Nat Neurosci. Autoriaus rankraštis; galima PMC 1 m. sausio 2014 d.
Paskelbta galutine redaguota forma:
Nat Neurosci. 2013 m. liepa; 16(7): 10.1038/nn.3420.
Paskelbta internete birželio 2, 2013. doi: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Wang,*,1,2,3 Florianas Duklotas,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Wang,2,3 ir Mohamed Kabbaj1,2
Galutinę leidėjo redaguotą šio straipsnio versiją galite rasti tinklalapyje Nat Neurosci
Žr. Kitus PMC straipsnius citata paskelbtas straipsnis.
Abstraktus
Socialiai monogamiškame prerijų pelėnyje (Microtus ochrogaster), poravimasis sukelia ilgalaikius porų ryšius, kuriuos inicijuoja partnerio pirmenybės formavimasis ir kuriuos reguliuoja įvairūs neuromediatoriai, įskaitant oksitociną, vazopresiną ir dopaminą. Čia ištyrėme galimus epigenetinius mechanizmus, tarpininkaujančius porų ryšių reguliavimui. Mes parodome, kad histono deacetilazės inhibitoriai natrio butiratas ir TrichoStatin A (TSA) palengvina prerijų pelėnų patelių partnerio pasirinkimo formavimąsi, kai nėra poravimosi. Tai buvo susijusi su specifiniu oksitocino (OTR) ir vazopresino V1a receptorių (V1aR) reguliavimu branduolyje, padidinus histono acetilinimą atitinkamame promotoriuje. Be to, TSA palengvintam partnerio pasirinkimui užkirto kelią OTR arba V1aR blokada branduolyje. Svarbu tai, kad poravimosi sukeltas partnerio pasirinkimas sukėlė tą patį OTR ir V1aR geno promotorių epigenetinį reguliavimą kaip ir TSA. Taigi šie stebėjimai rodo, kad TSA ir poravimasis palengvina partnerio pirmenybę per epigenetinius įvykius, o tai yra pirmasis tiesioginis porų ryšio epigenetinio reguliavimo įrodymas.
Įvadas
Socialinė priklausomybė yra esminė žmogaus socialinio elgesio savybė, o socialiniai pažinimo trūkumai yra dažni daugelio neuropsichiatrinių sutrikimų, įskaitant šizofreniją ir autizmo spektro sutrikimus, taip pat priklausomybę ir depresiją, bruožai.1. Socialiai monogamiški prerijų pelėnai (Microtus ochrogaster) pasirodė kaip labai įdomus modelis tiriant neurobiologinius socialinio prisirišimo pagrindus, nes tiek laboratoriniai, tiek laisvai gyvenantys asmenys užmezga ilgalaikius porinius ryšius.2-4, kuriuos pirmiausiai inicijuoja selektyvios priklausomybės elgesys su partneriu, vadinamas partnerio pirmenybe5. Šis partnerio pasirinkimo formavimas apima įvairius neurotransmiterius ir hormonines sistemas, įskaitant neuropeptidus oksitociną ir vazopresiną (AVP) ir mezolimbinį dopaminą.5.
IApskritai, partnerio pirmenybės formavimas vyksta per AVP neurotransmisiją ventraliniame blyškiame sluoksnyje ir šoninėje pertvaroje (LS) patinams, o oksitocino neurotransmisiją nucleus accumbens (NAcc) ir prelimbinę žievę prerijų pelėnų patelių.6-8.
Paprastai dopaminas, susijęs su natūralų atlygį, pavyzdžiui, poravimusi, yra svarbus tarpininkas prerijų pelėnams teikiant pirmenybę partneriams. Dopamino D2 tipo receptorių (D2R) aktyvavimas NAcc palengvina, o dopamino D1 tipo receptorių (D1R) aktyvavimas slopina partnerio pirmenybės formavimąsi prerijų pelėnų patinuose ir patelėse.9-11.
Svarbu tai, kad oksitocino ir AVP V1a receptorių, atitinkamai OTR ir V1aR, genų ekspresijos pokyčiai gali smarkiai paveikti partnerio pasirinkimą. Pavyzdžiui, prerinių pelėnų patelėms per didelė OTR raiška NAcc palengvina partnerio pirmenybę, kai nėra poravimosi.12-14.
Be porų ryšio reguliavimo, oksitocinas ir AVP taip pat yra susiję su įvairiu socialiniu elgesiu, įskaitant socialinį pripažinimą, agresiją ir motinos priežiūrą.15, 16. Pažymėtina, kad pastarojo elgesio sutrikimai graužikams sukelia ilgalaikes neuroadaptacijas per epigenetinius mechanizmus, įskaitant estrogenų receptorių alfa DNR metilinimą.17 ir AVP genai18, taip pat gliukokortikoidų receptorių promotoriaus histono acetilinimas19. Be to, histono deacetilazės (HDAC) inhibitoriai, didinantys genų ekspresiją padidindami histono acetilinimą graužikų smegenyse20, gali pakeisti šiuos pakeitimus19ir tiesiogiai įtakoja socialinį elgesį, pavyzdžiui, seksualinį imlumą21. Svarbu tai, kad plaučių vėžio ląstelių linijoje HDAC inhibitorius trichostatinas A (TSA) tiesiogiai sustiprina OTR transkripciją, lokaliai skatindamas histono acetilinimą.22.
