Pratimai padidina dopamino D2 receptorių pelės modelį Parkinsono liga In vivo vaizdavimas su (18F) fallypride (2010)

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti dopamino D2 receptorių (DA-D2R) ekspresijos pokyčius MPTP pelių bazinėse gangliose, kurioms buvo taikomas intensyvus važiavimo takas. Naudojant Vakarų imunoblotinę sinaptoneurosomų analizę. \ T in vivo pozitrono emisijos tomografijos (PET) vaizdavimas naudojant DA-D2R specifinį ligandą [¹⁸F] fallypride, mes nustatėme, kad didelio intensyvumo važinėjimo treniruotė paskatino striatų DA-D2R ekspresiją, kuri buvo ryškiausia MPTP, lyginant su gydomomis druskomis. DA-D2R dopamino išeikvotų bazinių ganglijų fizinio aktyvumo pokyčiai atitinka potencialų šio receptoriaus vaidmenį moduliuojančių vidutinio spyglių neuronų (MSN) funkcijoje ir elgsenos atkūrime. Svarbu tai, kad šio tyrimo rezultatai patvirtina PET vaizdavimo naudojant [¹⁸F] fallypride tirti DA-D2R pokyčius asmenims, sergantiems Parkinsono liga (PD), kuriems atliekamas intensyvus treniruoklių mokymas.

Gyvūnai, gydymo grupės ir MPTP administracija

Vyriškos C57BL / 6 pelės 8 savaitės (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) buvo grupuojamos į temperatūrą kontroliuojamoje patalpoje, esant 12 h šviesai / 12 h tamsiam ciklui. Visos procedūros buvo atliktos pagal USI IACUC patvirtintą laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą. Iš viso 164 pelėms buvo naudojamos keturios gydymo grupės: (1) fiziologinis tirpalas (n = 42), (2) fiziologinis tirpalas ir pratimas (n = 55), (3) MPTP (n = 57) ir (4) MPTP plius pratimas (n = 42). Sužalojimui pelės gavo keturias intraperitonines 20 mg / kg MPTP (laisvos bazės; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) injekcijas, ištirpintas 0.9% fiziologiniame tirpale, 2-h intervalais arba keturias intraperitonines 0.1 ml 0.9% NaCl injekcijas. kaip kontrolė. Pažeidimą patvirtino striatrijos dopamino lygių HPLC analizė. Vartojant 10 dienas po MPTP, MPTP pelėms (82.2 ± 48.0 ng / mg baltymų) buvo sumažėjęs 8.4% dopamino kiekis (269.5 ± 24.9 ng / mg baltymų). Tyrimo pabaigoje reikšmingų skirtumų tarp stropinės dopamino koncentracijos tarp MPTP plius pratybų pelių (69.8 ± 11.7 ng / mg baltymų) nebuvo, palyginti su MPTP (77.9 ± 12.0 ng / mg baltymų). Tačiau, palyginti su fiziologiniu tirpalu (315.2 ± 9.0 ng / mg baltymų), fiziologinio tirpalo plius treniruočių pelėse (246.9 ± 19.8 ng / mg baltymų) reikšmingai padidėjo striatalo dopamino kiekis.F_(3,16) = 7.78; P <0.05).

Bėgimo takelio pratimas

Pratimai prasidėjo 5 dienas po pažeidimo. Dviejų treniruočių grupių pelės (fiziologinis tirpalas ir fizinis krūvis, MPTP plius pratimas) buvo apmokytos važiuoti 100 cm varikliu (Exer 6M, Columbus Instruments, OH) 6 savaičių (5 dienų / savaitės) metu. 60 min / day ir 18 – 20 m / min greitis.^5,6

Magnetinio rezonanso tomografija

Su 1-T mikro-MRI sistema (Bruker Biospin, Billerica, MA) buvo gautas pelės smegenų trimatis tūrinis T7 svertinis magnetinio rezonanso (MR) vaizdas. Vaizdo gavimo parametrai buvo: TE = 46.1 ms, TR = 6292.5 ms, 0.4-mm pjūvio storis, 0.45-mm interslice storis, 128 × 128 × 128 matricos dydis.

