Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publicēts tiešsaistē 2017 maijs 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Anotācija
Mērķi / hipotēze
Uzturvielu tauku pārēšanās izraisa cilvēku un grauzēju aptaukošanos. Nesenie pētījumi ar cilvēkiem un grauzējiem ir parādījuši, ka atkarība no taukiem ir kopīgs mehānisms ar atkarību no alkohola, nikotīna un narkotikām smadzeņu atalgojuma sistēmu darbības traucējumu ziņā. Ir uzsvērts, ka augsta tauku satura diēta (HFD) vājina dopamīna D2 receptoru (D2R) signālu striatumā, kas ir galvenais smadzeņu atlīdzības sistēmas regulators, kā rezultātā rodas hedoniska pārēšanās. Mēs iepriekš ziņojām, ka brūnie rīsiem raksturīgā bioaktīvā sastāvdaļa γ-oryzanols mazināja HFD izvēli, izmantojot hipotalāmu kontroli. Tādēļ mēs izpētījām iespēju, ka γ-orianzols modulētu smadzeņu atlīdzības sistēmas darbību pelēm.
Metodes
Vīriešu C57BL / 6J peles, kas tika barotas ar HFD, orāli tika ārstētas ar γ-orianzolu, un tika novērtēts D2R signalizācijā iesaistīto molekulu striatāla līmenis. Tika pārbaudīta γ-orianzola ietekme uz D2R promotora DNS metilēšanu un turpmākās izmaiņas tauku uztura preferencēs. Tika pētītas arī 5-aza-2-deoxycytidine, spēcīga DNS metiltransferāžu (DNMT) inhibitora ietekme uz pārtikas izvēli, D2R signalizāciju un DNMT līmeņiem striatumā. Γ-orianzola inhibējošā iedarbība uz DNMT aktivitāti tika novērtēta in vitro.
rezultāti
Strijās no HFD barotām pelēm D2R ražošana tika samazināta, palielinot D2R promotora reģiona DNS metilēšanu. Γ-orianzola perorāla ievadīšana samazināja DNMT ekspresiju un aktivitāti, tādējādi atjaunojot D2R līmeni striatumā. Arī DNNT farmakoloģiskā inhibīcija ar 5-aza-2-deoxycytidine arī uzlaboja uztura tauku izvēli. Atbilstoši šiem konstatējumiem, fermentu in vitro testos tika pierādīts, ka γ-orianzols inhibēja DNMT aktivitāti.
Secinājumi / interpretācija
Mēs pierādījām, ka γ-orianzols uzlabo HFD inducēto D2R promotora reģiona DNS hipermetilāciju peles strijā. Mūsu eksperimentālā paradigma iezīmē γ-oryzanolu kā daudzsološu pretapaugļošanās vielu ar atšķirīgu īpašību, ka tā ir jauna epigenetiskā modulatora īpašība.
Elektroniskais papildu materiāls
Šī raksta tiešsaistes versija (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) satur salīdzinoši pārskatītu, bet neizmainītu papildu materiālu, kas ir pieejams autorizētiem lietotājiem.
Ievads
Pārmērīga aptaukošanās aptaukošanās gadījumā cilvēkiem ir vismaz daļēji kopīgi mehānismi ar atkarību no alkohola, nikotīna un narkotikām [1]. Kā arī apetītes hipotalāmu un hormonālo regulējumu, smadzeņu atlīdzības sistēma, jo īpaši dopamīna receptoru signalizācija, ir cieši saistīta ar atkarību vai hedonisku barošanas uzvedību [2]. Iepriekšējais pētījums ar žurkām parādīja, ka striatāla dopamīna D2 receptoru (D2R) atrašana, izmantojot lēnas vīrusu izraisītu īsas matadata interferējošu RNS, ātri izraisīja atkarību, piemēram, atalgojuma deficītu un piespiedu pārtiku meklēšanu [3]. Sakarā ar samazinātu D2R blīvumu, muguras striatums ir mazāk reaģē uz pārtikas atlīdzību, salīdzinot ar liesās kontroles grupām aptaukošanās cilvēkiem un grauzējiem [3-5]. Saskaņā ar šo jēdzienu TaqIA alēle. \ T ANKK1 gēnu lokusu (kas kodē DRD2 / ankirīna atkārtojumu un kināzes domēnu, kas satur 1), kas samazina striatāla D2R ražošanu, ir saistīta ar aptaukošanās fenotipu cilvēkiem [6], bet svara zuduma sekas pēc bariatriskās ķirurģijas ir saistītas ar paaugstinātu striatāla D2R blīvumu [7]. Šie dati liecina par striatāla D2R nozīmīgumu kā jaunu terapeitisku mērķi aptaukošanās ārstēšanai. Tomēr dažas zāles, kas tika izstrādātas, kas darbojās smadzeņu atlīdzības sistēmā, izraisīja ievērojamas nelabvēlīgas sekas, tostarp nopietnas psihiskas problēmas, kā rezultātā tika novērsta klīnika [8].
