DeltaFosB netieši regulē Cck veicinātāja darbību (2010)

Brain Res. 2010 maijs 6; 1329: 10 – 20.

Publicēts tiešsaistē 2010 March 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 un Colleen A. McClung2, *

Autora informācija ► Autortiesību un licences informācija ►

Izdevēja galīgā rediģētā šī raksta versija ir pieejama vietnē Smadzenes Res

Skatiet citus PMC rakstus citāts publicēto rakstu.

Iet uz:

Anotācija

Dažas no nozīmīgām bioķīmiskām, strukturālām un uzvedības izmaiņām, ko izraisa hroniska iedarbība uz narkotikām, šķiet, ir starp ļoti stabilas transkripcijas faktora ΔFosB starpniecību. Iepriekšējais darbs ir parādījis, ka ΔFosB pārmērīga ekspresija pelēm 2 nedēļu laikā palielina daudzu gēnu ekspresiju striatumā, no kuriem lielākā daļa vēlāk tiek regulēti pēc ΔFosB ekspresijas 8 nedēļām. Interesanti, ka liels skaits šo gēnu tika regulēti arī pelēm, kas pārmērīgi izpauž transkripcijas faktoru CREB. Tomēr šajā pētījumā nebija skaidrs, vai īstermiņa ΔFosB regulē šos gēnus, izmantojot CREB. Šeit mēs atklājam, ka 2 nedēļas ΔFosB pārmērīga ekspresija palielina CREB izpausmi striatumā, kas izdalās ar 8 nedēļām. Agrīna indukcija ir saistīta ar paaugstinātu CREB saistīšanos ar noteiktiem mērķa gēnu promotoriem šajā smadzeņu reģionā. Pārsteidzoši, viens gēns, kas bija aizdomas par CREB mērķi, pamatojoties uz iepriekšējiem ziņojumiem, holecistokinīns (Cck), CREB nekontrolēja striatumā. Turpināt pētīt. \ T Cck pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas mēs apstiprinājām, ka īstermiņa ΔFosB pārmērīga ekspresija palielina abu Cck veicinātāja aktivitāte un gēnu ekspresija. Tas arī palielina saistošo aktivitāti iespējamā CREB saistīšanās vietā (CRE) Cck veicinātājs. Tomēr, lai gan CRE vieta ir nepieciešama normālai bazālajai izpausmei Cck, tas nav nepieciešams ΔFosB indukcijai Cck. Kopumā šie rezultāti liecina, ka, lai gan īstermiņa ΔFosB indukcija palielina CREB ekspresiju un aktivitāti noteiktos gēnu promotoros, tas nav vienīgais mehānisms, ar kura palīdzību šajos apstākļos gēni tiek regulēti.

atslēgvārdi: kodols accumbens, transkripcija, atkarība

Iet uz:

IEVADS

Hroniska iedarbība uz narkotikām izraisa bioķīmiskas un strukturālas izmaiņas vairākos smadzeņu reģionos. Tiek uzskatīts, ka šīs izmaiņas ir saistītas ar glikozes ekspresijas profilu maiņu mesolimbiskajā sistēmā. Šī sistēma sastāv no dopamīnerģiskiem neironiem, kas no ventrālās tegmentālās zonas (VTA) vidējā smadzenē veido vidējas smailes neironus kodola accumbens (ventrālā striatum), kā arī vairākus citus smadzeņu reģionus. Ir ierosināts mainīt divu transkripcijas faktoru, cAMP atbildes elementa saistošā proteīna (CREB) un ΔFosB (Fos ģimenes olbaltumvielu) aktivitātes, lai mediētu daudzas no bioķīmiskām, strukturālām un uzvedības izmaiņām, kas novērotas ar hronisku iedarbību uz narkotikām ( pārskatīja Nestler, 2005).

CREB ir visuresoši izteikts transkripcijas faktors, kas ir CREB / ATF ģimenes loceklis. CREB homodimeri saistās ar CRE sekvences (konsensa: TGACGTCA) variācijām, kas atrodamas daudzu gēnu promotoros. CREB fosforilāciju (galvenokārt serīna 133 gadījumā, lai gan ir identificētas citas vietas) var stimulēt vairākas signalizācijas kaskādes, tostarp tās, kas atrodas lejup pa dopamīna receptoriem (Cole et al., 1995). Pēc fosforilācijas pie serīna 133, CREB pieņem darbā CREB līdzaktivējošo proteīnu (CBP) vai saistītos proteīnus, kas izraisa gēnu ekspresijas palielināšanos Johannessen et al., 2004). Hroniska opiātu vai psihostimulantu ietekme uz ļaunprātīgu izmantošanu izraisa pārejošu CREB aktivitātes palielināšanos kodolā (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), adaptācija, kas domāta, lai samazinātu šo zāļu atalgojošās īpašības un veicinātu negatīvu emocionālo narkotiku lietošanas pārtraukšanas stāvokli (Nestler, 2005).

Ltiek uzskatīts, ka ļaunprātīgi izmantoto ogļūdeņražu narkotiku pielāgošana daļēji ir osFosB, ļoti stabils FosB splice variants (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos ģimenes locekļi dimerizējas ar Jun ģimenes locekļiem, lai izveidotu aktīvā proteīna 1 (AP-1) kompleksu. AP-1 transkripcijas kompleksi saistās ar AP-1 atbildes elementa variācijām (vienprātība: TGACTCA), lai regulētu transkripciju (pārskatījis Chinenov un Kerppola, 2001). Kaut arī ļaunprātīga iedarbība uz narkotikām izraisa īslaicīgu Fos ģimenes locekļu indukciju (stundās) (kā arī paaugstinātu CREB aktivitāti), atkārtota zāļu iedarbība izraisa ļoti stabilu ΔFosB uzkrāšanos (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), kuras izpausme saglabājas vairākas nedēļas.

Bi-transgēnu pelēm, kas inducējam pārmērīgi ekspresē vai nu ΔFosB, vai CREB pieaugušo striatumā, parādās daudzi bioķīmiskie un uzvedības fenotipi, ko novēro dzīvnieki, kas atkārtoti pakļauti psihostimulantiem vai citām ļaunprātīgas lietošanas vielām. Agēnu ekspresijas izmaiņu nalīze šajos transgēnajos dzīvniekos identificēja daudzus gēnus, ko regulēja ΔFosB īstermiņa (2 nedēļas) pārmērīga ekspresija, izmaiņas, kas saistītas ar vienlaicīgu zāļu atlīdzības samazināšanos. Gēnu ekspresijas un uzvedības reakcijas izmaiņas ar īstermiņa ΔFosB bija ievērojami līdzīgas tām, kas novērotas dzīvniekiem, kas pārspēja CREB 2 vai 8 nedēļas (McClung un Nestler, 2003). Spilgtajā kontrastā ΔFosB ilgstoša pārmērīga ekspresija (8 nedēļas) samazināja daudzu šo pašu gēnu ekspresiju un palielināja zāļu atlīdzību (Kelz et al., 1999; McClung un Nestler, 2003).

Viens šajos pētījumos identificētais gēns ir holecistokinīns (Cck), neiropeptīds, kas iegūts vairākos smadzeņu reģionos, ieskaitot \ tHokfelt et al., 1980). CCK var modulēt dopamīnerģisko transmisiju (Vaccarino, 1992), ir iesaistīts narkotiku atlīdzībā un pastiprināšanā (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), un to izraisa hronisks kokaīns (\ tDing un Mocchetti, 1992). Papildus Cck ir pierādīts, ka promotors reaģē gan uz CREB, gan AP-1 kompleksiem (Haun un Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Tā kā daudzi gēni (ieskaitot Cck), kas parādīja pastiprinātu izteiksmi pēc gan CREB, gan īstermiņa ΔFosB ekspresijas bija zināmi vai aizdomīgi CREB mērķa gēni (McClung un Nestler, 2003), mēs vēlējāmies noteikt, vai īstermiņa ΔFosB izteiksme noved pie šo gēnu regulēšanas (koncentrējoties uz Cck) regulējot CREB vai izmantojot sarežģītākus gēnu regulēšanas mehānismus.

