Nat Neurosci. 2011 m. sausio mėn.; 14(1): 22–24.
Paskelbta internete 2010 m. gruodžio 5 d. doi: 10.1038 / nn.2703
Abstraktus
Nugarinis striatumas vaidina svarbų vaidmenį vystantis priklausomybei nuo narkotikų; tačiau tikslus vaidmenų supratimas striatopallidalinis (netiesioginis) ir striatonigralis (tiesioginis) kelias neuronai, reguliuojantys elgesį, lieka sunkiai suprantami.
Naudojant naują metodą, kuris priklauso nuo virusų sukeltos inžinerijos GPCR (hM4D), mes parodėme, kad hM aktyvacija4D receptoriai su klozapinuN-oksidas (CNO) stipriai sumažino striatalinio neurono jaudrumą. Kai hM4D receptoriai buvo selektyviai ekspresuojami tiesioginio arba netiesioginio kelio neuronuose žiurkėms, CNO nepakeitė ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą, bet pakeitė elgesio plastiškumą, susijusį su pakartotiniu gydymu vaistais. Tiksliau, laikinai sutrikdantis striatopallidalinį neuronų aktyvumą palengvino elgesio jautrinimą, o mažėjantis striatonigrinių neuronų jaudrumas sumažino jo išlikimą. Šios išvados rodo, kad ūmus vaistų poveikis gali būti išanalizuotas iš elgesio adaptacijų, susijusių su pakartotiniu vaistų poveikiu, ir pabrėžia šio metodo naudą dekonstruojant neuronų kelio indėlį į elgesį, pvz., Įjautrinimą.
Nepaisant didžiulių neigiamų narkomanijos pasekmių, psichostimuliatorių vartojimas ir piktnaudžiavimas tebėra paplitęs. Perėjimas nuo pradinio vaisto poveikio iki reguliaraus vartojimo ir galiausiai prie kompulsyvaus, įprasto elgesio ir slopinančios kontrolės praradimo apima daugybę molekulinių adaptacijų atskirose neuroschemose.1,2,3. Striatumas buvo nustatytas kaip pagrindinė daugelio elgesio ir neurobiologinių adaptacijų vieta, kuri, kaip manoma, sudaro pagrindinius procesus, kurie tarpininkauja priklausomybei.1,2,3. Dauguma striatum esančių neuronų (~ 95%) yra GABAerginiai vidutinio dydžio projekciniai neuronai (MSN) tkepurės skiriasi savo neuropeptidų ekspresija ir sudaro du pagrindinius eferentinius kelius4.
- Striatopallidaliniuose MSN yra enkefalino (ENK) ir jie sudaro netiesioginį kelią
- kadangi striatonigriniuose MSN yra dinorfino (DYN) ir medžiagos P ir jie sudaro tiesioginį kelią.
Daugelis konceptualių modelių kelia hipotezę, kad šios MSN populiacijos prieštarauja viena kitai tiek mechaniškai, tiek funkciniu požiūriu.5,6. Tačiau yra mažai empirinių įrodymų, patvirtinančių skirtingą jų vaidmenį kontroliuojant elgesį, nes šios ląstelių populiacijos yra fiziškai susimaišiusios ir morfologiškai nesiskiriančios, todėl selektyvus manipuliavimas techniškai sunkiai įmanomas.
Norėdami ištirti šių striatalinių ląstelių populiacijų vaidmenį vystant elgesį, atsirandantį po pakartotinio piktnaudžiavimo narkotikais, sujungėme dvi naujas strategijas: virusinius vektorius, kurie naudoja ENK arba DYN geno promotorius, kad nukreiptų transgeno ekspresiją į striatopallidinius arba striatonigrinius neuronus. , atitinkamai, ir sukonstruotas GPCR (Gi / oprijungtas žmogaus muskarinas M4 DREADD; Dizainerinis receptorius, suaktyvintas išskirtinai dizainerio preparato; hM4D)7 kurį aktyvuoja kitaip farmakologiškai inertiškas ligandas, klozapinas.N-oksidas8,9 (CNO; 1a pav., h). Po ekspresijos kultivuotuose neuronuose CNO vartojimas stimuliuoja Gi / o-sujungtas hM4D receptoriai aktyvuoja į vidų rektifikuojančius kalio 3 (Kir3) kanalus, dėl kurių atsiranda membranos hiperpoliarizacija ir trumpalaikis neuronų nutildymas9.