Todėl galima pasiūlyti epigenetinį pagrindą formuojant prerijų pelėnus partnerio pirmenybę. Norėdami patikrinti šią hipotezę, pirmiausia įvertinome dviejų HDAC inhibitorių, natrio butirato (NaB) ir TSA, poveikį suaugusių prerijų pelėnų patelių partnerių pasirinkimui. Vėliau mes ištyrėme molekulinius mechanizmus, tarpininkaujančius TSA poveikiui skatinant pirmenybę prerijų pelėnų patelėse. Galiausiai siekėme nustatyti, ar TSA sukeltus epigenetinius pokyčius bendro gyvenimo metu taip pat sukėlė poravimasis.
rezultatai
Gydymas TSA palengvina partnerio pasirinkimą
Seksualiai naivioms prerijų pelėnų patelėms buvo suleistos intracerebroventrikuliariai (icv.) su CSF arba CSF, kurių sudėtyje yra 0.08, 0.4 arba 4 ng TSA prieš pat 6 valandas trukusį bendrą gyvenimą su patinu be poravimosi, o tada buvo patikrintas jų partnerio pasirinkimas. Šešių valandų bendro gyvenimo su patinu be poravimosi prerijų pelėnų patelės partnerio pirmenybės nesusiformuoja4 ir todėl ši elgesio paradigma buvo plačiai naudojama vertinant įvairių vaistų poveikį palengvinant partnerio pasirinkimo formavimąsi.5.
CSF gydyti gyvūnai parodė neselektyvų greta esantį kontaktą su partneriu arba nepažįstamuoju po 6 valandų bendro gyvenimo be poravimosi (t15= 0.76, P = 0.46; 1a). Tačiau gyvūnai, gydyti TSA visomis ištirtomis dozėmis, daugiau laiko praleisdavo su partneriu nei su nepažįstamuoju (t8= 4.35, P = 0.002 TSA 0.08 ng grupė; t15= 3.63, P = 0.002 TSA 0.4 ng grupė; ir t8= 2.58, P = 0.03 TSA 4 ng grupė). Svarbu tai, kad lokomotorinio aktyvumo grupių skirtumų nenustatyta (F3,46 = 1.25, P= 0.30, 1b) ir nebuvo pastebėtas joks agresyvus bandomosios moters elgesys nei su nepažįstamuoju, nei su partneriu, o tai rodo, kad TSA poveikis buvo būdingas socialinei pirmenybei, o ne antrinis dėl judėjimo pasikeitimo ar socialinio pasibjaurėjimo nepažįstamajam.
Norint ištirti, ar TSA sustiprina histono acetilinimą smegenų struktūrose, kurios yra susijusios su partnerio pasirinkimo formavimu, atskirai patelių partijai buvo suleista vidutinė TSA dozė (0.4). ng) ir gyveno kartu su patinu be poravimosi 30 min., 2 arba 9 valandas. Pažymėtina, kad bet kuriuo metu nebuvo galima aptikti reikšmingų pasaulinio histono H3 acetilinimo (Lys14) lygio pokyčių tiek NAcc, tiek uodeginiame putamene (P > 0.05 visoms grupėms, 1c ir d pav). Tai rodo, kad TSA palengvina partnerio pirmenybės formavimąsi, kai nėra poravimosi, nepaisant to, kad jis neturi įtakos pasauliniam histono H3 acetilinimui NAcc arba caudate putamen.
Svarbu tai, kad natrio butiratas taip pat palengvino prerijų pelėnų patelių partnerio pasirinkimą po to, kai 6 valandas buvo kartu su patinu be poravimosi, o tai susiję su padidėjusiu pasauliniu histono H3 acetilinimo (Lys14) kiekiu NAcc.Papildomas paveikslas 1). Taigi TSA poveikis partnerio pasirinkimo formavimuisi gali būti atkurtas naudojant kitą HDAC inhibitorių, o tai rodo HDAC slopinimą, o ne nespecifinį TSA poveikį palengvinant partnerio pasirinkimą. Atsižvelgiant į tai, kad TSA yra specifiškesnis ir afininis I/II klasės HDAC inhibitorius23, 24, ir kad TSA poveikis elgesiui buvo ryškesnis nei NaB, pasirinkome naudoti TSA, o ne NaB, norėdami ištirti specifines molekulines koreliacijas tolesnėse tyrimo dalyse.
TSA palengvinto partnerio pasirinkimo molekulinės koreliacijos
Kadangi genų ekspresijos lygių skirtumai pelėnams NAcc buvo susiję su skirtingomis monogaminių ir nemonogaminių pelėnų poravimosi strategijomis ir su partnerių pirmenybės formavimosi pokyčiais, ypač prerijų pelėnams.12, 13, 25, 26, įvertinome, ar TSA palengvintas partnerių pasirinkimo formavimas buvo susijęs su genų ekspresijos pokyčiais NAcc.
Gydymas TSA (0.4 ng, icv.) sukėlė OTR mRNR koncentracijos padidėjimą NAcc po 2 valandų bendro gyvenimo, palyginti su KSŠ gydytais kontroliniais gyvūnais (t10 = 2.38, P = 0.038, 2a), kuris išliko po 9 valandų bendro gyvenimo (t9 = 2.17, P = 0.058, 2b). Nors praėjus 1 valandoms po TSA injekcijos NAcc buvo galima pastebėti nedidelį, bet nereikšmingą V2aR mRNR padidėjimą, jokių kitų grupių skirtumų nebuvo aptikta nė vienu iš kitų išmatuotų mRNR, įskaitant D1R arba D2R.P > 0.05, 2a, b). Svarbu tai, kad jokiu laiko momentu ir jokiai išmatuotai mRNR nepastebėta jokių grupių skirtumų tarp uodegos putameno (P >0.05 visoms grupėms, 2c,d pav), o tai rodo, kad OTR mRNR padidėjimas, pastebėtas TSA gydytiems gyvūnams, buvo būdingas NAcc. Be to, toks padidintas reguliavimas buvo tik po gyvenimo kartu su patinu, nes OTR ir V1aR mRNR lygiai NAcc nepasikeitė praėjus 2 valandoms po TSA injekcijos negyvenant kartu (OTR: 100.0% ± 11.70 CSF grupėje, 86.7% ± 12.11 TSA grupė, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0 % ± 26.24 CSF grupei, 92.3 % ± 13.75 TSA grupei, t9 = 0.27, P = 0.791).