Iet uz:

REZULTĀTI

ΔFosB pārmērīga ekspresija īslaicīgi palielina CREB līmeni

Mēs izmantojām Western blotting, lai noskaidrotu, vai ΔFosB pārmērīga ekspresija palielina CREB proteīnu līmeni peles striatumā. Šajā pētījumā mēs izmantojām bi-transgēnās peles (līnija 11A), kurās ir gan NSE-tTA transgēns, gan TetOp-ΔFosB transgēns. Ja nav doksiciklīna, šīs peles uzrāda strauju ΔFosB ekspresijas pieaugumu dinamometīna pozitīvajos neironos striatumā (Kelz et al., 1999). Šī ΔFosB pārmērīgas ekspresijas metode ir plaši dokumentēta un ļauj noteikt reģionam raksturīgu pārmērīgu ekspresiju, kas ir paralēla ΔFosB indukcijai, ko novēro dzīvniekiem, kuri pakļauti hroniskajam kokaīnam (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Mēs atklājām, ka 11A pelēm, kas pārmērīgi izpaužas ΔFosB, CREB proteīna līmenis pēc 2 izpausmes nedēļām tika ievērojami paaugstināts, un pēc 8 izpausmes nedēļām šie līmeņi atgriezās sākotnējā līmenī.Attēls 1A, n = 8). Lai noteiktu, vai CREB līmeņa izmaiņas ar īstermiņa ΔFosB pārmērīgu ekspresiju varētu atkārtot citā sistēmā, mēs pārejoši pārekspresējām ΔFosB PC12 šūnās un konstatējām, ka CREB līmenis ievērojami palielinājās (p <0.05), salīdzinot ar kontrolgrupām (Attēls 1B, n = 4). Šie rezultāti parāda, ka īstermiņa ΔFosB ekspresija palielina CREB proteīna līmeni.

Skaitlis 1

Skaitlis 1

CREB līmeņi palielinās ar ΔFosB pārmērīgu ekspresiju. Lizātu Western blot analīze (A) peles striata no 11A pelēm no dox 2 vai 8 nedēļām vai (B) PC12 šūnas, kas pārmērīgi ekspressē ΔFosB. Dati A tiek attēloti kā procentuāli mainītie dox rādītāji ...

Gan ΔFosB, gan CREB saistās ar specifisku mērķa gēnu promotoriem striatumā pēc īstermiņa ΔFosB pārmērīgas ekspresijas

Mēs izmantojām Chiat (hromatīna imunoprecipitācijas) testus striatāla audiem, lai noteiktu, vai AFosB vai CREB saistīšanās notika pie noteiktiem mērķa gēnu promotoriem, un ja šī saistība palielinājās pēc īstermiņa ΔFosB pārmērīgas ekspresijas. Mēs analizējām saistošos BDNF un Cck promotori, jo abi gēni ir augsti regulēti pēc īstermiņa ΔFosB pārmērīgas ekspresijas, CREB pārmērīgas ekspresijas vai hroniskas kokaīna terapijas (McClung un Nestler, 2003). Mēs arī analizējām saistošos CDK5 veicinātājs, jo tas ir zināms tiešs ΔFosB mērķis (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Visbeidzot, mēs izmērījām saistošos prodinorfīns jo iepriekšējos pētījumos ir konstatēts, ka to var saistīt gan ΔFosB, gan CREB dažādos apstākļos (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP analīze tika veikta ar striata no 11A pelēm, kas pārmērīgi ekspressēja ΔFosB 2 nedēļām, izmantojot antivielas, kas atpazīst CREB vai ΔFosB. Normālos apstākļos mēs atklājām, ka ΔFosB saistās ar CDK5 un prodinorfīns veicinātājiem, kamēr nav konstatējama saistoša BDNF or Cck veicinātāji (Tabula 1). Turklāt ΔFosB pārmērīga ekspresija palielināja ΔFosB saistīšanos pie CDK5 veicinātājs, bet ne prodinorfīns veicinātājs. Pēc tam mēs izmērījām CREB saistīšanos šajos promotoros un konstatējām, ka CREB saistās ar CDK5, BDNF un prodinorfīns veicinātājiem, bet ne uz Cck normālā striatumā un ka ΔFosB pārmērīga ekspresija 2 nedēļām palielina CREB saistīšanos \ t BDNF un prodinorfīns veicinātājiem, bet ne CDK5 veicinātājs. Kopumā šie rezultāti liecina, ka ΔFosB un CREB var saistīties ar dažiem gēnu promotoriem, piemēram, prodinorfīns un CDK5tomēr CREB saistība ir raksturīga citiem veicinātājiem, piemēram, BDNF. Turklāt FosB pārmērīga ekspresija izraisa AFosB saistīšanās palielināšanos noteiktos promotoros, kā tas būtu sagaidāms, bet arī CREB saistīšanos ar specifiskiem promotoriem, kas atbilst šajā brīdī novērotajai ΔFosB-mediētajai CREB indukcijai.

Tabula 1

Tabula 1

Iespējamo regulējošo proteīnu saistīšanās ar dažādiem promotoriem pelēm, kas pārmērīgi ekspressē ΔFosB divas nedēļas.

Iepriekšējais darbs ir parādījis, ka gēnu ekspresijas izmaiņas, ko izraisa ilgstoša ΔFosB pārmērīga ekspresija, ir saistītas ar hromatīna modifikācijām, jo ​​īpaši histona H3 acetilēšanu specifiskos gēnu promotoros (Kumar et al., 2005). Lai noteiktu, vai tas varētu izraisīt gēnu ekspresijas izmaiņas īsākā termiņā ΔFosB pārmērīga ekspresija, mēs mērījām acetilētā histona H3 saistīšanos (histona modifikāciju, kas saistīta ar transkripcionāli aktīvo hromatīnu) vai metilētu histonu H3 (Lys9, histona modifikācija, kas saistīta ar transkripciju) neaktīvs hromatīns). Mēs noskaidrojām, ka ΔFosB pārmērīga ekspresija 2 nedēļām neizraisīja izmaiņas acetilētā H3 saistīšanā kādā no pētītajiem gēnu promotoriem (Tabula 1). Mēs konstatējām ievērojamu metilētā histona H3 saistīšanās samazināšanos prodinorfīns veicinātājs, bet nav saistošs Cck veicinātājs un nav saistošas ​​izmaiņas CDK5 un BDNF ierosinātāji, kas liek domāt, ka tas nav vispārējs mehānisms, ar kuru ΔFosB īstermiņā regulē gēnu ekspresiju. Mēs bijām pārsteigti un ieinteresēti, ka mēs nekonstatējām atšķirības mūsu ChIP testos, kas varētu radīt pieaugumu Cck mRNS ekspresija 11A pelēm pēc ΔFosB ekspresijas 2 nedēļas un nolēma turpināt šo mehānismu.

Īstermiņa AFosB palielinās Cck izteiksme vairākās sistēmās

Bi-transgēnu 11A peles, kas pārmērīgi ekspressē ΔFosB striatumā, mikroarray raksturojums atklāja, ka Cck ekspresijas līmeņi palielinās pēc 2 nedēļas pārmērīgas ekspresijas un pēc tam pakāpeniski samazinās ar ilgākiem ΔFosB ekspresijas periodiem (Attēls 2A, n = 3). Mēs apstiprinājām šo efektu Cck izmantojot reālā laika PCR atsevišķā dzīvnieku grupā 2 un 8 nedēļās un konstatēja, ka rezultāti divos laika punktos ir līdzīgi mikroarray analīzei (dati nav parādīti).