Norėdami patikrinti virusinių vektorių ląstelių fenotipo specifiškumą, naudojome dvigubo žymėjimo imunofluorescencinę mikroskopiją po virusų infuzijos į nugaros striatumą (Papildomas pav. 1), kurie išreiškia hemagliutininu pažymėtą hM4D receptoriai, kuriuos kontroliuoja arba ENK promotorius (pENK-hM4D) arba DYN promotorius (pDYN-hM4D). Mes nustatėme, kad pENK-hM4D ekspresija pirmiausia buvo ENK turinčiose MSN (90% hemagliutinino ląstelių buvo ENK+, 85 iš 94; 6% hemagliutinino ląstelių buvo medžiaga P+, 4 iš 70 ląstelių; 1b) tuo tarpu pDYN-hM4D ekspresija pirmiausia buvo medžiagos P turinčiose MSN (95 % hemagliutinino ląstelių buvo medžiaga P+, 109 iš 115 ląstelių; 5 % hemagliutinino ląstelių buvo ENK+, 5 iš 97 ląstelių; 1i). Panašūs rezultatai buvo gauti po promotoriui būdingų virusų, kurie ekspresuoja žalią fluorescencinį baltymą, infuzijos (pENK-GFP ir pDYN-GFP; Papildomi pav. 2a ir 3a).
Atsižvelgiant į tai, kad striatopallidaliniai MSN pirmiausia projektuojasi į išorinį globus pallidus (GPe), o striatonigraliniai MSN pirmiausia projektuoja į substantia nigra pars reticulata (SNpr), mes panaudojome retrogradinio žymeklio Fluoro-Gold injekcijas į šias smegenų sritis, po kurių buvo atlikta dviguba fluorescencinė imunohistochemija. patvirtinti, kad pENK ir pDYN virusai sukėlė specifinę infekciją. Pastebėjome, kad pENK-GFP ląstelės, lokalizuotos kartu su striataline Fluoro-Gold ekspresija po infuzijos į GPe, bet ne į SNpr (Papildomas 2b pav) tuo tarpu pDYN-GFP ląstelės, lokalizuotos kartu su striataline Fluoro-Gold ekspresija po infuzijos į SNpr, bet ne į GPe (Papildomas 3b pav). Virusinių vektorių ekspresija nepakeitė ENK+ arba substancijos P+ neuronų skaičiaus virusinės infekcijos srityje, o tai rodo, kad šių promotorių naudojimas viruso sukeltam genų perdavimui netrukdė endogeninių neuropeptidų lygiams. Visi šie rezultatai rodo, kad pENK ir pDYN virusiniai vektoriai išreiškia genus tinkamai atskirtose striatalinių ląstelių populiacijose.
Nors hM4Įrodyta, kad D receptoriais pagrįsti metodai moduliuoja kitų neuronų tipų aktyvumą9, jų gebėjimas paveikti striatalinius neuronus nebuvo ištirtas. Todėl hM užkrėtėme striatalinius vidutinio dydžio neuronus4D receptoriai, kuriuos kontroliuoja herpes simplex viruso (HSV) promotorius, po dviejų dienų paruošė vainikinius nugaros striatumo pjūvius ir ištyrė, kaip hM4D ekspresuojantys vidutinio dygliuoto striato neuronai reaguoja į CNO. Pastebėjome, kad vietinis CNO taikymas (10 μM) sukėlė membranos potencialo hiperpoliarizaciją (~7 mV, bazinis membranos potencialas buvo pakoreguotas iki -80 mV); 1c) ir sumažino neuronų įvesties atsparumą po CNO taikymo (1d pav., e), o tai rodo, kad kalio laidumą (ty Kir3 tarpininkaujamą srovę) suaktyvina CNO hM4D receptorius ekspresuojantys neuronai. Be to, CNO perfuzija žymiai sumažino sukeltų veikimo potencialų skaičių hM4D ekspresuojančiuose neuronuose, bet ne kontrolinėse ląstelėse, tokiu būdu veiksmingai slopinant virusu užkrėstų neuronų funkcinę išeigą hM ekspresija4Vien D receptoriai nepakeitė įvesties pasipriešinimo (P = 0.84) arba veikimo potencialo šaudymas (P = 0.64). (1f pav., g). Visi šie duomenys rodo, kad panašiai kaip ir hipokampo neuronai9, hM4D / CNO pagrįstas metodas gali veiksmingai sumažinti žiurkių striatalinių neuronų jaudrumą.