Epigenetiskās modifikācijas ir svarīgas ne tikai attīstībai un diferenciācijai, bet arī tāpēc, ka tās rodas vides pārmaiņu, tostarp diētas un dzīvesveida, rezultātā [9]. DNS metilēšana ir galvenais epigenetiskais notikums gēnu ekspresijas stabilitātei [9]. Žurku mātītei ar augstu tauku satura diētu (HFD) pakļautībā mainās DNS metilēšana centrālajā atalgojuma sistēmā pēcnācējiem, kā rezultātā mazuļi patērē HFD [10]. Jo īpaši DNS metiltransferāzes (DNMT) spēlē kritisku lomu gan barošanas uzvedības, gan fiziskās aktivitātes regulēšanā [10, 11], kas liecina, ka DNMT varētu būt daudzsološi terapeitiski mērķi aptaukošanās - diabēta sindroma ārstēšanai. Svarīgi, ka ir zināms, ka dažas dabiskas pārtikas izcelsmes vielas, tostarp kofeīnskābe un epigallokatechīns, darbojas kā DNMT inhibitori [12, 13].
Nesen mēs pierādījām, ka bioaktīvs, brūnie rīsiem raksturīgais komponents γ-oryzanols, ferulīnskābes estera un vairāku fitosterīnu maisījums, samazina uztura tauku izvēli, samazinot hipotalāma endoplazmas retikulāta (ER) stresu [14]. Pelēm un trušiem perorāli ievadīts γ-oryzanols ātri uzsūcās no zarnām un izplatījās galvenokārt smadzenēs [15, 16]. Ņemot vērā šos rezultātus, dabiski pārtikas produkti, kas darbojas uz centrālo nervu sistēmu, varētu būt alternatīva, lai droši samazinātu traucētu barošanas uzvedību aptaukošanās gadījumā. Šajā kontekstā mēs pārbaudījām hipotēzi, ka γ-orianzols varētu mainīt DNS metilēšanas statusu smadzeņu atlīdzības sistēmā, kā rezultātā samazinās HFD izvēle pelēm.
Metodes
Dzīvnieki
Septiņu nedēļu vecas vīriešu kārtas C57BL / 6J peles, kas iegūtas no Charles River Laboratories Japan (Kanagava, Japāna), tika izmitinātas (3–4 katrā būrī) īpašos apstākļos bez patogēniem 24 ° C temperatūrā 12 h / 12 h gaismas / tumšais cikls. Pēc nedēļas ilgas aklimatizācijas 8 nedēļas vecām pelēm tika piešķirts svars un tās tika sadalītas divās vai trīs grupās, lai veiktu katru eksperimentu. Peles varēja brīvi piekļūt pārtikai un ūdenim. Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Rjukju universitātes Dzīvnieku eksperimentu ētikas komiteja (Nr. 5352, 5718 un 5943).
Γ-orianzola un 5-aza-2'-deoksicitidīna ievadīšana
Lai novērtētu HFD izvēli, y-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japāna) 8 nedēļas vecām pelēm tika ievadītas ar barošanas palīdzību pārtikas izvēles izvēles laikā, kā aprakstīts iepriekš.14, 17]. Citiem eksperimentiem kā granulas ražoja HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA), kas satur 0.4% γ-oryzanol. Diētas sastāvdaļas ir redzamas elektroniskā papildmateriāla (ESM) tabulā 1. Pēc 12 barošanas nedēļām audi tika savākti no striatuma un hipotalāma. Dienas γ-orizanola daudzums, kas aprēķināts pēc vidējās peles devas, bija aptuveni 320 μg / g ķermeņa svara. Γ-orizanola devas tika noteiktas, kā aprakstīts iepriekš [14]. 5-aza-2′-deoksicitidīns (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) trīs nedēļas nedēļā 0.25 nedēļas intraperitoneāli tika injicēts (12 μg / g ķermeņa svara) [18].
Uztura tauku preferences novērtējums
Lai novērtētu uztura tauku izvēli, pārtikas testos tika piedāvāta izvēle starp čau un HFD (D12450B un D12451; Pētījuma diētas), kā aprakstīts iepriekš.14]. Diētas sastāvdaļas ir parādītas ESM tabulā 1. Īsāk sakot, pelēm tika atļauta brīva piekļuve chow un HFD. Čovu un HFD uzņemšana tika mērīta katru nedēļu un analizēta, lai noteiktu izmaiņas preferencē uztura taukiem. HFD priekšroka tika aprēķināta pēc formulas: HFD preference = [(HFD uzņemšana / kopējā ēdiena uzņemšana) × 100].
