Neirālo shēmu dekodēšana, kas kontrolē kompulsīvo saharozi (2015) (BINGE MECHANISM)

Lai identificētu LH neironus, kas in vivo nodrošina monosinaptisku ievadi VTA un novērotu to aktivitāti brīvi kustīgas uzvedības laikā, mēs izmantojām dubultvīrusu stratēģiju, lai selektīvi izteiktu kanradrodopsīnu-2 (ChR2) LH neironos, nodrošinot monosinaptisku ievadi VTA (Skaitļi 1A un S1). Mēs injicējām adeno saistītu vīrusu vektoru (AAV₅), kas ChR2-eYFP satur Cre-rekombināzes atkarīgā dubultā apgrieztā atvērtā lasīšanas rāmja (DIO) konstrukcijā LH, lai inficētu vietējās somatas, un injicēja retrogradāli ceļojošu herpes simplex vīrusu (HSV), kas pārnēsāja Cre-rekombināzi VTA. Turpmākā rekombinācija pieļāva opzīna un fluorofora ekspresiju selektīvi LH neironos, nodrošinot monosinaptisku ievadi VTA. Lai apstiprinātu mūsu pieeju, mēs veicām ex vivo visu šūnu plāksteru skavu ierakstus horizontālās smadzeņu šķēlēs, kas satur LH, un reģistrē no neironiem, kas ekspresē ChR2-eYFP, kā arī no kaimiņu LH neironiem, kuri bija ChR2-eYFP negatīvi (1. attēlsB). Gaismas izraisītie smailes latentumi, mērot no gaismas impulsa sākuma līdz darbības potenciāla virsotnei, svārstījās no 3–8 ms (1. attēlsC). Mēs arī atklājām, ka nevienā no neekspresējošajām (ChR2 negatīvajām) šūnām nebija uzbudinošas reakcijas uz fotostimulāciju (n = 14; 1. attēlsC), neskatoties uz to tuvumu ChR2 ekspresējošajām šūnām.

Lai in vivo veiktu optogenētiski mediētu fotoidentifikāciju, LH tika implantēts optrode, lai reģistrētu neironu aktivitāti saharozes meklēšanas uzdevuma laikā. Tajā pašā ierakstīšanas sesijā mēs nodrošinājām vairākus fotostimulācijas modeļus, lai identificētu ChR2 ekspresējošos LH-VTA neironus (Skaitļi 1D un S1). Mēs pārbaudījām eksitējošo fotorezistentu latentumu sadalījumu visos LH neironos, kas parādīja laika bloķēšanu, mainot šaušanas ātrumu, reaģējot uz apgaismojumu, un novēroja bimodālu sadalījumu (1. attēlsE). In vivo ierakstu laikā mēs novērojām neironu populāciju ar latentumu 3–8 ms diapazonā. Tas bija identisks latentuma diapazonam, kas atrasts ChR2 ekspresējošos LH-VTA neironos, kad reģistrējām ex vivo. Šīs vienības mēs nosaucām par “1. tipa” vienībām (Skaitļi 1C, 1E un 1F). Turklāt bija izteikta šūnu populācija ar ∼100 ms fotoreakcijas latentumu (Skaitļi 1E un 1G), un mēs saucām par šīm “2 tipa” vienībām. Mēs arī novērojām neironus, kas tika inhibēti, reaģējot uz LH-VTA neironu fotostimulāciju (S2 attēls), un mēs saucām par šīm “3 tipa” vienībām. Mēs salīdzinājām darbības potenciāla ilgumu (mērot no pīķa līdz silei) un vidējos šaušanas ātrumus 1 un 2 tipa vienībām, kā arī tos, kas neuzrādīja fotoreakciju (1. attēlsH). 1 tipa darbības potenciāla ilgumu sadalījums (1. attēlsI) un 2 tips (1. attēlsJ) vienības parāda, ka lielākajai daļai 1. tipa vienību darbības potenciāla ilgums ir mazāks par 500 μs (84%; n = 16/19, binomālais sadalījums, p = 0.002).

Lai gan 1. tipa vienības atbilst standarta kritērijiem, lai tās varētu klasificēt kā ChR2 ekspresējošas (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), nebija skaidrs, vai 2. tipa vienību ilgāka latentā fotoreaģēšana liecināja par ChR2 ekspresējošiem neironiem, kas reaģēja lēnāk līdz fotostimulācijai vai arī tas, vai šo efektu izraisīja tīkla darbība. Ņemot vērā to, ka ChR2 ekspresējošie (1. tipa) LH neironi projicējas tieši uz VTA, viena iespēja bija tāda, ka 2. tipa neironi saņēma atgriezenisko saiti no VTA (1. attēlsK). Vēl viena iespēja bija, ka 2 tipa neironus aktivizēja ar 1 tipa neironiem, kas iegūti no aksoniem.1. attēlsL). Lai nošķirtu šos divus iespējamos ķēdes modeļus, mēs aizkavējām VTA kopā ar fotoidentifikāciju LH.

