DeltaFosB indukcija orbitofrontālajā garozā pastiprina lokomotorisko sensibilizāciju, neraugoties uz kokaīna izraisītu kognitīvo disfunkciju mazināšanu (2009).

2. Metodes

Visi eksperimenti tika veikti, stingri ievērojot NIH laboratorijas dzīvnieku aprūpes un lietošanas rokasgrāmatu, un tos apstiprināja UT Dienvidrietumu institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja.

2.5. MRNS kvantitatīva noteikšana

Žurkas saņēma AAV-GFP vai AAV-ΔFosB OFC injekcijas, kam sekoja 21 divas reizes dienā sāls šķīduma vai kokaīna injekcijas tieši tā, kā aprakstīts uzvedības eksperimentos. Dzīvnieki tika izmantoti 24 h pēc pēdējās sāls vai kokaīna injekcijas. Žurkas tika nogalinātas ar dekapitāciju. Smadzenes tika ātri ekstrahētas un iegūti divpusēji NAc 1 mm biezi 12 mērierīces un nekavējoties iesaldēti un uzglabāti –80 ° C temperatūrā līdz RNS izolācijai. Arī OFC perforatori tika noņemti analīzei ar DNS mikrolīmeni, kas apstiprināja veiksmīgu vīrusu mediētu gēnu pārnešanu šajā reģionā (skatīt (Winstanley et al., 2007), lai iegūtu sīkākus rezultātus). RNS tika ekstrahēts no NAc paraugiem, izmantojot RNS Stat-60 reaģentu (Teltest, Houston, TX) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Piesārņojoša DNS tika noņemta ar DNāzes apstrādi (bez DNS, katalogs # 1906, Ambion, Austin TX). Attīrīta RNS tika pārvērsta cDNS (Superscript First Strand Synthesis, Katalogs # 12371-019; Invitrogen). Transkripti interesējošiem gēniem tika kvantificēti, izmantojot reālā laika qPCR (SYBR Green; Applied Biosystems, Foster City, CA) uz Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-well termocikleriem. Visi primeri tika sintezēti pēc Operon (Huntsville, AL; skat Tabula 1 sekvencēm) un validē linearitāti un specifiskumu pirms eksperimentiem. Visi PCR dati tika normalizēti atbilstoši gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāzes (GAPDH) līmenim, ko kokaīna terapija nemainīja saskaņā ar šādu formulu: ΔC_t =C_t(interesējošais gēns) - C_t (GAPDH). Pēc tam koriģētie ekspresijas līmeņi gan AAV-ΔFosB, gan AAV-GFP žurkām, kas saņēma kokaīnu, un AAV-ΔFosB žurkām, kas saņēma hronisku sāls šķīdumu, tika aprēķinātas, salīdzinot ar kontrolēm (AAV-GFP grupa, kam ievadīta hroniska fizioloģiskā šķīdums): ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (kontroles grupa). Saskaņā ar ieteikto praksi šajā jomā (Livak un Schmittgen, 2001), ekspresijas līmeņi attiecībā pret kontrolēm tika aprēķināti, izmantojot šādu izteiksmi: 2^−ΔΔCt.

  

Tabula 1

Primeru secība, ko izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu cDNS līmeņus, izmantojot reālā laika PCR.

3. Rezultāti

eksperiments 1

Hroniska kokaīna lietošana rada sensibilizāciju akūtas kokaīna hiperlokomotorajai iedarbībai, ko atdarina ΔFosB

Kā paredzēts, kontroles dzīvniekiem novēroja spēcīgu lokomotorisko sensibilizāciju pēc hroniskas kokaīna iedarbības, un dzīvnieki, kas hroniski tika ārstēti ar kokaīnu, palielināja hiperaktivitāti, reaģējot uz akūtu kokaīna izaicinājumu (1A, hroniska ārstēšana: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Dzīvnieki, kas pārmērīgi ekspresē ΔJunD, dominējošu JunD negatīvu mutantu, kas darbojas kā ΔFosB antagonists (Zachariou et al., 2006), OFC nebija atšķirami no kontroles dzīvniekiem (1C, GFP pret ΔJunD, grupa: F_{1, 56} = 1.509, NS). Tomēr dzīvnieki, kas pārmērīgi ekspresēja ΔFosB OFC, kas bija saņēmuši atkārtotu sāls šķīdumu injekcijas, parādījās „iepriekš jutīgi”: tie parādīja pastiprinātu lokomotorisko atbildes reakciju uz akūtu kokaīnu, kas neatšķīrās no jutīgo reakciju, ko radīja viņu hroniskie kokaīdi (1B, GFP vs ΔFosB ķirurģija × hroniska ārstēšana: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; Tikai ΔFosB: hroniska ārstēšana: F_1,22 = 0.664, NS). AFosB dzīvnieki bija nedaudz hiperaktīvi pirmajā 15 min laikā, kad tie tika ievietoti lokomotīvju kastēs (GFP vs ΔFosB, operācija: F_1,56 = 4.229, p <0.04), bet kustību aktivitātes līmenis bija salīdzināms ar kontrolēm 15 minūtēs pirms kokaīna ievadīšanas (operācija: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Fig. 1

