PLoS Viens. 2013 Nov 25, 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
avots
Uzvedības fizioloģijas laboratorija, Humanitāro zinātņu augstskola, Tokijas metropoles universitāte, Tokija, Japāna.
Anotācija
Fiziskais vingrinājums uzlabo daudzus hipokampusa funkcijas aspektus. Saskaņā ar priekšstatu, ka neironu darbība ir būtiska, lai veicinātu neironu funkcijas, iepriekšējā literatūra ir konsekventi parādījusi, ka akūtās vingrinājumi izraisa neironu aktivāciju hipokampā. Atkārtoti aktivizējošie stimuli izraisa transkripcijas faktora ΔFosB uzkrāšanos, kas mediē ilgstošu nervu plastiskumu.
Šajā pētījumā mēs pārbaudījām hipotēzi, ka ilgstoša brīvprātīga riteņu vadīšana izraisa ΔFosB ekspresiju hipokampā un pārbaudīja visus iespējamos reģiona specifiskos efektus hippokampālā apakšmezglos gar dorsventrālo asi. Vīrieši C57BL / 6 pelēm tika izmitināti ar vai bez braukšanas riteņa 4 nedēļām. Ilgtermiņa riteņu vadība ievērojami palielināja FosB / ΔFosB imūnreaktivitāti visos hippokampu reģionos, kas tika mērīti (ti, DG, CA1 un CA3 apakšnozarēs gan muguras, gan vēdera hipokampam). Rezultāti apstiprināja, ka riteņu vadīšana izraisīja specifisku FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes ekspresiju garozā, liekot domāt, ka vienāds FosB / ΔFosB pieaugums hipokampā nav nekādas specifiskas darbības sekas. Western blot dati liecināja, ka paaugstinātā hippokampālā FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte galvenokārt bija saistīta ar palielināto ΔFosB. Šie rezultāti liecina, ka ilgstošs fiziskais vingrinājums ir spēcīgs AFosB indukcijas ierosinātājs visā hipokampā, kas izskaidro, kāpēc vingrinājums var uzlabot gan muguras, gan vēdera hipokampusa atkarīgās funkcijas. Interesanti, ka mēs konstatējām, ka FosB / ΔFosB ekspresija DG bija pozitīvi saistīta ar dubultkortīna-imunoreaktīvo (ti, nenobriedušo) neironu skaitu.
Lai gan mehānismi, ar kuriem ΔFosB mediē vingrojuma izraisīto neirģenēzi, joprojām ir neskaidri, šie dati norāda, ka vingrojumu izraisīta neirogeneze ir vismaz atkarīga no aktivitātes. Kopumā mūsu pašreizējie rezultāti liecina, ka ΔFosB ir jauns molekulārs mērķis, kas iesaistīts vingrošanas izraisītas hipokampas plastiskuma regulēšanā.
Ievads
Vingrojums piešķir dažādus ieguvumus no hipokampusa molekulārajiem, strukturālajiem un funkcionālajiem aspektiem grauzējiem [1,2], no kuriem daži tika atbalstīti ar cilvēka pētījumiem [3,4]. Tomēr mehānismi, kas ir pamatā vingrošanas izraisītajām hipokampas plastiskuma izmaiņām, nav pietiekami saprotami. Iepriekšējā literatūra ir konsekventi parādījusi, ka vingrinājumi izraisa hippokampu neironu aktivāciju grauzējiem. Imūnhistoķīmiskie pētījumi, kuros izmanto c-Fos, pārejoša neironu aktivācijas marķieri, ir pierādījuši, ka gan piespiedu, gan brīvprātīga palielināta c-Fos ekspresija grauzēju hipokampusa dentāta gyrus (DG), CA1 un CA3 apakšnozarēs [5-7]. Turklāt iepriekšējā pētījumā, kurā tika izmantota lāzera-Doplera plūsmas metode (LDF), ir pierādīts, ka maigs skrejceļš, kas darbojas ar paaugstinātu reģionālo smadzeņu asins plūsmu (rCBF), kas ir alternatīvs neironu aktivācijas marķieris, CA1 apakšmākslā žurkām [8]. Imūnhistoķīmiskie pētījumi ļauj detalizētai reģionam specifiskai analīzei pēc treniņa pārtraukšanas, bet LDF ļauj reālā laikā uzraudzīt rCBF lokalizētā zonā treniņu laikā. Neskatoties uz katra pētījuma priekšrocībām un ierobežojumiem, šie pētījumi līdzīgi demonstrēja akūtu vingrojumu ietekmi uz hipokampu neironu aktivitāti. Šie rezultāti liecina par mehānismu, ar kura palīdzību ilgstoša regulāra fiziskā slodze veicina hipokampu plastiskumu, atkārtoti aktivizējot neironu aktivāciju [9].