Skaitlis 2

Skaitlis 2

Palielinās ΔFosB īstermiņa pārprodukcija Cck gēnu ekspresiju. (A) Cck mRNS ekspresija striatumā pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas 11A pelēm 1, 2, 4 vai 8 nedēļās. Microarray analīze tika veikta ar striatāla paraugiem un Cck līmenis ...

Turpināt pētīt ΔFosB spēju regulēt Cck izteiksme, mēs izmantojām PC12 šūnas, kas īslaicīgi tika transficētas ar a Cck-luciferāzes reportera plazmīds un vai nu FosB ekspresijas plazmīds, vai vienāds daudzums pCDNA. Abas divas (n = 5-9) un trīs (n = 11-13) dienas osFosB pārmērīga ekspresija izraisīja ievērojamu \ t Cckluciferāzes ekspresija. Turklāt trīs dienas ΔFosB pārmērīga ekspresija izraisīja ievērojami vairāk Cckluciferāzes indukcija, salīdzinot ar divām pārmērīgas ekspresijas dienām (\ tAttēls 2B). OsFosB pārmērīga ekspresija neizraisīja promotera bez luciferāzes konstrukcijas ekspresiju (dati nav parādīti). Nekādā gadījumā ārstēšanas apstākļi nebija samazināti Cckluciferāzes aktivitāte ir acīmredzama. Šie rezultāti liecina, ka īstermiņa ΔFosB ekspresija palielina Cck veicinātājs un neatbildēts mehānisms, ar kuru tiek novērsta ilgtermiņa ΔFosB pārmērīga ekspresija Cck izteiksme.

ΔFosB pārmērīga ekspresija palielina saistīšanos iespējamā CREB saistīšanās vietā Cck veicinātājs

Mūsu analīzes to atklāja Cck izteiksme tiek palielināta pēc īstermiņa ΔFosB izteiksmes, tomēr mūsu ChIP testos konstatēts, ka ne CREB, ne ΔFosB nav saistoši Cck veicinātājs. Lai noteiktu, vai ir kādas izmaiņas proteīna saistīšanās procesā Cck promotors pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas, mēs izmantojām elektroforētiskās mobilitātes maiņas testus (EMSA) ar zondi, kas satur iespējamo CRE līdzīgo vietni, kas atrodas Cck veicinātājs. Izmantojot 11A peles, kas 2 nedēļām pārspīlēja ΔFosB, striata kodoliekārtu ekstraktus, mēs konstatējām, ka palielinās saistīšanās ar iespējamo CRE vietni. Cck veicinātājs (Attēls 3 A, C, n = 4). Interesanti, ka 11A pelēm, kas pārmērīgi izpaužas ΔFosB 8 nedēļām, kas liecina par Cck izteiksme, arī šajā vietnē parādīja lielāku saistošu3B, C attēls, n = 4). Salīdzinājumam, mēs pārbaudījām saistīšanos ar vienprātīgu CRE vietu pelēm, kas pārmērīgi ekspressēja ΔFosB 2 nedēļām, un konstatējām stabilu CRE saistīšanos striatāla ekstraktos, bet neuzlabojās saistīšanās pēc ΔFosB indukcijas (Attēls 3F, n = 4). Tādējādi, neskatoties uz aFosB izraisīto kopējo CREB līmeņu pieaugumu, kas redzams šajā laika posmā, šie rezultāti atbilst mūsu ChIP testiem, kuros konstatēts, ka paaugstināta CREB saistība ar promotoriem, kas seko ΔFosB pārmērīgai ekspresijai, ir raksturīga tikai dažiem gēniem un nav globāla parādība . Lai noteiktu, vai CREB ir saistīts ar Cck EMSA analīzē mēs veicām pārspīlējuma testus ar CREB specifisku antivielu. Vienojoties ar mūsu ChIP testiem, mēs neatradām nekādu CREB saistīšanu ar a Cck zonde, kas satur iespējamo CRE vietu EMSA analīzēs, bet CREB būtiski saistīja un nomainīja vienprātīgu CRE vietu (3D, E attēls, n = 4). DNS saistīšanās aktivitāte Cck promotors netika ietekmēts arī pret AFosB antivielām (dati nav parādīti) apstākļos, kas parādīti vairākos iepriekšējos pētījumos, lai bloķētu ΔFosB saistīšanos ar bona fide AP-1 vietām (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Pēc 11 nedēļu ilga ΔFosB ekspresijas mēs arī veikām ChIP testus uz 8A dzīvnieku striata un joprojām nesaskatām CREB vai ΔFosB saistīšanos. Cck veicinātājs (dati nav parādīti). Tādējādi ΔFosB ekspresija izraisa proteīnu saistīšanās pieaugumu Cck pēc 2 un 8 izpausmes nedēļām; tomēr šo faktoru identitāte nav zināma.

Skaitlis 3

Skaitlis 3

Proteīnu saistošs pie Cck veicinātājs. (A, B) Elektroforētiskās mobilitātes maiņas tests, izmantojot Cck CRE līdzīga vietne ar striatāla audiem no dzīvniekiem, kas pārmērīgi ekspressē ΔFosB 2 nedēļas (A) vai 8 nedēļas (B). In (A), konkurence ar lieko marķieri bez konkurenta ...

Iespējamā CRE vietne Cck veicinātājs nav atbildīgs par paaugstinātu veicinātāja darbību

Tā kā mēs konstatējām proteīnu saistīšanās palielināšanos, izmantojot. \ T Cck reklamētājs, kas satur iespējamo CRE vietni pēc ΔFosB pārmērīgas izpausmes, mēs vēlējāmies noteikt, vai šī vietne ir nepieciešama, lai palielinātu Cck izteiksme pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas. Lai pārbaudītu šo iespēju, mēs pārnēsājām PC12 šūnas ar a Cck- luciferāzes plazmīds, kas satur tās neskarto CRE līdzīgo vietu vai vienu, kas satur mutāciju vietā, kas atceltu jebkādu mijiedarbību ar CREB. Interesanti, ka CRE līdzīgas vietas mutācija pazemināja bazālo Cck 32% veicinātāja aktivitāte (Attēls 4A, n = 9), bet neietekmēja Cck ierosinātāja indukcija ar ΔFosB pārekspresiju (Attēls 4B, n = 11-13). Tas liecina, ka, lai gan Cck promoteram ir nepieciešama neskarta CRE līdzīga vietne pilnīgai bazālajai aktivitātei, palielināta promotora aktivitāte, ko inducē ΔFosB pārmērīga ekspresija, neprasa CRE līdzīgu secību.

Skaitlis 4

Skaitlis 4

Jūsu darbs IR Klientu apkalpošana Ccklīdzīga CRE vietne nav nepieciešama Cck ΔFosB indukcija. (A) Cckluciferāzes aktivitāte tika mērīta 2 dienas pēc transfekcijas ar kādu no normāliem Cck-luciferāze vai tāda, kurā tika mutēta CRE līdzīgā vieta. * p <0.05 (B) Cck-luciferāze ...

cFos saistās ar Cck veicinātājs

Iepriekšējie pētījumi to ir atklājuši cFos mRNS palielinās ar ΔFosB īstermiņa ekspresiju, tomēr pēc ilgstošas ​​ΔFosB ekspresijas samazinās kokaīna terapijas spēja inducēt cFos striatumā.McClung un Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Tāpēc varētu būt iespējams, ka cFos veicina pieaugumu Cck izteiksme pēc īstermiņa ΔFosB ekspresijas. Mēs veicām ChIP testus ar antivielām, kas ir specifiskas cFos, un mērīja cFos saistošos Cck promotors ar un bez īstermiņa ΔFosB izteiksmes. Lai gan mēs atklājām, ka cFos tas saistās ar Cck veicinātājs, šī saistība būtiski nepalielinājās pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas (Skaitlis 5, n = 5). Tas liecina, ka, tā kā cFos saistās ar Cck veicinātājs var veicināt vispārējo regulējumu Cck izpausme, bet visticamāk, tā nav iesaistīta. \ t Cck ΔFosB veicinātājs.

