avots
Nathan Kline institūts, Orangeburg, Ņujorka, 10962, ASV. [e-pasts aizsargāts]
Anotācija
Bērni un pusaudži arvien vairāk tiek pakļauti psihostimulantiem, vai nu nelikumīgi, vai parastu neiropsihisku slimību ārstēšanai, piemēram, uzmanības deficīta traucējumi ar un bez hiperaktivitātes. Neskatoties uz psihomotorisko stimulatoru plašu lietošanu jaunākās vecuma grupās, maz ir zināms par hroniskām molekulārām neuroadaptīvām atbildēm uz šiem aģentiem nenobriedušajās smadzenēs. Šeit mēs parādām, ka pēc psihostimulantu hroniskas lietošanas kokaīns un amfetamīns, transkripcijas faktors DeltaFosB ir augsti regulēts periadolescent peles bet ne pēc atšķiršanas vai pieaugušajiem peles. Indukcija DeltaFosB notiek arī tikai. \ t periadolescent peles pēc amfetamīns administrācija. Šie rezultāti parāda unikālo plastiskumu kritiskās molekulas pusaudžu smadzenēs, kas regulē psihostimulējošo darbību un liek domāt, ka šīs neiroadaptīvās izmaiņas var būt iesaistītas mediācijas procesā. uzlabota atkarības tendences pusaudžiem salīdzinājumā ar pieaugušo.
Ievads
Psihostimulanti tiek izmantoti, lai ārstētu bērnības traucējumus, piemēram, hiperaktivitātes traucējumus. Turklāt pusaudžu vidū bieži ir stimulējošo vielu, tostarp amfetamīna un kokaīna, ļaunprātīga izmantošana - vecums, kad ir pierādījumi par pastiprinātu atkarību no pieaugušajiem (Estroff et al., 1989; Myers un Anderson, 1991). Neskatoties uz datiem, kas norāda uz attīstību regulējošām uzvedības sekām, ir maz zināms par molekulāro neuroadaptīvo reakciju nenobriedušajās smadzenēs, kas rodas šo vielu ievadīšanas laikā. Kokaīns un amfetamīns var izraisīt ilgstošas uzvedības izmaiņas daļēji, stimulējot dopamīnu D1receptoriem un transkripcijas faktoru, tostarp ΔFosB, līmeņa paaugstināšanās muguras striatumā (ti, caudāta putamenā) un vēdera strijā (ti,Chen et al., 1997). ΔFosB līmeņa paaugstināšanās, iespējams, stabilizējoties olbaltumvielu produktiem, saglabājas vairākas nedēļas pēc ilgstošas kokaīna vai amfetamīna iedarbības, un to vismaz daļēji regulē dopamīna signāla transdukcijas ceļš (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Jauno dzīvnieku centrālā dopamīnerģiskā sistēma ļoti strauji mainās kritisko molekulu līmeņa izmaiņu dēļ normālas attīstības laikā, ieskaitot dopamīnu D.1receptoru DARPP-32 (dopamīna un cAMP regulētais fosfoproteīns;r no 32 kDa) un cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Psihostimulantu iedarbība šajā periodā, kas uzlabo dopamīnerģisko neirotransmisiju, var izraisīt kvantitatīvi un / vai kvalitatīvi dažādas molekulārās atbildes, ieskaitot izmaiņas ΔFosB ekspresijā. Lai pārbaudītu hipotēzi, ka pastāv hroniskas psihostimulantu iedarbības laikā atkarīgas neuroadaptīvas atbildes, sērijveida eksperimentos tika analizētas trīs peles grupas: pieaugušie (60 d veci injekciju sākumā), periadolescent (33 d vecs injekciju sākumā), un pēc atšķaidīšanas (24 d vecs injekcijas sākumā). Šī ir pirmā tiešā molekulārā neuroadaptīvā reakcija uz hronisku psihostimulantu iedarbību šajās trīs vecuma grupās. Mēs atklājām, ka pēc identiskām ārstēšanas paradigmām periadolescent pelēm ir uzlabota ΔFosB regulācija, reaģējot uz kokaīnu un amfetamīnu.