Transkripcijas faktoru ΔFosB, saīsinātu spraugas izofilmu, kas ir pilna garuma FosB, inducē dažāda veida atkārtoti stimuli specifiskos smadzeņu reģionos, kur tas pakāpeniski uzkrājas, pateicoties tās unikālajai stabilitātei (nedēļu pusperiods) [10-12]. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka palielināts ΔFosB līmenis ir saistīts ar ilgstošu neironu un uzvedības plastiskumu, kas saistīts ar konkrētiem stimuliem [11,13]. Piemēram, ļaunprātīgas lietošanas, piemēram, kokaīna un morfīna, hroniska lietošana parasti palielina ΔFosB ekspresiju kodolkrāsās, kas ir viens no molekulārajiem mehānismiem, kas palielina jutību pret šīm zālēm. [11,14,15]. Slīdzīgi citiem atalgojuma stimuliem, ieskaitot augstu tauku saturu un seksuālo pieredzi [16,17], lbrīvprātīga riteņu vadība uz laiku palielināja arī FosB / ΔFosB imūnreaktivitāti žurku kodolā, kas liecina, ka brīvprātīga braukšana ir dabisks atalgojums grauzējiem. [18,19]. Tomēr, cik mums zināms, nevienā literatūrā nav pētīts, vai atkārtota fiziskās slodzes iedarbība izraisa ΔFosB izpausmi hipokampā. Tā kā vingrinājums izraisa neironu aktivizēšanos hipokampā, mēs pieņēmām, ka ilgstoša brīvprātīga riteņu vadīšana arī izraisītu ΔFosB izpausmi hipokampā. Lai gan precīzie mehānismi, ar kuriem ΔFosB regulē hipokampu plastiskumu, ir neskaidri, pētījumi ir pierādījuši, ka pelēm, kurām nav \ t fosB gēns uzrāda hipokampu neirogēzi un pastiprinātu depresiju līdzīgu uzvedību [20,21]. Iir zināms, ka vingrinājums uzlabo neirogēzi un ir antidepresantu īpašības [22-25]. If Mūsu hipotēze ir pareiza, ΔFosB būtu jauns potenciāls molekulārs mērķa starpnieks, kas veicina vingrojumu izraisītu hipokampu plastiskumu.
Hipokampam ir anatomiska un funkcionāla gradienta gar garenisko (dorso-ventrālo) asi [26]. Dorsālajam hipokampam ir galvenā loma telpiskajā mācīšanā un atmiņā [27,28], turpretim vēdera hipokamps galvenokārt ir iesaistīts emocionālās uzvedības regulēšanā [29,30]. Turklāt pētījumi ir pierādījuši, ka fizioloģiskie stimuli inducē dažādus c-Fos ekspresijas modeļus hipokampusa muguras un vēdera daļās [31-33]. Tā kā vingrinājums uzlabo gan muguras [34-37] un vēdera hipokampusa atkarīgās funkcijas [24,25,38] ir svarīgi pārbaudīt, vai ilgstoša brīvprātīga darbība izraisa reģionam raksturīgu ΔFosB ekspresiju hipokampā.
Šī pētījuma primārā hipotēze bija tāda, ka ilglaicīga brīvprātīga riteņu kustība izraisītu ΔFosB ekspresiju peles hipokampā. Šo hipotēzi pētīja FosB / ΔFosB imūnhistoķīmija dorsālo un ventrālo hipokampu apakšnozarēs, DG, CA1 un CA3, īpaši uzsverot reģiona specifiskās indukcijas noteikšanu. Rezultātus apstiprināja ar rietumu blotēšanu, kas tika izmantots, lai identificētu fosB hippocampus izraisītie gēnu produkti. Mēs arī pārbaudījām reģiona specifiskās FosB / ΔFosB indukcijas garozu, lai izslēgtu iespēju, ka ilgstoša fiziskā aktivitāte nespecifiski palielina FosB / ΔFosB imunoreaktivitāti smadzenēs. Visbeidzot, tika pētīta korelatīvā saistība starp FosB / ΔFosB ekspresiju un neirogēzi, jo tā bija pirmais solis, lai meklētu vingrojuma izraisītas ΔFosB indukcijas funkcionālās sekas hipokampu plastiskuma regulēšanā.
Materiāli un metodes
1: Dzīvnieki un ētikas paziņojums
Divdesmit vīriešu C57BL / 6 peles (8 nedēļas) iegādājās no komerciāla selekcionāra (SLC, Shizuoka, Japāna). Eksperimentam 1 tika izmantotas desmit peles, bet pārējās desmit - 2. Peles tika turētas kontrolētos temperatūras apstākļos (22 – 24 ° C) un gaismā (12 / 12-h gaišais / tumšais cikls, iedegās pie 0500) un tika nodrošināta pārtika un ūdens ad libitum. Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja Tokyo Metropolitan University dzīvnieku eksperimentālās ētikas komiteja.
Katrā eksperimentā pēc ierašanās peles tika nejauši iedalītas vai nu kontrolgrupā (Control, n = 5), vai arī darbojas grupā (Runner, n = 5). Pirmajā nedēļā visas peles tika ievietotas standarta plastmasas būros grupās (5 peles / būris) sākotnējai aklimatizācijai. Pēc tam Runner peles tika pārvietotas būrī, kas aprīkota ar braukšanas riteni (ENV-046, Med Associate Inc., Gruzija, VT, ASV). Tā kā ir zināms, ka sociālā izolācija slāpē vingrojumu izraisītu neirogēzi hipokampā [39] Runner peles tika izmitinātas kā grupa (5 peles / būris) papildu 4 nedēļām. Riteņu rotāciju skaits tika reģistrēts katru rītu, un ķermeņa svars (g) tika mērīts katru nedēļu.
