Cdk5 fosforilāti Dopamīna D2 receptors un vājina lejupvērstu signālu (2013)

citāts: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforilāti Dopamīna D2 receptors un vājina lejupvērstu signālu. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Redaktors: James Porter, Ziemeļdakotas Universitāte, Amerikas Savienotās Valstis

Saņemts: Maijs 20, 2013; Pieņemts: 14 novembris, 2013; Publicēts: Decembris 31, 2013

Autortiesības: © 2013 Jeong et al. Šis ir atvērta piekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar Creative Commons piešķiršanas licence, kas pieļauj neierobežotu izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja tiek ieskaitīts oriģinālais autors un avots.

Finansējums: Šo darbu atbalstīja Korejas valdības (NRIP) dotācijas (NRF-2012R1A2A2A01012923A2012 un NRF-1R4A1028200A2012), un tās tika atbalstītas arī starptautiskās sadarbības programmas ietvaros, ko vada Korejas NRF (2K1A2033117A2031) un Korejas smadzeņu pētniecības institūts (KBRI) MSIP pamatprogramma (415-2004). SKP bija 2006 un XNUMX Nacionālās šizofrēnijas un depresijas izpētes alianses (NARSAD) jauno pētnieku balvas saņēmējs. Finansētājiem nebija nekādas nozīmes pētījuma izstrādē, datu vākšanā un analīzē, lēmumu publicēt vai sagatavot manuskriptu.

Konkurējošas intereses: Autori ir paziņojuši, ka nav konkurējošu interešu.

Ievads

Dopamīna signalizācija ir saistīta ar dažādām smadzeņu funkcijām, ieskaitot motoru koordināciju, garastāvokļa kontroli un atlīdzības mehānismus [1]. Galvenais dopamīna signalizācijas komponents mugurkaulniekiem ir striatāla vidējas smadzeņu neironiem (MSNs), kas selektīvi ekspresē dopamīna receptoru apakškopu un saņem dopamīnerģisku ievadi galvenokārt no ventrālās tegmentālās zonas (VTA) un materiāla nigras (SN).) [2]. Dopamīna receptori ir ar G proteīnu saistīti receptori (GPCR) ar septiņiem transmembrāniem domēniem un sastāv no diviem apakštipiem, \ t D1 līdzīgi un D2 līdzīgi receptori, kas veicina savstarpēju darbību dopamīna signalizācijā [1]. Piemēram, dopamīna D1 līdzīgie receptori (D1, D5) aktivizē adenililciklāzi caur G_αs un palielina cAMP intracelulāro līmeni, bet dopamīna D2 līdzīgie receptori (D2, D3, D4) inhibē adenililciklāzi caur G_αi un samazina cAMP intracelulāro līmeni [1], [3].

Dopamīna receptoru vidū D2 receptors (DRD2) ir saistīts ar vairāku nozīmīgu psihisku traucējumu, tostarp šizofrēnijas un narkomānijas, patofizioloģiju. [4]tā, ka daudzi antipsihotiskie līdzekļi vismaz daļēji vērš uzmanību uz DRD2. Ir zināms arī tas, ka DRD2 aktivitāte labi ietekmē korupcijas ietekmi uz narkotiku lietošanu dzīvnieku modeļos [5]. Antidepresanti un garastāvokļa stabilizētāja efektivitāte ir saistīta arī ar izmaiņām DRD2 šūnu virsmas ekspresijā vai PAS, ERK un GSK3 mediētā intracelulārā signālierīce. [1], [4], [6]. Neskatoties uz šīm kritiskajām DRD2 lomām smadzenēs, detalizēti regulējošie mehānismi, kas piešķir DRD2 īpašībām neviendabīgumu un sarežģītību, nav pilnībā saprotami.

Pierādījumu rindas liecina, ka DRD2 darbības precizēšanai ir iesaistītas vairākas pēctranslācijas modifikācijas. DRD2 plaša glikozilācija tika atklāta agrīnā fotofinozitātes marķēšanas pētījumā [7]un disulfīdu saite veidošanās DRD2 ietvaros tika identificēta arī kā nozīmīgs ligandu saistīšanas modifikācijas [8]. Turklāt DRD2 fosforilācijas vietas sākotnēji tika identificētas ar in vitro pētījums ar radioizotopiem, nodrošinot ceļu dažādiem regulēšanas ceļiem, ko mediē dažādas kināzes [9]. Patiešām, proteīnkināzes C (PKC) regulē intracelulārā kalcija DRD2 mediētu un modulē DRD2 mijiedarbību ar citoskeleta proteīniem [10]. Fosforilēšana ar GPCR kināzi 2 (GRK2) regulē DRD2 agonistu izraisītās rezensitizācijas modeļus [11].

