Laikinas neuronų slopinimas atskleidžia netiesioginių ir tiesioginių jautrinimo būdų priešingus vaidmenis (2011)

Nat Neurosci. 2011 sausis; 14 (1): 22 – 24.

Paskelbta internete 2010 gruodžio 5. doi:  10.1038 / nn.2703

PMCID: PMC3058296
NIHMSID: NIHMS245934
Galutinę leidėjo redaguotą šio straipsnio versiją galite rasti tinklalapyje Nat Neurosci
Žr. Kitus PMC straipsnius citata paskelbtas straipsnis.

Abstraktus

Nugaros striatumas vaidina svarbų vaidmenį plėtojant narkomaniją; tačiau tiksliai supranta, koks vaidmuo tenka striatopallidinis (netiesioginis) ir striatonigral (tiesioginis) kelias neuronai reguliuojant elgesį lieka sunkūs.

Naudojant naują metodą, kuris remiasi virusinės medijuojamos GPCR (hM.) Ekspresija4D), parodėme, kad hM aktyvavimas4D receptoriai su klozapinuN- oksido (CNO) stipriai sumažėjęs striatalo neuronų susijaudinimas. Kai hM4D receptoriai buvo selektyviai ekspresuojami žiurkių tiesioginiuose arba netiesioginiuose neuronuose, CNO nekeičia ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą, bet pakeitė elgesio plastiškumą, susijusį su pakartotiniu gydymu. Konkrečiai, trumpalaikis striatopallidinio neuroninio aktyvumo sutrikimas palengvino elgsenos jautrinimą, o mažėjantis striatonigrinių neuronų susijaudinimas pablogino jo išlikimą. Šie duomenys rodo, kad ūminis vaisto poveikis gali būti analizuojamas pagal elgesio adaptacijas, susijusias su pakartotiniu vaisto poveikiu, ir pabrėžia šio metodo naudingumą dekonstruojant neuronų kelio įnašus į elgesį, pvz., Jautrinimą.

Nepaisant didžiulių neigiamų narkomanijos pasekmių, psichostimuliantų vartojimas ir piktnaudžiavimas išlieka vyraujantys. Progresas nuo pradinio vaisto poveikio iki reguliaraus vartojimo ir galiausiai iki kompulsinio, įprasto elgesio ir slopinamosios kontrolės praradimo apima daugybę molekulinių adaptacijų diskrečiuose neurocircyse1,2,3. Striatumas buvo identifikuotas kaip pagrindinė daugelio elgesio ir neurobiologinių adaptacijų, kurios, kaip manoma, sudaro pagrindinius procesus, kurie tarpininkauja priklausomybei, vietą.1,2,3. Dauguma striatume esančių neuronų (~ 95%) yra GABAerginiai vidutinio nugaros projekcijos neuronai (MSN) tkepurė skiriasi savo neuropeptido ekspresija ir sudaro du pagrindinius efferentinius kelius4.

  • Striatopallidiniai MSN yra enkefalinas (ENK) ir sudaro netiesioginį kelią
  • kadangi striatonigriniai MSN yra dinamorfinas (DYN) ir P medžiaga ir sudaro tiesioginį kelią.

Daugelis konceptualių modelių numato, kad šios MSN populiacijos viena kitai priešinasi tiek mechaniniu, tiek funkciniu požiūriu5,6. Tačiau yra nedaug empirinių įrodymų, patvirtinančių jų skirtingą vaidmenį elgsenos kontrolėje, nes šios ląstelių populiacijos fiziškai susilieja ir morfologiškai neatitinka selektyvaus manipuliavimo techniškai neįmanoma.