2: Eksperiments 1. FosB / ΔFosB ekspresijas un hipokampālā neirogenēzes imūnhistoķīmiskā pārbaude
2.1: Perfūzija un audu apstrāde
No rīta (0900 – 1100) pēc pēdējās darba laika dienas pelēm dziļi tika anestezētas ar pentobarbitāla nātriju un transkardiāli perfūzētas ar aukstu sāls šķīdumu. Smadzenes tika ātri noņemtas un pēc tam fiksētas 4% paraformaldehīdā 0.1 M fosfāta buferētajā sāls šķīdumā (PBS, pH 7.4). Pēc tam smadzenes tika aizsargātas ar 30% saharozi PBS un sasaldētas līdz turpmākai pārstrādei. Puslodes koronālās smadzeņu sekcijas (40 μm) tika iegūtas, izmantojot sasalšanas mikrotomu un savācot PBS ar 0.01% nātrija azīdu.
2.2: Imūnhistoķīmija
FosB / ΔFosB imūnfiltrēšanai izlases veidā tika atlasīta viena sešu sekciju sērija. Blakus esošā sērija tika izmantota doublecortin (DCX) marķēšanai, kas ir nenobriedušu neironu marķieris, kas apstiprināts, lai novērtētu neirogēzi [40,41]. Pēc endogēnās peroksidāzes aktivitātes pārtraukšanas ar 1% H2O2 PBS, brīvi peldošas sekcijas tika iepriekš inkubētas ar bloķējošu šķīdumu, kas satur 10% normālu zirgu serumu PBS 2 h. Pēc skalošanas PBS, sekcijas tika inkubētas ar trušu poliklonālo pan-FosB antivielu (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), kas atšķaidīts PBS ar 0.5% Triton X-100 un 0.5% BSA -BSA) 24 h pie 4 ° C. Vēl viena sekciju sērija tika inkubēta ar kazas poliklonālo anti-DCX antivielu (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) PBST-BSA 48 h pie 4 ° C. Sekcijas tālāk inkubēja ar atbilstošu biotinilētu sekundāro antivielu (anti-truša IgG, 1: 1000, AP182B; anti-kazu IgG, 1: 1000, AP180B, abas antivielas no EMD Millipore, Billerica, MA, ASV) PBST-BSA. 2 h istabas temperatūrā. Pēc tam sekcijas tika apstrādātas ar avidīna-biotīna-peroksidāzes kompleksu (Vectastain ABC peroksidāzes komplekts, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, ASV) pēc 90 min pēc ražotāja norādījumiem. Visbeidzot, antigēni vizualizēja ar 0.02% 3,3-diaminobenzidīnu (DAB) 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), kas satur 0.01% H2O2. FosB / ΔFosB imūnfiltrācijai reakcija tika pastiprināta ar niķeļa amonija sulfātu. DCX iekrāsošanai šūnu kodoli tika nokrāsoti ar Nissl krāsošanu. Sekcijas tika uzstādītas uz želatīna pārklātajiem priekšmetstikliņiem un uzliktas plāksnes.
2.3: FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot attēla sliekšņus
Šajā pētījumā izmantotā pan-FosB antiviela tika audzēta pret iekšējo reģionu, ko kopīgi izmanto FosB un ΔFosB N-terminālais reģions, tāpēc nevar izšķirt abas šīs izoformas. Tādēļ imūnsistēmas struktūras tika aprakstītas kā FosB / ΔFosB imūnreaktīvie (FosB / ΔFosB-ir) kodoli. Objektīvai aklai kvantitatīvai noteikšanai slaidi tika kodēti pirms analīzes. Peles smadzeņu atlants [42] tika izmantots, lai identificētu šādu interešu apgabalu atrašanās vietu (ROI): DG (3 sekciju) granulu šūnu slānis (GCL), CA1 (3 sekcijas) piramīdas šūnu slānis un sekcijas CA3 (2 – 3 sekcijas) \ t (slēgts -2.2 mm no bregmas); DG (2 sekcijas), CA1 (2 sekcijas) un CA3 (2 sekcijas) vēdera hipokampā (aizvērtas -3.4 mm no bregmas) (Skaitlis 4, pa kreisi). Caudālas sekcijas satur gan hipokampusa muguras, gan vēdera daļas, bet vēdera daļa tika mērķēta. ĢD, suprapyramidal (DGsp) un infrapiramīdo (DGip) asmeņi tika analizēti atsevišķi. Motoru garoza (2 – 3 sekcijas, aizvērtas -0.6 mm no bregmas), somatosensorālais stobra garoza (2 – 3 sekcijas, aizvērtas -0.6 mm no bregmas), redzes garoza (3 sekcijas, aizvērtas -2.9 mm no bregma), dzirdes garoza (3 sekcijas, aizvērtas -2.9 mm no bregmas) un ožas spuldze (3 sekcijas, slēgtas līdz + 4.3 mm no bregmas).Skaitlis 6, pa kreisi).