Atsižvelgiant į aukštesnį OTR mRNR lygį, TSA gydyti gyvūnai taip pat turėjo didesnį OTR baltymų kiekį abiem NAcc laiko taškais (2 valandos: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 valandos: t10 = 3.16, P = 0.01, 2e, f pav), bet ne caudate putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, 2g pav.,h). Įdomu tai, kad praėjus 1 ar 2 valandoms po TSA injekcijos NAcc nebuvo aptikta jokių reikšmingų V9aR mRNR lygio pokyčių (2a, b), V1aR baltymo lygis NAcc buvo reikšmingai padidėjęs po 9 valandų, palyginti su CSF gydytų gyvūnų.t9 = 3.46, P = 0.007, 2f), bet ne caudate putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, 2h). Nors su tam tikrais skirtumais, D1R ir D2R baltymų lygiai NAcc ir uodeginiame putamenyje TSA skyrimas neturėjo reikšmingos įtakos (P > 0.05, 2e-h pav).
TSA palengvina oxtr ir avpr1a histono acetilinimą
MRNR ir baltymų kiekio padidėjimas OTR po bendro gyvenimo po gydymo TSA rodo, kad TSA greičiausiai padidino transkripciją oxtr, genas, koduojantis OTR, o ne keičiantis baltymo transliaciją ar apyvartą. Be to, V1aR baltymų kiekis buvo didesnis NAcc, susijęs su nedideliu, bet ne reikšmingu mRNR padidėjimu po gydymo TSA (Pav 2). Atsižvelgiant į tai, kad TSA yra galingas I ir II klasės HDAC inhibitorius23, 24, 27, iškėlėme hipotezę, kad TSA padidino histono acetilinimą oxtr ir avpr1a promotorius NAcc, vėliau sustiprindami jų transkripciją. Gauta nauja gyvūnų partija icv. TSA injekcija (0.4 ng) ir tuoj pat gyveno kartu su patinu be poravimosi 30 minučių prieš paaukojimą. 30 minučių laiko langas buvo pasirinktas remiantis ankstesniu darbu, kuriame buvo pranešta apie maksimalų histono acetilinimo padidėjimą po vietinės TSA injekcijos žiurkėms ir pelėms28, 29. H3K14 acetilinimas oxtr ir avpr1a promotoriai buvo analizuojami naudojant chromatino imunoprecipitaciją.
Atsižvelgiant į anksčiau pastebėtą OTR mRNR ir baltymų kiekio padidėjimą, TSA gydyti gyvūnai labai padidino (+ 460%) histono H3 acetilinimą. oxtr geno promotorius, lyginant su CSF gydytais kontroliniais gyvūnais, NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), bet ne caudate putamen (t9= 0.31, P = 0.76, 3a). Be to, histono H3 acetilinimas avpr1a promotorius buvo žymiai padidėjęs praėjus 30 min. po TSA vartojimo (+196%) NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01), bet ne caudate putamen (t9= 0.38, P = 0.71), lyginant su CSF gydytais kontroliniais gyvūnais (3b). Todėl TSA padidino histono acetilinimo vietą konkrečiai NAcc jau praėjus 30 minučių nuo bendro gyvenimo su patinu pradžios.
TSA palengvina partnerių pasirinkimą per OTR ir V1aR
Iš ankstesnių eksperimentų rinkinio atsiranda molekulinis veikimo modelis, kai bendro gyvenimo metu TSA sustiprina histono acetilinimą. oxtr ir avpr1a promotorius, po to sustiprina jų transkripciją ir dėl to padidėja OTR ir V1aR baltymų lygis iki 9 valandų nuo bendro gyvenimo laikotarpio pradžios. Svarbu tai, kad šis TSA poveikis priklauso nuo vietos, nes uodeginis putamenas lieka nepakitęs. Čia išbandėme, ar šis TSA sukeltas OTR ir V1aR padidėjimas yra susijęs su partnerio pirmenybės formavimo palengvinimu. Prerijų pelėnų patelėms į NAcc buvo sušvirkšta TSA (0.04ng vienoje pusėje) su išankstine injekcija arba be jos (30 minučių prieš TSA injekciją, 0.5ng vienoje pusėje) CSF arba CSF, kuriame yra vienas iš dviejų skirtingų OTR antagonistų – OTA(B) ir OTA(T) arba V1aR antagonistas (V1aRA). Iš karto po TSA injekcijos patelės buvo kartu su patinu 6 valandas be poravimosi, o po to buvo atliktas partnerio pasirinkimo testas.
CSF gydyti gyvūnai nenorėjo partnerio (t5 = 0.17, P = 0.87, 4a). Tačiau TSA gydyti gyvūnai praleido žymiai daugiau laiko bendraudami su „partneriu“ nei su „nepažįstamuoju“, o tai rodo, kad vienos TSA injekcijos tiesiai į NAcc pakanka, kad būtų lengviau susiformuoti partnerio pirmenybę be poravimosi (t5 = 7.04, P = 0.0009). Įdomu tai, kad OTR arba V1aR blokada iš anksto apdorojant OTA(B), OTA(T) arba V1aRA užkirto kelią TSA poveikiui.P >0.05 visoms grupėms). Kadangi lokomotorinio aktyvumo grupių skirtumų nenustatyta (F4,32 = 1.89, P = 0.14, 4b), šie duomenys rodo, kad TSA NAcc palengvina partnerio pirmenybės formavimąsi naudojant OTR ir V1aR tarpininkaujančius mechanizmus, atsižvelgiant į elgesį.