Bisulfīta sekvencēšana DNS metilēšanai
DNS tika attīrīts, izmantojot DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokija, Japāna). DNS šķīdumu sajauca ar svaigi sagatavotu 3 mol / l NaOH, inkubēja 37 ° C temperatūrā 15 minūtes un pievienoja 5.3 mol / l karbamīda, 1.7 mol / l nātrija bisulfīta un 4.9 mmol / l hidrohinona. Šķīdums tika pakļauts 15 denaturēšanas cikliem 95 ° C temperatūrā 30 s un inkubācijai 50 ° C temperatūrā 15 minūtes [19]. Bisulfīta apstrādātā DNS tika attīrīta, izmantojot MinElute PCR attīrīšanas komplektu (QIAGEN), un pastiprināja ar PCR, izmantojot KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR komplektu (KAPA Biosystems, Woburn, MA, ASV) un primerus ap D2R promotora reģiona CpG vietu. . Gruntēšanas sekvences bija šādas: priekškrāsns, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; atgriezeniskais grunts, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Tālāk adaptera sekvences tika pievienotas un notīrītas, izmantojot Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Pēc tam paraugi tika apkopoti un ielādēti GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japāna) sekvencēšanai saskaņā ar ražotāja protokolu. Metilēšanas līmenis tika izteikts kā metilētu citozīnu procentuālais daudzums visās citozīnu atliekās.
DNMT aktivitātes tests
DNMT enzimātiskās aktivitātes tests tika veikts, izmantojot EpiQuik DNS metiltransferāzes aktivitātes / inhibīcijas analīzes komplektu (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) un EPIgeneous Methyltransferase Assay komplektu (Cisbio Japan, Chiba, Japāna) saskaņā ar ražotāja protokoliem.
Novērtēt katra savienojuma inhibējošo aktivitāti DNS metilēšanas procesā S-adenozil-l-homocisteīnu (SAH) mēra katra savienojuma klātbūtnē (20 μmol / l skrīninga testiem), S-adenozilmetionīns (SAM; 10 μmol / l) un DNMT substrāts (4 ng / μl) 37 ° C temperatūrā 90 minūtes. Lai novērtētu Mihaela – Menten kinētiku, DNMT1 (20 μmol / l) 5 minūšu laikā inkubēja ar γ-orizanolu, SAM (37 μmol / l) un norādīto poli dI-dC koncentrāciju 90 ° C temperatūrā. DNMT3a (100 μmol / l) un DNMT3b (100 μmol / l) 5 minūtes inkubēja ar γ-orizanolu, SAM (37 μmol / l) un norādīto poli dG · dC koncentrāciju 120 ° C temperatūrā. Pārbaudes tika veiktas četrās reizēs. Iegūto olbaltumvielu (0.75 mg / ml) inkubēja ar SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) un poli dG · dC (5 μg / ml) 40 ° C temperatūrā 120 minūtes un Tika mērīta SAH veidošanās.
Estrogēnā receptoru-γ aktivitātes tests
Γ-orizanola potenciālā antagonistiskā aktivitāte uz estrogēniem saistīto receptoru-y (ERRγ) tika novērtēta, izmantojot cilvēka estrogēnu saistīto receptoru gamma reportieru pārbaudes sistēmu (INDIGO Bioscience, State College, PA, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu. Īsi sakot, zīdītāju reportera šūnas, kas nav cilvēki, kas vienmērīgi ekspresē aktīvo ERRγ, 24 stundas trijos eksemplāros tika pakļautas norādītajām katra savienojuma koncentrācijām.
Western blotting
Tas tika veikts, kā aprakstīts iepriekš [20] ar antivielām pret D2R (1: 500, trusis), dopamīna pārvadātāju (DAT; 1: 500, trusis), tirozīna hidroksilāzi (TH; 1: 1000, trusis) (AB5084P, AB1591P un AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, ASV), transkripcijas 3α signāla pārveidotājs un aktivators (STAT3α; 1: 1000, trusis), DNMT1 (1: 1000, trusis), DNMT3a (1: 1000, trusis) (Nr. 8768, 5032 un 3598; Cell Signaling Technology, Tokija, Japāna), DNMT3b (1 μg / ml, trusis), ERRγ (1: 1000, trusis) un β-aktīns (1: 10,000 16049, pele) (ab128930, ab6276 un abXNUMX; Abcam, Kembridža, MA, ASV).