MATERIĀLI UN METODES
Dzīvnieki un zāļu lietošana. Vīriešu CD-1 peles (Charles River Laboratories, Kingston, NY) tika novietotas uz 12 hr / tumšā cikla (6: 00 AM līdz 6: 00 PM) ar ad libitumpiekļuvi pārtikai un ūdenim. Pirms injekciju uzsākšanas dzīvniekiem tika atļauts ievietot dzīvnieku telpā vismaz 10 d. Dzīvniekus veica divi pētnieki, kuri veica visas injekcijas tajā pašā telpā, kurā dzīvnieki tika izmitināti. Visi dzīvnieki tika atņemti vecumā no 21 d. Injekcijas sākās 24 (pēc atšķaidīšanas), 33 (periadolescent) vai 60 (pieaugušo) d vecumā. Dzīvnieki saņēma 20 mg / kg kokaīna (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamīna (Sigma) vai vienādu tilpumu fizioloģiskā šķīduma intraperitoneāli starp 4: 00 un 5: 00 PM dienā 7 d. Pēc īsas CO iedarbības dzīvnieki tika nogalināti, atslēdzot to2 10: 00 AM dienā pēc pēdējās injekcijas. Smadzenes tika nekavējoties izņemtas no galvaskausa, un caudāta putamen un kodols accumbens tika ātri sadalīti uz ledus. Visi sadalījumi tika veikti no koronālām smadzeņu šķēlītēm ar vienu pētnieku, un proteīna ekstrakti tika sagatavoti no svaigiem audiem bez sasalšanas. Visas dzīvnieku procedūras tika apstiprinātas Dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejā, un tās bija saskaņā ar Nacionālajiem veselības institūtiem Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmata.
Western blot analīze. Attiecībā uz Western blot analīzēm katrā paraugā tika ievietoti vienādi proteīna daudzumi (40 μg caudāta putamenam un 20 μg kodoliem accumbens) katrā proteīna koncentrācijas mērījumā ar BCA testu (Pierce, Rockford, IL). Vienādu proteīnu slodzi pārbaudīja arī, vizualizējot kopējo proteīnu ar Ponceau Red pēc pārneses uz nitrocelulozi un / vai blotēšanu ar anti-aktīna antivielu (10: 1; Sigma). Fosu saistīto antigēnu (FRA) antiserumu, kas atpazīst ΔFosB izoformas, dāsni sniedza Dr. M. Iadarola (Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD) un izmantoja 500 koncentrāciju: 1. Iepriekšējie pētījumi (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), tostarp FRA antiseruma uzsūkšanās ar M-peptīda imunogēnu, parādīja šī antiseruma specifiku. DARPP-32 5a monoklonālo antivielu, ko izmantoja 1: 10,000, dāsni sniedza Drs. Hugh Hemmings un Paul Greengard (Rokfellera Universitāte, Ņujorka, NY). Dopamīna transportera (DAT) antiviela bija no Chemicon (Temecula, CA). Bloti tika reaģēti ar NEN-DuPont (Boston, MA) ķīmijuminescences sistēmu un pakļauti filmai. FosB imūnreaktivitātes densitometriskās vērtības tika iegūtas, izmantojot ScanAnalysis Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistiskā nozīmība tika noteikta, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja post hoc Tukey vairākkārtējais salīdzināšanas tests vai nepāra, divu astes studentu tests t testu, kā norādīts attēla leģendās. Zāļu ārstēšanas eksperimentos katras vecuma grupas analīze tika veikta ar atsevišķu blotēšanu, un tāpēc katrai sāls grupai patvaļīgi tika piešķirta 100% vērtība, lai salīdzinātu vecuma grupas. Ontogēnu pētījumiem tika analizēti visu vecuma grupu paraugi vienā blotā.
REZULTĀTI
ΔFosB indukcija pēc kokaīna un amfetamīna rodas tikai periadolescentu peles kodolā.
ΔFosB ekspresija tika mērīta kodolkrāsās un caudāta putamen pēc atšķaidīšanas, periadolescentiem un pieaugušiem pelēm pēc amfetamīna vai kokaīna ievadīšanas 7 d. Kodols accumbens ir smadzeņu reģions, kas, domājams, ir vissvarīgākais psihostimulantu atalgojošās iedarbības starpniecībā. Pēc ilgstošas amfetamīna ievadīšanas αFosB imūnreaktivitāte (35 kDa) tika selektīvi ierosināta periadolescento dzīvnieku kodolā. 1 A) vai kokaīnu. 1 B). Turpretī ΔFosB (35 kDa) līmenis pēc atšķaidīšanas vai pieaugušiem dzīvniekiem nav būtiski mainījies (att.1 A,B). Caudāta putamenā ΔFosB līmeņi (35 kDa) pēc hroniskas amfetamīna ievadīšanas tikai nozīmīgi palielinājās tikai periadolescentos dzīvniekos.2 A). Visās trijās vecuma grupās pēc ilgstošas kokaīna lietošanas caudāta putamenā ievērojami palielinājās ΔFosB (35 kDa) ekspresija.2 B). Tomēr indukcijas lielums bija vislielākais periadolescentos dzīvniekos, īpaši salīdzinot ar pēcdzemdībām. 2 B). Citas FRA un Fos izoformas visās vecuma grupās nemainījās (dati nav parādīti).