Katra ROI digitālie attēli (2070 × 1548 pikseļi) tika veikti, izmantojot optisko mikroskopu (BX-51, Olympus, Tokija, Japāna), kas aprīkota ar CCD kameru (DP-73, Olympus) un attēlveidošanas programmatūru (cellSens, Olympus). objektīva objektīva palielinājums bija 10 × hippokampālā ROI un 4 × attiecībā uz kortikālo ROI. Lai noteiktu vidēji spēcīgu FosB / ΔFosB imūnreaktivitāti (1D – G attēls), izmantojot vairākas sadaļas iepriekš, abi attēla iegūšanas iestatījumi (gaismas intensitāte, lauka apstāšanās lielums, ekspozīcijas laiks un baltā balanss) un sliekšņa līmeņi katram RGB komponentam tika optimizēti hipokampu un kortikālo ROI. Turpmāk veikta analīze tika veikta optimālos apstākļos (1). ROI atlasīja neregulāri veidots daudzstūris (Attēls 1A, B) (2). Attēls bija sliekšņa, kas pārveidoja FosB / ΔFosB-ir kodolus uz sarkanu krāsu (Attēls 1C-G) (3). Tad% ROI tika automātiski aprēķināts šādi:% ROI = (konvertētais apgabals (sarkanā krāsā) / kopējā ROI apgabals) × 100.
Lai apstiprinātu šo attēla sliekšņa analīzi, 20 reģioni tika nejauši izvēlēti no dažādām smadzeņu zonām ar dažādiem reģiona izmēriem. Papildus attēla sliekšņa kvantitatīvajai noteikšanai, FosB / ΔFosB-ir kodolu skaits izvēlētajos reģionos tika aprēķināts manuāli un FosB / ΔFosB-ir kodolu blīvums tika iegūts, dalot FosB / ΔFosB-ir kodolu skaitu ar izmērīto. platība (mm2).
2.4: DCX-ir nenobriedušu neironu kvantitatīva noteikšana zobu gyrus
DCX-ir nenobriedušie neironi Runner peles pelēm bija bagātīgi un pārklājas, tāpēc bija grūti precīzi aprēķināt DCX-ir soma diskrēto skaitu, izmantojot optisko mikroskopu. Tomēr iepriekšējā pētījumā Sholl analīze morfoloģiskajam novērtējumam parādīja, ka katram DCX-ir neironam vidēji ir viens dendrīts, ja to mēra soma 40 μm robežās.43]. Tāpēc tika izstrādāta šāda sākotnējā analīze, lai ļautu noteikt reģionam specifisku DCX-ir neironu daudzumu.
- (1) GCL attēls tika projicēts uz datora displeja, izmantojot attēlveidošanas programmatūru un 40 × objektīva lēcu (2). Uz tiešā attēla tika izveidots līnijas segments (150 ± 0.1 μm) pa GCL vidū (Skaitlis 2) (3). Mainot fokusa dziļumu, tika aprēķināts, cik reizes līnija segmenta šķērsoja DCX-ir dendrites (4). ROI (dorsāls DGsp, dDGsp; muguras DGip, dDGip; ventrālais DGsp, vDGsp; ventrālais DGip, vDGip) atbilst reģioniem, kuros tika analizēta FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte (5). Katrā ROI, 2 – 3 līnijas segmenti tika izvilkti pa sadaļu, un krustojumu skaits tika aprēķināts vidēji uz 2 – 3 sadaļām uz vienu peli. Tā kā GCL biezums ir aptuveni 60 – 80 μm, krustojumu skaitam jāatspoguļo DCX-ir neironu skaits ierobežotajā reģionā.
DCX-ir nenobriedušu neironu reprezentatīvs attēls un līnijas segments (150 ± 0.1 μm), kas pārklāts, lai aprēķinātu krustojumu skaitu ar DCX-ir dendrites.
3. Eksperimentējiet 2. FosB / ΔFosB izoformas identifikācija, ko izraisa riteņu kustība
3.1: Perfūzija un audu apstrāde
Papildu peles kohortu ārstēja kā iepriekš eksperimentā 1. Pēc 4 nedēļu ilgas iejaukšanās, peles transcardiāli tika perfūzētas ar aukstu sāls šķīdumu dziļā anestēzijā. Hippokampu ātri izdalīja un sasaldēja ar šķidru slāpekli, un uzglabāja -80 ° C. Katras peles hipokamps tika homogenizēts RIPA buferšķīdumā (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% nātrija deoksikolāts, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, ASV), kas satur proteāzes. inhibitori (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Vācija). Lizāti tika centrifugēti 15 min. Pie 5000 apgr./min. Pie 4 ° C un supernatanti tika savākti. Olbaltumvielu koncentrācijas tika mērītas ar BCA Protein Assay komplektu (#23227, Thermo Scientific, IL, ASV).
3.2: Western blotting
Vienādi olbaltumvielu daudzumi (30 μg / josla) tika elektroforēģēti uz 10% poliakrilamīda gela, pēc tam pārvietoti uz PVDF membrānu (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, ASV). Nespecifiska saistīšanās tika bloķēta, iepriekš inkubējot 1 h membrānu TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), kas satur 3% BSA. Membrānu inkubēja ar pan-FosB antivielu (1: 1000), ko iepriekš izmantoja imūnhistoķīmijai, izšķīdinot TBST, kas satur 3% BSA. Pēc mazgāšanas ar TBST membrāna tika inkubēta ar HRP konjugētu anti-trušu IgG antivielu (1: 5000 TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) istabas temperatūrā 1 h. Pēc mazgāšanas ar TBST, proteīnu joslas tika vizualizētas, inkubējot ar Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, ASV) un notverti, izmantojot Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Pēc tam membrāna tika ielādēta ar anti-gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāzes (GAPDH) antivielu (#2275, 1: 5000 TBS-T, Trevigen, MD, USA). Olbaltumvielu joslu optiskais blīvums tika kvantificēts, izmantojot Image-J un normalizēts līdz GAPDH līmenim.
