebrospinaliniu skysčiu. Duomenų analizei buvo naudojami paskutiniai kiekvieno 3-min segmento 5 min. Dynorphin A (1 – 17; 200 nM) ir orexin A (100 nM) buvo gauti iš Amerikos peptido ir ištirpinti distiliuotame vandenyje. Anksčiau buvo nustatyta, kad šios koncentracijos daro sotumą VTA ląstelių aktyvumui (5, 52). Tiorfanas (1 μM) ir bestatinas (10 μM) buvo gauti iš „Sigma-Aldrich“, ištirpinti distiliuotame vandenyje ir užpilti kartu su dinorfinu A (SI medžiagos ir metodai, elektrofiziologija).

FLIPR tyrimas.

OX₁R aktyvumas buvo įvertintas išmatuojant tarpląstelinį kalcio kiekį atliekant FLIPR tyrimą, kaip aprašyta anksčiau (53) (SI medžiagos ir metodai, fluorometrinio vaizdo plokštelių skaitytuvo tyrimas).

ICSS.

Pelėms buvo implantuoti vienpoliai stimuliuojantys elektrodai arba kaniulės (PlasticsOne) po ketamino / ksilazino (atitinkamai 80 ir 10 mg / kg, ip; Sigma), nukreiptų į LH (18) ir (arba) priešingos pusės VTA [iš bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; vidutinis (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm nuo dura]. Po 7-d pasveikimo pelės buvo išmokytos reaguoti į smegenų stimuliaciją, kaip aprašyta anksčiau (18). Mažiausias dažnis, palaikantis reagavimą (slenkstis), buvo apskaičiuotas naudojant mažiausių kvadratų tinkamiausios linijos analizę. Kai pelės atitiko ICSS slenksčių stabilumo kriterijus (± 10% per 5 iš eilės dienas), buvo išmatuotas gydymo vaistais poveikis. SB334867 (Scripps Florida) arba DMSO nešiklis buvo duodamas kitomis dienomis, naudojant Hamiltono švirkštą (0.1 ml / kg ip), o slenksčiai buvo nedelsiant įvertinti 15-min testuose. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) buvo duotas fiziologiniame tirpale (10 ml / kg) 48 prieš valandą iki ICSS tyrimo pradžios.

„5-CSRTT“.

Žiurkėms buvo apribotas maistas (iki 85% nemokamo šėrimo svorio) ir jie buvo mokomi kompiuteriu valdomose operacijų kamerose, esančiose vėdinamose, garsą slopinančiose spintelėse („Med Associates“), ir 5-CSRTT procedūroms, atliktoms kaip aprašyta (25). SB334867 (DMSO, 0.1 ml / kg) ir (arba) kokainas (fiziologiniame tirpale, 1 ml / kg; Sigma) buvo švirkščiamas ip. Injekcijomis 10 prieš bandymą, kaip ir kituose eksperimentuose, o norBNI buvo duotas bent 48 val. Prieš bandymo pradžia (SI medžiagos ir metodai, 5-Pasirinkta serijinės reakcijos laiko užduotis).

IV Kokaino savivalda.

Žiurkės ir pelės buvo anestezuojamos izoflurano (1 – 3% tūrio / tūrio) deguonies garų mišiniu ir chirurginiu būdu paruoštos Silastic (VWR Scientific) kateteriais žandikaulio venoje nustatyta tvarka (54). Iškart po kateterio implantavimo žiurkėms į VTA buvo implantuotos dvišalės nerūdijančio plieno kreipiamosios kaniulės (23 matuokliai, 17 mm ilgio) (iš bregmos: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm nuo dura ). Bandymai su SB334867 arba norBNI per 60 minučių trukmės kasdienes sesijas buvo atlikti po to, kai buvo pasiektas stabilus kokaino suvartojimas (<20% atsako skirtumai 3 dienas iš eilės; SI medžiagos ir metodai, IV kokaino savivalda).

Statistika

Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. ICSS eksperimentams buvo naudojami dviejų krypčių pakartotiniai matavimai ANOVA, kad būtų galima palyginti SB334867 ir norBNI + SB334867 gydytų sąlygų vidurkius. Norint palyginti vidurkius SB334867 ir norBNI + SB334867 sąlygomis, buvo naudojami vienpusiai pakartotiniai ANOVA su Newman – Keuls post hoc testais. Visų krypčių 5CSRTT eksperimentų vidurkių palyginimui taip pat buvo naudojami vienpusiai pakartotiniai matavimai ANOVA ir Newman-Keuls testai. Dviejų krypčių pakartotiniai matavimai ANOVA buvo naudojami norint palyginti kokybes tarp gydymo grupių kokaino savaiminio vartojimo eksperimentuose su OX₁R KO pelės. Norint palyginti vidutinius VTA DA neuronų atsakus į oreksiną ir dinorfiną, buvo naudojami vienpusiai pakartotiniai ANOVA ir Newmano-Keulso testai. Taip pat buvo naudojami vienpusiai pakartotiniai ANOVA ir Newmano-Keulso testai, siekiant palyginti kokaino suvartojimo vidurkius žiurkėms, gydomoms SB334867 ir norBNI. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, jei P <0.05.

Dėkojame dr. Garrett Fitzmaurice už naudingus komentarus dėl rankraščio, o Miranda S. Gallo ir Melissa Chen už pagalbą renkant duomenis. Šį darbą rėmė Nacionaliniai sveikatos apsaugos institutų F32-DA026250 ir K99-DA031767 (JWM), F32-DA024932 ir K99-DA031222 (JAH), R01-DA023915 (į. PJK) ir R01 (R063266) ir RXNUMX. ) ir gamtos mokslų ir inžinerinių tyrimų tarybos paramos stipendija (SLB).

Pareiškimas dėl interesų konflikto: WAC turi patentą (JAV patentas 6,528,518; teisių perėmėjas: McLean ligoninė), susijusį su kappa-opioidų antagonistų naudojimu depresijos sutrikimų gydymui. Visi kiti autoriai nedeklaruoja jokių konkuruojančių finansinių interesų.

Šis straipsnis yra PNAS tiesioginis pateikimas.

Žr. Komentarą puslapyje 5765.

Šiame straipsnyje pateikiama papildoma informacija internete www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.