Radiochemija

[¹⁸F] fallypridas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau, kai tozilo prekursoriaus nukleofilinė pakaitinė reakcija buvo su [¹⁸F] naudojant pagal užsakymą pagamintą radiochemijos aparatą.¹² Gryninimas buvo atliktas atvirkštinės fazės HPLC būdu, naudojant C8 (2) Phenomenex Luna kolonėlę, naudojant judančią fazę acetonitrilo ir natrio fosfato buferiu (55: 45). UV absorbcija buvo matuojama 254 nm ir AUFS 0.05. Radioaktyvusis pikas (sulaikymo laikas 17 min), atitinkantis [¹⁸F] fallypride, surenkamas ir tirpiklis pašalintas rotaciniu garintuvu. Galutinis produktas buvo tiriamas dėl pirogeninio, sterilumo, pH ir organinių tirpiklių pašalinimo dujų chromatografijos būdu. Specifinis aktyvumas ir radiocheminis grynumas buvo įvertintas naudojant Waters HPLC sistemą, naudojant C8 (2) Phenomenex Luna analizę. Specifinis aktyvumas buvo 3,000 – 12,000 Ci / mmol diapazone.

PET matavimai ir vaizdo analizė

PET vaizdavimui buvo naudojamos dvidešimt pelių (n = 6 fiziologinis tirpalas; n = 3 fiziologinis tirpalas ir pratimas; n = 5 MPTP ir n = 6 MPTP plius pratimas). Nuskaitymai buvo gauti naudojant „Concorde microPET R4“ skaitytuvą (CTI Concorde Microsystems, Knoxville, TN) su 60-min sąrašo režimo gavimo protokolu po 20 min. ⁶⁸Ge šaltinis. [¹⁸F] fallypride (10.92 – 11.28 MBq) buvo švirkščiama per uodegos veną (vienkartinį boliusą) išmetimo skenavimo pradžioje. Pelės anestezuotos 2% izofluoranu ir 98% deguonimi. Dinaminio sąrašo režimo duomenys buvo surūšiuoti pagal sinogramas su 26 rėmeliais (6 × 20 sec, 4 × 40 sec, 6 × 1 min ir 10 × 5 min) ir rekonstruoti du OSEM iteracijos (užsakytų pogrupių lūkesčių maksimalizavimas) ir 18 MAP (maksimalus a posteriori) atkūrimo algoritmas.¹⁴ Rekonstruoti vaizdai buvo apkarpyti, kad galvos būtų laikomi ir linijiškai interpoliuojami Z-Direction sukurti 128 × 128 × 63 vaizdą su izotropiniu 0.4 × 0.4 × 0.4 mm³ voxels. Iš rekonstruotų dinamiškų vaizdų, naudojant daugiašalius audinių etaloninius modelius, buvo apskaičiuoti striatumo didelio skiriamojo gebos (BP) vaizdai.¹⁵ ir „Logan“ sklypai¹⁶ didelis aktyvumas striatume ir labai mažas aktyvumas smegenėlių (referenciniame regione). Anatominiai regionai (striatum ir cerebellum) abiejuose pusrutuliuose buvo rankiniu būdu apibrėžti PET vaizduose, kurie buvo registruoti MRI naudojant „Rview“ (versija 8.21Beta).¹⁷ [¹⁸F] fallypride pelės striatume buvo atlikta naudojant BP vertę, kuri suteikia specifinio / nespecifinio surišimo santykio pusiausvyroje santykį.^18,19 Norint įrodyti, kad striatume yra specifinis specifiškumas, keturios pelės buvo surenkamos 60 min po ligandinės injekcijos, smegenys greitai užšaldytos skystame azoto sluoksnyje, suskirstytos į 30-μm storį ir sekcijos, prijungtos prie fosfotografo (Typhoon 9200, GE Healthcare Inc., Piscataway , NJ) (Pav 1). Tyrimai parodė, kad [¹⁸F] fallypridas specifiškai prisijungia prie DA-D2R, ir kaip labai mažai DA-D3R yra striatume, rišimas rodo DA-D2R užimamą.^9,10,12,13

 

Fig. 1

[¹⁸F] Fallypride rodo aukštą pelės striatumo specifiškumą. Kairiajame skydelyje pateikiama anatominė koronato sekcija apytiksliai bregma 0.20. Dešiniajame skydelyje rodomas reprezentatyvus autoradiografas su intensyviu ženklinimu ...