Ciklīna atkarīgs kināze 5 (Cdk5) ir prolīna virzīta serīna / treonīna kināze, kurai ir preferenciāla aktivitāte smadzeņu specifisko tās aktivatoru ekspresijas dēļ, p35 un p39 [12]. Cdk5 ir iesaistīts dažādos neironu procesos, ieskaitot neironu migrāciju un axon vadību, un Cdk5 un p35 null pelēm ir defekti kortikālā slāņošanā. [13]. Nesen tika pierādīts, ka WAVE1 un ephexin fosforilēšana ar Cdk5 regulē dendritisko mugurkaula morfogenēzi. [14]. Turklāt Cdk5 regulē arī NMDA receptoru, NR2B un NR2A-mediēto NMDA strāvu virsmas ekspresijas līmeni. [15], [16]. Jāatzīmē, ka vairāki pierādījumi liecina par ciešu saikni starp Cdk5 un dopamīna sistēmu. Cdk5 fosforilē tirozīna hidroksilāzi (TH), regulējot tā stabilitāti un tādējādi saglabājot dopamīnerģisko homeostāzi [17]. Postinaptiskajos neironos, kad dopamīna T75 atlikums un cikliskā-AMP regulētā fosfoproteīna-32kD (DARPP-32) fosforilējas ar Cdk5, tas var inhibēt PKA aktivitāti un tādējādi antagonizēt dopamīna DRD1 starpniecību. [18]. Interesanti, ka, ja kokaīns, kas ir netiešs dopamīna receptoru agonists, tiek ievadīts hroniski žurkām, Cdk5 mRNS un olbaltumvielu līmenis vidējos smailes neironos palielinās. [19]. Kopīgi, Cdk5, šķiet, ir iesaistīts narkotiku izraisītās sinaptiskās adaptācijās. Šajā pētījumā mēs parādām DRD2 un Cdk5 funkcionālo mijiedarbību, kas vēl vairāk paplašina Cdk5 lomu dopamīna signalizācijā.

Materiāli un metodes

Antivielas

Anti-trušu serumi tika iegūti pret peptīdiem, kas satur fosforo serīnu 321 (pS321) trešajā DRD2 (D2i3) intracelulārā cilpā. Fosfopeptīdu, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), izmantoja, lai izveidotu peptīdu konjugētu kolonnu afinitātes attīrīšanai (20401, PIERCE). Anti-pS321 antivielas tika bagātinātas ar afinitātes attīrīšanas sistēmu, ievērojot ražotāja norādījumus. Attīrītu fosfo-antivielu uzglabāja PBS ar 0.1% nātrija azīdu un 0.1% želatīnu. Anti-peles anti-Cdk5 antiviela (sc-249) un anti-trušu anti-p35 antiviela (sc-820) tika izmantota Cdk5 / p35 Western blotēšanai un imunocitokēmijai. DRD9996-GFP imunoprecipitācijai un Western blotēšanai izmanto anti-GFP antivielu (sc-2). Anti-trušu anti-FLAG antiviela (sc-807), anti-trušu anti-HA antiviela (sc-805), anti-GST anti-GST antiviela (sc-138) un anti-GAPDH antiviela (sk. 32293) iegādājās no Santa Cruz Biotechnologies.

Dzīvnieki

P35 knockout pele bija sava veida dāvana no Dr. Katsuhiko Mikoshiba RIKEN Brain Science Institute Japānā un tika izmantota primārajai neironu kultūrai. Gruntu komplekti genotipizēšanai bija 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC un 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT, kā aprakstīts iepriekš [20]. ICR peles un Sprague Dawley žurkas tika izmantotas smadzeņu lizāta pagatavošanai. Visas dzīvnieku procedūras tika apstiprinātas Pohang Zinātnes un tehnoloģiju universitātes institūtu dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejā.

Plasmidu konstrukcijas

Cilvēka DRD2 ilgi izoforma EGFP-N1 plazmidvektorā un trešā intracelulārā DRD2 cilpa (212-373 aminoskābju atlikumi, ieskaitot 29 papildu aminoskābju atlikumus, kas ir unikāli DRD2 ilgi izoformai) tika izmantoti pFLAG-CMV-2 plazmīda vektorā. Cilvēka Cdk5 tika ievietots pCMV-HA plazmīda vektorā, un cilvēka p35 tika ievietots pcDNA 3.1 plazmīda vektorā. Cilvēka Cdk5 tika ievietots zem citomegalovīrusa (CMV) promotora kopā ar cilvēka p35 pcDNA 3.1 vektorā, lai izveidotu divkāršu ekspresijas konstrukciju (Cdk5 / p35) imūnocitohīmijai, receptoru internalizācijas testam, [³⁵S] -GTP_γS saistīšanās tests, radioliganda saistīšanās tests un cAMP fermenta imūnanalīze.

in vitro Kināzes tests

Saistīts ar IP in vitro kināzes testu veica šādi. Viena vesela peles smadzenes tika izšķīdinātas 3 mL eritrocītu līzes buferī (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) ar Dounce homogenizatora 20 sitieniem, lai iegūtu homogenizētus smadzeņu lizātus . Lizāti tika inkubēti uz ledus 30 min, sonikēti un centrifugēti pie 16,000 × g 10 min. Supernatanti tika imunizēti ar anti-truša anti-p35 antivielu, lai iegūtu aktīvu Cdk5 / p35 kompleksu. Cdk5 / p35 komplekss un attīrīts GST sulas proteīns tika sajaukts ar adenozīna 5'-trifosfātu, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) un inkubē kināzes buferī (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) 1 h istabas temperatūrā [18], [21]. Tika izmantots arī attīrīts Cdk5 / p25 komplekss (14 – 516, Millipore) in vitro kināzes testu, kā aprakstīts iepriekš. 2 × parauga iekraušanas buferis tika pievienots reakcijas maisījumam un vāra 100 ° C. Pēc tam paraugi tika pakļauti SDS-PAGE un žāvēto gelu novērtēja ar autoradiogrāfiju.