Norėdami ištirti šių striatų ląstelių populiacijų vaidmenį, atsirandantį po elgesio, kuris atsiranda po pakartotinio poveikio piktnaudžiavimo narkotikais, mes sujungėme dvi naujas strategijas: virusinius vektorius, kurie naudoja ENK arba DYN genų promotorius, kad nukreiptų transgeno ekspresiją į striatopallidinius ar striatonigrinius neuronus ir atitinkamai sukurtą GPCR (Gi / oprijungtas žmogaus muskarinas M4 DREADD; Dizainerio receptorius, kurį aktyvuoja tik dizainerio vaistas; hM4D)7 kuris yra aktyvuojamas kitaip farmakologiškai inertiniu ligandu, klozapino \ tN- oksidas8,9 (CNO; 1a, h). Po ekspresijos kultivuojamuose neuronuose, CNO stimuliuoja Gi / osusietas hM4D receptoriai, tokiu būdu suaktyvindami į vidų nukreipiančius kalio 3 (Kir3) kanalus, dėl to atsiranda membranos hiperpolarizacija ir trumpalaikis neuronų slopinimas9.

1 pav  

Laikinas ir tikslinis striatrijos ląstelių signalizacijos slopinimas. (a, h) „Amplicon“ žemėlapiai pENK-hM4D/pENK-GFP (a) ir pDYN-hM4D/pDYN-GFP (h) nukreipimo vektoriai. (b, i) Konokalinė mikroskopija parodė, kad pENK-hM4D receptoriai buvo selektyviai išreikšti striatopallidu ...

Siekiant patikrinti virusinių vektorių ląstelių fenotipo specifiškumą, mes naudojome dvigubos etiketės imunofluorescencinę mikroskopiją po virusų dorsalinės infuzijos.Papildomas pav. 1), kurie išreiškia hemagliutinino pažymėtą hM4D receptoriai, kontroliuojami arba ENK promotoriaus (pENK-hM4D) arba DYN promotorius (pDYN-hM4D). Mes nustatėme, kad pENK-hM4D ekspresija pirmiausia buvo ENK turintiems MSN (90% hemagliutinino ląstelių buvo ENK +, 85 iš 94; 6% hemagliutinino ląstelių buvo P +, 4 iš 70 ląstelių; 1b) kadangi pDYN-hM4D ekspresija pirmiausia buvo P-turinčioje MSN (95% hemagliutinino ląstelių buvo P +, 109 iš 115 ląstelių; 5% hemagliutinino ląstelių buvo ENK +, 5 iš 97 ląstelių; 1i). Panašūs rezultatai buvo gauti po to, kai infuzuojami specifiniai virusai, kurie ekspresuoja žalią fluorescencinį baltymą (pENK-GFP ir pDYN-GFP; Papildomosios priemonės. 2a ir 3a).

Atsižvelgiant į tai, kad striatopallidiniai MSN pirmiausia projektuoja į globus pallidus išorinius (GPe) ir striatonigralius MSN, kurie pirmiausia projektuojami į materia nigra pars reticulata (SNpr), šiuose smegenų regionuose panaudojome retrogracinio žymeklio Fluoro-Gold injekcijas, po to sekė dvigubo žymėjimo fluorescencinė imunohistochemija patvirtinti, kad pENK ir pDYN virusai sukėlė specifinę infekciją. Mes pastebėjome, kad pENK-GFP ląstelės, lokalizuotos su striatalu Fluoro-Gold ekspresija po infuzijų į GPe, bet ne SNpr (Papildomas pav. 2b) kadangi pDYN-GFP ląstelės, lokalizuotos su striatalu Fluoro-Gold išraiška po infuzijų į SNpr, bet ne GPe (Papildomas pav. 3b). Virusinių vektorių ekspresija nekeičia ENK + arba P + neuronų kiekio virusinės infekcijos regione, o tai rodo, kad šių promotorių panaudojimas viruso perduodamam virusui nepaveikė endogeninių neuropeptidų kiekių. Visi šie rezultatai rodo, kad pENK ir pDYN virusiniai vektoriai išreiškia genus jų tinkamai atskirtose striatrijos ląstelių populiacijose.