Audinių surinkimas HPLC ir baltymų analizei

Tyrimo pabaigoje smegenys buvo greitai pašalintos ir nugaros striatumas išpjaustytas šviežia, atitinkančia anatominius regionus nuo bregmos 1.2 iki 0.6 su korpuso skrituliu kaip nugaros riba, šoninis korpuso skersmens aspektas kaip šoninė siena ir virš priekinės komisijos. ventralinė riba.²⁰

Dopamino ir jo metabolitų HPLC analizė

Dopamino koncentracijos striatų homogenizuose (n = 4 vienoje grupėje) buvo nustatytos HPLC su elektrocheminiu nustatymu.⁶ Sistemą sudarė ESA automatinis mėginių ėmiklis (ESA, Chelmsford, MA), turintis 150 × 3.2 mm atvirkštinės fazės C-18 kolonėlę (3μm skersmuo) ir CoulArray 5600A (ESA, Chelmsford, MA), įrengtas keturiais - kanalų analizės elementas su potencialais, nustatytais –75, 50, 220 ir 350 mV.

Vakarų imunoblotinė analizė

Mokslinis poveikis DA-D1R ir DA-D2R sinaptinei ekspresijai buvo analizuojamas sinaptoneurosomų preparatuose, pagamintuose iš aštuonių dorsolaterinių striatumų.²¹ Ši procedūra buvo atlikta trims pelių grupėms iš viso 24 pelių per eksperimentinę grupę (n = 3 preparatai grupėje). Santykinė baltymų ekspresija DA-D1R (~ 50 kDa), DA-D2R (~ 50 kDa), tirozino hidroksilazės (58 kDa), dopamino transporterio (68 kDa) ir α-tubulino (50 kDa) (kaip pakrovimo kontrolės) atveju buvo analizuojami Vakarų imunoblotu²² naudojant komerciškai prieinamus pirminius antikūnus (triušio polikloninius ir pelės monokloninius antikūnus, Millipore, Temecula, CA). Baltymų juostos buvo vizualizuotos afininiu būdu išgrynintomis ožkų anti-triušio arba anti-pelės antriniais antikūnais, prijungtais prie IRDye₆₈₀ arba IRDye₈₀₀ (Rockland, Gilbertsville, PA). Fluorescentinis signalas buvo aptiktas skenuojant filtrą LI-COR Odyssey netoli infraraudonųjų spindulių vaizdo platformos ir kiekybiškai įvertintas naudojant „Odyssey 2.1“ programinę įrangą (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE). Rezultatai rodomi kaip santykiniai ekspresijos lygiai, lyginant su fiziologiniu tirpalu (nustatyta 100%).

Statistinė analizė

Skirtumai tarp [BP] grupių¹⁸F] fallypride, DA-D1R ir DA-D2R baltymų kiekiai buvo analizuojami naudojant dvipusę dispersijos analizę (ANOVA), gydant tarp subjekto faktoriaus (fiziologinio tirpalo ir MPTP), ir fizinį krūvį, kaip ir tiriamojo faktoriaus (be pratimų prieš pratimas). Maksimaliam važiuojamosios dalies važiavimo greičio bandymui buvo naudojamas laikas tarp dalyko faktoriaus (1, 2 ir kt.) Ir gydymas buvo naudojamas kaip tiriamojo faktoriaus (fiziologinio tirpalo ir MPTP). Bonferroni post hoc testas buvo naudojamas daugkartiniams palyginimams ištaisyti, įvertinant dominančią reikšmę. Nustatytas reikšmingumo lygis P <0.05. Norint ištirti praktinę grupių skirtumų reikšmę, buvo apskaičiuotas skirtumų tarp grupių dydis, naudojant efekto dydį (ES) (ES = Vidutinis_{Grupė 1} - vidurkis_{Grupė 2}/ SD_sujungtas). ES atspindi gydymo poveikį dominančiai populiacijai ir pagal nustatytus kriterijus pateikiama kaip maža (<0.41), vidutinė (0.41–0.70) arba didelė (> 0.70).²³ Analizė atlikta naudojant „Prism5 for Windows“ (GraphPad, San Diego, CA).

