Narkotiku pieredze epigenētiski inducē Fosb gēnu inducējamību žurku kodolā (2012)

Anotācija

Ievads

Narkotiku atkarību raksturo kompulsīva narkotiku meklēšana un to lietošana, neskatoties uz nopietnām nelabvēlīgām sekāmKalivas et al., 2005; Hymans et al., 2006). Hroniska zāļu iedarbība izraisa nemainīgas gēnu ekspresijas izmaiņas vēdera striatumā (vai kodolkrūmos; NAc) un muguras striatumā (vai caudate putamen; CPu), striatāla struktūrās, kas saistītas ar narkotiku atlīdzību un atkarību (Freeman et al., 2001; Robinsons un Kolb, 2004; Shaham un Hope, 2005; Maze un Nestler, 2011). ΔFosB, atdalīts un stabils proteīns, ko kodē tiešais agrīnā gēns, \ t Fosbs, ir labi raksturots transkripcijas faktors, ko inducē NAc un CPu ar hronisku ekspozīciju praktiski visām ļaunprātīgas lietošanas zālēm, kur tas mediē sensibilizētas uzvedības reakcijas uz atkārtotu zāļu ievadīšanu. (Nestler, 2008). Tomēr, vai iepriekšēja hroniska iedarbība uz ļaunprātīgu narkotiku iedarbību maina turpmāko ΔFosB indukciju, nav zināms.

Mēs nesen pieņēmām, ka hromatīna modifikācijas, reaģējot uz hronisku zāļu iedarbību, var mainīt specifisku gēnu inducējamību mērķa smadzeņu reģionos (Robison un Nestler, 2011). Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka ļaunprātīgas lietošanas narkotikas pēc hroniskas lietošanas maina hromatīna struktūru un transkripcijas pieejamību, izmantojot daudzu veidu modifikācijas, tostarp fosforilēšanu, acetilēšanu un histonu astes metilēšanu. Jaunāks darbs šūnu kultūras sistēmās ir vērsts uz RNS polimerāzes II (Pol II) piesaisti „inducējamo” gēnu promotoram pirms to izpausmes, Pol Pol II pastāvīgi piesaistoties pie tuvākajiem promotora reģioniem un ap transkripcijas sākuma vietu (TSS ) “apstājies” stāvoklī (Core un Lis, 2008; Nechaev un Adelman, 2008). Tiek uzskatīts, ka iestrēgušā Pol II aktivizēšana ir atbildīga par tās aizbēgšanu no promocijas un TSS reģioniem un to transkripcijas šiem „gruntētajiem” gēniem (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille et al., 2012).

Šeit mēs parādām, ka iepriekšēja hroniska kokaīna iedarbība, kam seko pagarināts zāļu izdalīšanās periods, maina AUC induciblitāti Fosbs gēnu uz turpmāko kokaīna ievadīšanu, un NAc tiek sagatavots indukcijai, kamēr CPu nav. Pēc tam mēs identificējam atšķirīgus hromatīna parakstus Fosbs gēnu promotors NAc un CPu, kas ir saistīti ar šādu. \ t Fosbs gēnu, tostarp apturēto Pol II pieņemšanu darbā Fosbs proksimālais promotors tikai NAc, kā arī izmaiņas vairākos aktivizējošos vai represīvos histona modifikācijās abos smadzeņu reģionos. Šie rezultāti sniedz jaunu ieskatu hromatīna dinamikā Fosbs gēnu promotors un pirmo reizi norāda mehānismu, ar kuru tiek pārtraukta Pol II prime Fosbs lielākai aktivizēšanai NAc pēc kokaīna atkārtotas iedarbības.