Kaip papildomą koncepcijos įrodymą išbandėme, ar hM4D receptoriai blokuotų neurotransmisiją gerai nusistovėjusioje grandinėje, kur nervinį aktyvumą nuspėjamai sukelia elgsenai svarbūs dirgikliai. Atitinkamai, mes užkrėtėme ventralinės tegmentinės srities (VTA) neuronus hM4D receptoriai, kuriuos kontroliuoja HSV promotorius, kuris stipriai ekspresuoja dopamino neuronuose10ir naudojo greito nuskaitymo ciklinę voltammetriją, kad išmatuotų dopamino išsiskyrimo pokyčius branduolyje po netikėto maisto atlygio.11. CNO vartojimas žymiai sumažino maisto granulių sukeltą dopamino išsiskyrimą branduolyje, palyginti su nešikliu (Papildomas pav. 4). Galiausiai išbandėme, ar mažėja specifinių neuronų ląstelių tipų aktyvumas striatumoje in vivo gali pakeisti amfetamino gebėjimą stimuliuoti Fos ekspresiją. Psichostimuliatoriai, tokie kaip amfetaminas, yra stiprūs c-fos striatumoje12 ir padidės c-fos tiek striatonigriniuose, tiek striatopallidaliniuose neuronuose mūsų eksperimentinėmis sąlygomis13. Be to, kad jis naudojamas kaip neuronų aktyvumo žymeklis, psichostimuliatorius sukelia c-fos Manoma, kad jis vaidina svarbų vaidmenį inicijuojant ir palaikant neuronų adaptacijas, susijusias su psichomotoriniu jautrumu1,14. Mes nustatėme, kad CNO sukeltas pENK-hM4D receptoriai žymiai sumažino bendrą amfetamino sukeltų c-Fos ląstelių skaičių juostoje.1k pav ir Papildomas pav. 5a). Šis sumažėjimas įvyko abiejuose hemagliutininui teigiamuose neuronuose (ty tuose, kurie ekspresuoja hM4D receptoriai) ir hemagliutininui neigiami neuronai (ty tie, kurie neišreiškia hM4D receptoriai; 1l pav), rodantis neuronų kryžminio pokalbio efektą tarp hM4D ekspresuojantys neuronai ir neužkrėsti neuronai. Taip pat pastebėtas reikšmingas bendro amfetamino sukeltų c-Fos ląstelių skaičiaus ir hemagliutininui teigiamų c-Fos ląstelių skaičiaus sumažėjimas, kai hM4D receptoriai buvo aktyvuoti tiesioginio kelio neuronuose (1n pav., o ir Papildomas 5b pav). Svarbu tai, kad šiuos efektus sukelia ne tik virusinė naujo receptoriaus ekspresija, nes bet kurio pENK-hM4D arba pDYN-hM4D receptoriai, negydant CNO, neturėjo įtakos amfetamino sukeltų Fos ląstelių skaičiui (Papildomi Fig. 6 ir 7). Taigi šie radiniai rodo, kad CNO sukeltas hM aktyvavimas4D receptoriai taip pat gali sumažinti neuronų aktyvumą, mažindami neurotransmiterių išsiskyrimą ir susilpnindami tarpląstelinį signalizavimą.
Pakartotinis priklausomybę sukeliančių narkotikų poveikis gali sukelti laipsnišką ir nuolatinį elgesio reagavimo padidėjimą, dažnai vadinamą elgesio jautrumu. Svarbu tai, kad jautrinimas apima kai kurias tas pačias nervų grandines, susijusias su žmogaus priklausomybės nuo narkotikų vystymusi.3. Čia mes naudojame savo naujus įrankius, kad ištirtume grandinės specifinio striatalinio neurono aktyvumo slopinimo poveikį amfetamino jautrinimo vystymuisi. Mes iškėlėme hipotezę, kad tiesioginio ir netiesioginio kelio neuronai atlieka priešingą vaidmenį, kai striatonigriniai neuronai skatina jautrinimą, o striatopallidaliniai neuronai slopina jautrumą, atitinkančius jų konceptualiai siūlomus vaidmenis atitinkamai aktyvuojant ir slopinant elgesį.5,6. Atitinkamai, mes išbandėme, ar biochemiškai mažėjantis striatopallidalinių neuronų neuronų jaudrumas sukeltų jautrumą amfetamino dozavimo režimui, kuris sukelia jautrumo slenkstinį lygį, ir ar sumažėjęs striatonigrinių neuronų neuronų jaudrumas užkirs kelią jautrumui protokole, kuris normaliai sukelia jautrumą.