Šķidruma hromatogrāfija (LC) -Mass spektrometrija (MS) / MS analīze

Rekombinants GST-D2i3 proteīns tika analizēts pēc LC-MS / MS pēc IP piesaistes in vitro kināzes testu. Mēs veicām LC-MS / MS datu peptīdu identifikāciju, izmantojot X !! Tandem (versija Dec-01-2008). Katrs RAW datu fails vispirms tika pārveidots par mzXML, izmantojot trans-proteomisko cauruļvadu (TPP; versija 4.3). MS / MS skenē konvertētajos mzXMLs tika pakļauti meklēšanai pret UniProt peles proteīna sekvences datubāzi (atbrīvošanu 2010_07), ieskaitot GST-D2i3 secību, izmantojot X !! Tandem. Tolerance tika iestatīta uz 3 Da prekursoru joniem un 2 Da fragmentu joniem. Tika izmantota enzīma specifika attiecībā uz triptīnu. Cistīna (57.021 Da) karbamidometilēšanai, metionīna oksidēšanai (15.995 Da), asparagīna hidrolīzei (0.987 Da) un serīna fosforilācijai (79.966 Da) tika izmantotas mainīgas modifikācijas iespējas.

Imunoprecipitācija

Imunoprecipitācija tika veikta ar šūnu lizātiem ELB līzes buferī. Anti-GFP antiviela tika pievienota lizātiem un inkubēta 3 h pie 4 ° C. Imūnkompleksi tika attīrīti, izmantojot proteīna-A agarozi. Nogulsnes tika inkubētas ar SDS parauga ielādes buferi 30 min 37 ° C temperatūrā un pakļautas SDS-PAGE un Western blot.

GST Pull-down Assay

10 µg attīrīta GST un GST – D2i3 tika inkubēti ar žurku smadzeņu lizātu 1.5 h pie 4 ° C. Pievienoja 30 µL glutationa (GSH) konjugētās Sepharose 4B granulas (17-0756-01, GE Healthcare), kas bija līdzsvarotas ar līzes buferi, un inkubēja papildu 1 h. Pērles savāca, centrifugējot pie 2,000 ×g un noskalo ar līzinga buferi 4 reizes [22], [23]. Nokrišņi tika analizēti ar Western blotēšanu, izmantojot anti-Cdk5 un anti-p35 antivielas.

Imūnocitochemistry

Transfektētās HEK 293 šūnas un striatāla neironi, kas tika kultivēti uz segas, tika mazgāti vienu reizi ar fosfāta buferšķīdumu (PBS) un fiksēti, iegremdējot aukstā 4% paraformaldehīda / PBS 30 min. Primārā antiviela tika atšķaidīta bloķējošā šķīdumā (2% zirgu serums un 1% Triton X-100 PBS). Kā sekundārās antivielas tika izmantota Alexafluor-647 konjugēta anti-peles antiviela (A20990, Invitrogen) un Alexafluor-568 konjugēta antivielu antiviela (A11011, Invitrogen). Hoechst tika izmantots kodolkrāsošanai. Attēli iegūti ar konfokālo mikroskopu (Olympus, FluoView-1000).

Receptoru internalizācijas tests

24 h pēc transfekcijas, šūnas tika apstrādātas ar 1 µM ​​hinpirolu (Q102, Sigma) 30 min un 90 min 37 ° C. Šūnas atkārtoti suspendēja 2 mL aukstā PBS un katrai reakcijai tika izmantotas 200 µL alikvotas. Zāļu ārstēšana tika veikta istabas temperatūrā 3 h šādās koncentrācijās; 3 nM [³H] -spiperons (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpirīds (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidols (H1512, Sigma). Hidrofobisks [³H] -spiperonu izmantoja, lai marķētu visus ekspresīvos receptorus, un hidrofilais sulpirīds tika izmantots, lai aizstātu membrānu receptoru saistīto [³H] -spiperona signāli. Ar membrānu saistītie receptoru signāli tika aprēķināti, atņemot intracelulāro receptoru vērtības no kopējā ekspresētā receptoru vērtības. Šūnas filtrēja uz GF / B (Millipore) filtra un mazgāja 3 reizes ar mazgāšanas buferi (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrus izžāvēja un atlikušo radioaktivitāti noteica, izmantojot šķidruma scintilācijas skaitītāju [24].

Šūnu membrānas sagatavošana

Konfidenciālas šūnas 100 mm kultūru traukos pēc transfekcijas tika nomazgātas ar ledus aukstu PBS un iegūtas 1 mL HME buferšķīdumā (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Homogenizētie lizāti tika centrifugēti ar 500 × g uz 15 min, un supernatanti pēc tam centrifugēti ar 36,000 × g 30 min. Analīzēm tika izmantotas granulas, kas atkārtoti suspendētas HME buferšķīdumā.

[³⁵S] -GTP_γS saistošs tests

Šūnu membrānas frakcijas tika iepriekš inkubētas ar 1 µM ​​hinpirolu (Q102, Sigma) testa buferī (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA un 0.01 mM IKP) 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) pievienoja 3 nM galīgajai koncentrācijai 30 µL un tālāk inkubēja 90 min. 170 µL ledus auksta buferšķīduma (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂un 0.1 mM GTP), lai apturētu reakciju. Membrānas filtrēja uz GF / B filtra (Millipore) un mazgāja 3 reizes ar mazgāšanas buferi (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtri tika žāvēti un radioaktivitāte tika mērīta, izmantojot scintilācijas skaitītāju [25], [26].