Materiāli un metodes

rezultāti

Greater Fosb inducējamība ar kokainu ārstētiem žurkām NAc, bet ne CPu

Izpētīt iepriekšēja hroniska kokaīna kursa ietekmi, kam seko ilgstošs zāļu lietošanas pārtraukšanas periods. \ T Fosbs gēnu, reaģējot uz nākamo kokaīna izaicinājumu, žurkām, kuras iepriekš ievadīja ip divas reizes dienā ar sāls šķīdumu vai kokaīnu (15 mg / kg) 10 dienām, tika dota zāļu devas pēc 28 izņemšanas dienas (1A). Vispirms mēs izmērījām lokomotorās atbildes reakcijas vienā dzīvnieku grupā, lai apstiprinātu lokomotorisko sensibilizāciju ar iepriekšēju kokaīna iedarbību, kas ir paredzama zāļu lietošanas ilglaicīga ietekme. Kokaīna un pieredzējušiem žurkām bija līdzvērtīga sākotnējā lokomotoriskā aktivitāte, un kokaīna iedarbība tika novērsta pret iepriekš neārstētiem dzīvniekiem, palielinot to kustību (1B. Atkārtoti pasākumi divvirzienu ANOVA, apstrāde: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; kokaīna izaicinājums: F_2,66= 58.39, p <0.0001; ārstēšana x kokaīna izaicinājums: F_2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferroni pēcpārbaudes ^{^}p <0.001). Šī kokaīna izsaukšana izraisīja ievērojami lielāku kustību aktivitāti, ti, sensibilizāciju, ar kokainu pieredzējušām žurkām (Bonferroni pēcpārbaudes * p <0.001).

  

Skaitlis 1

Iepriekšējas hroniskas kokaīna iedarbības ietekme uz lokomotorisko aktivitāti un Fosbs indukcija NAc un CPu pēc zāļu atkārtotas iedarbības

Lai novērtētu šīs kokaīna pirmapstrādes shēmas ietekmi uz ΔFosB ekspresiju NAc un CPu, mēs izmērījām ΔFosB proteīnu ar imūnhistoķīmiskām metodēm 24 hr pēc kokaīna neārstētiem un kokaīna pieredzējušiem dzīvniekiem ārstējot ar 0, 1, 3 vai 6 ikdienas kokaīna izaicinājumu injekcijas (15 mg / kg; skatīt 1A). Kā iepriekš noteikts (Nye et al., 1995), 3 kokaīna injekcijas bija pietiekamas, lai nozīmīgi izraisītu ΔFosB proteīnu neārstētu dzīvnieku NAc un CPu, un tās uzkrāšanās saglabājās nozīmīga pēc 6 dienas kokaīna injekcijām (1C. Atkārtoti pasākumi divvirzienu ANOVA, NAc kodols, apstrāde: F_1,28= 23.5, p <0.0001; kokaīna izaicinājums: F_3,28= 49.16, p <0.0001; ārstēšana x kokaīna izaicinājums: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc apvalks, apstrāde: F_1,28= 18.69, p <0.0001; kokaīna izaicinājums: F_3,28= 31.52, p <0.0001; ārstēšana x kokaīna izaicinājums: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, ārstēšana: F_1,28= 9.47, p <0.001; kokaīna izaicinājums: F_3,28= 19.74, p <0.0001; ārstēšana x kokaīna izaicinājums: F_3,28= 0.94, p> 0.05. NAc kodolā, apvalkā un CPu Bonferroni pēcpārbaudes ^{^}p <0.05). Kokaīnā pieredzējušiem dzīvniekiem nebija pierādījumu par nepārtrauktu ΔFosB indukciju NAc vai CPu pēc 28 dienu pārtraukšanas, saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem, ka ΔFosB signāls līdz šim brīdim pilnībā izkliedējas (Nye et al., 1995), iemesls šim laika posmam tika izmantots šajā pētījumā. Tomēr pārsteidzoši, ka kokainu pieredzējušām žurkām, kas saņēma 3 vai 6 kokaīna injekcijas injekcijas, bija ievērojami lielāka ΔFosB proteīna indukcija NAc, kas ir acīmredzama gan kodolu, gan čaumalu apakšreģionos (1C. Bonferroni pēcpārbaudes * p <0.05). Turpretī CPu netika novērota šāda lielāka ΔFosB olbaltumvielu indukcija; tā vietā ekvivalenta ΔFosB indukcija tika novērota šajā reģionā pēc 3 vai 6 dienu ilgas kokaīna izaicināšanas injekcijām žurkas, kas iepriekš nebija lietojušas kokaīnu un kurām nebija pieredzes (1C).