Balstoties uz mūsu ķēdes modeļiem, mēs sagaidām, ka distālā inhibīcija neietekmēs ChR2 ekspresējošo LH neironu fotorezonos. Tomēr, ja fotoreaktīvi, bet neizpaužot, LH neironi balstījās uz atgriezenisko saiti no VTA, lai izsauktu laika bloķētu reakciju uz apgaismojumu (1. attēlsK), mēs sagaidām, ka šajos neironos pēc VTA inhibīcijas fotorezonu samazinās. Mēs izrādījām ChR2 LH-VTA šūnās, kā minēts iepriekš, bet šoreiz VTA izteica arī uzlaboto halorodopīnu 3.0 (NpHR) un papildus optiskajam LH implantēt optisko šķiedru VTA.2. attēlsA). Mēs nodrošinājām vienādus zilās gaismas apgaismojuma modeļus LH visiem trim laikmetiem, bet arī fotoinhibējamējām VTA ar dzelteno gaismu otrajā laikmetā (2. attēlsA).

1 vienību fotorefekti līdz zilās gaismas apgaismojumam LH neietekmēja VTA fotoinhibēšana, kas atbilst ChR2 ekspresijai 1 tipa LH-VTA neironos (2. attēlsB). Turpretī lielākā daļa 2. tipa vienību (87%; n = 13/15, binomālais sadalījums, p = 0.004) parādīja ievērojamu fotorezonu vājināšanos zilās gaismas impulsiem, kas tika piegādāti LH pēc VTA neironu fotoinhibīcijas. 1. un 2. tipa vienību reakcijas VTA fotoinhibīcijas laikā bija ievērojami atšķirīgas (chi-square = 7.64, p = 0.0057; Skaitļi 2B un 2C). Šīs atšķirības var redzēt arī maksimālajos Z rādītājos atsevišķos laikmetos (2. attēlsD) un dzeltenā ON laikmets, kas normalizēts ar dzelteno-OFF laikmetu (2. attēlsE). Šie dati liecina, ka 2 LH neironi saņem VTA ievadi (tieši vai netieši).1. attēlsK), nevis vietējie axon nodrošinājumi (1. attēlsL).

Pēc tam, kad LH-VTA cilpā ir identificēti šie divi atšķirīgie LH neironu tipi, mēs gribējām pārbaudīt dabiski sastopamo nervu aktivitāti saharozes pašpārvaldes uzdevuma laikā (3. attēlsA). Peles tika apmācītas veikt atbildes uz degunu, lai norādītu saharozes piegādi blakus esošajā ostā (kā Tye et al., 2008). Lai ļautu mums diferencēt neironu reakcijas uz deguna kakliņu un signālu, bižele un saharoze tika piegādāti pēc daļējas pastiprināšanas shēmas, kur 50% deguna kaklu tika savienoti pārī ar bižele un saharozes piegādi.

1 tipa vienībām bija faziska reakcija uz saharozes portu, kā redzams 1 tipveida vienībā (3. attēlsB), kā arī visu 1 tipa vienību populācijas dati (\ t3. attēlsC). Tomēr 2 tipa bloku fāziskās atbildes pārsvarā atspoguļoja atbildes uz atalgojuma prognozēšanas likmi (Skaitļi 3D un 3E). Katram uzdevuma komponentam tiek parādīti visu reģistrēto neironu normalizētie šaušanas modeļi (n = 198, sadalīti 1., 2., 3. tipa un nereaģējošās vienībās): deguna kakliņi, kas savienoti pārī ar signālu, deguna kakli, ja nav signāla. saharozes ostas ieraksts (3. attēlsF). Visas 1. tipa vienības, kurās parādījās ar uzdevumu saistītas darbības pakāpeniskas izmaiņas (74%; n = 14/19), tika vai nu pakāpeniski uzbudinātas, vai arī kavētas, ievadot saharozes portu, un neliels skaits parādīja arī pakāpenisku nomākšanu atlīdzības prognozēšanas signālam (Skaitļi 3B, 3C un 3G). Turpretim 2 tipa vienības bija daudz neviendabīgākas, ar uzdevumu atsaucošiem neironiem, kas kodē kodējumu selektīvi (35%), saharozes portu ievade selektīvi (26%), vai gan cue, gan portu ieraksts (12%; Skaitļi 3D, 3E un 3H). Lai ilustrētu 1 tipa un 2 tipa bloku atbilžu stiprumu ar uzdevumiem saistītiem notikumiem, katrai šūnai tika uzrādīta trīsdimensiju diagramma saskaņā ar Z punktu skaitu3. attēlsI). Lai parādītu fāzisko izmaiņu sadalījumu šaušanā vairākos ar uzdevumu saistītos pasākumos kvalitatīvā līmenī, mēs uzrādījām katras fotoreaktīvā tipa šūnu skaitu, kas nonāca noteiktā kategorijā (3. attēlsJ).