Radioliganda saistīšanas tests

Sagatavotās šūnu membrānas inkubēja ar 0.01 nM [³H] -spiperons (NET-565, PerkinElmer) un palielinošās hinpirola (Q102, Sigma) koncentrācijas 30 min testa analīzē (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrānas filtrēja uz GF / B filtra (Millipore) un mazgāja 3 reizes ar mazgāšanas buferi (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakcija tika pārtraukta ar ātru filtrēšanu caur GF / C filtriem. Atlikušo radioaktivitāti noteica, izmantojot šķidruma scintilācijas skaitītāju [27]-[29].

cAMP Enzīmu imūnanalīze

Transfektētās HEK 293 šūnas iepriekš apstrādāja ar 10 µM ​​rolipramu (R6520, Sigma) 1 h, un pēc tam apstrādāja ar 0.1 µM ​​forskolīnu (F6886, Sigma) un palielinot hinpirola (Q102, Sigma) koncentrāciju 30 min. Primārās kultivētās striatāla neironi tika ārstēti ar 10 µM ​​rolipramu 1 h, un pēc tam 1 µM ​​dopamīna 1 h [22]. Šūnu lizātus sagatavoja ar 0.1 M HCl un cAMP līmeni noteica ar cAMP enzīmu imūnanalīzes komplektu (Sapphire Bioscience), ievērojot ražotāja norādījumus.

Primārās kultivētās Striatālās neirons

Striatāla zona tika izolēta no peles embriju smadzenēm (E15). Sadalīto audu disociēja minimālā būtiskā vidē (MEM) (11095, Invitrogen), kas satur 0.25% triptīnu (T4549-100, Sigma) un 0.1% DNāzes I 6 min 37 ° C temperatūrā. Šūnas atkārtoti suspendēja pārklājuma vidē (MEM ar 0.01 M HEPES (pH 7.4) un 10% (tilp. / Tilp.) Zirgu serumu (16050-122, GIBCO)). Neironi tika audzēti 7 dienās in vitro (DIV 7) MEM ar B27 papildinājumu (17504-044, Invitrogen) pirms lietošanas cAMP enzīmu imūnanalīzēm.

rezultāti

Cdk5 fosforilāti serīns 321 DRD2 trešajā intracelulārajā cilpā in vitro

Lai identificētu jaunus Cdk5 substrātus, mēs veicām sistemātisku meklēšanu, izmantojot (S / T) PX (K / H / R) kā Cdk5 atpazīšanas konsensa sekvences [30] un identificēja DRD2 kā kandidāta substrātu. Konsensa secība, ieskaitot serīnu 321, atrodas DRD2 (D2i3) trešajā intracelulārajā cilpā, kurā ir iesaistīti dažādi regulēšanas mehānismi. [3], [10], [11]. Secība ir evolucionāli konservēta DRD2 mugurkaulniekiem, kas nozīmē atlikuma funkcionālo nozīmi.1A).

Lejupielādēt:   

• PPT

  PowerPoint slaids

• PNG

  lielāks attēls (2.08MB)

• TIFF

  oriģinālais attēls (4.36MB)

Attēls 1. Cdk5 fosforilē serīnu 321 DRD2 trešajā intracelulārajā cilpā in vitro.

(A) Aminoskābju secības saskaņošana, kurā parādīti DRD2 konservēti reģioni no dažādām sugām (iekrāsots). Potenciālo Cdk5 fosforilācijas vietu norāda ar zvaigznīti. (B) IP piesaistīts in vitro kināzes tests ar rekombinanto GST-D2i3 un GST-D2i3 mutantu proteīniem. Kināzes reakcijām tika izmantots Cdk5 / p35 komplekss, kas bagātināts no peles smadzeņu ekstrakta, izmantojot anti-p35 imunoprecipitāciju. Tiek parādīts fosforilēto proteīnu autoradiogrāfs kopā ar Coomassie briljanto zilo krāsošanu no tā paša gēla. Arrowhead norāda radioaktīvo signālu, kas atbilst GST-D2i3s, un atvērta bulttaustiņa norāda radioaktīvos signālus no p35. (C) D2i3 fosforilētā peptīda fragmenta MS / MS spektrs. Teorētiskie fragmentācijas modeļi ir parādīti zem spektra. Visu fragmentu jonu spektrā konstatēti konstatētie y- un b-joni. Y₆ un y₇ joni spēcīgi norāda uz serīna 321 fosforilāciju. (D) In vitro kināzes tests ar attīrītu Cdk5 / GST-p25 kompleksu, izmantojot GST-D2i3 un GST-D2i3 mutantu proteīnus. Fosforilētie proteīni tika parādīti autoradiogrāfijā kopā ar Coomassie brilliant blue krāsošanu. Arrowhead norāda radioaktīvo signālu, kas atbilst GST-D2i3 un atvērtajai bultiņas galvai norāda radioaktīvos signālus no GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Lai novērtētu Cdk5 spēju fosforilēt D2i3, mēs veicām IP pieslēgumu in vitro kināzes testi, izmantojot aktīvo Cdk5 / p35 kompleksu, kas bagātināts no peles smadzeņu lizāta ar p35 imunoprecipitāciju ar attīrītiem rekombinētiem GST-D2i3 (aminoskābju atlikumiem 212 – 373) proteīniem kā substrātiem. Mēs novērojām fosforilācijas signālus attīrītajos GST-D2i3 un GST-D2i3 S297A proteīnos, bet signāls ievērojami samazinājās, izmantojot GST-D2i3 S321A (1B). Lai vēl vairāk pārbaudītu serīna 321 fosforilāciju GST-D2i3, mēs veica LC-MS / MS analīzi no IP piesaistītajiem paraugiem. in vitro kināzes testi ar LTQ XL masas spektrometriju. Konsekventi tika atgūti fosfo-peptīdi, kas atbilst fosfo-serīna 321 peptīdu masai (1C). Ņemot vērā, ka datu atkarīga iegūšana LC-MS / MS analīzes laikā mēdz atklāt paraugā bagātīgas olbaltumvielas [31], šie dati liecina, ka serīna 321 atlikums ir dominējošā fosforilācijas vieta Cdk5 reģionā D2i3 reģionā. Lai pierādītu serīna 321 tiešo fosforilāciju GST-D2i3 ar Cdk5, in vitro veica kināzes analīzi, izmantojot attīrītu Cdk5 / GST-p25 kompleksu ar attīrītiem rekombinanto GST-D2i3 proteīniem. Mēs identificējām nozīmīgu fosforilācijas signālu GST-D2i3, kas nebija iekļauts GST-D2i3 S321A (1D). Kopumā šie rezultāti liecina, ka D2i3 S321 atlikums ir Cdk5 mediētā fosforilācijas priekšroka.