Didelio intensyvumo bėgimo takelis MPPV pažeidimų turinčiose pelėse veikia geriau

Prieš MPTP pažeidimą ir treniruotės pradžią vidutinės visų pelių pradinių greičių dvi pratimų grupės buvo panašios (fiziologinis tirpalas ir pratimas: 11.7 ± 1.1 m / min ir MPTP plius pratimas: 11.2 ± 1.1 m / min). Dienos pratimai 6 savaitėms pagerino maksimalų važiavimo tako greitį abiejose pratybų grupėse su fiziologiniu tirpalu ir pratybų pelėmis, rodančiomis žymiai didesnį maksimalų greitį, palyginti su MPTP pliuso pratybų pelėmis per 1 per savaitę 4 (Pav 2). Tačiau MPTP plius mankštos pelės buvo panašios maksimalios važiuojamosios dalies važiavimo greičio, lyginant su fiziologiniu tirpalu ir pratybų pelėmis, 5 savaitę (MPTP plius pratimas: 17.2 ± 3.6 m / min ir fiziologinis tirpalas ir pratimas: 22.0 ± 1.5 m / min) ir savaitę 6 (19.2 ± 1.2 m / min ir 22.2 ± 0.9 m / min). Kaip pranešta anksčiau, MPTP pažeistos pelės, kurioms nebuvo treniruočių treniruočių treniruotės, parodė, kad 7.0 savaitės treniruočių laikotarpio pabaigoje jų greitis 0.3 ± 6 m / min nebuvo spontaniškas.⁵

 

Fig. 2

Pratimai pagerina variklio elgesį MPTP pele. Kiekvienos savaitės pabaigoje buvo išbandytas maksimalus druskos tirpalo (n = 12) ir MPTP (n = 12) pelių greitis motorinėje važiavimo kelyje. Pradiniai bėgimo tako greičiai buvo matuojami prieš MPTP pažeidimą. ...

Didelio intensyvumo važinėjimo pratimas padidino striatalų DA-D2R, bet ne DA-D1R baltymą

Didelio intensyvumo važinėjimo treniruotės skirtingai paveikė DA-D2R ir DA-D1R koncentracijas sinaptoneurosominiuose preparatuose iš nugaros striatumo, kaip parodė Western blot analizė (Pav 3). MPTP plius treniruočių pelės padidino striatų DA-D48.8R 2%, lyginant su MPTP pelėmis (3B) ir reikšmingą sąveiką tarp pratimų ir MPTP pažeidimų su DA-D2R baltymų kiekiu (\ tF_(1,8) = 6.0; P <0.05). Ir atvirkščiai, DA-D1R baltymų lygiui tarp grupių nebuvo jokio poveikio (3A; F_(1,8) = 0.1, P = 0.78). Vien tik MPTP pažeidimas reikšmingai nekeičia DA-D2R (F_(1,8) = 0.0; P = 0.88) arba DA-D1R išraiška (F_(1,8) = 0.0; P = 0.92). Be to, du skirtingi vidutinio smegenų dopaminerginių pluoštų vientisumo baltymai, tirozino hidroksilazė (TH; 3C) ir dopamino transporteris (DAT; 3D pav), parodė, kad MPTP žymiai sumažino striatalinį TH baltymą (\ tF_(1,8) = 757.3; P <0.05) ir DAT išraiška (F_(1,8) = 218.0; P <0.05).

 

Fig. 3

Pratimai selektyviai reguliuoja DA-D2R, bet ne DA-D1R striatalų baltymą. Skydas (A) rodo Vakarų imunoblotinę sinaptoneurosomų preparatų analizę iš DA-D1R baltymo nugaros striatumo. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp ...