ΔFosB imūnreaktivitāte kodolā accumbens pēc hroniskas psihostimulanta ievadīšanas. CD-1 peles tika injicētas vienu reizi dienā ar sāls šķīdumu, amfetamīnu vai kokaīnu 7 d, sākot no 24 dienas (P24; pēc atšķiršanas), diena 33 (P33; periadolescent) vai 60 dienu (Pieaugušo). Pēc hroniskas amfetamīna parādās ΔFosB (35 kDa) imunoreaktivitātes līmenis kodolkrāsās.A) vai kokaīnu (B) administrācija. Reprezentatīvi imunobloti no sāls šķīduma (\ tS), amfetamīns (A) un kokaīna (C) injicēts pēc atšķiršanas (P24), periadolescent (P33), un pieaugušās peles ir parādītas augšējie paneļi. Apakšējie paneļi rādīt vidējo ± SEM procentuālo daļu no ΔFosB bazālās ekspresijas. n vērtības katrai grupai ir norādītas stieņi. Būtiskas ΔFosB palielināšanās tika konstatēta tikai periadolescentu pelēm. *p <0.05; **p <0.01 (Studentu t pārbaude; sāls šķīdums pret narkotikām).
ΔFosB imunoreaktivitāte caudāta putamenā pēc hroniskas psihostimulanta ievadīšanas. CD-1 peles tika injicētas vienu reizi dienā ar sāls šķīdumu, amfetamīnu vai kokaīnu 7 d, sākot no 24 dienas (P24; pēc atšķiršanas), diena 33 (P33; periadolescent) vai 60 dienu (Pieaugušo). Pēc hroniskas amfetamīna parādās ΔFosB (35 kDa) imūnreaktivitātes līmenis caudāta putamenā.A) vai kokaīnu (B) administrācija. Reprezentatīvi imunobloti no sāls šķīduma (\ tS), amfetamīns (A) un kokaīna (C) injicētas periadolescent peles (\ tP33) ir parādītiaugšējie paneļi. Apakšējie paneļi rādīt vidējo ± SEM procentuālo daļu no ΔFosB bazālās ekspresijas. n vērtības katrai grupai ir norādītas stieņi. Nozīmīgs amfetamīna inducētais ΔFosB imūnreaktivitātes pieaugums tika konstatēts tikai periadolescentu peles caudāta putamenā (A). Hroniska kokaīna lietošana palielināja ΔFosB visās trīs vecuma grupās (B). *p <0.05; **p <0.01 (Studentu t pārbaude; sāls šķīdums pret narkotikām).
Pēc hroniska kokaīna vai amfetamīna DAT un DARPP-32 līmenis nemainās
Vairākas galvenās molekulas, ko izsaka dopamīnerģiskie un / vai dopaminoceptīvie neironi, ieskaitot DARPP-32, D1 dopamīna receptoriem un DAT, veicina akūtu un hronisku reakciju uz psihostimulantiem (\ tMoratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). DARPP-32, D dati1 DAT null un DAT knock-down pelēm ir sarežģīta saikne starp to līmeņiem, dopamīnerģiskās aktivitātes regulēšanu un reakciju uz psihostimulantiem. Faktiski, ΔFosB indukcija nenotiek DARPP-32 nulles pelēm, kas saņem hronisku kokaīnu (Fienberg et al., 1998). Pieaugušām pelēm 7 d iedarbība uz 20 mg / kg kokaīna tomēr nemaina kopējo DARPP-32 līmeni (\ tFienberg et al., 1998). DAT proteīnu regulējums iepriekš nav ziņots pelēm, kas pakļautas hroniskām psihostimulantiem, lai gan dažās sugās ir ziņots par radioligandas saistīšanās ar dopamīna transporteru izmaiņām.Letchworth et al., 2001). Šeit mēs izmērījām DARPP-32 un DAT proteīna līmeni, lai noteiktu, vai šo proteīnu ekspresija tiek mainīta pēc hroniskas psihostimulanta ievadīšanas jebkurā no trim peles vecuma grupām. Mūsu rezultāti liecina, ka pēc tam, kad ilgstoši lietoja kokaīnu vai amfetamīnu vienā no trim vecuma grupām, nav konstatētas būtiskas kopējās DARPP-32 vai DAT līmeņa izmaiņas visā caudāta putamenā vai kodolā. 1).