Cdk5 fosforilāti serīns 321 trešajā DRD2 intracelulārajā cilpā šūnās

Lai noteiktu serīna 321 fosforilāciju, mēs paaugstinājām antivielas, kas specifiskas fosfo-serīnam 321 (pS321). IP piesaistītie paraugi in vitro kināzes analīzi analizēja, izmantojot Western blotting, izmantojot anti-pS321 antivielu. Blotiem bija atšķirīga josla kināzes reakcijā, kas bija atkarīga no GST-D2i3 (2A). Lai pārbaudītu serīna 321 potenciālo fosforilāciju DRD2, izmantojot Cdk5 šūnās, anti-GFP imunoprecipitāti no HEK 293 šūnām, kas ekspresē DRD2-GFP un DRD2 S321A-GFP ar vai bez HA-Cdk5 un p35, tika analizēti ar Western blotēšanu, izmantojot anti-GFP un anti-pS321 antivielas. Anti-GFP antivielas, kas, kā zināms, ir saistītas ar DRD2 pārmērīgo glikozilāciju, raksturīgie smeared joslas signāli tiek novēroti tikai DRD2-GFP klātbūtnē, un anti-pS321 antivielas konstatēja līdzīgus DRD2 signālus tikai ar Cdk5 / p35 kopprasību (2B) [7]. Lai vēl vairāk pārbaudītu serīna 321 fosforilāciju ar Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) un D2i3 mutantu formu (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 un FLAG-D2i3 S321A, kas ekspresēti ar vai bez HA-Cdk5 un p35 HEK 293 šūnās, tika analizēti ar SDS-gel mobilitātes maiņas testu. FLAG-D5i2, bet ne FLAG-D3i2 S3A, tika novērota ievērojama Cdk321 atkarīga mobilitātes maiņa.2C). Mēs novērtējām arī DRD2 fosforilācijas līmeni Ser321 pēc agonistu stimulācijas. HEK 293 šūnas, kas ekspresē DRD2-GFP un Cdk5 / p35 kompleksu, tika stimulētas ar hinpirolu, un anti-GFP imunoprecipitāti no šūnu lizātiem tika analizēti, izmantojot Western blotting, izmantojot anti-GFP un anti-pS321 antivielas. Mēs atklājām, ka Cdk5 mediētā DRD2 fosforilācija Ser321 nav ietekmējusi agonistu stimulāciju, kas atšķiras no GRK- un PKC-mediētajām fosforilācijām (2D) [32], [33]. Kopā šie rezultāti liecina, ka Cdk5 var fosforilēt DRD321 serīna 2 atlikumu šūnu vidē.

Lejupielādēt:   

• PPT

  PowerPoint slaids

• PNG

  lielāks attēls (1.92MB)

• TIFF

  oriģinālais attēls (3.5MB)

Attēls 2. Cdk5 fosforilē serīnu 321 trešajā DRD2 intracelulārajā cilpā šūnās.

Serīna 5 Cdk321 mediētā fosforilācija tika analizēta, izmantojot anti-pS321 antivielu. (A) No IP piesaistītie paraugi in vitro kināzes analīzi, izmantojot GST-D2i3 proteīnus, analizēja ar Western blotēšanu (WB) ar norādītajām antivielām. Bultiņas norāda GST-D2i3. (B) DRD2-GFP un DRD2 S321A-GFP tika izteiktas ar vai bez HA-Cdk5 un p35 HEK 293 šūnās. Anti-GFP imunoprecipitātus analizēja, izmantojot Western blotting, izmantojot anti-GFP un anti-pS321 antivielas. Kronšteins norāda uz DRD2 signāliem un atklātā bultiņa norāda uz nespecifiskiem signāliem no anti-GFP imunoprecipitātiem. “% input” ir kopējā lizāta tilpums IP reakcijai. Vāji endogēni Cdk5 signāli tika atzīmēti ar zvaigznītēm. (C) Gēla mobilitātes maiņas tests. HEK 293 šūnas, kas transfekētas, kā norādīts, tika analizētas ar Western blotting. (D) Transfektētās HEK 293 šūnas tika ārstētas ar hinpirolu, un anti-GFP imunoprecipitāti tika analizēti ar Western blotēšanu ar anti-GFP un anti-pS321 antivielām. Atvērta bulttaustiņa norāda uz nespecifiskiem signāliem no anti-GFP imunoprecipitātiem.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 komplekss un DRD2 ir fiziski saistīti