4: Statistiskā analīze
Peles ķermeņa masas izmaiņas tika analizētas ar divvirzienu atkārtojumu ANOVA (grupa x laiks). Lai noteiktu statistiskās atšķirības starp grupām, tika izmantots nesalīdzināts t-tests (Control vs Runner). Pearson korelācijas analīze tika izmantota, lai apstiprinātu FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes analīzi (manuālā skaitīšana pret attēla sliekšņa noteikšanu), un lai pārbaudītu saistību starp FosB / ΔFosB izteiksmes līmeni un DCX šķērsojumu skaitu ĢD. Dati tika parādīti kā vidējais ± SEM. Statistiskā nozīmīguma slieksnis tika noteikts P <0.05.
rezultāti
1: ķermeņa svars un braukšanas attālums eksperimentos 1 un 2
1 un 2 eksperimentos gan kontroles, gan skrējēju peles ķermeņa masas izmaiņas tiek apvienotas un parādītas Skaitlis 3. Divvirzienu atkārtoti pasākumi ANOVA norāda uz būtisku mijiedarbību (grupa × laiks, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) un grupas galvenā ietekme F(1, 18) = 6.07, P <0.05), kas norāda uz ievērojami mazāku ķermeņa svaru Runner pelēm. Skrējiena distance uz būru ir parādīta Tabula 1. Lai gan katra peles precīzs braukšanas attālums bija neskaidrs, jo peles tika izmitinātas kopā, regulāra novērošana apstiprināja, ka visas peles bieži veica riteni. Eksperimenta 2 skrējēju peles ilga ilgāk nekā eksperimentā 1, bet vidējais braukšanas attālums (m / diena / būris) bija vienmērīgs katrā eksperimentā.
2: FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes kvantitatīvās noteikšanas apstiprināšana, izmantojot attēla sliekšņa noteikšanu
Pastāv ievērojama korelācija starp FosB / ΔFosB-ir laukumu, kas iegūts ar attēla sliekšņa palīdzību, un FosB / ΔFosB-ir kodolu blīvumu, kas iegūts ar manuālo skaitīšanu (r = 0.941, P <00001, Skaitlis 4).
3: FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte hipokampā
FosB / ΔFosB imūnfilmu reprezentatīvie attēli muguras un vēdera hipokampu apakšnozarēs tika parādīti Skaitlis 5. Visos analizētajos ROI FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte Runner pelēm (Skaitlis 5, pa labi) bija kvalitatīvi augstāks nekā kontroles pelēm (Skaitlis 5, centrs). Runner pelēm kvantitatīvā analīze liecināja par ievērojamu FosB / ΔFosB-ir platības palielināšanos gan mugurā (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) un vēdera hipokampu apakšlauki (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Skaitlis 6).
4: FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte garozā
FosB / ΔFosB imūnfilmu reprezentatīvie attēli kortikālajā ROI ir parādīti Skaitlis 7. Kvantitatīvā analīze atklāja atkarības no reģiona FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes izmaiņas ilgtermiņā (Skaitlis 8). Runner pelēm FosB / ΔFosB-ir apgabals bija ievērojami augstāks motoru garozā (P <0.05) un somatosensorās mucas garozā (P <0.05), bet ne redzes garozā (P = 0.662) vai ožas spuldze (P = 0.523). Dzirdes garozā FosB / ΔFosB-ir apgabals palielinājās Runner pelēm (P = 0.105).
5: Neirogeneze
DCX imūnfilmu reprezentatīvie attēli ir parādīti Skaitlis 9. Dorsālajā hipokampā DCX imūnreaktivitāte Runner pelēm (Skaitlis 9, pa labi) bija kvalitatīvi augstāks nekā kontroles pelēm (Skaitlis 9, pa kreisi). Salīdzinot ar muguras hipokampu, DCX imūnreaktivitāte vēdera hipokampā bija vājāka gan kontroles, gan runner pelēm. Runner pelēm krustojumu skaits bija ievērojami augstāks dDGsp (P <0.01) un dDGip (P <0.01; Skaitlis 10). Vēdera hipokampā šķērsošanas skaits Runner pelēm bija tendence palielināties, bet starp grupām nebija būtisku atšķirību (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Skaitlis 10).
6: korelācija starp FosB / ΔFosB ekspresiju un neirogēzi
Tika veikta korelācijas analīze starp FosB / ΔFosB-ir apgabalu un DCX krustojumu skaitu (Skaitlis 11). Tā kā katrs datu kopums (piem., Dorsālā DGsp kontroles pelēs) sastāv tikai no 5 pāriem, analīzi vispirms veica ar visiem 40 pāriem. Interesanti, ka starp FosB / ΔFosB-ir un DCX krustojumu skaitu bija ievērojama korelācija (r = 0.885, P <0.0001). Turklāt nozīmīgas korelācijas tika noteiktas arī tad, kad muguras ĢD (r = 0.762, P <0.05) un ventrālais ģenerāldirektorāts (r = 0.816, P <0.01) analizēja atsevišķi.