Skaitlis 5

Skaitlis 5

cFos saistās ar Cck veicinātājs. Hromatīna imunoprecipitācijas analīzes tika veiktas ar specifisku antivielu cFos, izmantojot striatāla audu no AFosB pārmērīgas ekspresijas pelēm vai nu dox, vai pēc 2 nedēļu dox izņemšanas. Reālā laika PCR analīze bija ...

Iet uz:

DISKUSIJA

Šis pētījums apstiprina un paplašina iepriekšējos konstatējumus, kas liecina, ka ΔFosB regulē gēnu ekspresiju striatumā, un mēs redzam, ka tas notiek ar vairāku mehānismu palīdzību pēc īstermiņa izteiksmes. Mēs parādām, ka pēc 2 nedēļu pārmērīgas ekspresijas ΔFosB tieši saistās ar konkrētu gēnu promotoriem, kas izraisa izteiksmes izmaiņas (ti, CDK5). Turklāt tas palielina CREB proteīnu līmeni, kas novērots gan šūnās, gan šūnās, kā rezultātā palielinās CREB saistīšanās citos gēnu promotoros (ti, dinorfīns un BDNF). Iepriekšējā pētījumā konstatējām, ka ΔFosB īslaicīga pārmērīga ekspresija striatumā noved pie daudzām tām pašām gēnu ekspresijas izmaiņām, kas tiek konstatētas, kad CREB tiek pārmērīgi izteikta, un izraisa līdzīgas uzvedības reakcijas kokaīna preferences mērījumos (McClung un Nestler, 2003). Tādējādi pašreizējais konstatējums, ka AFosB izraisa CREB indukciju, kā arī CREB saistīšanās ar noteiktiem gēnu promotoriem, palīdz izskaidrot, kāpēc tik daudzi no gēnu ekspresijas izmaiņām bija kopīgi šiem diviem transkripcijas faktoriem.

CREB indukcija ar ΔFosB ir interesanta, jo ir pierādīts, ka ļaunprātīgas lietošanas zāles izraisa izmaiņas serīna 133 fosforilētajā CREB līmenī (Mattson et al., 2005) un palielina CRE mediēto transkripciju (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), nemainot CREB kopējo līmeni. Iespējams, ka CREB līmeņu izmaiņas var būt pārejošas, un tāpēc citos pētījumos tās var viegli palaist garām. Mūsu rokās mēs esam redzējuši kokaīna izraisītu CREB mRNS palielināšanos konkrētos eksperimentos, tomēr šī ietekme ir ļoti mainīga (nepublicēts novērojums). Tā kā gan 11A transgēnās peles, gan PC-12 šūnas uzrāda CREB indukciju pēc īstermiņa ΔFosB pārmērīgas ekspresijas, tas liecina, ka CREB patiešām izraisa ΔFosB (vai ΔFosB mērķis), nodrošinot vēl vienu mehānismu, lai izskaidrotu zāļu izraisītās izmaiņas gēnā izteiksme.

Pārsteidzoši, mēs atklājām, ka ne CREB, ne ΔFosB nav saistoši Cck veicinātājs, lai gan Cck ekspresija ir skaidri regulēta pēc īstermiņa ΔFosB ekspresijas. Cck ir bagātīgs neiropeptīds, kas izteikts gan VTA, gan NAc (Hokfelt et al., 1980) un, iespējams, ir iesaistīta uzvedības reakcijās pret narkotikām (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Šūnu kultūras testos Cck reklamētājs ir plaši raksturots un ir pierādīts, ka tas reaģē uz CREB un AP-1 ģimenes locekļiem. Hansen, 2001). Haun un Dixon (1990) parādīja, ka AP-1 kompleksi var saistīties ar Cck CRE līdzīga vietne in vitroun vēlāk tika parādīts, izmantojot SK-N-MC neiroblastomas šūnas, ka CRE līdzīgās vietas mutācija samazināja promotora reakciju uz pārmērīgi izteiktu cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Patiešām, mēs atrodam arī palielinājumu Cck veicinātāja darbība (Skaitlis 2) un saistošs CRE līdzīgā elementā vai tā tuvumā (Skaitlis 3) pēc osFosB, cita AP-1 ģimenes locekļa pārmērīgas ekspresijas, bet mēs nevaram atrast tiešu ΔFosB saistīšanos ar Cck veicinātājs in vivo or in vitro, pat pēc pārmērīgas izpausmes.

Daudz darbs ir parādījis CREB lomu ES regulējumā Cck veicinātāja aktivitāte. The Cck CRE līdzīga vietne ir saglabāta no mugurkaulniekiem (Hansen, 2001) un dažās šūnu kultūras analīzēs gan CREB, gan AP-1 kompleksi saistās ar šo vietu un ir nepieciešami Cck veicinātāja darbība (Haun un Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Turklāt vairāki zināmi Cck ekspresija (ieskaitot bFGF, PACAP, peptonus un depolarizāciju) darbojas ar CREB (Hansen et al., 1999; Deavall et al., 2000; Bernard et al., 2001; Gevrejs uc, 2002; Hansen et al., 2004). Mūsu Cckluciferāzes reportiera gēnu dati atbalsta būtisku CRE līdzīgas vietas lomu regulēšanā Cck aktivitāte, jo šīs vietnes mutācija samazina bazālo Cck veicinātāja darbība un. \ t Cckluciferāzes ekspresija, ko inducē VP16-CREB, konstitutīvi aktīva CREB forma, tiek zaudēta, kad šī vieta ir mutēta (nepublicēts novērojums). Tādējādi mēs bijām pārsteigti, ka CREB nav saistošs Cck promotors striatāla ekstraktos vai nu sākotnējā, vai pēc īstermiņa ΔFosB pārmērīgas ekspresijas, kad CREB līmenis ir palielināts. Tas norāda, ka CREB līmeņi per se nav vienīgais faktors, nosakot saistošo summu šajā vietnē, un to atbalsta citu darbs (Cha-Molstad et al., 2004). Tā kā citu iepriekš identificētu CREB mērķa gēnu, piemēram, BDNF un prodinorfīns, bija saistošs CREB, mēs esam pārliecināti, ka CREB nav saistošs Cck promotors striatāla kodoliekārtu ekstraktos. Turklāt,. \ T CckΔFosB luciferāzes aktivitāte nebija atkarīga no neskartās CRE līdzīgās vietas, norādot, ka ΔFosB neregulē Cck izpausme, regulējot CREB tiešo saistīšanu ar Cck veicinātājs.