Mēs pētījām iespējamo fizisko mijiedarbību starp Cdk5 / p35 kompleksu un DRD2, jo ir zināms, ka daudzi Cdk5 substrāti ir fiziski saistīti ar Cdk5 / p35 kompleksu [23], [34], [35]. Pirmkārt, tika veikts GST nolaižamais eksperiments. Attīrīts rekombinants GST-D2i3 proteīns tika inkubēts ar žurkas smadzeņu lizātu un GST nolaižamās nogulsnes tika analizētas Western blotēšanai. Kā parādīts 3Aendogēnās Cdk5 un p35 tika identificētas nolaižamās nogulsnēs, norādot uz fizisko mijiedarbību starp DRD2 un Cdk5 / p35 kompleksu (3A). Turklāt anti-GFP imunoprecipitātos tika konstatēti HA-Cdk5 un p35 no HEK 293 šūnu lizātiem, kas ekspresē DRD2-GFP un Cdk5 / p35 (3B). Bez tam, mēs veicām imūnsistēmiskas analīzes un konstatējām, ka DRD2-GFP, HA-Cdk5 un p35 uzrāda nozīmīgus kopregulācijas signālus HEK 293 šūnu membrānas apgabalā (3C, augšējie paneļi). Mēs arī pētījām DRD2 un Cdk5 / p35 kopīgo lokalizāciju neironu kontekstā. Konsekventi, DRD2-GFP arī parādīja nozīmīgu līdzāspastāvēšanu ar endogēnu Cdk5 un p35 kultivētajos striatāla neironos (DIV7), vēl vairāk atbalstot funkcionālās saites starp DRD2 un Cdk5 / p35 (3C, apakšējie paneļi). Rezultāti liecina, ka DRD2 un Cdk5 / p35 var veidot kompleksu un tādējādi atbalstīt priekšstatu, ka DRD2 ir Cdk5 fizioloģiskais substrāts.

Lejupielādēt:   

• PPT

  PowerPoint slaids

• PNG

  lielāks attēls (3.91MB)

• TIFF

  oriģinālais attēls (5.35MB)

Attēls 3. Cdk5 / p35 var veidot kompleksu ar DRD2.

(A) GST nolaišanas tests, izmantojot attīrītu rekombinanto GST-D2i3 proteīnu ar žurkas smadzeņu ekstraktu. GST nolaižamās nogulsnes tika pakļautas Western blotting analīzēm. “Bead” norāda nolaižamo nogulsni bez GST proteīniem. (B) DRD2 un Cdk5 / p35 kompleksa imunoprecipitācija. Anti-GFP IP no transficēto šūnu lizātiem tika pakļauts Western blotting analīzēm. Kronšteins norāda uz DRD2 signāliem un atklātā bultiņa norāda uz nespecifiskiem signāliem no anti-GFP imunoprecipitātiem. Labajā pusē ir parādīts arī pārmērīgs ekspozīcijas efekts. (C) DRD2 un Cdk5 / p35 imūnocitokemiskās analīzes. HEK 293 šūnas, kas ekspresē DRD2-GFP un Cdk5 / p35, tika iekrāsotas ar anti-Cdk5 un anti-p35 antivielām (augšējie paneļi). DRD2-GFP tika ekspresēts tikai kultivētajos striatāla neironos un krāsots ar anti-Cdk5 un anti-p35 antivielām (apakšējiem paneļiem). Hoechst tika izmantots kodolkrāsošanai. Skalas josla ir 5 µm. Visi attēli tika iegūti, izmantojot konfokālo mikroskopu (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5 fosfilācija Cdk2-mediētā veidā vājina receptoru aktivitāti

Ir ziņots, ka fosforilācija modulē GPCR kritiskās īpašības, piemēram, G proteīna savienojumu, receptoru internalizāciju, intracelulāro lokalizāciju un saistību ar modulatora proteīniem. [9], [11], [24]. gonistu izraisīta receptoru internalizācija ir kritisks signālu pārraides regulēšanas process. Mēs pētījām Cdk5 mediēto DRD2 internalizācijas modulāciju. HEK 293 šūnas, kas ekspresē DRD2-GFP un DRD2 S321A-GFP ar vai bez Cdk5 / p35, tika inkubētas ar 1 µM ​​quinpirole, lai izraisītu agonistu stimulētu DRD2 internalizāciju (4A). [³H] -spiperona signāli DRD2-GFP ekspresējošām šūnām tika ievērojami samazināti 30 min quinpirole terapijas laikā un atgūti 90 min. Interesanti, [³H] -spiperona signāli no DRD2-GFP un Cdk5 / p35 ekspresējošām šūnām arī tika samazināti 30 min quinpirole terapijas laikā, bet nav atgūti 90 min.4A, otrā daļa). No otras puses, [³H] -spiperona signāli DRD2 S321A-GFP ekspresējošās šūnās tika samazināti pie 30 min un atgūti pie 90 min, neatkarīgi no kopējās ekspresijas ar Cdk5 / p35. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka internalizētā DRD2 atgriežas atpakaļ plazmas membrānā pēc ilgstošas ​​agonistu stimulācijas. [11]. Tšķiet, ka DRD5 ar Cdk2 starpniecību saistītā fosforilācija ir iesaistīta rezensitizācijas procesos pēc agonistu izraisītās DRD2 internalizācijas.

Lejupielādēt:   

• PPT

  PowerPoint slaids

• PNG

  lielāks attēls (387KB)

• TIFF

  oriģinālais attēls (1.31MB)

Attēls 4. Cdk5-mediētā fosforilācija vājina DRD2 virsmas ekspresiju un lejupvērstu signalizāciju.