7: FosB / ΔFosB izoforma noteikšana, ko izraisa ilgstoša darbība
Visbeidzot, lai identificētu. \ T fosB Hipokampā inducēti gēnu produkti, reaģējot uz ilgstošu darbību, hipokampi no papildu peles kohortas tika pakļauti rietumu blotēšanai, izmantojot to pašu pan-FosB antivielu. 35 – 37 kDa vairākas joslas, kas pārstāv ΔFosB modificētas izoformas [44], ievērojami palielinājās Runner versus Control pelēm (\ tSkaitlis 12, P <0.01). No otras puses, 48 kDa FosB izoformu nevienā grupā nebija iespējams noteikt. Cita josla, kas ir vāji redzama virs 25 kDa, iespējams, atspoguļo Δ2ΔFosB izoformu (27 kDa). Bija divas citas joslas, virs 50 kDa un 37 kDa, kuras, visticamāk, bija nespecifiskas saistīšanās dēļ. Kvantificējot, netika konstatētas atšķirības šajās ne-ΔFosB joslās starp grupām (dati nav parādīti).
diskusija
Kopumā, šis pētījums vispirms veica imūnhistoķīmisku analīzi, lai pārbaudītu 1), vai ilgstošs brīvprātīgais riteņu vadīšana izraisa FosB / ΔFosB ekspresiju hipokampā; un 2), vai reģiona specifiskā reakcija pastāv gar tā dorso-vēdera asi.
Četru nedēļu brīvprātīga riteņa vadīšana izraisīja ievērojamu FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes palielināšanos visos analizētajos hipokampu reģionos (ti, hippokampusa muguras un vēdera daļas DG, CA1 un CA3 apakšmapi). Mēs apstiprinājām, ka 35 – 37kDa ΔFosB izoforma bija galvenais fosB gēnu produkts, kas uzkrājas, reaģējot uz ilgstošu darbību. Šie rezultāti nepārprotami apstiprina hipotēzi, ka ilgstošs regulārs vingrinājums ir spēcīgs AFosB indukcijas ierosinātājs visā hipokampā un ka tā indukcija varētu būt jauns molekulārs mehānisms, ar kura palīdzību tiek ietekmētas dažādas dorsālās un / vai ventrālās hipokampusa funkcijas.
1: FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes kvantitatīvās noteikšanas validācija un ierobežojumi, izmantojot attēla sliekšņa noteikšanu
Šajā pētījumā tika pieņemta attēla sliekšņa metode, ko plaši izmanto imūnhistoķīmiskos pētījumos mērķa šūnu skaita skaitīšanai un šūnu morfoloģijas novērtēšanai, lai noteiktu reģionam specifisku FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes kvantitatīvo noteikšanu [15,45,46]. Tika pierādīta nozīmīga korelācija starp FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes līmeņiem, kas izteikti kvantitatīvi pēc attēla sliekšņa un ar manuālo skaitīšanu.Skaitlis 4). Tomēr, tā kā blīvums un pārklāšanās neļāva skaitīt FosB / ΔFosB-ir kodolu skaitu ļoti blīvos apgabalos, pierādītā korelācija nozīmē tikai attēla sliekšņa noteikšanas metodes precizitāti, ja FosB / ΔFosB-ir apgabali veido <~ 40% no kopējās ROI apgabalā. Tāpēc nepieciešama rūpīga interpretācija FosB / ΔFosB-ir apgabaliem, kas pārsniedz 40% no kopējās ROI platības.
Jo īpaši Runner peles ģenerāldirektorātā (Skaitlis 4), FosB / ΔFosB ekspresija tika ievērojami izraisīta ar riteņu vadīšanu, un lielākā daļa FosB / ΔFosB-ir kodolu pārklājās. Šajās jomās FosB / ΔFosB ekspresijas palielināšanās izraisa izteiksmes līmeņa lielāku novērtējumu neatkarīgi no izmantotās kvantitatīvās noteikšanas metodes (attēla sliekšņa vai manuālās skaitīšanas). Tomēr, neskatoties uz nepietiekamas novērtēšanas risku, ir svarīgi atzīmēt, ka šis pētījums veiksmīgi parādīja ievērojamu FosB / ΔFosB-ir platības pieaugumu Runner peles ģenerāldirektorātā. Tas liecina, ka metodoloģiskie ierobežojumi neapdraud mūsu secinājumus. Tā vietā potenciālais nepietiekamais novērtējums palielina konstatējumu ticamību, ka ilgtermiņā palielināta FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte hipokampā.