Nors HM4Nustatyta, kad D receptorių metodai moduliuoja kitų neuronų tipų aktyvumą9, jų gebėjimas paveikti strialių neuronus nebuvo ištirtas. Todėl mes užsikrėtėme striatriškus vidutinio smegenų neuronus su hM4D receptoriai, kontroliuojami herpes simplex viruso (HSV) promotoriaus, paruošė doralinės striatos koroninius gabalus po dviejų dienų, ir ištyrė, kaip hM4D-ekspresuojantys vidutiniai spinijiniai striatrijos neuronai reaguoja į CNO. Pastebėjome, kad vietinis CNO (10 μM) panaudojimas sukėlė membranos potencialo hiperpolarizaciją (~ 7 mV, pradinis membranos potencialas buvo pritaikytas prie –80 mV; 1c) ir sumažino neuronų įvesties atsparumą po CNO taikymo (1d, e), rodo, kad kalio laidumas (ty Kir3-medijuojama srovė) yra aktyvuojamas CNO hM4D receptorių išreiškiantys neuronai. Be to, CNO perfuzija žymiai sumažino sukeltų veiksmo potencialų skaičių hM4D ekspresuojantys neuronai, bet ne kontrolinėse ląstelėse, tokiu būdu veiksmingai slopindami virusiškai užsikrėtusių neuronų funkcinę išeigą hM ekspresija4Vien tik D receptoriai nekeičia įėjimo atsparumo (P = 0.84) arba veiksmo potencialo deginimas (P = 0.64). (1f, g). Kartu šie duomenys rodo, kad, panašiai kaip hipokampo neuronai9, hM4D / CNO pagrįstas metodas gali veiksmingai sumažinti žiurkių strialių neuronų nervingumą.

Kaip papildomas koncepcijos įrodymas, išbandėme, ar hM4D receptoriai blokuotų neurotransmisiją gerai įsitvirtinusioje grandinėje, kur neuroninis aktyvumas yra numatomas pagal elgseną atitinkančius stimulus. Atitinkamai, mes užsikrėtėme ventralių tegmentalių (VTA) neuronus su hM4D receptoriai, kontroliuojami HSV promotoriaus, kuris stipriai ekspresuoja dopamino neuronuose10ir panaudojo greitojo nuskaitymo ciklinę voltammetriją, kad būtų galima išmatuoti dopamino išsiskyrimo branduolyje accumbens pokyčius po netikėto maisto atlygio pristatymo11. CNO žymiai susilpnėjęs maisto granulių sukeltas dopamino išsiskyrimas į branduolį accumbens, palyginti su transporto priemone (Papildomas pav. 4). Galiausiai, išbandėme, ar specifinių neuronų ląstelių tipų aktyvumas mažėja in vivo gali pakeisti amfetamino gebėjimą skatinti Fos ekspresiją. Psichostimuliantai, tokie kaip amfetaminas, yra patikimi c-fos striatume12 ir padidės c-fos striatonigralų ir striatopallidinių neuronų metu mūsų eksperimentinėmis sąlygomis13. Be to, kad jis naudojamas kaip neuronų aktyvumo žymuo, psichostimuliantinis c- \ tfos manoma, kad jis atlieka svarbų vaidmenį inicijuojant ir palaikant nervų adaptacijas, susijusias su psichomotoriniu jautrinimu1,14. Mes nustatėme, kad CNO tarpininkauja pENK-hM4D receptoriai žymiai sumažino bendrą amfetamino sukeltų c-Fos ląstelių skaičių striatume (1k ir Papildomas pav. 5a). Šis sumažėjimas pasireiškė abiejuose hemagliutinino neuronuose (ty tose, kurios išreiškė hM4D receptoriai) ir hemagliutinino neigiami neuronai (ty tie, kurie ne išreiškia hM4D receptoriai; 1l), rodo, kad tarp hM yra neuronų pasikalbėjimo efektas4D-ekspresuojantys neuronai ir neinfekuoti neuronai. Žymiai sumažėjęs bendras amfetamino sukeltų c-Fos ląstelių skaičius ir hemagliutinino teigiamų c-Fos ląstelių skaičius taip pat buvo pastebėtas, kai hM4D receptoriai buvo aktyvuoti tiesioginiuose neuronuose (1n, o ir Papildomas pav. 5b). Svarbu tai, kad tokį poveikį sukelia ne tik naujų receptorių virusinė ekspresija, bet ir pENK-hM4D arba pDYN-hM4D receptorių be CNO gydymo neturėjo įtakos amfetamino sukeltų Fos ląstelių skaičiui (Papildomos fig. 6 ir 7). Taigi, šie rezultatai parodo, kad CNM tarpininkauja hM aktyvacija4D receptoriai taip pat gali sukelti neuronų aktyvumo mažėjimą, mažinant neurotransmiterių išsiskyrimą ir silpninantis ląstelių ląstelių signalizavimą.