Mūsu nespēja atklāt CREB, kas mijiedarbojas ar Cck veicinātājs tiek atbalstīts Renthal et al. (2009), kas izmantoja ChIP mikroshēmas pieeju, lai pēc hroniskas kokaīna iedarbības aplūkotu globālās izmaiņas fosforilētā CREB (pCREB) un ΔFosB saistīšanā striatumā. Šajos eksperimentos DNS-olbaltumvielu kompleksi tika imunoprecipitēti ar AFosB vai pCREB antivielām, un nogulsnētā DNS pēc marķēšanas tika hibridizēta ar promotora mikrolīmei. Lai gan ar šo pieeju tika identificēti daudzi iepriekš raksturotie CREB mērķa gēni (piemēram, BDNF, prodinorfīns), Cck nav identificēts. Turklāt ir pierādīts, ka CREB saistīšanās ar vienprātīgu CRE vietu ievērojami atšķiras starp kultivētām šūnu līnijām (Cha-Molstad et al., 2004). Visi iepriekšējie pētījumi, kas atklāja CREB mijiedarbību ar Cck promotors tika veikts šūnu kultūrā (nevis smadzenēs, no kurām tika iegūti mūsu EMSA un ChIP paraugi) un izmantoja gēla nobīdes testus, lai izpētītu proteīnu-DNS mijiedarbību. Kaut arī EMSA var novērtēt faktora potenciālu saistīties ar DNS sekvenci, ChIP testi sniedz jaunu skatījumu uz šīm mijiedarbībām. in vivo. Turklāt liela daļa datu, kas pierāda vai nu indukciju Cck vai CREB saistošs Cck promotori tika iegūti no šūnām, ko stimulējuši tādi faktori kā peptoni (Bernard et al., 2001), depolarizācija (Hansen et al., 2004) vai dažādi intracelulāro signalizācijas kaskāžu aktivatori, ieskaitot cAMP un ERK (Hansen et al., 1999). Mūsu eksperimentos vienīgais izmantotais stimuls bija ΔFosB pārmērīga ekspresija, kas ir pietiekama, lai Cck izteiksme. Kopumā tas liecina, ka CREB spēja piesaistīt (un potenciāli regulēt) Cck promotors ir lielā mērā atkarīgs no šūnu veida un konkrētu signalizācijas ceļu aktivizēšanas. Turklāt Cck CRE līdzīgs promotora elements (vismaz neinducētajās PC12 šūnās un peles striatumā) nav tiešs CREB vai ΔFosB mērķis. Interesanti, ka FosB CREB izteiksme ir specifiska arī šūnu tipam un stimulācijas veidam. Andersona pētījums un citi. konstatēja, ka CREB antisense oligonukleotīdu injicēšana peles striatumā daļēji kavēja. \ t FosB pēc kokaīna lietošanas (Andersson et al., 2001). Tomēr viņi arī konstatēja, ka L-Dopa spēja izraisīt FosB ekspresija 6-OHDA bojātajā striatumā neietekmēja CREB antisensu oligonukleotīdu klātbūtni.

Tā kā CREB un ΔFosB, šķiet, netieši regulē Cck promotors, un izmaiņas hromatīna struktūrā ir dokumentētas, reaģējot uz dažādiem stimuliem, kas inducē ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), mēs pamatojām, ka ΔFosB var netieši modulēt promotora aktivitāti, mainot hromatīna struktūru. Tomēr pelēm, kas pārmērīgi ekspresēja ΔFosB 2 nedēļu laikā, histona H3 acetilēšanas \ t Cck veicinātājs (Tabula 1). To atbalsta ChIP mikroshēmas dati Renthal et al. (2009), kas ziņoja, ka acetilētā H3 saistība nav mainījusies Cck promotors pelēm, kas pakļautas hroniskam kokaīnam. Kopš Cck promotors ir aktīvs striatumā, nebija sagaidāma vai novērota represēta metilēta histona H3 saistīšanās. Interesanti, ka mēs arī neredzējām izmaiņas ΔFosB pārmērīga ekspresija acetilētā H3 saistīšanā BDNF (kas parādīja paaugstinātu CREB saistīšanu) vai CDK5 un prodinorfīns veicinātājiem (kas parādīja palielinātu ΔFosB saistīšanu). Tā kā ir vairāki histona modifikācijas, kas saistītas ar izmaiņām promotora aktivitātē (pārskatījusi. \ T Rando un Chang, 2009), iespējams, ir arī citas hromatīna modifikācijas, kas saistītas ar šo gēnu indukciju. Jebkura atsevišķa hromatīna modifikācija, lai gan bieži prognozē promotora aktivitātes līmeni, var nemainīties konkrēta gēna aktivācijas laikā. Turpmākajā darbā būtu interesanti aplūkot citas iespējamās izmaiņas hromatīna struktūrā ap Cck promotors pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas. Interesanti, hronisks kokaīns (iespējams līdz ΔFosB indukcija) ir izraisījusi sirtuīna 1 un 2, III klases histona deacetilāzi, ekspresiju, kas, šķiet, maina neironu fizioloģiju, ERK signalizāciju un uzvedību uz kokaīnu (Renthal et al., 2009). Histona deacetilāzes indukcija spētu vienlaicīgi regulēt daudzu gēnu ekspresiju līdz globālās izmaiņas hromatīna struktūrā.

Viens iespējams kandidāts Cck regulēšana pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas bija AP-1 ģimenes loceklis cFos. CFos izteiksmi regulē CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), un cFos pārmērīga izpausme (atbilst tās saistošā partnera cJun pārprodukcijai) palielinās Cck veicinātāja darbība (Rourke et al., 1999). Tāpēc paaugstināts CREB līmenis īslaicīgas ΔFosB pārmērīgas ekspresijas dēļ varētu palielināt cFos līmeni un izraisīt palielinātu saistību ar Cck CRE līdzīga vietne. cfos mRNS inducējas pelēm pēc divu nedēļu ilgas ΔFosB pārmērīgas ekspresijas (McClung un Nestler, 2003) un samazinājās pelēm, kas pakļautas hroniskam kokaīnam vai ilgstošai ΔFosB pārmērīgai ekspresijai (\ tRenthal et al., 2008). Šeit mēs atklājam, ka cFos tieši saistās ar Cck promotors striatāla audos, tomēr ΔFosB pārmērīga ekspresija būtiski neuzlabo saistīšanos. Tas liek domāt, ka, lai gan cFos varētu būt iesaistīti regulēšanā Cck izpausme vispār, cFos saistīšanās izmaiņas vien nav iespējams, ka ΔFosB regulē mehānismu Cck izteiksme. Tomēr ir iespējams, ka ΔFosB var izraisīt vai nu pēctranslācijas izmaiņas cFos (piemēram, izmainītā fosforilācija), vai inducēt saistošā partnera (piemēram, cJun) vai koaktivatora proteīna ekspresiju. Tomēr, tā kā neskartā CRE līdzīgā vietne (kas iepriekš bijusi saistoša vietne AP-1 kompleksiem, skat. Haun un Dixon, 1990) nav nepieciešams, lai palielinātu Cck promotora aktivitāte, kas novērota ar ΔFosB pārmērīgu ekspresiju (kā novērtēts mūsu reportiera gēnu eksperimentos), ir pamats uzskatīt, ka arī citi transaktīvie faktori tiek regulēti ar ΔFosB.

Jūsu darbs IR Klientu apkalpošana Cck mūsu luciferāzes reportiera gēnu eksperimentos izmantotais promotora fragments satur konservētu Sp1 saistīšanās vietu un E-box (pārskatījis Hansen, 2002). Konkrētāk, ir pierādīts, ka E-kastes sekvences saistās ar daudziem transkripcijas faktoriem (pārskatīts ar Forrests un McNamara, 2004). Izmantojot PC12 šūnas, mēs redzējām, ka E-kastes mutācija samazinās Cck aktivitāte, bet nemaina promotora reakciju uz ΔFosB (dati nav parādīti). Interesanti, ka CckLuciferāzes reportierim, kas satur mutācijas gan CRE vietā, gan E-kastē, nav konstatējamas bazālās aktivitātes un nereaģē uz ΔFosB pārmērīgu ekspresiju (nepublicēts novērojums). Vēl viens potenciāls ΔFosB darbības starpnieks Cck promotors ir ATF, kuru zināmas formas ir izraisītas striatumā hroniskas psihostimulanta iedarbības rezultātā (Green et al., 2008). Tomēr mēs neesam atraduši nekādus pierādījumus par šo ATF indukciju ΔFosB (dati nav parādīti), un nav sagaidāms, ka ATFs saistīsies ar mutācijas CRE līdzīgo vietni Cck veicinātājs.