Poravimasis sukelia panašias neuroadaptacijas kaip ir TSA
Remdamiesi ankstesniais stebėjimais, nustatėme, kad oksitocino ir vazopresino neurotransmisijos epigenetinis stiprinimas patelės NAcc buvo pakankamas, kad būtų lengviau formuoti partnerio pirmenybę, kai nėra poravimosi. Norint ištirti, ar šios neuroadaptacijos vyksta ir natūraliai formuojantis partnerio pirmenybei, prerijų pelėnų patelės poravimosi metu buvo kartu su patinu 24 valandas, o tai skatina partnerio pirmenybę.4, ir paaukoti. Mes stebėjome tiek OTR, tiek V1aR mRNR ir baltymų kiekio padidėjimą NAcc, lyginant su seksualiai negyvenusiomis patelėmis (OTR: +38%, t10 = 2.68, P = 0.02 mRNR ir +58 % t8 = 3.05, P = 0.01 baltymams; V1aR: +89 % t14= 2.53, P = 0.02 mRNR ir +26 % t20 = 2.23, P = 0.037 baltymams, 5a, b).
Kadangi tiek OTR, tiek V1aR mRNR ir baltymų lygiai padidėjo dėl poravimosi, toliau ištyrėme, ar šis padidėjęs reguliavimas buvo susijęs su epigenetiniu oxtr ir avpr1a genų transkripcija. Taigi nauja patelių partija buvo kartu su patinu 6 valandas poruojant ir acetilinant H3K14. oxtr ir avpr1a promotoriai, išmatuoti chromatino imunoprecipitacija. Atsižvelgiant į OTR ir V1aR mRNR ir baltymų lygį, prerijų pelėnų patelės turi didesnį H3K14 acetilinimą. oxtr ir avpr1a promotoriai NAcc, lyginant su seksualiai naiviomis moterimis (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 5c,d pav). Šie duomenys rodo, kad bendro gyvenimo paradigmos, kurios patikimai skatina prerijų pelėnų patelių partnerio pasirinkimą, per epigenetinius mechanizmus padidina OTR ir V1aR ekspresijos reguliavimą NAcc, kaip pastebėta po gydymo TSA.
Diskusija
Šiame tyrime pirmą kartą pranešame apie epigenetinį partnerio pirmenybės formavimo reguliavimą. Pirma, mes parodėme, kad padidinus histono acetilinimą NAcc, vartojant HDAC inhibitorių, suaugusiems prerijų pelėnų patelėms poravimosi nėra. Tatskleidėme tiesioginių įrodymų, kad patelių partnerio pirmenybės formavimasis yra nulemtas epigenetiškai, nes padaugėjo bendro gyvenimo ir poravimosi su patinu. oxtr ir avpr1a genų ekspresija per sustiprintą histono acetilinimą NAcc. TSA skyrimas NAcc sukėlė partnerio pirmenybę ir padidino OTR mRNR ir baltymų kiekį NAcc. Be to, nors pasaulinis histono H3 acetilinimas nebuvo paveiktas TSA gydytų patelių, histono acetilinimas pastebimai praturtėjo. oxtr promotorius NAcc buvo pastebėtas jau 30 minučių po TSA vartojimo. Galiausiai, blokuoti OTR NAcc pakako, kad būtų išvengta TSA palengvinto partnerio pasirinkimo. Kadangi panašios epigenetiškai sukeltos modifikacijos buvo aptiktos po bendro gyvenimo poravimosi, taikant procedūras, kurios, kaip žinoma, skatina partnerio pirmenybę, mūsų duomenys pateikė epigenetinio socialinio elgesio reguliavimo modelį. Dsugyvenimas kartu su patinu, TSA arba poravimasis, greitai sukelia specifinį histono H3 acetilinimą oxtr promotorius NAcc, kuris pagerina jo transkripciją, todėl padidėja OTR mRNR ir baltymų lygis, o tai vėliau palengvina partnerio pirmenybės formavimąsi.
Prerijų pelėnų patelės 6 valandos bendro gyvenimo su patinu be poravimosi nesukelia partnerio pasirinkimo4, ir ši elgesio paradigma buvo naudojama tiriant farmakologinių manipuliacijų poveikį partnerio pirmenybės indukcijai.5. Mūsų tyrime, nors fiziologiniu tirpalu arba CSF gydytiems kontroliniams gyvūnams partneris nebuvo pasirinktas, prerijų pelėnų patelės, gydytos NaB arba TSA, padarė. Kadangi nei NaB, nei TSA neturėjo įtakos bendram judėjimui, atrodė, kad jų poveikis partnerio pasirinkimui buvo būdingas elgesiui, o ne antrinis poveikis judėjimui. Šį specifinį TSA poveikį dar labiau patvirtino mūsų molekuliniai stebėjimai. Iš tiesų, nors ir administruojamas icv., mes galėjome aptikti specifinį genų ekspresijos pokytį NAcc, bet ne gretimoje struktūroje, caudate putamen. Be to, net NAcc, D1R ir D2R mRNR ir baltymų lygis liko nepakitęs. Toks specifiškumas atrodo stebinantis plačiam HDAC inhibitoriui, pavyzdžiui, TSA, kuris veikia tiek I, tiek II klasės HDAC. Nepaisant to, buvo pranešta, kad TSA turi įtakos tik nedidelio žinduolių genomo genų pogrupio ekspresijai30-32, įskaitant peles20.