Ņemot vērā precīzi definēto VTA lomu atlīdzības prognozēšanas kļūdās (piemēram, DA neironu šaušanas pakāpeniska samazināšana, reaģējot uz negaidītu atlīdzības izlaišanu, un fāzes ierosmi, reaģējot uz negaidītu atlīdzības piegādi) (Schultz et al., 1997), mēs pētījām, vai LH neironi kodēs negaidītu saharozes atlīdzības izlaišanu. Lai to izdarītu, mēs labi apmācītiem dzīvniekiem reģistrējām fotoreaktīvo neironu neironu darbību vienā un tajā pašā mērķa un atlīdzības uzdevumā, bet pēc noklusējuma nejauši izlaida 30% saharozes piegāžu (4. attēlsA).

Lielākā daļa 1. tipa vienību (88%; n = 15/17, binomālais sadalījums, p = 0.001) bija nejutīgas pret atalgojuma izlaidumu (Skaitļi 4B un 4D), turpretī lielā 2. tipa vienību apakškopā (67%; n = 12/18) bija ievērojami atšķirīga reakcija uz atlīdzības pasniegtajiem un izlaistajiem izmēģinājumiem (Skaitļi 4C un 4D). Mēs secinājām, ka LH-VTA (1 tipa) neironi kodē darbību, lai ieietu ostā, jo šīs ostas ieejas reakcijas bija noturīgas pat pēc atalgojuma izlaiduma (4. attēlsD), atšķirībā no 2. tipa vienībām (chi-square = 10.9804, p = 0.0009).

Lai noteiktu, vai 1 tipa atbildes uz ostas ierakstu patiešām kodēja kondicionēto atbildi (CR), pretēji vispārējai atalgojuma meklēšanai vai izpētei, mēs ierakstījām neapmācītas peles, kas vēl nebija ieguvušas šo uzdevumu. Ar uzdevumu nezināmām pelēm mēs nosūtījām ostā saharozi, ja nebija prognozējama ceļa (neparedzēta atlīdzības piegāde), un konstatējām, ka 1 tipa vienības neparādīja faziskas atbildes uz ostas ierakstu (Skaitļi 4E, 4F un 4I), kas atbilst modelim, ka 1 tipa neironi kodē CR (4. attēlsJ).

Pēc tam, lai noteiktu, vai 2 tipa vienības darbība atbilst atalgojuma prognozēšanas kļūdas veida atbildes profilam, mēs arī fiksējām šos neironus labi apmācītiem dzīvniekiem neparedzētas atlīdzības piegādes laikā (4. attēlsG). Mēs noskaidrojām, ka 2. tipa vienību apakškopa reaģēja uz neparedzētām saharozes piegādēm (50%; Skaitļi 4G – 4I). Kopumā 2 vienību apakšgrupas ir jutīgas pret negaidītu atalgojuma izlaidumu (Skaitļi 4C un 4D) un neparedzētu atalgojuma piegādi (Skaitļi 4G – 4I), kas atbilst atalgojuma prognozēšanas kļūdas reakcijas profilam.

Kā jau iepriekš parādīts, 1 tipa vienības pārstāv CR neirālo korelāciju. Svarīgi, ka šaušanas ātruma pieaugums sākas pirms CR, palielinoties līdz CR pabeigšanai (Skaitļi 3B, 3C un 4B). Lai noskaidrotu, vai LH-VTA ceļa aktivizēšana var veicināt CR, mēs vēlējāmies pārbaudīt LH-VTA aktivācijas spēju CR braukšanas laikā negatīvās sekas. Savvaļas tipa pelēm mēs LH šūnu struktūrās ekspresējām tikai ChR2-eYFP vai eYFP un implantējām optisko šķiedru virs VTA (Skaitļi 5A un S4). Un otrādi, lai pārbaudītu LH-VTA ceļa lomu CR vai ar barošanu saistītas uzvedības starpniecībā, mēs LH šūnās divpusēji izteicām tikai NpHR-eYFP vai eYFP un virs VTA implantējām optisko šķiedru (Skaitļi 5A un S4).