DARPP-32 un DAT relatīvās densitometrijas vērtības amfetamīna un kokaīna ārstētajā P24, P33 un pieaugušo pelēm, salīdzinot ar kontroles, sāls vērtībām, patvaļīgi iestatot pie 100%
ΔFosB bāzes līmeņi tiek regulēti
Mēs pārbaudījām ΔFosB ontogēnu, jo pieaugušajiem pelēm ar ģenētiski modificētu ΔFosB ekspresiju striatumā ir paaugstināta uzvedības reakcija uz psihostimulantiem (Kelz et al., 1999). Mēs noskaidrojām, ka ΔFosB sākotnējie līmeņi jaunākiem dzīvniekiem bija ievērojami zemāki, salīdzinot ar pieaugušajiem, gan caudāta putamen, gan kodols accumbens (1. att.).3 A). Dopamīna sistēmas funkcionālo marķieru līmeņi, ieskaitot DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) un dopamīna receptoriem (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) arī tiek regulēti attīstīti. Iepriekšējie ziņojumi par CD-1 pelēm liecina par maksimālo striatālu DARPP-32 pēcnāves dienā 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). Žurku caudāta putamen un nucleus accumbens, D1līmenis no P28 līdz P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), bet līdzīgi pētījumi nav veikti ar peli. Turpretī šeit mēs atklājām, ka DAT proteīna līmenis caudāta putamenā un kodolkrāsās bija nemainīgs starp pēcdzemdību dienu 24 un pieaugušo vecumu. 3 B). Tādējādi relatīvās attiecības starp D1 receptoriem, DAT, DARPP-32 un ΔFosB atšķiras vecuma grupās, kas potenciāli var izraisīt D \ t1 receptoru aktivitāte, kas varētu ietekmēt ΔFosB indukcijas pakāpi.
ΔFosB un DAT attīstības izpausme. A, ΔFosB (35 – 37 kDa) imunoreaktivitāte naivās CD-1 peles caudāta putamenā un kodolā, kā vecuma funkcija. Reprezentatīvie imunobloti ir parādīti augšējie paneļi.Apakšējie paneļi uzrāda trīs ± 1 peles grupu grupā. *p <0.05, pieaugušais pret P24; #p <0.05, pieaugušajiem pret P36 (Tukey vairākkārtējs salīdzināšanas tests pēc ANOVA). B, DAT imunoreaktivitātes densitometriskās vērtības caudāta putamenā un kodolos accumbens naivām CD-1 pelēm kā vecuma funkciju. DAT līmenis trijās vecuma grupās neatšķīrās.
DISKUSIJA
Psihomotorā stimulatora uzvedības ietekme ir atkarīga no vecuma. Atkarības tendences ir visaugstākās pusaudža gados, kad nelegālo vielu lietošana palielinās (Estroff et al., 1989; Myers un Anderson, 1991). Faktiski, jaunāki bērni bieži kļūst par disforiem, ja viņi pakļauti psihostimulantiem, bet pusaudžiem un pieaugušajiem ir euforija (Rapoport et al., 1980). Grauzēju modeļos daži pētījumi liecina, ka periadolescent dzīvniekiem ir augstāks sākotnējais aktivitātes līmenis (\ tŠķēpu un bremzes, 1983) un izmaiņas psihostimulantiem attiecībā pret jaunākiem un vecākiem dzīvniekiem. Tādējādi tie liecina par mazāk lokomotorisku stimulāciju un novatorisku meklēšanu, reaģējot uz psihostimulantu akūtu zemu devu lietošanu attiecībā pret atšķiršanu un pieaugušiem dzīvniekiem, bet paaugstinātu hiperaktivitāti pēc lielas devas lietošanas. Ar hronisku ievadīšanu jutīgums pret kokaīna izraisītu lokomotīvi ir lielāks periadolescējošām žurkām, salīdzinot ar pieaugušajiem, bet sensibilizācija pret stereotipiem ir zemāka. Arī mikrodialīzes dati atklāja atšķirības starp periadolescentiem un pieaugušajiem žurkām attiecībā uz sensibilizāciju amfetamīna izraisītā dopamīna izdalīšanā (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani un Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Tomēr ir pretrunīgi pētījumi par ilgtermiņa reaktivitāti pret kokaīnu pēc metilfenidāta ievadīšanas pusaudžu žurkām (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Pēdējos divos ziņojumos uzsvērts, ka ir grūti salīdzināt pētījumus, izmantojot dažādas eksperimentālās paradigmas. Mēģinājumi salīdzināt uzvedības pētījumus jaunākiem dzīvniekiem vēl vairāk tiek sajaukti ar dažādu sugu un celmu izmantošanu.