2: vienota ΔFosB indukcija hipokampā ilgstošas darbības laikā
Hipokampam ir anatomiski un funkcionāli gradienti gar tā garenisko asi [26], tāpēc attiecībā uz šo pētījumu FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte hipokampusa muguras un vēdera daļās tika analizēta atsevišķi. Dati parādīja, ka ilgtermiņā vienmērīgi palielinājās FosB / ΔFosB izteiksme visos izmērītajos hipokampu ROI. Šo vienoto FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes indukciju var nespecifiski izraisīt sistēmiskas vielmaiņas izmaiņas, kas saistītas ar ilgstošu darbību. Tomēr ir svarīgi atzīmēt, ka garozā bija FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes reģionam raksturīgais pieaugums. Šo rezultātu apstiprina jaunākie konstatējumi, kas liecina, ka strauja skrejceļš uzbrauca paaugstinātu reģionālo smadzeņu asins plūsmu hipokampā, bet ne ar ožas spuldzi [8]. Turklāt Rhodes et al. (2003) parādīja, ka 7 dienas brīvprātīgam riteņam, kas darbojas ar hipokampus (CA2 netika mērīts) un CA3 / 1, izraisīja c-Fos ekspresiju un jutekļu garozā, bet ne vizuālajā garozā [47]. Kopumā šie pētījumi liecina, ka vienāda FosB / ΔFosB ekspresijas indukcija hipokampā nav ilgtermiņa specifiskas sekas. Interesanti, ka Hawley et al. nesen ziņoja, ka hroniska neprognozējama spriedze palielināja FosB / ΔFosB ekspresiju mugurā, bet ne vēdera dobumā, žurka hipokampusa ģenerāldirektorātā [48]. Veicot turpmāku izmeklēšanu, FosB / ΔFosB indukcijas atšķirīgie modeļi, piemēram, tie, ko izraisa vingrinājums vai stress, sniegs nepārtrauktu ieskatu par stimuliem atkarīgu ietekmi uz hipokampu.
Šajā pētījumā izmantotā primārā pan-FosB antiviela atpazīst visas FosB proteīnu izoformas. Pēc Western blotting analīzes mēs noskaidrojām, ka vienīgās izoformas, kas pēc ilgstošas darbības palielinājās hipokampā, bija modificētās ΔFosB (35 – 37 kDa) izoformas, vienīgās stabilās izoformas starp Fos ģimenes proteīniem [11]. Šis secinājums atbilst iepriekšējam darbam, izmantojot pan-Fos antivielas, lai pierādītu, ka 35 – 37 kDa ΔFosB ir dominējošais Fos ģimenes proteīns, ko izraisa hronisks stress [44]. Līdz ar to hippokampālā FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes pieaugums, ko izraisa ilgstoša darbība, visticamāk, atspoguļo ΔFosB līmeni.
Mazāk ir zināms par reăionam raksturīgo fiziskās slodzes ietekmi uz hipokampusa molekulārajiem un strukturālajiem aspektiem. Tomēr daudzi uzvedības pētījumi liecina par lielisku vingrojumu izraisītu uzlabojumu potenciālu gan muguras, gan vēdera hipokampas funkcijās. Pierādīts, ka vingrinājums uzlabo telpisko mācīšanos un atmiņu [34-38] un telpiskā un konteksta apstrāde galvenokārt ir atkarīga no muguras hipokampusa [27,28]. Pretstatā tam, ir zināms, ka vingrinājumi iedarbojas arī uz anksiolītiskām un antidepresantiem [24,25,38] un šīs emocionālās reakcijas pārsvarā regulē vēdera hipokamps [29,30]. Šajā pētījumā novērotā vienotā ΔFosB indukcija ilgtermiņā liecina, ka visā hipokampā radās kāda veida neiroplastiskas izmaiņas. Tas izskaidro, kāpēc vingrinājumi var ietekmēt gan no muguras, gan vēdera hippokampusa atkarīgās funkcijas.
3: vingrinājumu izraisītas neirogēzes reģiona specifiskā analīze
Pieaug uzmanība arī no neirogēzes funkcionālās disociācijas starp muguras un vēdera hipokampu [49]. Šajā pētījumā, izmantojot DCX-ir nenobriedušo neironu morfoloģiskās īpašības [43], mēs skaitījām krustojumu skaitu starp DCX-ir dendrites un līnijas segmentu, kas novilkts gar GCL vidū. Šis mērījums nesniedza kopējo DCX-ir neironu skaitu ģenerāldirektorātā, bet tas ļāva reģionam raksturīgo kvantitatīvo novērtējumu, kas vajadzīgs, lai veiktu korelācijas analīzi ar FosB / ΔFosB izteiksmes datiem (skatīt tālāk). Pēc ilgstošas darbības DCX-ir neironu skaits ievērojami palielinājās mugurā, bet ne vēdera, DG. Tas liek domāt, ka vingrinājums varētu stimulēt neirogēzi dorsālā, salīdzinot ar ģenerāldirektorāta ventrālo daļu. Tomēr iepriekšējos pētījumos ir ziņots par pretrunīgiem rezultātiem, kuros riteņu kustība palielināja neirogēzi gan muguras, gan vēdera galvaspilsētā [50,51]. Šajā pētījumā DCX-ir šķērsošanas skaits vēdera ģenerāldirektorātā palielinājās, braucot, lai gan nelielais parauga lielums (5 peles katrā grupā) varēja ierobežot spēju noteikt statistiski nozīmīgu atšķirību starp grupām. Tādēļ ir iespējams pāragri izslēgt iespēju, ka brīvprātīga riteņa vadīšana var stimulēt vēdera hipokampu neirogenēzi. Ir nepieciešami turpmāki sīki pētījumi, lai izprastu vingrojumu izraisītās neirogeneses reģiona specifiku attiecībā uz tās daudzpakāpju procesu (šūnu proliferāciju, diferenciāciju, migrāciju un izdzīvošanu).