Lai iegūtu priekšstatu par NAc un CPu transkripcijas izmaiņām, reaģējot uz kokaīna izaicinājumu, mēs pētījām AFosB un FosB mRNS transkriptu inducējamības laika gaitu (45, 90 un 180 min), ievadot vienu kokaīnu vai sāls šķīdumu. pēc 28 izņemšanas dienām (skatīt. \ t 1A). Salīdzinot ar sālsūdens izaicinājumu, kokaīna izaicinājums izraisīja strauju AFosB un FosB mRNS līmeņa paaugstināšanos visos triju laika posmos gan ar NAc, gan CPu grupā, kas nav iepriekš ārstēti ar kokaīnu.1D. Atkārtoti pasākumi vienā virzienā ANOVA uz laika punktu; Bonferroni pēcpārbaudes ^{^}p <0.05). NAc gadījumā mēs novērojām lielāku ΔFosB un FosB mRNS indukciju dzīvniekiem ar kokaīnu, kuri bija pieredzējuši kokaīnu, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas iepriekš nebija lietojuši kokaīnu, pēc kokaīna izsaukšanas, efekts bija ievērojams 90 minūšu laikā, savukārt, pretēji ΔFosB un FosB mRNS inducējamība CPu bija ievērojami samazinājies dzīvniekiem ar kokaīnu (1D. Bonferroni pēcpārbaudes ^%p = 0.08, * p <0.05).

Kokaīna pieredzējušu žurku augšupejošo signālu ceļu raksturojums NAc un CPu

Viens no iespējamiem izskaidrojumiem par izmainīto. \ T Fosbs NAc un CPu gēns pēc iepriekšēja hroniska kokaīna kursa ir tāds, ka attālināta kokaīna ekspozīcijas vēsture var izraisīt ilgstošas ​​izmaiņas signalizācijas ceļos, kas atrodas augšup pa straumi. Fosbs gēnu indukcija tādā veidā, ka kokaīna izaicinājums pēc tam inducē gēnu aberranta pakāpē. Lai izpētītu šo hipotēzi, mēs analizējām abus transkripcijas faktorus - SRF un CREB, kas nesen tika pierādīti, lai būtu nepieciešami ΔFosB kokaīna indukcijai šajos smadzeņu reģionos (Vialou et al., 2012) kopā ar proteīnu kināzēm, ERK un AKT, kas saistītas arī ar kokaīna iedarbību (\ tValjent et al., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Mēs nespējām noteikt jebkādas izmaiņas šo dažādo proteīnu kopējā vai fosforilētajā līmenī, kas varētu izskaidrot izmainīto inducibilitāti. Fosbs novērotas, ieskaitot izmaiņas SRF, CREB vai AKT (2B, C). PKRF un pCREB izmaiņu trūkums NAc, reaģējot uz kokaīna izaicinājumu, atbilst nesenajam ziņojumam, kurā konstatēts, ka tikai hronisks kokaīns izraisīja būtisku ietekmi (Vialou et al., 2012).

  

Skaitlis 2

Iepriekšējas hroniskas kokaīna iedarbības ietekme uz augšupējās molekulārās signalizācijas kaskādēm NAc un CPu

Narkotiku un CPu gadījumā, kas nav iepriekš ārstēti ar dzīvniekiem, 20 min pēc sākotnējās zāļu iedarbības (2A), viena kokaīna lietošanas problēma mazina pERK42 / 44 \ t2B, C. Divu astes Studenta t-tests: * p <0.05). Iepriekš ir ziņots par pERK līmeņa paaugstināšanos šajos reģionos pēc akūtas kokaīna lietošanas (Valjent et al., 2000). To ir grūti salīdzināt ar citiem dokumentiem, kuros aplūkota ERK fosforilācija NAc, pārtraucot atkārtotas kokaīna injekcijas (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), tāpat kā mūsu pētījumā pERK tika noteikts pēc 28 izņemšanas dienām un pēc kokaīna vai sāls šķīduma. Salīdzinājumā ar iepriekš neārstētiem medikamentiem, kuri pirmo reizi piedzīvoja kokaīnu, kokaīna lietošanas laikā atkārtoti lietojot kokainu, pēc 28 lietošanas pārtraukšanas dienas, ievērojami palielinājās pERK42 / 44 līmenis CPu (2B, C. Divu astes studentu t-tests: * p <0.05).