Pirmajame tyrime taikėme gydymo režimą, kuris sukelia slenkstinį lokomotorinio jautrumo lygį GFP kontrolėje (keturios vaistų ekspozicijos). Pasibaigus išlaukos laikotarpiui, nesant CNO sukelto neuronų aktyvumo susilpnėjimo, buvo sušvirkšta vidutinė amfetamino dozė (2 mg/kg), siekiant nustatyti, ar jautrinimas buvo nuolatinis. CNO sukeltas pENK-hM4D receptoriai gydymo amfetaminu metu nepakeitė ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą (2a). Tačiau CNO sukeltas neuronų aktyvumo sutrikimas netiesioginio kelio neuronuose palengvino žymiai stipresnio jautrinimo išsivystymą, palyginti su GFP kontrolėmis.2b). Šis jautrumo padidėjimas buvo išlaikytas atliekant amfetamino iššūkį, kuris buvo atliktas po savaitės, kai nebuvo gydymo CNO (2c pav., d). Šie poveikiai gali būti siejami su nuo CNO priklausomu hM striatopallidalinių neuronų aktyvumo sumažėjimu4D receptorių, nes hM4D receptorių ekspresija be gydymo CNO nesukelia lokomotorinio jautrumo šiam švelniam amfetamino dozavimo režimui (Papildomas pav. 6).
Siekdami nustatyti, ar striatonigriniai neuronai gali priešingai reguliuoti reagavimą į vaistus, mes ištyrėme biochemiškai mažėjančio striatonigrinių neuronų jaudrumą dorsomedialiniame striatum gydymo amfetaminu režimu, kuris sukelia stiprų jautrumą GFP kontrolei (šešis vaistų poveikis). ), taip pat vartojant mažą amfetamino dozę (0.5 mg/kg), nesant receptorių sukelto neuronų veiklos sutrikimo. Kaip ir netiesioginio kelio slopinimo atveju, CNO sukeltas tiesioginio kelio neuronų jaudrumo sumažėjimas gydymo amfetaminu metu nepakeitė ūminio lokomotorinio atsako į amfetaminą.2e). Nors jautrumo vystymasis atrodė panašus į GFP kontrolę po CNO sukeltos pDYN-hM4D receptoriai gydymo fazės metu (2f), jautrinimas neišliko pDYN-hM4D grupėje, bet vis tiek buvo tvirtai išlaikytas GFP kontrolėje (2g pav., h). Šis poveikis taip pat gali būti siejamas su nuo CNO priklausomu striatonigrinių neuronų aktyvumo sumažėjimu hM.4D receptorių, nes hM4D receptorių ekspresija, jei nebuvo gydymo CNO, neblokavo lokomotorinio jautrumo išsivystymo, nes jautrinimas buvo pastebėtas gydymo fazės metu ir vartojant vaistą.Papildomas pav. 7). Šie duomenys rodo, kad striatonigriniai neuronai gali būti ypač svarbūs reguliuojant ilgalaikes elgesio adaptacijas, kurios yra pakartotinio narkotikų vartojimo pasekmė.
Apibendrinant galima pasakyti, kad šie duomenys yra pirmasis įrodymas, kad striatopallidaliniai ir striatonigriniai neuronai yra svarbūs ir priešingi, reguliuojant nuo narkotikų vartojimo patirties priklausomą elgesio plastiškumą.. Be to, tai, kad neuronų slopinimas neturi įtakos ūminiam lokomotoriniam atsakui į amfetaminą, suteikia papildomų įrodymų, kad mechanizmai, reguliuojantys ūminį atsaką į vaistus, skiriasi nuo tų, kurie moduliuoja ilgalaikes adaptacijas, atsirandančias pakartotinai vartojant vaistą. Galiausiai, fenotipinių specifinių virusinių vektorių sujungimas su dizainerių receptoriais, galinčiais pakeisti neuronų aktyvumą, visam laikui netrikdant ląstelių funkcijos, yra naujas ir galingas būdas dekonstruoti priklausomybės molekulinį pagrindą.
Padėka
Šis darbas buvo paremtas NIH dotacijomis K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 ir T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 ir F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 023206H19 NPD BLR ) ir R82441 DA21 (JFN), apdovanojimas už pasiekimus kolegijos mokslininkams (DE) ir NARSAD išskirtinio tyrėjo apdovanojimas (BLR).
Išnašos
Konkuruojančių interesų pareiškimas
Autoriai pareiškia, kad jie neturi konkuruojančių finansinių interesų.
Nuorodos
;