Mēs izstrādājām Pavlovijas kondicionēšanas uzdevumu, kurā pelēm, kurām nav pārtikas, bija jāpārvar šoka režģis, lai iegūtu saharozes atlīdzību (5. attēlsB). Pirmajā “bāzes” laikmetā (ar izslēgtu šoka režģi) mēs pārbaudījām, vai katra pele ir ieguvusi Pavlova nosacītās pieejas uzdevumu. Otrajā (“Šoks”) laikmetā šoka režģis katru sekundi izraisīja vieglus pēdu triecienus. Visbeidzot, trešajā laikmetā (“Trieciens + gaisma”) mēs turpinājām piegādāt pēdu triecienus, bet arī apgaismojām LH spailes VTA ar zilu gaismu (10 Hz) pelēm, kuras izteica ChR2 un saskaņotas eYFP vadīklas un dzeltenu gaismu (nemainīgu), lai pelēm, kas pauž NpHR, un to eYFP kontrolēm (5. attēlsB).

Mēs novērojām ievērojami lielāku portu ierakstu skaitu uz vienu celi Shock + Light epohas laikā un ievērojami lielāku atšķirību rezultātu (Shock + Light epoch - Shock-only epoch) ChR2 pelēm, salīdzinot ar eYFP pelēm (5. attēlsC un Filma S1). Turpretim LH-VTA ceļa fotoinhibēšana izraisīja nozīmīgu ostas ierakstu samazinājumu uz vienu cue un starpību punktu NpHR pelēm salīdzinājumā ar eYFP pelēm (5. attēlsD un Filma S2). Sesijas laikā izmiršanas eksperimentos, kuru laikā neievēroja saharozes piegādi, bija līdzīgas tendences (S4 attēls).

Svarīgi, ka mēs vēlējāmies noskaidrot, vai izmaiņas, ko mēs esam guvuši, saharozes meklējumos izraisīja ar barību saistītās uzvedības vai jutīguma pret sāpēm izmaiņas. Mēs novērojām, ka LH-VTA projekcijas fotoaktivizācija ievērojami palielināja laiku, ko ChR2 grupā pavadīja labi barotā pelēm.5. attēlsE). Tomēr LH-VTA ceļa fotoinhibēšana būtiski nemazināja barošanu (5. attēlsF), lai gan šie dzīvnieki bija liegti, lai palielinātu mūsu spēju noteikt samazinājumu attiecībā pret sākotnējo laikmetu (salīdzinot ar dzīvniekiem, kas dzīvo 5. attēlsE). Ne ChR2 (5. attēlsG) un NpHR grupa (5. attēlsH) vai mēs novērojām latentuma atšķirību līdz astes izņemšanai no karstā ūdens (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto and Sulman, 1967), norādot, ka manipulēšana ar LH-VTA projekciju nemainīja atsāpināšanu.

Lai izpētītu LH ievadu ātrās pārraides komponentu sastāvu VTA, kas izraisīja šos efektus, mēs veicām visu šūnu plāksteru skavu ierakstus no VTA neironiem akūtas šķēles preparātā, vienlaikus optiski aktivizējot LH ievadi, kas izteica ChR2-eYFP (Skaitļi 6A un S5). Ņemot vērā to, ka VTA ir labi izveidota neviendabība, tai skaitā ~ 65% DA neironi, ~ 30% GABA neironi un ~ 5% glutamāta neironi (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007), mēs ierakstīšanas laikā piepildījām šūnas ar biocitīnu, lai varētu identificēt šūnu tipu, izmantojot tirozīna hidroksilāzes (TH; 6. attēlsB) papildus hiperpolarizācijas aktivētās katjona strāvas ierakstīšanai (I_h) un šūnu atrašanās vietas kartēšana (Skaitļi 6B un S5).

Pirmkārt, ChR2 ekspresējošo LH ieeju fotostimulācijas laikā reģistrējām strāvas skavu un konstatējām, ka 23 neironu 27 parādīja laika bloķētu reakciju uz LH ieeju fotostimulāciju (6. attēlsC). Lielākā daļa DA neironu, no kuriem tika ņemti paraugi VTA, saņēma neto eksitācijas ievadi no LH (56%), bet citā apakšgrupā bija neto inhibīcija (30%; 6. attēlsC). Šo DA neironu telpiskais sadalījums tiek kartēts uz horizontālu šķēļu atlases, kas satur VTA (6. attēlsD).

Lai noteiktu LH ievadu monosinaptisko ieguldījumu VTA DA neironos, mēs izmantojām ChR2 atbalstītu ķēdes kartēšanu, kur sprieguma skavas ierakstus veica tetrodotoksīna (TTX) un 4-aminopiridīna (4AP; Petreanu et al., 2007) klātbūtnē. . Saskaņā ar mūsu novērojumiem no pašreizējiem skavas ierakstiem, mēs novērojām, ka lielākā daļa reģistrēto VTA DA neironu saņēma tikai ierosinošu monosinaptisku ievadi no LH (67%), salīdzinot ar VTA DA neironiem, kas saņēma tikai inhibējošu monosinaptisku ievadi (11%) vai abi (22%; Skaitļi 6E un S6).