4: vingrojuma izraisītas ΔFosB indukcijas funkcionālās sekas hipokampas plastiskuma regulēšanai
Visbeidzot, kā pirmais solis, lai atpazītu vingrošanas izraisītās ΔFosB indukcijas funkcionālās sekas hipokampā, mēs pārbaudījām FosB / ΔFosB imunoreaktivitātes saistību ar DCX-ir krustojumiem gan muguras, gan vēdera ģenerāldirektorātā un konstatējām būtisku, pozitīvu korelāciju starp abiem mainīgajiem lielumiem. Lai gan precīzie mehānismi, ar kuriem ΔFosB regulē vingrojumu izraisītu neirogenitāti, paliek neskaidri, nesenais pētījums parādīja, ka fosB- nulles peles, kurām trūkst FosB, ΔFosB un Δ2ΔFosB (visas fosB produkti), izrādījās deficīts bazālajā hipokampālā neirogenēzē, ieskaitot neironu cilmes šūnu proliferācijas samazināšanos, palielinātu jaundzimušo neironu migrāciju un patoloģiskas ĢD struktūras [20]. Tomēr šīs izmaiņas netika novērotas fosB(d / d) pelēm, kurām trūkst FosB, bet ne ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interesanti, ka fosB- nulles peles, dažu ar neirogēzi saistītu gēnu ekspresija, ieskaitot Vgf (VGF nervu augšanas faktors ir inducējams) un. \ T gal (Galanīna prepropeptīds) tika \ t20]. Tā kā VGF un GAL ir sekrēcijas molekulas, viens priekšlikums, kurā ir solījums, uzskata, ka neironi, kas ekspresē ΔFosB, var regulēt neirogenēzi ar autokrīno / parakrīno aktivitāti [20].
Turklāt jāatzīmē, ka reģions, kur ΔFosB tiek inducēts, darbojoties telpiski pārklājas ar reģionu, kur neirogēnā aktivitāte ir augsta. Šis konstatējums liecina, ka vingrojumu izraisīta neirogenēze ir atkarīga no minimālās aktivitātes. Neironu aktivizēšana ir būtiska centrālās nervu sistēmas funkcijas uzturēšanai un uzlabošanai [9], izmantojot mehānismus, tostarp smadzeņu radītā neirotrofiskā faktora (BDNF) izpausmi un atbrīvošanu [52,53], seruma insulīnam līdzīga augšanas faktora-1 (IGF-1) uzņemšana caur asins-smadzeņu barjeru [54,55], apoptozes nomākums [56] un mitohondriju kustības regulēšana [57]. Līdz ar to šis pētījums liecina, ka ilgstoša fiziskā aktivitāte izraisīja atkārtotu neironu aktivāciju, kas ir redzama palielinātajā FosB ekspresijā, kas veicina hipokampu plastiskumu, iespējams, izmantojot šos vairākos iepriekš aprakstītos mehānismus.
Šajā pētījumā tikai novērtēta vingrojumu izraisītā neirogēze un tās saistība ar FosB / ΔFosB izteiksmi ĢD. Tomēr FosB / ΔFosB imunoreaktivitāte tika izraisīta arī CA1 un CA3 apakšmēslos. Lai gan ir nepieciešami papildu pētījumi, lai iegūtu labāku izpratni par vingrinājumu izraisīto ΔFosB izpausmju funkcionālo lomu šajās apakšmēslās, iepriekšējā literatūra piedāvā daudzsološu iespēju. Guan et al. (2011) pierādīja, ka ciklīna atkarīgā kināzes 5 (Cdk5) specifiskā ablācija CA1 vai CA3 piramīdas neironos traucēja atmiņas konsolidāciju vai atgūšanu [58]. Interesanti, ka Cdk5 ir ΔFosB [59] un ir iesaistīts sinaptiskā plastiskuma regulēšanā [60]. Tāpēc vingrinājumu izraisītā ΔFosB ekspresija varētu būt iesaistīta sinaptiskā plastiskuma regulēšanā, izmantojot Cdk5 aktivāciju CA1 un CA3 apakšmēslos.
Secinājumi
Lai gan bija zināms, ka akūtās vingrinājumi izraisīja tiešu agrīnu gēnu proteīnu ekspresiju hipokampā, šis pētījums sniedz pirmo pierādījumu tam, ka ilgstoša regulāra fiziskā slodze būtiski stimulē ΔFosB ekspresiju visā hipokampā. Thir vienota ΔFosB indukcija atbalsta pašreizējo izpratni, ka vingrinājums ir efektīva nefarmakoloģiska iejaukšanās, kas spēj uzlabot daudzu hipokampu funkcijas. Kopā ar nozīmīgo korelāciju starp FosB / ΔFosB ekspresiju un neirogēzi, šie dati ir provokatīvi un norāda uz nepieciešamību veikt turpmākus pētījumus, kuros tiek definēta ΔFosB loma mediācijas seku pārnēsāšanā uz hipokampu funkciju, tostarp neirogenēzi.
Finansējuma pārskats
Atsauces
;