Lokomotīvju sensibilizācija pret kokaīnu. Akūts kokaīns palielināja lokomotorisko aktivitāti kontroles dzīvniekiem, kas hroniski ārstēti ar kokaīnu pret sāls šķīdumu (A panelis). Dzīvniekiem, kas pārmērīgi ekspresē ΔFosB (B panelis), tiem, kas saņēma atkārtotu sāls šķīdumu (vairāk ...)

Ņemot vērā, ka, lietojot kokaīnu 5CSRT laikā, tiem pašiem dzīvniekiem bija salīdzinoši lielāka spēja aizkavēt priekšlaicīgu motoru atbildes reakciju, šī hiperaktivitāte ir raksturīga ambulatorai kustībai, ti, kustības veids, ko parasti reģistrē lokomotorās sensibilizācijas pētījumos. Lai gan pastiprināta aktivitāte, reaģējot uz stimulējošām zālēm, varētu atspoguļot anksiogēnu profilu, ΔFosB pārmērīga ekspresija OFC nepalielina trauksmi, ko mēra, izmantojot paaugstinātu labirints vai atklātā lauka testu (dati nav parādīti). Dzīvnieki bija labi pieraduši pie IP injekcijām, un sāls šķīdumi neietekmēja to kognitīvo veiktspēju (Winstanley et al., 2007), tāpēc šo mehānisko efektu nevar attiecināt uz vispārēju reakciju uz IP injekciju. Kopumā šie atklājumi liecina, ka ΔFosB indukcija OFC ir pietiekama (bet nav nepieciešama) jutīgai lokomotorai, kas reaģē uz kokaīnu, lai gan ΔFosB tajā pašā reģionā rada toleranci pret kokaīna ietekmi uz motivāciju un impulsivitāti (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

FosB mRNS līmenis NAc nemainīja ne hronisku zāļu terapiju (2A, narkotikas: F_1,14 = 1.179, ns) vai ΔFosB ekspresija OFC (operācija: F_{1, 14} = 0.235, ns). Tomēr ΔFosB līmenis bija ievērojami augstāks dzīvniekiem, kas hroniski ārstēti ar kokaīnu saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem (Chen et al., 1997); 2B, narkotikas: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Interesanti, ka ΔFosB mRNS daudzums ar fizioloģisko šķīdumu ārstēto dzīvnieku NAc bija mazāks tiem, kuros šis transkripcijas faktors bija pārmērīgi izteikts OFC (zāles: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Tomēr zāļu × operācijas mijiedarbības neesamība norāda, ka hroniskai kokaīna terapijai bija tāda pati ietekme gan AAV-GFP, gan AAV-ΔFosB ārstētajās grupās, proporcionāli līdzīgā mērā paaugstinot ΔFosB līmeni (narkotiku × operācija: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig. 2

Izmaiņas mRNS ietvaros NAc dzīvniekiem, kas pārmērīgi ekspresē GFP vai ΔFosB OFC, un hroniski apstrādāti ar sāls šķīdumu vai kokaīnu. Dati norāda uz lineārām izteiksmes izmaiņām kā daļu no kontroles vērtībām. Parādītie dati ir (vairāk ...)