Mēs identificējām VTA GABA neironus, injicējot no Cre atkarīgu fluoroforu (AAV₅-DIO-mCherry) VGAT :: Cre peles VTA un izmantoja mCherry ekspresiju, lai virzītu VTA GABA neironu (n = 24; 6. attēlsF). Četrdesmit seši procenti VTA GABA neironu reaģēja ar neto ierosmi, bet 54% reaģēja ar neto inhibīciju, ChR2 ekspresējošo LH ieeju fotostimulācijai (6. attēlsG). Šo šūnu telpiskais sadalījums ir parādīts 6. attēlsH. Pārbaudot LH monosinaptisko ievadi (kā aprakstīts iepriekš), mēs noskaidrojām, ka 18% no atlasītajiem GABA neironiem saņēma tikai eksitējošu ieeju un 9% saņēma tikai inhibējošu ievadi (6. attēlsI). Tomēr, salīdzinot ar VTA DA neironiem, mēs noskaidrojām, ka vairāk VTA GABA neironu saņēma gan ierosinošu AMPAR starpniecību, gan inhibējošu GABA_AR-starpniecības monosinaptiskais ievads no LH (73%; chi-kvadrāts = 5.0505, p = 0.0246; Skaitļi 6Es un S6).

Ņemot vērā to, ka mūsu ex vivo ieraksti sniedza pierādījumus, kas pamatoja gan GABAergisko, gan glutamaterģisko LH projekciju spēcīgo ievadīšanu VTA, mēs tālāk pārbaudījām katra komponenta lomu neatkarīgi. Lai to izdarītu, mēs izmantojām transgēnas peles līnijas, kas neironos ekspresē Cre-rekombināzi, kas izteica vai nu vezikulārā glutamāta 2 (VGLUT2), vai vezikulārā GABA (VGAT) pārvadātāju. Mēs injicējām AAV₅-DIO-ChR2-eYFP vai AAV₅-DIO-eYFP VGLUT2 :: Cre un VGAT :: Cre peles LH un implantēja optisko šķiedru virs VTA (S7 attēls). Šie dzīvnieki pēc tam tika veikti katram uzvedības testam, kas parādīts 5. attēls.

Mēs nenovērojām nekādas konstatējamas atšķirības starp portu ierakstu skaitu, kas veikts uz vienu celi starp pelēm, kas izteica ChR2 vai eYFP LH^pārpilnība-VTA projekcija (7. attēlsA) vai LH^GABA-VTA projekcija (7. attēlsB). Tomēr pēc video analīzes mēs pamanījām, ka LH ir novirzījusies uzvedība^GABA-VTA: ChR2 grupa pēc zilās gaismas apgaismojuma (skat Filmas S3 un S4). LH^pārpilnība-VTA pelēm, lai gan ChR2 grupā bija tendence samazināt barošanu pēc fotostimulācijas salīdzinājumā ar eYFP grupu, tas nebija statistiski nozīmīgs (7. attēlsC). Pretēji tam, mēs novērojām spēcīgu laika pieaugumu, kas pavadīts barošanas laikā ar pelēm pēc apgaismojuma LH^GABA-VTA: ChR2 grupa attiecībā pret kontrolēm (7. attēlsD un Filma S3). Nevienā dzīvnieku grupā nebija vieglas stimulācijas ietekmes astes izņemšanas testā (Skaitļi 7E un 7F).

Barošanas uzdevuma laikā, kā mēs to darījām uzdevuma veikšanas laikā, mēs atkal pamanījām neskaidras ar barību saistītas motora sekvences. Mēs filmējām reprezentatīvu peli LH^GABA-VTA: ChR2 grupa tukšā caurspīdīgā kamerā un pēc 20 Hz fotostimulācijas novērojām neparastas ēstgribas motora sekvences, piemēram, grīdas vai tukšas vietas laizīšanu un graušanu (Filma S4). Mēs šo skaitļošanas uzvedību kvantificējām barošanas uzdevumā savvaļas tipa LH-VTA (7. attēlsG), LH^pārpilnība-VTA (7. attēlsH) un LH^GABA-VTA (7. attēlsI) grupas un parādīja, ka LH^GABA-VTA: ChR2 pelēm gnawed vairāk nekā savvaļas tipa vai LH^pārpilnība-VTA: ChR2 peles, ja tās ir fotostimulētas, salīdzinot ar to attiecīgajām eYFP grupām (7. attēlsJ). Mēs izskatījām, vai ar novirzīšanu saistītā uzvedība var tikt atdalīta no pienācīgi virzītas barošanas zemākās frekvencēs. Tomēr, kad mēs pārbaudījām LH^GABA-VTA: ChR2 grupa ar 5 Hz un 10 Hz zilās gaismas vilcieniem, mēs novērojām proporcionālu saistību starp stimulācijas biežumu un barošanu un graušanu (7. attēlsK).