Pakartotinis priklausomybę sukeliančių vaistų poveikis gali lemti laipsnišką ir nuolatinį elgesio jautrumo padidėjimą, dažnai vadinamą elgesio jautrinimu. Svarbu tai, kad jautrinimas apima kai kurias tas pačias nervų grandines, susijusias su žmogaus narkomanijos vystymusi3. Čia mes naudojame naujus įrankius, kad ištirtume specifinį striatų neurono aktyvumo slopinimo poveikį amfetamino jautrinimo vystymuisi. Manome, kad tiesioginiai ir netiesioginiai neuronų neuronai turi priešingus vaidmenis, kai striatonigriniai neuronai skatina jautrinimą ir striatopallidiniai neuronai slopina jautrumą, atitinkantį jų konceptualiai pasiūlytus vaidmenis elgsenos aktyvavimo ir slopinimo atžvilgiu5,6. Atitinkamai išbandėme, ar striatopallidinių neuronų biochemiškai mažėjantis neuroninis sužadinimas sukeltų jautrinimą amfetamino dozavimo režimui, kuris sukelia slenkstinį jautrumo lygį ir ar striatonigralinių neuronų neuroninio susijaudinamumo sumažėjimas neleistų jautrinti protokole, kuris paprastai sukelia tvirtą jautrinimą.

Pirmajame tyrime naudojome gydymo režimą, kuris sukelia lokomotorinio jautrumo slenkstinį lygį GFP kontrolėje (keturios vaisto ekspozicijos). Po ištraukos laikotarpio vidutinio sunkumo amfetamino dozė (2 mg / kg) buvo skiriama nesant CNO sukelto neuronų aktyvumo slopinimo, siekiant nustatyti, ar jautrumas buvo patvarus. CNO tarpininkaujančio pENK-hM4D gydymo amfetamino metu nepakito ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą (\ t2a). Tačiau netiesioginių neuronų neuroninio aktyvumo sutrikimas, kurį sąlygoja CNO, palengvino žymiai patikimesnį jautrinimą, palyginti su GFP kontrolėmis (2b). Šis padidėjęs jautrinimas buvo palaikomas amfetamino poveikiu, kuris buvo atliktas praėjus savaitei vėliau be CNO gydymo (2c, d). Šie poveikiai gali būti priskirti nuo CNO priklausomo striatopallidinių neuronų aktyvumo sumažėjimo hM4D receptoriai, nes hM4D receptorių ekspresija be CNO gydymo nesukelia judesio jautrumo šiam lengvo amfetamino dozavimo režimui (Papildomas pav. 6).

2 pav  

Pernelyg mažinant striatopalidinių ar striatonigrinių neuronų sužadinamumą, buvo priešingas poveikis amfetamino sensibilizacijai. (a, e) Ūmus lokomotorinis atsakas į amfetaminą po CNO sukeltos aktyvacijos pENK-hM4D (a) ir pDYN-hM4D (e) receptoriai. ...