4. Diskusija

Šeit mēs parādām, ka ΔFosB pārmērīga ekspresija OFC sensibilizētās žurkās uz kokaīna lokomotorisko stimulējošo iedarbību, imitējot hroniskas kokaīna lietošanas darbības. Mēs jau iepriekš esam pierādījuši, ka šo pašu dzīvnieku darbība 5CSRT un kavēšanās diskontēšanas paradigmās ir mazāk ietekmēta ar akūtu kokaīnu, un ka līdzīga toleranci līdzīga iedarbība tiek novērota pēc atkārtotas kokaīna iedarbības. Tādā pašā veidā var novērot sensibilizāciju un toleranci pret dažādām kokaīna aktivitātēm, abām adaptācijām izmantojot to pašu molekulu, ΔFosB, kas darbojas tajā pašā smadzeņu reģionā. Fakts, ka abas parādības var vienlaikus radīt, mīmējot vienu kokaīna iedarbību vienā frontokortikālajā lokā, akcentē kortikālo reģionu nozīmi hroniskas narkotiku lietošanas sekās.. Turklāt šie dati liecina, ka tolerance un sensibilizācija atspoguļo divus, šķietami kontrastējošus, tomēr cieši saistītus atkarības no atkarības narkotiku aspektus.

Ņemot vērā, ka palielināta ΔFosB ekspresija NAc ir būtiski iesaistīta lokomotoriskās sensibilizācijas attīstībā, viena ticama hipotēze būtu bijusi tāda, ka ΔFosB pārmērīga ekspresija OFC iepriekš dzīvniekus jutina pret kokaīnu, palielinot ΔFosB līmeni NAc. Tomēr tika konstatēts apgrieztais rezultāts: ΔFosB līmeņi NAc bija ievērojami zemāki dzīvniekiem, kas pārmērīgi ekspresēja ΔFosB OFC. Šīs NAc ΔFosB samazināšanās uzvedības sekas ir grūti interpretējamas, jo ΔFosB darbību inhibēšana ar ΔJunD pārmērīgu ekspresiju šajā reģionā samazina daudzus kokaīna efektus pelēm (Peakman et al., 2003). Pastāv dažas paralēles starp šiem novērojumiem un tiem, kas veikti saistībā ar dopamīna sistēmu. Piemēram, daļēja dopamīna izsīkšana NAc var novest pie hiperaktivitātes, kas var tieši ietekmēt dopamīna agonistus šajā reģionā (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinsona et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Tāpat fakts, ka ΔFosB pieaugošie kortikālā līmeņi var mazināt subortikālo izpausmi, līdzinās labi konstatētajam konstatējumam, ka prefrontālās dopamīnerģiskās transmisijas palielināšanās bieži vien ir saistīta ar striatāla dopamīna līmeņa savstarpēju samazināšanos (Deutch et al., 1990; Mitchell un Gratton, 1992). Šāda atgriezeniskās saites mehānisma darbība šūnu iekšējās signalizācijas molekulās šobrīd ir neskaidra, bet tā var atspoguļot izmaiņas dažu neironu tīklu vispārējā aktivitātē, ko izraisa gēnu transkripcijas izmaiņas. Piemēram, palielinot ΔFosB OFC, palielinās lokālās inhibējošās aktivitātes, ko apliecina GABA līmeņa paaugstināšanās._A receptoru, mGluR5 receptoru un vielu P, kā konstatēts mikroarray analīzē (Winstanley et al., 2007). Šī OFC aktivitātes maiņa varētu ietekmēt aktivitāti citās smadzeņu zonās, kas savukārt var novest pie vietējās izmaiņas ΔFosB ekspresijā. Tas, vai ΔFosB līmenis atspoguļo relatīvās dopamīna aktivitātes izmaiņas, ir jautājums, kas prasa turpmāku izmeklēšanu.

Pēc hroniskas kokaīna terapijas visi dzīvnieki ievērojami palielināja ΔFosB mRNS līmeni NAc, ievērojot iepriekšējos ziņojumus par palielinātu olbaltumvielu līmeni (Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). Tomēr nesenā ziņojumā konstatēts, ka pēc hroniskas amfetamīna terapijas AFosB mRNS līmenis vairs nav ievērojami paaugstināts 24 h, lai gan pēc pēdējās injekcijas 3 h novēroja ievērojamu pieaugumu (Alibhai et al., 2007). Šī neatbilstība var būt saistīta ar izmantoto psihostimulējošo zāļu (kokaīna un amfetamīna) atšķirību, bet, ņemot vērā kokaīna īsāku pusperiodu, būtu saprātīgi sagaidīt, ka tā ietekme uz gēnu ekspresiju normalizēsies ātrāk nekā amfetamīna, nevis otrādi. Daudz ticamāks iemesls šiem atšķirīgajiem rezultātiem ir tas, ka šajā pētījumā dzīvnieki 21 dienām tika injicēti ar mērenu zāļu devu divas reizes dienā, salīdzinot ar vienu lielas devas injekciju 7 dienās (Alibhai et al., 2007). Plašāka ārstēšanas shēma varēja izraisīt izteiktākas izmaiņas, kas novērotas šeit.