LH projekcija uz VTA ir pētīta ar elektriskās stimulācijas sadursmes pētījumiem (Bielajew un Shizgal, 1986), un jau sen ir bijusi hipotēze, ka tai būs nozīme atalgojuma apstrādē (Hoebel un Teitelbaum, 1962, Margules un Olds, 1962), tomēr norādot to uzdevums. Šeit mēs sniedzam detalizētu izklāstu par to, kā LH-VTA cilpas atsevišķie komponenti apstrādā ar atalgojumu saistītā uzdevuma dažādus aspektus.

Izmantojot optogēno mediēto fototransportēšanu (1. attēls), mēs esam identificējuši divas atsevišķas LH neironu populācijas: šūnas, kas nosūta projekcijas uz VTA (1 tips) un šūnas, kas saņem atgriezenisko saiti no VTA (2 tips; 2. attēls) - lai gan šīm populācijām nav jābūt savstarpēji izslēdzošām, jo ​​ir iespējams, ka LH neironi varētu gan nosūtīt, gan saņemt ievades VTA un no tās. Interesanti, ka mēs atklājām, ka salīdzinoši maz fotorezistīvu neironu neietilpst bimodālajā sadalījumā, kas iekapsulē šīs divas populācijas (S2B un 1E). Ņemot to vērā, apvienojumā ar ilgo latentuma aizkavi 2. tipa fotorezonos (∼100 ms) mēs spekulējam, ka var būt viens dominējošs ceļš, kas veicina 2. tipa neironu darbību. Turklāt, tā kā DA saistās ar G olbaltumvielām saistītos receptorus, kinētika ir lēnāka nekā lielākajai daļai glutamaterģisko sinapsju (Girault un Greengard, 2004), un tā var izskaidrot šo 100 ms latentās fotoreaktīvās vienības kopu. Ir arī iespējams, ka VTA var sniegt netiešu atgriezenisko saiti caur citiem distālajiem reģioniem, izmantojot ierosinošus starpposma reģionus, piemēram, amigdālu, vai ar disinhibīciju caur nucleus accumbens (NAc) vai stria terminalis gultnes kodolu (BNST).

Interesanti, ka, tā kā 1. tipa vienību fotostimulācija izraisa ierosmes reakcijas 2. tipa vienībās, 1. un 2. tipa vienībām ir atšķirīgas uzvedības kodēšanas īpašības. Piemēram, 1. un 2. tipa vienību skaits, kas selektīvi kodē atlīdzības prognozēšanas signālu, ir ievērojami atšķirīgi (n = 0/19 1. tips pret n = 12/34 2. tips, chi-square = 8.67, p = 0.003) . Šis paradoksālais reakcijas modelis varētu būt saistīts ar skaitļošanas procesiem starpposma ķēdes elementā, piemēram, VTA, kas, iespējams, spēlē aktīvu lomu uzvedības uzdevuma laikā, bet neaktīvs fotopiešķiršanas laikā. Turklāt šo datu apstrādi var ietekmēt dzīvnieka uzvedības stāvoklis.