Siekiant nustatyti, ar striatonigraliniai neuronai gali reguliuoti vaisto reakciją priešingai, mes išbandėme biochemiškai mažėjančio striatonigrinių neuronų susijaudinimo poveikį dorsomedialinės striatumo metu gydant amfetaminą, kuris sukelia tvirtą jautrinimą GFP kontrolėje (šešios vaisto ekspozicijos) ), taip pat mažos amfetamino (0.5 mg / kg) dozės, kai nėra receptoriaus sukeltų neuronų veiklos sutrikimų, dozės. Kaip ir netiesioginio kelio slopinimo atveju, CNO tarpininkaujančių tiesioginių takų neuronų sužadinimo sumažėjimas amfetamino gydymo metu nepakeitė ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą (2e). Nors jautrumo atsiradimas pasirodė panašus į GFP kontrolę po CNO sukeltos aktyvacijos pDYN-hM4D gydymo fazės metu (\ t2f), pDYN-hM4D grupei, bet vis dar buvo tvirtai išlaikyta GFP kontrolėje (2g, h). Šie poveikiai taip pat gali būti siejami su CNM priklausomu striatonigrinių neuronų aktyvumo sumažėjimu hM4D receptoriai, nes hM4D receptorių ekspresija be CNO gydymo blokuoja lokomotorinio jautrumo vystymąsi, nes gydymo fazėje ir vaistinio preparato veikimo metu buvo stebimas jautrinimas (Papildomas pav. 7). Šie duomenys rodo, kad striatonigriniai neuronai gali būti ypač svarbūs reguliuojant ilgalaikius elgesio pritaikymus, kurie yra pakartotinio narkotikų vartojimo pasekmė.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šie duomenys yra pirmasis įrodymas, kad striatopallidiniai ir striatonigriniai neuronai vaidina svarbų ir priešingą vaidmenį reguliuojant nuo narkotikų patirties priklausomą elgesį;. Be to, neuronų slopinimo poveikio ūminiam lokomotoriniam atsakui į amfetaminą trūkumas suteikia papildomų įrodymų, kad mechanizmai, reguliuojanti ūminį atsaką į vaistus, skiriasi nuo tų, kurie moduliuoja ilgalaikius prisitaikymus, atsirandančius pakartotinai veikiant vaistui. Galiausiai, susiejant fenotipinius specifinius virusinius vektorius su dizainerio receptoriais, galinčiais pakeisti neuroninį aktyvumą, nenutraukiant ląstelių funkcijos, atsiranda naujas ir galingas metodas priklausomybės molekulinio pagrindo dekonstrukcijai.

Padėka

Šis darbas buvo paremtas NIH stipendijomis K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 ir T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 ir F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 DA023206 (YD), U19MH82441 ir NIMH-PDSP (BLR ) ir R21 DA021273 (JFN), pasiekimų apdovanojimai koledžo mokslininkams (DE) ir „NARSAD Distinguished Investigator Award“ (BLR)

Išnašos

Konkuruojančių interesų pareiškimas

Autoriai pareiškia, kad jie neturi konkuruojančių finansinių interesų.

Nuorodos

1. Berke JD, Hyman SE. Neuronas. 2000: 25: 515 – 532. [PubMed]
2. Neslter EJ. Nat Rev Neurosci. 2001: 2: 119 – 128. [PubMed]
3. Robinson TE, Berridge KC. Priklausomybė. 2001: 96: 103 – 114. [PubMed]
4. Smith Y, Bevan MD, Shink E, Bolam JP. Neurologija. 1998: 86: 353 – 387. [PubMed]
5. Shen W, Flajolet M, Greengard P, Surmeier DJ. Mokslas. 2008: 321: 848 – 851. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
6. Durieux PF ir kt. Nat Neurosci. 2009: 12: 393 – 395. [PubMed]
7. Conklin BR ir kt. Nat metodai. 2008: 5: 673 – 678. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
8. Alexander GM, et al. Neuronas. 2009: 63: 27 – 39. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
9. Armbruster BN, Li X, Pausch MJ, Herlitze S, Roth BL. Proc Natl Acad Sci USA. 2007: 104: 5163 – 5168. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
10. Choi KH et al. Ann NY Acad Sci. 2003: 1003: 372 – 374. [PubMed]
11. Clark JJ, et al. Nat metodai. 2010: 7: 126 – 129. [PMC nemokamas straipsnis] [PubMed]
12. Harlan RE, Garcia MM. Mol Neurobiol. 1998: 16: 221 – 267. [PubMed]
13. Badiani A, Oates MM, diena HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Behav Brain Res. 1999: 103: 203 – 209. [PubMed]
14. Hyman SE, Malenka RC. Nat Rev Neurosci. 2001: 2: 695 – 703. [PubMed]