Peles kļūst arvien svarīgāks dzīvnieku modelis psihostimulantu lietošanas un ļaunprātīgas izmantošanas pētījumā, un tā ir pirmā sistemātiska molekulāro neuroadaptīvo reakciju analīze trīs dažādos attīstības vecumos ar peli vai jebkuru citu atsevišķu sugu. Iepriekšējie pētījumi, no kuriem tika iegūtas mūsu ārstēšanas paradigmas, ir pierādījuši ΔFosB pieaugumu savvaļas pieaugušo žurku izolētajā muguras un vēdera strijā pēc hroniskas kokaīna un amfetamīna ievadīšanas (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997), bet tikai kombinētā dorsālā un ventrālā striatumā vai izolētā dorsālā striatumā, kas sastopams savvaļas tipa pieaugušiem pelēm pēc hroniska kokaīna (\ tFienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Tagad mēs demonstrējam telpiskās un kvantitatīvās atšķirības psihostimulantu izraisītajā ΔFosB pēc atšķirtības, periadolescent un pieaugušo pelēm. Paaugstinātas atbildes novērošanu periadolescent dzīvniekiem, salīdzinot ar pieaugušajiem un pēcdzemdībām, pastiprina fakts, ka ar kokaīnu un amfetamīnu ārstētām pelēm atbildes reakcija ir līdzīga. Psihostimulanti kokaīns un amfetamīns gan palielina sinaptisko dopamīnu, gan serotonīnu un norepinefrīnu, bet gan ar dažādiem mehānismiem. Kokaīns saistās ar plazmalemmas transportētājiem dopamīna, serotonīna un norepinefrīna gadījumā un kavē to atkārtotu uzņemšanu presinaptīvajos terminālos. Turpretim amfetamīns veicina šo raidītāju atbrīvošanu. Selektīva ΔFosB indukcija tikai periadoles vecuma grupas kodolā pēc stimulantu ievadīšanas 7 d un relatīvi paaugstināta ΔFosB indukcija caudāta putamenā var būt neirobioloģiska reprezentācija vai iemesls iepriekš konstatētajai pastiprinātajai tendencei ļaunprātīgi izmantot psihostimulantus. vecuma grupa (Estroff et al., 1989; Myers un Anderson, 1991) un citas ilgtermiņa izmaiņas gēnu ekspresijā, kas atšķiras vecuma grupās (Andersen et al., 2002). Turklāt šīs atšķirības var būt būtiski regulētas, mainoties galvenajām molekulām, ieskaitot pašas ΔFosB. ΔFosB sākotnējo līmeņu atšķirību iespējamās sekas vecuma grupās ir līdzīgas tām, kas ierosinātas attiecībā uz atšķirībām starp žurku celmiem (Haile et al., 2001). Patiesībā mēs sagaidām, ka līdzīgas celmu atšķirības tiks konstatētas starp inbred pelēm. Iespējams arī, ka dažādu vecumu pelēm būs atšķirīgas molekulārās adaptācijas smadzeņu apgabalos, kas nav kodolkrāsas. Papildu analīze, izmantojot periadolescent peles ar ģenētiski modificētām izmaiņām galveno molekulu līmeņos un vienlaicīgas uzvedības novērojumi, vēl vairāk pārbaudīs šīs hipotēzes.
Zemsvītras piezīmes
- Saņēma Aprīlis 8, 2002.
- Saņemta pārskatīšana Augusts 6, 2002.
- Pieņemts Augusts 8, 2002.
Šo darbu atbalstīja Nacionālie Veselības institūti / Nacionālais neiroloģisko traucējumu institūts un insultu grants NS41871 (MEE un EMU) un Nacionālais narkomānijas apkarošanas piešķīruma institūts P30-DA13429 (EMS).
Sarakste jāvēršas Dr. Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Filadelfija, PA 19107. E-pasts: [e-pasts aizsargāts].
- Copyright © 2002 Neiroloģijas biedrība
;