(A) DRD2 virsmas ekspresija, ko mēra ar [³H] -spiperona saistīšanās tests. Transfektētās HEK293 šūnas tika stimulētas ar 1 µM ​​kvinpirolu norādītajā laikā un novāktas, kam sekoja 3 nM [³H] -spiperona apstrāde 3 h. Tika izmērīta radioaktivitāte un aprēķināti virsmas signāli. Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; vienvirziena ANOVA ar Dunnett post hoc testu: salīdziniet visas kolonnas ar kontroles kolonnu). (B) [³⁵S] -GTP_γS saistīšanās tests. Šūnu membrānas tika pagatavotas no šūnām, kas tika transficētas kā norādīts. Membrānas preparātus inkubēja ar 1 µM ​​quinpirole, kam sekoja 3 nM [³⁵S] -GTP_γS 90 minūtes. Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; vienvirziena ANOVA ar Bonferroni post hoc testu: salīdziniet visus kolonnu pārus). (C) Hinpirola konkurējošais [³H] -spiperona saistīšanās tests. Membrānas preparāti no transficētām šūnām tika inkubēti ar 0.01 nM [³H] -spiperons un pieaugoša hinpirola koncentrācija 30 minūtes. Nelineāro regresiju ieguva GraphPad. Kļūdu joslas norāda vidējo ± SE (n = 3). (D) cAMP enzīmu imūnās pārbaudes transfektētās HEK 293 šūnās. Transfektētās šūnas 10 stundu iepriekš apstrādāja ar 1 µM roliprama un pēc tam 0.1 minūtes kopīgi apstrādāja ar 30 µM forskolīnu un palielinātu hinpirola koncentrāciju. Nelineāro regresiju ieguva GraphPad. Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± SE (n = 4; ** p <0.01; divzaru t-tests). (E) Kultivēti striatāla neironi no savvaļas tipa un p35 izlaistiem embrijiem (DIV 7) tika ārstēti ar 10 µM ​​rolipramu 1 h, kam sekoja 1 µM ​​dopamīns 1 h. Kļūdu joslas ir vidējais ± SE (n = 4; **p<0.01; divdaļīgs t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Mēs arī izvērtējām iespējamo G-proteīna agonistu sajaukšanās ar DRD2 saistīto ar Cdk5 saistīto fosforilāciju, izmantojot [³⁵S] -GTP_γS saistīšanās tests [25], [26]. DRD2-GFP un DRD2 S321A-GFP ar vai bez Cdk5 / p35 tika izteiktas HEK 293 šūnās. Membrānas tika sagatavotas un stimulētas ar 1 µM ​​quinpirole un tālāk atļauts [³⁵S] -GTP_γS iekļaušana. DRD2-GFP un Cdk5 / p35 ekspresējošā šūnu membrāna ievērojami samazinājās [³⁵S] -GTP_γS saistīšanās, salīdzinot ar visām citām šūnu membrānām (4B). Šie rezultāti liecina, ka Cdk5-mediētā fosforilācija regulē agonistu stimulēto G proteīnu saistīšanos DRD2.

Bez tam, činpirole konkurē [³H] -spiperona saistīšanās testi tika veikti, lai izpētītu jebkādas iespējamās izmaiņas agonistu-afinitātes ziņā DRD2, izmantojot Cdk5-mediētu fosforilāciju. [³H] -spiperonu pēc paaugstinātas koncentrācijas hinpirola apstrādes pret membrānas preparātu no transfekcijas tika mērīts. Kvinpirola un [³H] -spiperons pie DRD2-GFP un DRD2 S321A-GFP veica līdzīgu logK_i vērtības (-9.789 DRD2-GFP; -9.691 attiecībā uz DRD2 S321A-GFP), kas norāda, ka ligzdas ar DRD2 afinitāti būtiski neietekmē Cdk5-mediētais fosforilācijas process DRD2 (4C).

Cdk5-mediētais fosforilācijas režīms Regulē DRD2-cAMP signalizācijas ceļu

Pēc tam mēs pētījām, vai Cdk2 veiktā DRD5 modifikācija ietekmē pakārtotos signalizācijas ceļus. Mēs uzraudzījām forskolīna stimulēta cAMP ražošanas inhibīciju ar adenililciklāzi šūnās, kas ekspresē DRD2-GFP un DRD2 S2A-GFP, izmantojot cAMP enzīmu imūnanalīzi. DRD321 ekspresējošās šūnas uzrādīja samazinātu cAMP līmeni atbildes reakcijā uz hinpirolu devas atkarīgā veidā. Jāatzīmē, ka Cdk2 / p5 ekspresija būtiski samazināja maksimālo cAMP veidošanās inhibīciju (4D, kreisais panelis). No otras puses, DRD2 S321A-GFP ekspresējošās šūnās cAMP veidojumi tika efektīvi inhibēti, reaģējot uz ārstēšanu ar hinpirolu neatkarīgi no Cdk5 / p35 ekspresijas (4D attēls, labais panelis). Šie rezultāti liecina, ka DRD5 Cdk2 mediētā fosforilācija vājina DRD2 inhibējošo aktivitāti lejupējā cAMP signalizācijas ceļā. Lai vēl vairāk apstiprinātu parādības fizioloģiski nozīmīgākā vidē, mēs izmantojām primārus kultivētus neironus no izsitošiem embrijiem, kas bija nepietiekami p35, būtisks Cdk5 aktivators. Primārās kultivētās striatāla neironi tika ārstēti ar 1 µM ​​dopamīnu un analizēti ar cAMP enzīmu imūnanalīzi. Neironi no p35 knockout pelēm uzrādīja samazinātu cAMP līmeni, salīdzinot ar savvaļas tipa neironiem, ja tie tika stimulēti ar dopamīnu (4E). TKopā mēs secinājām, ka DRD5 Cdk2-mediētā fosforilācija izraisa kavējošā tonusa samazināšanos uz DRM2 izraisītā cAMP ceļa.