Didelio intensyvumo bėgimo takelio pratimas padidino striatūrą [¹⁸F] Fallypride įrišimo potencialas (BP)

Nors Vakarų imunoblotinė receptorių baltymų ekspresijos analizė matavo bendrą antikūnų epitopų (tiek paviršinių, tiek vidinių ląstelių parduotuvių), in vivo PET vaizdavimas su didelio afiniteto DA-D2R specifiniu radioligandu [¹⁸F] fallypride gali apibūdinti fizinio krūvio poveikį prieinamumui DA-D2R surišti ligandą (Pav 4). Statistinė analizė parodė, kad buvo reikšmingas pratybų poveikis (F_(1,16) = 12.3; P <0.05), taip pat MPTP pažeidimas (F_(1,16) = 160.3; P <0.05) be reikšmingos sąveikos tarp MPTP ir fizinio krūvio (F_(1,16) = 3.5; P = 0.07) į [¹⁸F] fallypride BP. Bonferroni post hoc analizė parodė reikšmingą BP reikšmių skirtumą tarp MPTP ir MPTP plius pratybų pelių (t = 1.1, Df = 1, 16; P <0.01), o reikšmingo skirtumo tarp fiziologinio tirpalo ir fiziologinio tirpalo bei fizinių pratimų pelių nėra (t = 4.1, Df = 1, 16; P > 0.05). Konkrečiai, MPTP plius pratimų pelėms 73.1% padidėjo [¹⁸F] fallypride BP, palyginti su MPTP pelėmis (MPTP plius pratimų vidutinės BP vertės: 7.1 ± 0.7; MPTP pelių vidutinės BP vertės: 4.1 ± 0.3) (4B). Be to, fiziologinio tirpalo ir pratimų pelėms 8.2% padidėjo [¹⁸F] fallypride BP (13.2 ± 1.0), lyginant su pelių (12.2 ± 0.3) druskos tirpalu. Remiantis šiais duomenimis, „efekto dydžio“ skaičiavimai atskleidė didesnį pratybų efektą tarp MPTP grupių (ES = 2.61), nei nustatyta tarp druskingo tirpalo grupių (ES = 0.94).

 

Fig. 4

Pratimai pasirinktinai didėja [¹⁸F] fallypride surišimo potencialas (BP) pelių MPTP striatume. Skydas (A) rodo [¹⁸F] fallypride BP reprezentatyvius vaizdus koronoje (kairėje pusėje) ir horizontalioje padėtyje (dešinėje pusėje). Skalės juosta ...

Šis darbas buvo paremtas USC CTSI visos bandomosios dotacijos programos dotacija ir dosniais fondais iš Parkinsono ligos fondo, komandos „Parkinson“ (Los Andželas), Parkinsono aljanso, Whittier Parkinsono ligos švietimo grupės, NINDS RO1 NS44327-1, NIA ( AG 21937) ir JAV armijos NETRP W81XWH-04-1-0444. MGV yra gavusi USC Neuroscience Graduate Program Merit stipendiją. Norime padėkoti Ryan Parkui ir dr. Peteriui Conti iš USC mažų gyvūnų vaizdavimo branduolių, kad padėtų su mikro-PET vaizdavimu ir dr. Norėtume padėkoti Yi-Hsuanui (Lilianui) už pagalbą, susijusią su treniruočių treniruotėmis, ir Avery Abernathy dėl savo patirties HPLC analizėje. Dėkojame USC Parkinsono ligos tyrimų grupės draugams, įskaitant Džordžą ir Marylou Boonę, Walterį ir Susaną Donigerą bei Roberto Gonzalesą už jų turtingą paramą.

Galimas interesų konfliktas: nieko nereikia pranešti.

Pastaba pridėta kaip įrodymas: Šis straipsnis buvo paskelbtas internete 19 spalio 2010. Vėliau buvo nustatyta klaida. Šis pranešimas yra įtrauktas į internetines ir spausdintas versijas, kad būtų nurodyta, kad abi jos buvo ištaisytos.

Finansiniai atskleidimai: USC Neuroscience Graduate Program Merit Fellowship (MV), NINDS RO1 NS44327-1 (MV, CW, JW, MJ ir GP), USC CTSI piloto bandomųjų programų programa (QL, AN, MJ, GP).