Čia parodėme, kad histono H3 acetilinimas Lys14 oxtr promotorius, modifikacija, susijusi su sustiprinta genų transkripcija, įskaitant smegenų plastiškumą33, 34, pabrėžia aukštesnį OTR mRNR ir baltymų kiekį. Kaip atsakas į TSA, histono acetilinimas oxtr promotorius padidina ir palengvina jo transkripcijos aktyvavimą žmogaus ląstelių linijoje22, patvirtinantys mūsų atradimą oxtr galima reguliuoti epigenetiškai. Kadangi vietinės OTR blokados NAcc pakako, kad būtų išvengta TSA elgesio poveikio, mūsų duomenys rodo, kad TSA sukelta OTR ekspresija NAcc bendro gyvenimo metu palengvino partnerio pirmenybės formavimąsi. Be to, 24 valandas trunkantis gyvenimas kartu su poravimu, procedūra, kuri patikimai skatina prerijų pelėnų patelių partnerio pasirinkimą, sukėlė panašų OTR ekspresijos padidėjimą patelės NAcc . Tai visiškai atitinka žinomą oksitocino ir jo receptorių dalyvavimą pelėnų patelių partnerio pirmenybės formavimo neurobiologijoje. Poravimasis sukelia tarpląstelinio oksitocino koncentracijos padidėjimą NAcc25, o vietinė oksitocino infuzija į NAcc palengvina partnerio pasirinkimo formavimąsi, kai nėra poravimosi8. Be to, OTR antagonistai blokuoja partnerio pasirinkimo formavimąsi, kurį sukelia oksitocino vartojimas arba poravimasis8, 35. Svarbu tai, kad viruso sukeltas per didelis OTR ekspresija moterų NAcc yra pakankamas, kad palengvintų partnerio pasirinkimo formavimąsi.12, 13.
Mūsų rezultatai ne tik sustiprina OTR vaidmenį, bet ir rodo, kad OTR geno ekspresija suaktyvėja per epigenetinius mechanizmus, kai gyvena kartu su patinu, kai nėra poravimosi. Iš tiesų, nors ir nepakanka, kad paskatintų partnerio pirmenybę, toks gyvenimas be poravimosi trumpą laiką suaktyvina neurobiologinius procesus, kuriais grindžiamas partnerio pirmenybės formavimas.. Pavyzdžiui, dvi valandos laisvo patino poveikio sukelia nedidelį, bet nereikšmingą oksitocino išsiskyrimo padidėjimą moterų NAcc.25. Todėl galima pasiūlyti, kad TSA arba NaB sustiprintų neuroadaptacijas, sukeltas bendro gyvenimo su vyru, palengvinant partnerio pasirinkimo vystymąsi. Įdomu tai, kad apie tokį stiprinimą jau buvo pranešta graužikams, kai I ir II klasės HDAC inhibitoriai, įskaitant NaB ir TSA, palengvina mokymosi įvykio konsolidavimą, dėl kurio kontroliniams gyvūnams nesusiformuoja ilgalaikė atmintis.36, 37. Šiai sampratai paremti ilgesni bendro gyvenimo laikotarpiai (pvz., 48 valandos) gali paskatinti partnerio pirmenybę net ir nesant poravimosi4. Taip pat svarbu pažymėti, kad gyvenimas kartu su poravimu sukėlė patelės NAcc padidintą OTR ir V1aR ekspresijos reguliavimą per tuos pačius epigenetinius mechanizmus, kaip ir po gydymo kartu su TSA, kurie rodo, kad TSA ir poravimasis veikia tuos pačius skatinimo būdus. partnerio pirmenybės formavimas. Svarbu tai, kad TSA nesukelia OTR ir V1aR padidėjimo moterų NAcc, jei nėra bendro gyvenimo su vyru. Apskritai tai patvirtina hipotezę, kad TSA palengvina partnerio pirmenybės formavimąsi, sustiprindama endogenines neuroadaptacijas, kurias natūraliai sukelia bendras gyvenimas su vyru, o ne pati suaktyvindama šias ar skirtingas neuroadaptacijas.
OJūsų tyrimas taip pat pabrėžia kritinį NAcc V1aR vaidmenį formuojant patelių partnerio pirmenybę, nes TSA gydytiems gyvūnams būdingas didesnis V1aR lygis, kurio blokada užkirto kelią TSA palengvintam partnerio pirmenybės formavimuisi.. Be to, šie poveikiai buvo susiję su didesniu histono acetiliavimu avpr1a promotorius, nepaisant reikšmingo V1aR mRNR padidėjimo, tikėtina, dėl neoptimalaus laiko taško. Nors negalime atmesti galimybės, kad TSA reguliuoja baltymų stabilumą acetilinant ne histoninius baltymus38, ši išvada rodo, kad panašiai kaip oxtr reklamuotojas, TSA gali skatinti avpr1a transkripcija per vietinį histono acetilinimą. Nors buvo aprašytas AVP indėlis į vyrų porų ryšį5, jo vaidmuo patelės elgesyje vis dar prieštaringas. Viena vertus, an icv. AVP injekcija palengvina partnerio pirmenybės formavimąsi pelėnų patinams ir patelėms, o to užkerta kelią V1aR arba OTR blokada.39. Kita vertus, icv. V1aR antagonisto injekcija blokuoja poravimosi sukeltą partnerio pasirinkimą prerijų pelėnų patinams, bet ne patelėms.40. Tačiau visi šie tyrimai buvo naudojami icv. injekcijos, užkertant kelią bet kokiai tolesnei informacijai apie susijusias struktūras. Pateikiame pirmuosius įrodymus, kad AVP neurotransmisija NAcc gali būti susijusi su pelėnų patelių partnerio pirmenybės formavimu, o daugumoje literatūros aprašomas jos dalyvavimas įvairiose srityse, tokiose kaip pilvo blyškumas, šoninė pertvara, lovos branduolys. stria terminalis ir vyrų migdolinis kūnas5. Todėl tampa įdomu pastebėti, kad OTR arba V1aR blokados patelės NAcc pakako, kad po gydymo TSA nesusiformuotų partnerio pirmenybė, o tai rodo, kad norint formuoti partnerio pirmenybę reikia aktyvuoti ir V1aR, ir OTR.. Tjo išvada sutampa su ankstesniu prerijų pelėnų patinų pastebėjimu ir jį patvirtina, kad vienalaikė prieiga prie OTR ir V1aR LS yra būtina AVP sukeltam partnerio pasirinkimui.6. Be to, specifinio OTR ir V1aR lygio padidėjimo stebėjimas TSA gydytiems gyvūnams dar labiau patvirtina reikalavimą tuo pačiu metu aktyvuoti AVP ir oksitocino neurotransmisijas, kad būtų galima susieti porą.