Viens no šī pētījuma paņēmieniem ir tas, ka mēs izmantojam bi-transgēnu sistēmu, lai pārspīlētu ΔFosB, un tāpēc ir jābūt konservatīvam, lai veidotu paralēles starp šo paradigmu un hroniskā kokaīna lietošanu. Tomēr 11A transgēnās peles sniedz unikālu iespēju aplūkot ΔFosB specifisko ietekmi uz striatumu, jo pārmērīga ekspresija ir ierobežota ar šo smadzeņu reģionu (Chen et al., 1998), bet kokaīna lietošana izraisa izmaiņas dažādos citos smadzeņu reģionos, kas pēc tam var netieši ietekmēt striatumu. Turklāt vairāki pētījumi ir dokumentējuši līdzīgus uzvedības un molekulāros fenotipus 11A pelēm, salīdzinot ar ne-transgeniskiem dzīvniekiem, kas ārstēti ar hronisku kokaīnu (Kelz et al., 1999; McClung un Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Papildus, Bibb et al. (2001) ziņoja par līdzīgu striatāla līmeni Cdk5 mRNS un olbaltumvielu indukcija šajā pašā 11A celmā, salīdzinot ar kokaīna apstrādātiem, ne-transgēniem pakaišiem, kā arī līdzīgas izmaiņas CDK5 mērķos, p35 un DARPP-32.

Nobeigumā var secināt, ka īstermiņa ΔFosB ekspresija izraisa gēnu inducēšanu striatumā, izmantojot vairākus mehānismus. Tie ietver tiešu promotora saistīšanos, CREB proteīna indukciju un aktivitāti, hromatīna modifikāciju, papildus ceļiem, kas vēl jānosaka.

Iet uz:

EKSPERIMENTĀLĀS PROCEDŪRAS

Dzīvnieki

Šajā pētījumā tika izmantoti vīriešu bi-transgēni 11A dzīvnieki (NSE-tTA x TetOP-AFosB), un tie ir raksturīgi Kelz et al., 1999. Lai pārmērīgi izpaustu ΔFosB, peles tika izņemtas no doksiciklīna starp 3 un 6 nedēļas vecumu, bet kontroles pelēm tika saglabāta doksiciklīns. Visas peles tika izmitinātas grupā un uzturētas 12: 12 gaismas / tumšajā ciklā, iedegās 7 am un iedegās pie 7 pm, ar ad lib piekļuvi pārtikai un ūdenim. Visi peles eksperimenti bija saskaņā ar protokoliem, ko apstiprinājusi Teksasas Universitātes Dienvidrietumu medicīnas centra dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja.

Reportieris un ekspresijas plazmīdas

Savvaļas veids (WT) Cck promotora-luciferāzes reportieris tika iegūts, ievietojot aptuveni 200 bp PCR fragmentu pGL3-luc vektorā (Promega). Šis fragments tika iegūts no peles genoma DNS (primeri: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' augšup un 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' lejup pa straumi) un sākotnēji ievietots pGEM-T Easy vektorā (Promega, #A1360). Tad promotora fragments tika klonēts pGL1-luc Kpn1 / Xho3 restrikcijas enzīma vietās.

Lai izveidotu CRE punkta mutāciju Cck promoters, mutagēns primer, kas vērsts pret iepriekš ziņotu CRE līdzīgu vietu (sensu primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACenes kombinācija The Change Kit's . Tādējādi paziņotā CRE veida vietne (ACTGCGTCAGC) tiek pārveidota par ACTGAGCTCC. Visas reportiera plazmīdas tika apstiprinātas ar DNS sekvencēšanu. ΔFosB ekspresijas plazmīds satur pilna garuma ΔFosB sekvenci, kas ievietota pCDNA 3 daudzkārtējā klonēšanas vietā, un ir aprakstīta iepriekš (Ulery un Nestler, 2007).

Šūnu kultūra un DNS transfekcija

Žurku feohromocitomas (PC12) šūnas tika uzturētas Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnē F-12, kas papildināta ar 10% zirgu serumu, 5% liellopu augļa serumu un 1% penicilīnu / streptomicīnu 37 ° C un 5% CO2. Šūnas tika transfektētas ar elektroporāciju, izmantojot BTX 360 elektroporatoru (350 V, 0 omi un 850 μF) 800 μl Dulbecco fosfāta buferšķīdumā 4 mm spraugas kivetēs ar 10 μg reportiera un 5 μg ekspresijas konstrukcijas. Lai normalizētu kopējo DNS daudzumu, tika izmantota tukša vektora plazmīda (pCDNA). Pēc transfekcijas šūnas tika audzētas uz 35 mm kolagēna pārklātajiem traukiem norādīto laiku.

Luciferāzes testi

Divas vai trīs dienas pēc transfekcijas šūnas 3 reizes mazgāja Dulbecco fosfāta buferšķīdumā, lizējot (izmantojot 25 mM glicilglicīna, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), savākti un iztīrīti centrifugējot. 30 μL lizāta kombinācijā ar 140 μL luciferāzes testa buferi (25 mM glicilglicīns, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kālija fosfāts, 1 mM koenzīms A, pH 7.8). Luminiscences aktivitāte tika mērīta, izmantojot FLx-800 mikroplašu fluorescences lasītāju pēc 40 μL 1 mM luciferīna automatizētas injekcijas katrā iedobē. Luciferāzes aktivitāte tika normalizēta līdz kopējam olbaltumvielu saturam, kas noteikts ar BioRad proteīna testu.

Elektroforētiskās mobilitātes maiņas tests

Kodoliekārtas ekstrakti no divstransgēnām 11A pelēm (tas, ja 2 vai 8 nedēļas tiek turētas uz doksiciklīna vai no tās)McClung un Nestler, 2003) tika sagatavoti saskaņā ar Huang un Walters (1996). 32P-iezīmētas divslāņu oligonukleotīdu zondes tika sagatavotas, izmantojot Promega Gel Shift Assay sistēmas protokolu (#E3300), un zondes tika attīrītas, izmantojot Roche Quick Spin kolonnas. Konsensa CRE un AP-1 zondu sekvences bija no Promega (attiecīgi #E328A un E320B) un Cck CRE sekvences bija (Cck-CRE izjūta: CTAGCGAGCTCTGGGGGGGGGGGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Saistošas ​​reakcijas un elektroforēze tika veiktas, izmantojot Promega Gel Shift Assay sistēmas procedūras (#E3300) modifikācijas. 50,000 CPM marķētajā zondē tika apvienota ar 10 μg striatāla kodolu ekstraktu. Pirms radioaktīvi iezīmēto zondu ievadīšanas tika pievienota aukstā konkurenta DNS vai antivielas. Eksperimentiem ar pārnesumu tika izmantots 2 μg CREB antivielas (Upstate Biotechnology # 06-083). Reakcijas tika elektroforēzes ar 4% poliakrilamīda gēliem, žāvētas un pakļautas filmai (izmantojot intensīvākus ekrānus 1 stundai līdz 2 dienām).