Kromatīna ainava pie Fosb gēna promotors NAc un CPu ar kokainu pieredzējušiem žurkām

Pēc tam mēs pētījām, vai ir izmaiņas Fosbs gēnu inducējamība ir saistīta ar izmaiņām tās hromatīna struktūrā. ChIP tika veikta ar NAc un CPu, izmantojot antivielas, kas vērstas pret trim labi raksturotām histona modifikāciju formām: histona H4 (H3K3me4) Lys3 trimetilēšanu, kas saistīta ar gēnu aktivizāciju, un H3K27me3 un H3K9me2, kas saistīti ar gēnu represijām. Pēc 28 atcelšanas dienām mēs analizējām ar kokaīnu neārstētas un pieredzējušās žurkas bez kokaīna injekcijas vai bez tās, ar dzīvniekiem vēlāk pārbaudot 1 hr.3A). NAc nav konstatētas nekādas būtiskas izmaiņas attiecībā uz kādu no šiem trim histona modifikācijām Fosbs gēnu promotors bez kokaīna izaicinājuma, lai gan bija tendence samazināt H3K9me2 līmeņus (3B-D. Divu astoņu studentu t-tests. ^#p = 0.2, salīdzinot ar attiecīgajām narkotiku apkarošanas kontrolēm). Šis efekts kļuva nozīmīgs pēc kokaīna lietošanas un bija specifisks gēna proksimālajam promotora reģionam (3C. * p <0.05). Kaut arī dažos gēnos H3K9me2 līmenis ir ļoti zems, Fosbs gēnu promotors uzrāda ievērojamus šīs zīmes līmeņus NAc kontroles apstākļos (Maze et al., 2010, dati nav parādīti). Pretstatā tam, CPu, mēs atklājām nelielu, bet ievērojamu H3K4me3 saistīšanās samazināšanos un palielinājās H3K27me3 saistošajā vietnē Fosbs veicinātājs bez kokaīna izaicinājuma, sekas, kas zaudētas pēc \ t3D. * p <0.05).

  

Skaitlis 3

Iepriekšējas hroniskas kokaīna iedarbības ietekme uz epigenetisko gruntēšanu. \ T Fosbs gēnu NAc un CPu

Pēc tam mēs pētījām Pol II saistošos Fosbs gēns, pamatojoties uz jaunākajiem konstatējumiem šūnu kultūrā, ka Pol II apstāšanās TSSs, ko raksturo tā fosforilācija Ser 5 tās CTD atkārtošanās reģionā, ir saistīta ar gēnu primēšanu (skatīt ievadu). Tādējādi mēs analizējām Pol II-pSer5 saistošos Fosbs četros atšķirīgos gēnu reģionos (3B). Šī analīze atklāja Pol II-pSer5 nozīmīgu bagātināšanos Fosbs gēnu, kas atrodas tuvākajā promocijas reģionā, un ap to TSS NAc ar kokainu pieredzējušiem dzīvniekiem pēc ilgstošas ​​atsaukšanas, ja nav kokaīna, salīdzinot ar kontroles līdzekļiem (3E. * p <0.05). Šī bagātināšanās nebija redzama divos Gēnu ķermeņa reģionos Fosbs, kas atbilst Pol II apstādināšanai, kas aprakstīta vienkāršākās eksperimentālās sistēmās. Interesanti, ka pēc kokaīna izaicinājuma Pol II-pSer5 saistīšanās joprojām liecināja par bagātināšanas pazīmēm, lai gan tās vairs nav ievērojami Fosbs proksimālais veicinātāja reģions (3E. ^%p = 0.1), bet atgriezās kontroles līmeņos TSS. CPu rezultāti bija daudz mainīgāki, un nav novērota skaidra Pol II-pSer5 saistīšanās tendence.