Lai gan gēnu ekspresijas izmaiņas, kas novērotas NAc pēc hroniska kokaīna, kopumā piekrīt iepriekš paziņotajiem konstatējumiem, iedarbības apmērs šajā pētījumā ir mazāks. Viens no iespējamiem iemesliem ir tas, ka dzīvnieki tika nogalināti tikai pēc 24 h pēc pēdējās kokaīna injekcijas, bet lielākā daļa pētījumu ir lietojuši audus, kas iegūti divas nedēļas pēc pēdējās zāļu iedarbības. Pētījumi, kas pēta lokomotoriskās sensibilizācijas laika gaitu, norāda, ka vēlākā laika posmā novērojamas izteiktākas izmaiņas gan uzvedībā, gan gēnu / proteīnu ekspresijā. Lai gan mēs ziņojam par nelielu dopamīna DRNS pieaugumu₂ receptoriem, vispārējā vienprātība ir tāda, ka D ekspresijas līmeņi₂ vai D₁ pēc lokomotoriskās sensibilizācijas attīstības, lai gan gan D palielināšanās, gan pazemināšanās, pastāvīgi nemainās₂ retrospektīvi pēc sensibilizējošā režīma beigām (skatīt (Pierce un Kalivas, 1997) diskusijām). Mūsu novērojums, ka GluR1 un GluR2 mRNS nemainījās pēc hroniskas kokaīna terapijas šajā agrīnā laika posmā, tāpat ir saskaņā ar iepriekšējo ziņojumu (Fitzgerald et al., 1996), lai gan GluR1 mRNS pieaugums ir konstatēts vēlākos punktos pēc hroniskas psihostimulanta ārstēšanas pārtraukšanas (Churchill et al., 1999).

Tomēr mēs novērojām nelielu PSD95 mRNS pieaugumu NAc dzīvniekiem, kas tika ārstēti hroniski ar kokaīnu. PSD95 ir sastatņu molekula, un tā ir viena no galvenajām olbaltumvielām, kas atrodas postinaptiskā eksitējošās sinapses blīvumā. Sinhronā tas nostiprina vairākus glutamāta receptorus un ar tiem saistītos signālu proteīnus, un tiek uzskatīts, ka PSD95 ekspresijas palielināšanās atspoguļo pastiprinātu sinaptisko aktivitāti un pastiprinātu glutamāta receptoru ievietošanu un stabilizāciju sinapsēs (van Zundert et al., 2004). Iepriekš tika ieteikta PSD95 loma lokomotoriskās sensibilizācijas attīstībā.Yao et al., 2004).

Loka izteiksmes pieaugums ir saistīts arī ar sinaptiskās aktivitātes pieaugumu. Tomēr, lai gan loka izpausmes pieaugums NAc ir novērots 50 min pēc injekcijas ar amfetamīnu (Klebaur et al., 2002), mūsu dati liecina, ka hroniska kokaīna lietošana nepalielina loka lokālo asinsspiedienu ilgstošāk, lai gan pēc ilgstošas ​​antidepresantu medikamentu lietošanas 24 h ir novērota loka palielināšanās.Larsen et al., 2007) un amfetamīnu (Ujike et al., 2002). Pēc akūtas kokaīna un amfetamīna ievadīšanas arī NAc novēro CREB fosforilācijas pieaugumu.Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Self et al., 1998), bet varbūt nav pārsteigums, ka pēc hroniskas kokaīna lietošanas CREB mRNS palielināšanās netika novērota. Tiek uzskatīts, ka signāls, izmantojot CREB ceļu, ir nozīmīgāks narkotiku lietošanas sākumposmā, un transkripcijas faktori, piemēram, ΔFosB, kas dominē kā atkarības progresēšana (McClung un Nestler, 2003). Kaut arī CREB ir iesaistīts kokaīna labvēlīgajā iedarbībā (Carlezon et al., 1998) nav ziņots, ka pieaugošā CREB izpausme ietekmē lokomotorisko sensibilizāciju, lai gan CREB endogēnā dominējošā negatīvā antagonista, inducējamā CAMP agresīvā proteīna vai ICER palielināšanās vīrusu starpā palielina hiperaktivitāti, ko izraisa akūta amfetamīna injekcija (Green et al., 2006).