Kartu su oksitocinu ir AVP, dopamino neurotransmisija NAcc moduliuoja pelėnų patelių partnerio pirmenybės formavimąsi.9. Nors poravimasis skatina dopamino išsiskyrimą NAcc9, receptorių lygio svyravimai pastebimi tik po ilgesnio (ilgesnio nei 24 val.) gyvenimo kartu su poravimusi, kuris yra svarbus porų ryšiui palaikyti.10. Remiantis šiais stebėjimais, prerijų pelėnų patelės, gydomos TSA, pirmenybę teikė partneriams be reikšmingų dopamino D1R ir D2R receptorių skirtumų. Todėl šis dopamino receptorių reguliavimo nebuvimas yra dar vienas TSA specifiškumo įrodymas.
Mūsų duomenys pirmą kartą praneša apie epigenetinį porų jungimosi neurobiologijos komponentą ir rodo, kad TSA sukelia prerijų pelėnų patelių „leidžiamąją būseną“, sustiprindama natūralų molekulinį atsaką į bendrą gyvenimą ir skatindama stipresnės socialinės sąveikos formavimąsi. lemiantis partnerio pirmenybę. Todėl kyla pagunda daryti hipotezę, kad TSA palengvintas partnerio pasirinkimas gali būti dar labiau sustiprintas ir sukelti nuolatinį ryšį. Nors konkrečius susijusius HDAC dar reikia nustatyti, būtų įdomu toliau tirti TSA poveikį kitam elgesiui, susijusiam su monogamiška prerijų pelėnų gyvenimo strategija, pavyzdžiui, selektyvią agresiją ir abiejų tėvų priežiūrą. Atsižvelgiant į prerijų pelėnų svarbą modeliuojant neurobiologinius porų sujungimo mechanizmus žmonėms5, ir perspektyvūs HDAC inhibitoriai jau klinikiniuose tyrimuose24, 41, 42, mūsų duomenys atveria kelią naujoms farmakologinėms galimybėms paveikti socialinį elgesį.
Metodai
Tematika
Seksualiai naivios prerijų pelėnų patelės (Microtus ochrogaster) iš laboratorinės veisimosi kolonijos buvo nujunkytos 21 dienos amžiaus ir laikomos tos pačios lyties brolių ir seserų porose plastikiniuose narvuose (12 × 28 × 16 cm) su vandeniu ir maistu. ad libitum. Visi narvai buvo laikomi 14:10 h šviesos ir tamsos ciklu, o temperatūra buvo maždaug 20 ° C. Visi gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į eksperimentines grupes, kai jiems sukako 70–90 dienų. Naudotų gyvūnų skaičius buvo pagrįstas ankstesniais mūsų grupės ir kitų atliktais šios srities tyrimais kartu su galios analize. Eksperimentines procedūras patvirtino Floridos valstijos universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.
Narkotikai
Natrio butiratas (NaB), ištirpintas fiziologiniame tirpale, ir trichostatinas A (TSA), ištirpintas dirbtiniame smegenų skysčio nešiklyje (CSF, BioFluids, Rockville, MD), buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (St Louis, MO). NaB buvo švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę (ip) 600 mg/kg doze, kuri, kaip žinoma, sukelia histono acetilinimą keliose pelių smegenų struktūrose43, 44. Panašiai, TSA dozės diapazonas buvo pagrįstas ankstesniu darbu, nustatančiu jo veiksmingumą sukeliant vietinius histono acetilinimo įvykius ir genų ekspresijos pokyčius graužikams.19, 20. Selektyvus V1aR receptorių antagonistas V1aRA, d(CH2)5[Tyr(Me)]AVP ir OTR antagonistas OTA(B), [d(CH2)5, Tyr (aš)2, Thr4, Tyr-NH29]-OVT), buvo gauti iš Bachem (Toransas, Kalifornija). Antrasis, selektyvesnis OTR antagonistas, OTA(T), dGly-NH2-d(CH2)5 [Tyr (aš)2, Thr4]OVT45, maloniai suteikė daktaras Maurice'as Manningas (Toledo universitetas, OH). Šie antagonistai ir naudojamos dozės buvo parinkti remiantis ankstesniais tyrimais, rodančiais jų selektyvumą atitinkamai V1aR arba OTR.35, 39, 46-49.