Mūsu atalgojuma izlaiduma eksperimenti ļāva mums atšķirt CR neiroloģisko kodējumu un beznosacījumu stimulēšanas patēriņu (ASV). Šajos eksperimentos 2 tipa vienību apakškopa reaģēja uz atalgojuma prognozēšanas cue (CS) un ASV, kā arī uzrādīja samazinājumu šaušanas ātrumam, kad gaidītie ieguvumi tika izlaisti. Turklāt 2 tipu vienību apakškopā parādās arī fazisks uzbudinājums pēc negaidītas atlīdzības piegādes (Skaitļi 4G un 4H). Šie dati atgādina veidu, kā DA neironi VTA kodē atlīdzības prognozēšanas kļūdu (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Mēs domājam, ka VTA neironi var pārraidīt atlīdzības prognozēšanas kļūdu signālus LH neironu apakškopai, kas ir labi izvietoti, lai integrētu šos signālus atbilstošas ​​uzvedības izejas noteikšanai. Konkrēti, LH ir cieši saistīta ar daudzām citām smadzeņu zonām (Berthoud un Münzberg, 2011) un ir cēloņsakarībā saistīta ar homeostatiskiem stāvokļiem, piemēram, miegu / uzbudinājumu un izsalkumu / sāta sajūtu (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Piespiedu atlīdzības meklētāja uzvedība galvenokārt tika apspriesta narkotiku atkarības kontekstā, kur klasiska piespiedu narkotiku meklēšanas paradigma ir pārbaudīt pakāpi, kādā narkotiku meklēšana uzvedība saglabājas negatīvu seku, piemēram, pēdu šoka gadījumā (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren and Everitt, 2004). Mēs pielāgojām šo uzdevumu saharozei, lai ļautu mums izpētīt, vai LH-VTA ceļa aktivizēšana bija pietiekama, lai veicinātu piespiedu saharozes meklēšanu. Ņemot vērā to, ka atšķirība starp narkotikām un dabisko atalgojumu ir tā, ka zāļu atlīdzība nav nepieciešama izdzīvošanai, pastāv domstarpības par to, kāda uzvedība būtu piespiedu saharozes vai ēdiena meklēšana. Alternatīva mūsu datu interpretācija ir tāda, ka LH-VTA ceļa aktivizēšana vienkārši palielina motivācijas motivāciju vai vēlmi meklēt ēstgribu pastiprinātājus. Tā kā aptaukošanās līmenis pēdējās desmitgadēs ir pieaudzis (Mietus-Snyder un Lustig, 2008), piespiedu pārēšanās un cukura atkarība ir izplatīti apstākļi, kas nopietni apdraud cilvēku veselību (Avena, 2007). Ēdināšanas uzvedība piesātinātām (pilnībā barotām) pelēm pēc LH-VTA ceļa aktivizēšanas atgādina ēšanas paradumus, kas novēroti cilvēkiem, kuriem diagnosticēti kompulsīvi pārēšanās traucējumi (vai iedzeršanas traucējumi) (DSM-V).

Ir ierosināts, ka atkārtotas darbības noved pie ieradumu veidošanās, kas paši noved pie atkarības piedzīvojošās kompulsīvās atalgojuma (Everitt un Robbins, 2005). Mūsu secinājums, ka LH-VTA neironi tikai šifrē ostas ieeju pēc kondicionēšanas, liek domāt, ka šis ceļš selektīvi kodē kondicionētu reakciju, nevis tikai motivētu rīcību. Tas ir saskaņā ar mūsu novērojumiem, ka šīs projekcijas optiski aktivizēšana var veicināt kompulsīvas atlīdzības meklēšanu, ņemot vērā negatīvas sekas (5. attēlsC), kā arī nepieciešamības trūkuma dēļ (kā redzams \ t 5. attēlsE). Šo interpretāciju pamato arī mūsu secinājums, ka LH-VTA ceļa fotoinhibēšana selektīvi samazina kompulsīvo saharozes meklēšanu (5. attēlsD), bet nesamazina barību pelēm ar ierobežotu uzturu (5. attēlsF). Viens no lielākajiem izaicinājumiem, ārstējot kompulsīvos pārēšanās vai ēšanas traucējumus, ir risks, ka tiek traucēta barošanas uzvedība kopumā. No translācijas viedokļa mēs, iespējams, esam identificējuši specifisku nervu ķēdi kā potenciālu mērķi, lai izstrādātu terapeitiskas iejaukšanās kompulsīvai pārēšanās vai cukura atkarībai, nezaudējot dabisko barošanas paradumu.

Mēs parādām, ka papildus glutamatergiskajam LH-VTA komponentam (Kempadoo et al., 2013), projekcijā ir arī ievērojams GABAergic komponents (Leinninger et al., 2009), un ka LH neironi sinapsējas tieši uz DA un GABA neironi VTA (6. attēls). Tomēr pastāv atšķirība starp eksitējošās / inhibējošās ievades līdzsvaru VTA DA un GABA neironiem.