diskusija

Šis pētījums sniedz jaunu ieskatu ilgstošā regulējumā Fosbs nedēļas pēc atkārtotas kokaīna iedarbības pārtraukšanas. Mēs parādām, ka iepriekšēja hroniska kokaīna lietošana padara Fosbs gēnu, kas ir inducējams NAc, kas izraisa ātrāku ΔFosB uzkrāšanos pēc atkārtotas zāļu iedarbības. Ņemot vērā to, ka pārsvarā ir pierādījumi, ka ΔFosB indukcija NAc vidē ietekmē sensibilizētas reakcijas uz kokaīnu (Nestler, 2008), mūsu konstatējumi atklāj jaunu mehānismu šādu sensibilizētu reakciju ātrākai atjaunošanai pēc ilgstošas ​​atsaukšanas.

Mēs parādām, ka uzlabotā ΔFosB indukcija NAc ir saistīta ar hromatīna izmaiņām Fosbs gēnu, kas sagaidāms, ka tas veicinās lielāku indukciju. Tādējādi mēs parādām palielinātu Pol II saistīšanos ar gēna proksimālo promotoru un TSS reģioniem, kas ir pēc 4 nedēļu pārtraukšanas no iepriekšējas hroniskas kokaīna lietošanas. Šāda Pol II bagātināšana TSS tiek ātri zaudēta, ja tiek izaicināts kokaīns, un Fosbs indukcija, kas atbilst modelim šūnu kultūrā, kas apturēja Pol II izdalīšanos no TSS pēc gēnu aktivācijas (skatīt ievadu). Kokaīna izaicinājums arī izraisa strauju H3K9me2 - gēnu represiju zīmes - samazināšanos uz Fosbs veicinātājs. Pretstatā tam, mēs atklājām, ka nav ilgstošu vairāku transkripcijas faktoru vai to augšupejošo kināžu indukcijas, par kurām ir zināms, ka tās ir Fosbs kokaīna indukcija. Šie rezultāti apstiprina mūsu hipotēzi, ka pastiprināta ΔFosB indukcija NAc ir saistīta ar epigenetisko primēšanu. Fosbs gēnu, nevis ar augšupvērstu notikumu regulēšanu.

Tika iegūti ļoti atšķirīgi rezultāti par CPu. Nebija pierādījumu par Pol II apstāšanos Fosbs ar kokainu ārstētiem žurkām pirms kokaīna lietošanas, lai gan bija nelieli, bet nozīmīgi histona modifikācijas, kas atbilst gēnu represijām: palielinājās H3K27me3 saistīšanās un samazinājās H3K4me3 saistīšanās. Nav arī izmaiņas augšupejošajos transkripcijas faktoros vai kināzēs, kas atbilst samazinātajam Fosbs indukcija. Šie rezultāti liecina, ka pēc hroniskas kokaīna lietošanas epigenetiskās modifikācijas mazina Fosbs gēnu inducējamība CPu, atšķirībā no gruntēšanas, kas redzama NAc. Tomēr, lai gan šie efekti atsāk ΔFosB mRNS indukciju pēc atkārtotas iedarbības uz kokaīnu, ΔFosB proteīna uzkrāšanās nav zudusi. Šim paradoksam pamatā esošais mehānisms tagad prasa turpmāku izmeklēšanu.

Vispārīgi runājot, mūsu rezultāti atbalsta modeli, kurā izmaiņas hromatīna ainavā noteiktos gēnos, reaģējot uz hronisku kokaīna ievadīšanu, kalpo, lai sāktu vai izjauktu šos gēnus turpmākai indukcijai pēc atkārtotas zāļu iedarbības. Šādas hromatīna izmaiņas, kuras var uzskatīt par “epigenetiskām rētām”, tiktu izlaistas gēnu gēnu stabila stāvokļa analīzēs. Šādā veidā atkarības epigēnuma raksturojums sola atklāt jaunu informāciju par slimības molekulāro patoģenēzi, kuru var iegūt jaunu ārstēšanas metožu izstrādei.

Pateicības

Atsauces