Stereotaksinė kaniuliacija ir mikroinjekcija
Moterys buvo anestezuotos natrio pentobarbitaliu (1 mg/10 g kūno svorio), o 26 dydžio nerūdijančio plieno kreipiamosios kaniulės (Plastics One, Roanoke, VA) buvo implantuotos stereotaksiniu būdu, nukreiptos į šoninį skilvelį (vienpusiškai; nosies strypas –2.5 mm, 0.6 mm). rostralinis, 1.0 mm šoninis ir 2.6 mm ventralinis iki bregmos) arba konkrečiai vietai NAcc (dvišalis; nosies strypas –2.5 mm, 1.7 mm rostralinis, ±1.0 mm abipusis ir 4.5 mm ventralinis iki bregmos). Po 3 dienų pasveikimo tiriamieji gavo mikroinjekcijas arba CSF, arba CSF, turinčio skirtingą TSA koncentraciją. Kai buvo naudojami selektyvūs OTR arba V1aR antagonistai, jie buvo švirkščiami 30 minučių prieš TSA. Injekcijos buvo padarytos 33 dydžio adata, kuri nusidriekė 1 mm žemiau kreipiančiosios kaniulės į tikslinę sritį, 500 nl injekcijos tūriu į šoninį skilvelį (icv.) arba 200 nL kiekvienoje pusėje į NAcc. Adata buvo prijungta prie Hamiltono švirkšto (Hamiltonas, Reno, NV) per polietileno-20 vamzdelį, o stūmoklio nuspaudimas buvo atliktas lėtai, o vienai injekcijai prireikė 1 minutės. Eksperimento pabaigoje visi tiriamieji buvo paaukoti greitai nupjaunant galvą, o smegenys buvo ištrauktos, kad būtų patikrinta, ar kaniulės yra įdėtos eksperimentinių sąlygų aklas stebėtojas. Tiriamieji, kurių kaniulės buvo netinkamai išdėstytos, nebuvo įtraukti į duomenų analizę.
Bendro gyvenimo ir partnerio pirmenybės testas
Iškart po to ip., icv., arba intra-NAcc vaistų injekcijos, patelės buvo kartu su patinu 6 valandas be poravimosi. Poravimosi nebuvimas buvo patikrintas išnagrinėjus vaizdo įraše nufilmuotą elgesį. Neuroadaptacijai, kurią sukelia poravimasis, estrogenais paruoštomis patelėmis (2 µg per dieną, ip., 3 dienas) gyveno kartu su patinu 6 arba 24 valandas ir buvo patikrintas poravimosi buvimas. posteriori vaizdajuostėje (svyruoja nuo 6 iki 11 susitikimų per pirmas 6 bendro gyvenimo valandas).
Partnerio pasirinkimo testas buvo atliktas iškart po 6 valandų bendro gyvenimo, kaip aprašyta anksčiau11. Trumpai tariant, trijų kamerų testavimo aparatą sudarė neutralus narvas, sujungtas su dviem lygiagrečiais identiškais narvais, kurių kiekviename buvo stimuliuojantis gyvūnas – nepažįstamas patinas „nepažįstamasis“ arba pažįstamas patinas „partneris“, naudotas bendro gyvenimo laikotarpiu. Moterys per 3 valandas trukusį bandymą galėjo laisvai judėti visame aparate, o stimuliuojantys patinai buvo pririšti savo narveliuose, neleidžiant jiems tiesioginio kontakto. Visas seansas buvo nufilmuotas vaizdo įraše, o tiriamojo kontakto su partneriu ar nepažįstamuoju trukmę vėliau kiekybiškai įvertino apmokytas eksperimentuotojas, nežinojęs apie biologines grupes. Partnerio pirmenybė buvo apibrėžiama kaip tiriamieji, praleidžiantys daug daugiau laiko kūno kontaktui su partneriu, palyginti su nepažįstamuoju, kaip nustatyta suporuotas, dvišalis. t- testas. Be to, trijų kamerų aparate buvo įrengti fotospindulių jutikliai, leidžiantys nustatyti lokomotorinį aktyvumą, nurodytą pagal patelės patekimų į stimulų kameras skaičių. Taigi šis lokomotorinis balas leidžia kontroliuoti numanomą antrinį narkotikų poveikį moterų elgesiui, pvz., bendrą aktyvumą, nerimą ar pakitusį naujos aplinkos tyrinėjimą, kaip dažniausiai naudoja mūsų grupė ir kiti.12.
RNR ir baltymų ekstrahavimas
Patelės buvo paaukotos greitai nupjaustant galvą, o smegenys buvo nedelsiant ekstrahuotos ir užšaldytos ant sauso ledo. Koroninės sekcijos (200 µm) buvo supjaustytos ant kriostato ir ant mikroskopo stiklelių pritvirtintos šerkšnas. Dvišaliai 1 mm skersmens audinių perforatoriai buvo paimti iš viso NAcc ir caudate putamen, pastaroji buvo kontrolinė sritis, ir iki apdorojimo laikomi –80 ° C temperatūroje. Bendra RNR ir baltymai buvo ekstrahuoti naudojant TRI-Reagent protokolą pagal gamintojo instrukcijas (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
Baltymų ekspresijos analizė Western blot metodu
Po atskyrimo ant 10% poliakrilamido gelio (15% histonams), baltymai buvo perkelti į nitroceliuliozės membranas ir inkubuojami su šiais pirminiais antikūnais: anti-OTR (sc-8102, 1:1000), -V1aR (sc-18096, 1:500), -D1R (sc-33660, 1:1000), -D2R (sc-9113, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -aktinas (A2066, 1:1000, Sigma Aldrich. Sent Luisas, MO) arba anti-acetilhistonas H3 (Lys14, #06–911, 1:1000) ir bendras H3 (#05–928, 1:1000, Millipore, Temecula, CA). Visi antikūnai yra patvirtinti, kad juos būtų galima naudoti žmonėms, žiurkėms ir pelėms, su kuriomis prerijų pelėnai turi didelę homologiją (nuo 81 iki 96 %). Po hibridizacijos su HRP konjuguotu antriniu antikūnu, membranos buvo atskleistos su ECL (ECL SuperSignal West Dura substratas, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) ir eksponuotos Fuji XAR plėvele (Fuji Film, Tokijas, Japonija). Kiekybinis nustatymas buvo atliktas naudojant AIS 6.0 Image programinę įrangą (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Kanada), ir visi signalai buvo normalizuoti toje pačioje membranoje iki aktino, išskyrus acetil-H3 signalą, kuris buvo normalizuotas pagal bendrą histono H3 signalą. Normalizuoti duomenys išreiškiami CSF gydytų gyvūnų procentais.