Imunoblotēšana

PC12 šūnām 35 mm transfektēto šūnu plāksnes mazgāja ledus aukstā Dulbecco fosfātu buferšķīdumā un lizātus sagatavoja ledus aukstā RIPA lizēšanas buferī (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% dezoksiholāts, 1 % Triton X-100, 0.1% nātrija dodecilsulfāts) satur proteāzes inhibitorus. Pēc apstrādes ar ultraskaņu, attīrīšanu un Bredforda olbaltumvielu testu lizāti tika pilnībā denaturēti un 50 μg katra parauga elektroforēze tika veikta ar 10% SDS poliakrilamīda gēliem. Olbaltumvielas tika pārnestas uz PVDF membrānu, uz vienu stundu bloķētas 1% beztauku sausā pienā Tris buferšķīdumā, kas satur 3% Tween-0.1 (TBS-T piens), un naktī 20 ° C temperatūrā tos pārbaudīja ar primārajām antivielām (CREB- Upstate Biotechnology # 4-06, lietots 083: 1 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, izmantots 1: 80,000 1), atšķaidīts ar TBS-T pienu. Pēc vairākām mazgāšanas reizēm TBS-T blotus vienu stundu pārbaudīja istabas temperatūrā, izmantojot sārmainās fosfatāzes konjugētās sekundārās antivielas (Sigma), kas atšķaidītas ar 5,000: 170 TBS-T pienā. Pēc vairākām mazgāšanas reizēm ar Tris buferšķīdumā, krāsu reakcija tika veikta saskaņā ar BioRad (# 6432-XNUMX) instrukcijām. Membrānas žāvēja nakti, skenēja uz plakanā skenera un densitometriju veica, izmantojot ImageJ (skatīt zemāk).

Striatāla ekstraktiem tika veiktas Western blot analīzes, kas publicētas iepriekš (Hope et al., 1994). Audi tika noņemti no dekapitētām pelēm, novietoti uz ledus un sadalīti uz smadzeņu matricas biezumā 1 mm. Tad tika izmantoti audu perforatori un sasaldēti -80 ° C temperatūrā līdz lietošanai. Audu apstrādāja ar ledu modificētā buferšķīdumā, kas satur gan fosfatāzes, gan proteāzes inhibitorus (Roche, Sigma). Pēc ultraskaņas, paraugi tika denaturēti verdošā ūdenī un centrifugēti 15,000xg 15 minūtes; pēc tam savāca un apstrādāja supernatantu; pēc tam proteīna koncentrācijas daudzumi tika kvantificēti, izmantojot Bradfordas analīzi (Bio-Rad). Paraugus veica ar 10% akrilamīda / bisakrilamīda gelu, pārvietoja uz PVDF membrānu, bloķēja 5% pienu un inkubēja ar primārajām antivielām (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Pēc tam bloti tika vizualizēti, izmantojot chemiluminescences sistēmu (Pierce). Visi paraugi tika normalizēti uz GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Standarta līknes tika veiktas, lai pārliecinātos, ka mēs esam testa lineārajā diapazonā.

Densitometrijas analīze

PC12 imunoblotiem densitometrijas analīze tika veikta, izmantojot ImageJ ar rodbarda kalibrēšanu. No katra mērījuma tika atņemts vidējais fona signāls, un katram paraugam tika aprēķināta CREB un GAPDH signāla attiecība. Striatāla imunoblotiem un EMSA analīzei Scion Image 1.62c tika izmantots ar fona atņemšanu.

Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP)

ChIP testi tika veikti saskaņā ar Tsankova et al. (2004) un Kumar et al. (2005). Īsāk sakot, divpusējie striatāla paraugi no 11A pelēm, kas tika turēti uz doksiciklīna vai ārpus tā, tika savstarpēji saistīti ar 1% formaldehīdu un šķērssaistīšana tika apturēta ar glicīnu (galīgā koncentrācija 0.125 M). Šie paraugi tika ņemti no veselām smadzeņu šķēlītēm, kas ņemtas accumbens kodola līmenī, noņemot garozu. Hromatīnu ar ultraskaņu sadala līdz aptuveni 0.2 līdz 1 kb fragmentiem, notīra ar proteīna G lodītēm (Thermo Scientific # 22852) un izejvielu paraugus sasaldēja -80 ° C temperatūrā. Katram nokrišņiem tika izmantots no 60 līdz 100 μg hromatīna. Tika izmantoti 5-10 μg katras primārās antivielas (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilēts H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilēta H3 (LYS9): šūnu signālu tehnoloģija, cFos: Santa Kruzas biotehnoloģija # SC-7202x). Antivielu-hromatīna kompleksi tika imunoprognozēti ar Protein G plus krellēm saskaņā ar ražošanas instrukcijām (Thermo Scientific # 22852). Pēc ievades un nogulsnēto paraugu reversās šķērssaites katram paraugam tika pakļauta kvantitatīva PCR (qPCR). Visu šo antivielu izmantošana ChIP ir plaši apstiprināta (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Proteīna piesaistes līmeņi katrā interesējošā gēna promotorā tika noteikti, mērot saistītā DNS daudzumu ar qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Ievade vai kopējā DNS (neimunoprecipitated) un imunoprecipitated DNS tika amplificētas trīs eksemplāros SYBR Green klātbūtnē (Applied Biosystems, CA). Ct vērtības no katra parauga tika iegūtas, izmantojot Sequence Detector 1.1 programmatūru. Veidnes DNS relatīvā kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot ΔΔCt metodi (Tsankova et al., 2004). Izmantotie primeri: BDNF promotors 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promotors: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck veicinātājs: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodinorfīna promotors: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistiskā analīze

Visi dati tiek parādīti kā vidējie rādītāji ± vidējā standarta kļūda. Statistisko atšķirību noteica ar studenta divu t-testu (p <0.05). Veicot vairākus salīdzinājumus, p vērtības koriģēja, izmantojot Bonferroni korekciju.

Iet uz:

Pateicības

Mēs vēlētos pateikties Will Renthal un Arvind Kumar par noderīgām diskusijām. Mēs arī vēlētos pateikties NIDA par šo eksperimentu finansēšanu.

Iet uz:

Zemsvītras piezīmes

Izdevēja atruna: Šis ir PDF fails, kurā nav publicēta manuskripta, kas ir pieņemts publicēšanai. Kā pakalpojums mūsu klientiem sniedzam šo rokraksta agrīno versiju. Manuskripts tiks pakļauts kopēšanu, apkopošanu un iegūto pierādījumu pārskatīšanu, pirms tas tiek publicēts tā galīgajā citējamajā formā. Lūdzu, ņemiet vērā, ka ražošanas procesa laikā var rasties kļūdas, kas var ietekmēt saturu, un attiecas uz visiem žurnālam piemērojamiem juridiskajiem atrunas.

Klasifikācijas noteikumi:

Sadaļa: Nervu sistēmu šūnu un molekulārā bioloģija #1

Iet uz:

Atsauces

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP atbildes elementa saistošs proteīns ir nepieciešams dopamīna atkarīgai gēnu ekspresijai neskartā, bet ne dopamīna denervētā striatumā. J Neurosci. 2001: 21: 9930 – 43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB aktivitāte kodolkrāsas apvalkā kontrolē uzvedības reakciju uz emocionāliem stimuliem. Proc Natl Acad Sci US A. 2002, 99: 11435 – 40. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokaīna terapija palielina ekstracelulāro holecistokinīnu (CCK) nomāktā, brīvi pārvietojošo žurku kodolā, kas palielinās žurkām, kuras uzvedības ziņā ir jutīgas pret kokaīnu. J Neurochem. 2002: 81: 1021 – 7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptoni stimulē zarnu kolecistokinīna gēnu transkripciju, izmantojot cikliskus adenozīna monofosfāta reakcijas elementus. Endokrinoloģija. 2001: 142: 721 – 9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kroniskās iedarbības ietekmi uz kokaīnu regulē neironu proteīns Cdk5. Daba. 2001: 410: 376 – 80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Transkripcijas faktora CREB šūnu tipa specifiska saistība ar cAMP-atbildes elementu. Proc Natl Acad Sci US A. 2004, 101: 13572 – 7. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Delta FosB un FosB līdzīgo proteīnu regulēšana ar elektrokonvulsīvo krampju un kokaīna terapiju. Mol Pharmacol. 1995: 48: 880 – 9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeniski dzīvnieki ar inducējamu, mērķtiecīgu gēnu ekspresiju smadzenēs. Mol Pharmacol. 1998: 54: 495 – 503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Ciklīna atkarīgas kināzes 5 indukcija hipokampā hronisku elektrokonvulsīvu krampju laikā: ΔFosB loma. J Neurosci. 2000: 20: 8965 – 71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Aizvērt daudzu veidu tikšanās: „Fos-Jun” mijiedarbība, kas veicina transkripcijas regulēšanas specifiku. Onkogēns. 2001: 20: 2438 – 52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neironu adaptācija amfetamīnam un dopamīnam: prodinorfīna gēnu regulēšanas molekulārie mehānismi žurku striatumā. Neirons. 1995: 14: 813 – 23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. CCK gēnu transkripcijas kontrole, izmantojot PACAP STC-1 šūnās. Am J Physiol Gastrointest aknas Physiol. 2000: 279: G605 – 12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Holecistokinīna mRNS satura dopamīnerģiskais regulējums žurku striatumā. Brain Res Mol Brain Res. 1992: 12: 77 – 83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id transkripcijas faktoru un asinsvadu bojājumu veidošanās. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004: 24: 2014 – 20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Ciklisko AMP un kalcija atkarīgo proteīnkināžu kopprasība holecistokinīna gēna transkripcijas aktivācijai ar proteīnu hidrolizātiem. J Biol Chem. 2002: 277: 22407 – 13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. ATF2, ATF3 un ATF4 aktivējošo transkripcijas faktoru (ATF) indukcija kodolkrāsās un to emocionālās uzvedības regulēšana. J Neurosci. 2008: 28: 2025 – 32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Dopamīna un holecistokinīna pārplūde žurku kodolā, reaģējot uz akūtu zāļu ievadīšanu. Sinapse. 2000: 38: 238 – 42. [PubMed]
  18. Hansens TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogēna aktivēta proteīnkināze un olbaltumvielu kināzes A signālu ceļi stimulē holecistokinīna transkripciju, aktivizējot ciklisko adenozīna 3 ’, 5′-monofosfāta atbildes elementu saistošo proteīnu. Mol endokrinols. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Neironu holecistokinīna gēnu transkripcijas regulēšana. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001: 234: 61 – 7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Holecistokinīna gēnu transkripcija: promotora elementi, transkripcijas faktori un signalizācijas ceļi. Peptīdi. 2001: 22: 1201 – 11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl un forskolīns sinerģiski regulē holecistokinīna gēna ekspresiju, koordinējot CREB un koaktivatoru CBP. J Neurochem. 2004: 89: 15 – 23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Žurkas holecistokinīna gēna ekspresijai būtisks transkripcijas pastiprinātājs satur sekvenci, kas ir identiska cilvēka c-fos gēna -296 elementam. J Biol Chem. 1990: 265: 15455 – 63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB gēna būtiskā loma hronisku elektrokonvulsīvu krampju molekulārajās, šūnu un uzvedības aktivitātēs. J Neurosci 1998. 1998: 18: 6952 – 62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Pierādījumi par dopamīna un CCK līdzāspastāvēšanu mezo-limbiskajos neironos. Daba. 1980: 285: 476 – 8. [PubMed]
  25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Hroniska elektrokonvulsīvā krampju (ECS) ārstēšana izraisa ilgstošu AP-1 kompleksa ekspresiju smadzenēs ar mainītu sastāvu un īpašībām. J Neurosci. 1994: 14: 4318 – 28. [PubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Ilgstoša AP-1 kompleksa, kas sastāv no mainītiem Fos līdzīgiem proteīniem smadzenēs, indukcija ar hronisku kokaīnu un citām hroniskām procedūrām. Neirons. 1994: 13: 1235 – 44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. AP-1 transkripcijas faktora DNS saistīšanās aktivitātes dopamīnerģiska regulēšana žurku striatumā. Neirozinātne. 1996: 75: 757 – 75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. CREB regulona definēšana: transkripcijas faktoru regulējošo reģionu genoma mēroga analīze. Šūna. 2004: 119: 1041 – 54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Kas ieslēdz CREB? Šūnu signāls. 2004: 16: 1211 – 27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. CCK (A) un CCK (B) antagonistu pretstata ietekme uz kondicionētās aktivitātes attīstību žurkām. Behav Pharmacol. 1996: 7: 505 – 512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Pierādījumi par CCK (A) receptoru iesaistīšanos kondicionētā aktivitātes iegūšanā, ko kokaīns rada žurkām. Brain Res. 1997: 763: 93 – 102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Transkripcijas faktora deltaFosB ekspresija smadzenēs kontrolē jutību pret kokaīnu. Daba. 1999: 401: 272 – 6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplants Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatin remodeling ir galvenais mehānisms, kas pamato kokaīna izraisīto plastiskumu striatumā. Neirons. 2005: 48: 303 – 14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokaīna izraisīta CREB fosforilācija kokainu jutīgo žurku kodolkrāsās ir iespējama, pastiprinot ekstracelulāro signālu saistītās kināzes aktivāciju, bet ne proteīnu kināzi A. J Neurochem. 2005: 95: 1481 – 94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Gēnu ekspresijas un kokaīna atlīdzības regulēšana ar CREB un DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208 – 15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulārs slēdzis ilgstošai adaptācijai smadzenēs. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: molekulārais mediators ilgstošai nervu un uzvedības plastiskumam. Brain Res. 1999: 835: 10 – 17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Vai ir kopīgs molekulārais ceļš atkarībai? Nat Neurosci. 2005: 8: 1445 – 9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Atkarības transkripcijas mehānismi: DeltaFosB loma. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008: 363: 3245 – 55. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB indukcijas smadzenēs atšķiras no ļaunprātīgas narkotikas. Sinapse. 2008: 62: 358 – 69. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Genoma mēroga skats uz hromatīna struktūru. Annu Rev Biochem. 2009: 78: 245 – 71. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB mediē c-fos gēna epigenetisko desensibilizāciju pēc hroniskas amfetamīna iedarbības. J Neurosci. 2008: 28: 7344 – 9. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Ar kokaīnu saistītā hromatīna regulējuma genoma mēroga analīze atklāj sirtuīnu lomu. Neirons. 2009: 62: 335 – 48. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Mezolimbiskās dopamīna funkcijas holecistokinīna modulācija: motivētas uzvedības regulēšana. Pharmacol Toxicol. 2002: 91: 404 – 13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatīva kooperativitāte starp blakus esošiem E-box un cAMP / TPA reaktīvajiem elementiem holecistokinīna gēna promotorā. FEBS Lett. 1999: 448: 15 – 8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. CRE-mediētas transkripcijas reģionālā un šūnu kartēšana naltreksona nogulsnēšanās laikā. J Neurosci. 2002: 22: 3663 – 3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. CRE-mediētas transkripcijas regulēšana peles smadzenēs ar amfetamīnu. Sinapse. 2003: 48: 10 – 7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membrānas depolarizācija un kalcija inducē c-fos transkripciju, izmantojot transkripcijas faktora CREB fosforilāciju. Neirons. 1990: 4: 571 – 82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histonu modifikācijas gēnu promotora reģionos žurku hipokampā pēc akūta un hroniska elektrokonvulsīvā lēkme. J Neurosci. 2004: 24: 5603 – 10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. DeltaFosB transkripcijas aktivitātes regulēšana ar Ser27 fosforilāciju. Eur J Neurosci. 2007: 25: 224 – 30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamīna-CCK mijiedarbība psihostimulanta atlīdzībā un ar to saistītā uzvedībā. Neurosci Biobehav Rev. 1992: 18: 207 – 14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: ΔFosB būtiska loma morfīna darbībā. Nature Neurosci. 2006: 9: 205 – 11. [PubMed]