Lai gan mēs izmantojām imūnhistoķīmisku apstrādi, lai pārbaudītu VTA neironu identitāti, mēs arī izmērījām I_h, ar hiperpolarizāciju aktivizēta iekšēji koriģējoša nespecifiskā katjonu strāva (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). Šīs strāvas klātbūtne ir plaši izmantota elektrofizioloģiskajos pētījumos, lai identificētu DA neironus, taču ir pierādīts, ka tā ir tikai DA neironu apakšpopulācijās, kuras norobežo projekcijas mērķis (Lammel et al., 2011). Lai gan iepriekš Fields un kolēģi pārskatā tika ierosināts, ka "LH neironi sinapsē uz VTA projekcijām uz PFC, bet ne uz tiem, kas izvirzīti uz NAc" (Fields et al., 2007), mūsu dati liecina, ka šo strīdu vajadzētu atsākt turpmākai izmeklēšanai. Pat ja mēs novērojām DA neironu apakškopu, kas saņēma neto ierosmi no LH un kam bija ļoti mazs I_h (saskaņā ar mPFC- vai NAc mediālo apvalku projektējošiem DA neironiem), mēs novērojām arī DA neironu apakšgrupu, kas saņēma neto excitatory ievadi un parādīja lielu I_h (atbilst DA neironu raksturlielumiem, kas izvirzās uz NAc sānu apvalku; S5 attēls; Lammel et al., 2011). Un otrādi, VTA DA neironi, kas saņēma neto inhibējošo ievadi, parādīja ļoti mazu I_h vai trūka šīs strāvas, kas atbilst priekšstatam, ka LH pārsvarā inhibējošu ievadi sūta uz VTA DA neironiem, kas izvirzīti uz mPFC vai NAc mediālo apvalku. Mēs arī parādām, ka LH ieejas var novērot gan mediālā, gan sānu VTA, kas liecina, ka LH nodrošina ievadi VTA neironiem ar dažādiem projekcijas mērķiem, jo ​​ir zināms, ka VTA projekcijas mērķis nedaudz atbilst telpiskajai atrašanās vietai gar mediālo-laterālo asi ( Lammel et al., 2008).

LH-VTA ceļa loma atlīdzības veicināšanā iepriekš tika attiecināta uz glutamaterģisko transmisiju VTA (Kempadoo et al., 2013), jo bieži tiek uzskatīts, ka CaMKIIα promoters ir selektīvs ierosinošo projekciju neironiem. Tomēr mūsu dati skaidri parāda, ka ChR2 ekspresēšana CaMKIIα promotera kontrolē ir vērsta arī uz GABAergisko projekciju neironiem LH (6. attēls).

Uzvedība, ko izraisa LH fotostimulācija^GABA-VTA ceļš bija nepieklājīgs, nepareizs un nepareizs (Filma S4). Viena interpretācija ir tā, ka LH aktivizēšana^GABA-VTA ceļš nosūta peles signālu, kas izraisa apetīti nostiprinātāja atpazīšanu. Alternatīva interpretācija ir tā, ka LH^GABA-VTA ceļš varētu vadīt stimulējošu īpašību vai intensīvu „gribu”, kas atbilst nosacījumam pakļautās pieejas signālam, bet ne-fizioloģiskā līmenī, kas rada šo novirzīšanos, kas saistīta ar barošanu (Berridge un Robinson, 2003). Saskaņā ar to ir iespējams, ka LH aktivizācija^GABA-VTA projekcija faktiski rada intensīvas izjūtas, vai mudina barot. Tomēr mūsu eksperimenti liecina, ka LH aktivācija^GABA-VTA neizraisa kompulsīvās saharozes palielināšanās, bet tas, iespējams, ir saistīts ar pārmērīgu graudainību un nevēlamu apetīti uzvedību, kas koncentrēta uz testēšanas kameras priekšmetiem, kas nav pārtikas produkti. Lai gan ir grūti noteikt peles pieredzi šīs manipulācijas laikā, ir skaidrs, ka atbilstoši orientēta barošanās ar uzvedību nepieciešama koordinēta LH-VTA ceļa GABAerg un glutamatergisko komponentu aktivizācija.

Optogenētiskās un farmakogenetiskās manipulācijas ir spēcīgi instrumenti cēloņsakarību noteikšanai, tomēr tie neatklāj neironu ķēdes elementu endogēnās, fizioloģiskās īpašības. Mūsu pētījums apvieno informāciju par sinaptisko savienojumu, dabisko endogēno funkciju un LH-VTA ceļa cēloņsakarību, sniedzot jaunu ieskatu par to, kā informācija ir integrēta šajā ķēdē. Šie rezultāti norāda uz to, cik svarīgi ir papildus ģenētiskajiem marķieriem pārbaudīt neironu funkcionālo lomu, izmantojot savienojamību. LH-VTA neironi selektīvi kodēja atalgojuma meklējuma darbību, bet nekodēja vides stimulus, turpretī atalgojuma stimulus un atalgojuma prognozējošos signālus kodēja LH neironu diskrēta populācija, kas atrodas lejup pa VTA. Turklāt mēs esam identificējuši īpašu projekciju, kas ir cēloņsakarīgi saistīta ar kompulsīvo saharozes meklēšanu un barošanu. LH-VTA projekcijas neviendabīgums ir vajadzīgs, lai nodrošinātu adaptīvo līdzsvaru starp braukšanas motivāciju un regulētu apetitīvu uzvedību. Šie atklājumi sniedz ieskatu par patoloģiskiem stāvokļiem, piemēram, kompulsīvo pārēšanās traucējumu, cukura atkarību un aptaukošanos