Pusiau kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (RT-PGR)
0.5 µg visos RNR buvo apdorota papildomai DNR sintezei, o tada analizuojama, kaip aprašyta anksčiau50 su normalizavimu į nikotinamido adenino dinukleotido dehidrogenazės (NADH) geną. Visos reakcijos buvo atliktos trimis egzemplioriais, o jų specifiškumas patikrintas lydymosi kreivės analize ir atskyrimu ant 2% agarozės gelio. Naudotos tokios pradmenų sekos: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3' (Fwd) ir 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAACC-3' (For) ir 5'GATAGC-TAGATC'3'GATAGC-1'. (Rev) AVP5aR, 3'- TTAACAACAATGGGGCTGTG-5' (For) ir 3'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-1' (Rev) D5R, 3'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-5' (For) ir 3'-CGGTCTReGTGTCATCAT'2 (CGGTCTReGTGTC ) D5R ir 3'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5' (skirta) ir 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-XNUMX' (Rev) NADH. Normalizuoti duomenys išreiškiami CSF gydytų gyvūnų procentine dalimi.
Chromatino imunoprecipitacija
Histono H3 acetilinimas (Lys14) NAcc ir caudate putamen audinių štampuose buvo analizuojamas naudojant Magna ChIP protein G Tissue Kit (Millipore, Temecula, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, po kryžminio susiejimo su 1% formaldehidu, chromatinas buvo nukirptas naudojant Misonix XL-2000 iki 200–600 bp fragmentų. Tada acetilinto histono H3 (Lys14) imunoprecipitacija buvo atlikta naudojant 10 µg antiacetil-H3 (Lys14) antikūno (Millipore) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po plovimų, eliuavimo iš granulių ir kryžminio ryšio panaikinimo, imuniniu būdu nusodinta DNR buvo išgryninta ir analizuojama trimis egzemplioriais RT-PCR ant iCycler platformos (žr. aukščiau) su vidine standartine kreive, sudaryta iš sujungtų INPUT mėginių. Pradmenys buvo sukurti taip, kad sustiprintų 236 bp ilgio sritį, esančią 128 bp prieš srovę nuo pirmojo egzono, koduojančio prerijų pelėną OTR (oxtr, Genbank prisijungimo Nr.AF079980), arba 192 bp ilgio regionas, esantis 141 bp prieš srovę nuo pirmojo egzono, koduojančio prerijų pelėną V1aR (avpr1a, Genbank prisijungimo Nr.AF069304). Sekos buvo tokios: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3' (Fwd) ir 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) oxtr, ir 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3' (Fwd) ir 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (rev) avpr1a. Kiekvienas mėginys buvo normalizuotas pagal atitinkamą INPUT vertę, o tada duomenys išreiškiami CSF gydytų gyvūnų procentais.
Statistinės analizės ir duomenų apdorojimas
Analizuojant partnerio pasirinkimą, nebuvo įtraukti gyvūnai, kurie poravimosi elgėsi bendro gyvenimo laikotarpiu arba kurių kaniulės buvo netinkamai išdėstytos. Atliekant visas kitas molekulines analizes, ne daugiau kaip vienas duomenų taškas vienoje biologinėje grupėje buvo atmestas, kai buvo nustatytas kaip išskirtinis. Dauguma eksperimentų buvo pakartoti, išskyrus atvejus, kai rezultatai buvo labai aiškūs. Laikas, praleistas šalia kontakto su bet kuriuo stimuliuojančiu gyvūnu partnerio pasirinkimo testo metu, buvo analizuojamas naudojant dviejų uodegų porą. t- testas. Judėjimo balai buvo analizuojami naudojant dvipusį metodą t- testas (dviem grupėms) arba vienpusis ANOVA (daugiau nei dviem grupėms) ir, jei reikia, Fischerio PLSD post-hoc bandymai buvo atlikti su reikšmingumo riba P < 0.05. Patikrinus normalumą, visi kiti duomenys buvo išanalizuoti naudojant dvipusę analizę t-testas darant prielaidą, kad prieš tai patikrintos vienodos arba nelygios dispersijos. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant StatView programinę įrangą (SAS institutas). Kai duomenys yra standartizuoti pagal jų atitinkamas kontrolę (% CSF, fiziologinio tirpalo arba poravimosi grupių), buvo atlikta neapdorotų duomenų statistinė analizė.
Padėka
Šį darbą palaikė Nacionalinis psichikos sveikatos institutas (NIMH), skiria MHR21-083128 MK ir ZW, o MHR01-058616 ZW. Taip pat dėkojame dr. Maurice'ui Manningui už dosnią OTR antagonisto OTA(T) dovaną.
Išnašos
Interesų konfliktas: Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.
Autoriaus įmokos
HW, FD ir YL atliko eksperimentus. HW ir FD analizavo duomenis. HW, FD, ZW ir MK sukūrė tyrimą. Straipsnį parašė FD, ZW ir MK. Visi autoriai aptarė rezultatus ir pakomentavo rankraštį.
Nuorodos
;