diskusija

Mēs identificējām DRD2 kā jaunu Cdk5 substrātu. Šķiet, ka fosforilācija samazina DRD2 virsmas ekspresiju, ietekmējot DRD2 likteni pēc receptoru internalizācijas, tādējādi samazinot DRD2 G_icAMP un cAMP ceļu. Tā kā fosforilācijas atlikums S321 eksistē gan DRD2 garajās, gan īsās izoforcijās, šajā pētījumā ierosinātais mehānisms var būt vispārējs regulēšanas veids DRD2 mediētā signalizācijā..

DRD2 vidējos smadzeņu neironos ne tikai tiek uzskatīts par galveno dopamīna receptoru apakštipu, bet arī atzīts par jutīgu pret izmaiņām pieejamībā, reaģējot uz vides stimuliem. Ir plaši pētīta DRD2 agonistu izraisītā desensibilizācija un resensibilizācija [11], [24]. Konkrētāk, vairāki pētījumi ir parādījuši, ka hroniskas psihostimulanta iedarbības, piemēram, kokaīna un amfetamīna iedarbība, kas paaugstina dopamīna ekstracelulāro līmeni striatāla sinapses laikā, ir saistīta ar dinamiskām DRD2 izmaiņām postynaptically [36]. Patiešām, ir zināms, ka hroniskie kokaīna lietotāji samazina DRD2 līmeni striatāla zonā, un DRD2 pieejamība kodolkrāsās (NAcc) uzrāda negatīvu korelāciju ar zāļu meklēšanu un pastiprinošo uzvedību pelēm un primātiem. [37]-[39]. Šie rezultāti liecina, ka DRD2 funkcionalitāte ir ļoti jutīga pret adaptīvu vai kompensējošu regulēšanu, reaģējot uz dažādiem stimuliem, ieskaitot hronisku zāļu iedarbību. Mūsu rezultāti liecina, ka S321 atlikumu DRD2 trešajā intracelulārajā cilpā var fosforilēt ar Cdk5, kā rezultātā samazinās DRD2 inhibējošā ietekme uz cAMP ceļu. Šī mijiedarbība piedāvā jaunu regulatīvo mehānismu, kas saistīts ar Cdk5 dopaminoceptīvajos neironos, kas varētu būt saistīts ar DRD2 virsmas pieejamības dinamisko raksturu.

Jāatzīmē, ka ir zināms, ka Cdk5 ir galvenais elements neironu vides adaptīvo izmaiņu starpniecībā. Piemēram, dendritisko muguriņu strukturālās un funkcionālās izmaiņas limbiskās ķēdes neironos ir viena no atkārtotas psihostimulanta iedarbības sekām. [40]. Šīs izmaiņas ir saistītas ar dažādām molekulārām izmaiņām, tostarp cAMP atbildes elementa saistošā proteīna (CREB) un ΔFosB indukciju, transkripcijas faktoriem, kam piemīt ilgstoša regulācija, reaģējot uz hronisku kokaīna lietošanu [41], [42]. Svarīgi, ka Cdk5 ir ΔFosB mērķis [19], un daudzi kritiski komponenti, kas iesaistīti dendrīta mugurkaula dinamikā, piemēram, PSD-95, p21-aktivētā kināze (PAK), β-katenīns un spinofilīns, tika ziņots kā Cdk5 substrāti [43]-[46]. Cdk5 aktivitātes konsekventi, ģenētiski vai farmakoloģiski manipulējot, izraisa dendritisko mugurkaula morfoloģijas un uzvedības reakciju izmaiņas, kas nozīmē, ka Cdk5 ir būtiska loma mesolimbisko dopamīna ķēžu molekulārajās un morfoloģiskajās pārmaiņās. [47], [48]. Mūsu rezultāti, kas pierāda, ka DRD2 ir jauns Cdk5 mērķis, sniedz papildu ieskatu dopamīna sistēmas adaptīvajās pārmaiņās, reaģējot uz hroniskām zāļu iedarbībām, jo ​​turpmākā ΔFosB-mediētā Cdk5 regulēšana var izraisīt DRD2 fosforilācijas tonizējošu pieaugumu . Turklāt ir zināms, ka DRD2 ietekmē daudzus šūnu procesus, tostarp cAMP un MAP kināzes ceļu regulēšanu un transkripcijas notikumus lejup pa straumi. [42], [49]. Tādējādi šajā pētījumā iegūtie rezultāti var ne tikai attēlot Cdk2 tiešo DRD5 regulāciju, bet arī sniedz jaunu ieskatu dopamīna sistēmas adaptīvajās reakcijās uz hronisku zāļu iedarbību.

Autora iemaksas

Izstrādāti un izstrādāti eksperimenti: JJ YUP DH SKP. Veicis eksperimentus: JJ YUP DKK YK. Analizēti dati: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Iegūtie reaģenti / materiāli / analīzes rīki: YHS. Rakstīja papīru: JJ SKP.