Kopumā, lai gan lielākā daļa no narkotiku izraisītajām izmaiņām, ko mēs novērojām, ir saderīgas ar literatūras prognozēm, mēs nekonstatējām nekādas izmaiņas gēnu ekspresijā NAc, kas varētu izskaidrot jutīgo lokomotorisko reakciju pret kokaīnu, kas novērots ar narkotikām neārstētiem dzīvniekiem. ar OFC AAV-ΔFosB. Tas palielina iespēju, ka ΔFosB palielināšana OFC var neietekmēt motora sensibilizāciju caur NAc, lai gan varētu būt iesaistīti daudzi citi gēni, kas šeit nav pētīti. Ievērojami pierādījumi liecina, ka mediālās prefrontālās garozas (mPFC) modulācija var mainīt striatāla darbību un tādējādi veicināt uzvedības sensibilizāciju psihostimulantiem (Steketee, 2003; Steketee un Walsh, 2005), lai gan mazāk ir zināms par vairāk vēdera prefrontālo reģionu, piemēram, OFC, lomu. NAC saņem dažas OFC prognozes (Berendse et al., 1992). Tomēr jaunākā un detalizētākajā pētījumā tika konstatētas tikai dažas tiešās OFC-NAc projekcijas: pēc anterogrādās marķiera ievadīšanas OFC sānu un ventrolaterālajās zonās, kā arī ventrālākajā OFC tika novērota retākā NAc apvalka daļas marķēšana. reģions nosūta minimālās prognozes NAc kodam (Schilman et al., 2008). Centrālais caudāts-putamens saņem daudz blīvāku inervāciju. Ņemot vērā šos anatomiskos pierādījumus, lielākā daļa NAC audu, kas analizēts mūsu PCR reakcijās, OFC netiktu tieši inervēts, samazinot izredzes, ka gēnu ekspresijas izmaiņas tiks veiksmīgi konstatētas.

OFC lielā mērā projektē reģionus, kas paši ir cieši saistīti ar NAc, piemēram, mPFC, basolaterālā amigda (BLA), caudāta putamen un subthalamic kodols (STN). Atklāts jautājums ir par to, vai izmaiņas OFC varētu netieši modulēt NAC darbību, ietekmējot šīs jomas. Ir pierādīts, ka aktivitāte BLA tiek mainīta pēc OFC bojājumiem, un ka tas būtiski veicina OFC bojājumu izraisītu apgrieztās mācīšanās deficītu (Stalnaker et al., 2007), bet jebkādas sekas tādās jomās kā NAc vēl nav jāziņo. Var būt daudz lietderīgāk pievērst uzmanību citām jomām, kas ir ciešāk saistītas ar OFC un kuras arī ir lielā mērā saistītas ar motoru vadību. STN ir īpaši daudzsološs mērķis, jo ne tikai STN un OFC bojājumi rada līdzīgu ietekmi uz impulsivitāti un Pavlovijas mācībām (Baunez un Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaners un Robinsons, 2006; Winstanley et al., 2005a), bet psihostimulantu izraisītā lokomotoriskā sensibilizācija ir saistīta ar c-Fos ekspresijas palielināšanos šajā reģionā (Uslaner et al., 2003). Turpmākie eksperimenti, kas paredzēti, lai pārbaudītu, kā narkotiku izraisītās izmaiņas gēnu ekspresijā OFC ietekmē pakārtoto teritoriju, piemēram, STN, darbību. OFC arī nosūta nelielu projekciju uz vēdera apvalka zonu (Geisler et al., 2007) reģions, par kuru ir zināms, ka tas ir kritiski iesaistīts lokomotorisko sensibilizāciju. Iespējams, ka ΔFosB pārmērīga ekspresija OFC var ietekmēt lokomotorisko sensibilizāciju caur šo ceļu.

Pašlaik nav skaidrs, kāda ir saistība starp zāļu izraisītajām izmaiņām kognitīvajā funkcijā un lokomotorisko sensibilizāciju, un līdz šim mēs esam koncentrējušies uz OFC. Ņemot vērā šos konstatējumus, ir iespējams, ka gēnu ekspresijas izmaiņas, kas saistītas ar lokomotoriskās sensibilizācijas attīstību citos smadzeņu reģionos, var pretēji ietekmēt kognitīvo reakciju uz kokaīnu. Eksperimenti, kuros tiek pētīta kortikālo un subkortikālo zonu mijiedarbība pēc atkarību izraisošu zāļu ievadīšanas, var radīt jaunu gaismu par to, kā tiek veidota un uzturēta atkarīgā valsts, un interaktīvajām lomām, ko šajā procesā ieņem sensitizācija un tolerance.

Atsauces