Kvantitatīvais reālā laika PCR
Gēnu ekspresija tika pārbaudīta, kā aprakstīts iepriekš [14]. mRNS līmenis tika normalizēts uz Rn18s (18S rRNS). Primārā komplekti, ko izmanto kvantitatīvai reālā laika PCR analīzei, ir apkopoti ESM tabulā 2.
Statistiskā analīze
Datus izsaka kā vidējo ± SEM. Vajadzības gadījumā tika izmantoti vienvirziena ANOVA un atkārtotu pasākumu ANOVA, kam sekoja vairāki salīdzināšanas testi (Bonferroni – Dunn metode). Studentu t tests tika izmantots, lai analizētu atšķirības starp divām grupām. Atšķirības tika uzskatītas par nozīmīgām p <0.05.
rezultāti
DNNT farmakoloģiskā inhibēšana ar 5-aza-dC mazināja diētas tauku izvēli pelēm.
Pelēm, kas barotas ar HFD, DNS metilēšana D2R promotora rajonā striatumā ievērojami palielinājās, salīdzinot ar pelēm, kas tika barotas ar govs diētu (1. att.). (Zīm.1a) .1a). No otras puses, hipotalāma DNS metilēšana D2R promotora reģionā bija acīmredzami augstāka par striatumā ar čow diētu (p <0.01) (Zīm. (Zīm.1a, 1a), f) un HFD to nemainīja (1. att.). (Zīm.1f) .1f). Pelēm, kuras baroja HFD, pastiprinātā DNS metilēšana D2R promotora rajonā striatumā tika normalizēta, ārstējot ar 5-aza-dC, kas ir spēcīgs DNMT inhibitors (1. att.). (Zīm.1a) .1a). Turpretī DNS metilēšana D2R promotora rajonā hipotalāmā būtiski nemainījās, apstrādājot ar 5-aza-dC (1. att.). (Zīm.1f) .1f). 20 nedēļas vecu vīriešu kārtas vīriešu striatumā, kuras 12 nedēļas baroja ar HFD, mRNS un olbaltumvielu D2R līmenis ievērojami samazinājās (XNUMX. attēls). (Zīm. 1b, 1b, k, l). Turpretī dopamīna D1 receptoru līmenis (D1Rs, ko kodē. \ T Drd1), kas darbojas pretēji D2R adenililciklāzei un cAMP-mediētā intracelulārā signalizācijai, nemainījās (1. att.). (Att.1c) .1c). Turklāt nav mainījusies citu D2R signālu saistīto molekulu līmeņi, piemēram, TH un DAT pie mRNS un / vai proteīna līmeņa (1. att.). (Zīm.1d, 1d, e, k, m). No otras puses, hipotalāmā, ieskaitot D2R, netika novērotas acīmredzamas izmaiņas. (Att. 1g – m) .1g – m). Proti, D2R un TH proteīna līmenis hipotalāmā bija daudz zemāks nekā striatumā. (Zīm. 1l, 1l, m), iespējams, atspoguļojot dopamīna receptoru signālu relatīvo nozīmi smadzeņu atlīdzības sistēmā, salīdzinot ar hipotalāmu.
Lai noskaidrotu, vai DNS metilēšana D2R promotora rajonā mainītu diētu tauku izvēli, tika analizēta 5-aza-dC apstrādāto peles barošanas uzvedība. Kā gaidīts, 5-aza-dC ievērojami palielināja mRNS un proteīna līmeni D2R HFD baroto pelēm (1. att.). (Zīm. 1b, 1b, k, l). No otras puses, nebija nekādas ietekmes uz. \ T Drd1, Th un Slc6a3 (kodē DAT) striatumā vai Drd2, Drd1, Th un Slc6a3 hipotalāmā. (Att.1c – e, 1c – e, g – m). Tā kā ar transportlīdzekļiem apstrādātās peles priekšroku deva HFD, 5-aza-dC ārstētajās pelēs HFD priekšroka tika ievērojami samazināta (88% no vērtībām, kas tika ārstētas ar pelēm). (Att.1n) .1n). Līdz ar to ārstēšana ar 5-aza-dC samazināja ķermeņa masas pieaugumu. (Att. 11o).
γ-orianzols samazina DNMT līmeni HFD baroto pelēm
Kā mēs iepriekš ziņojām [14], perorāli ievadot γ-oryzanolu tēviņiem ar barošanu, ievērojami mazinājās HFD izvēle (93% no vērtībām, kas iegūtas ar transportlīdzekļiem apstrādātajām pelēm) (1. att.). (Zīm.2a), 2a) radot acīmredzamu ķermeņa masas pieauguma vājināšanos. (Zīm.2b) .2b). Tāpēc mēs izpētījām γ-orianzola iespējamo ietekmi uz D2R epigenetisko modulāciju striatumā.
Zīdītājiem ir trīs galvenie DNMT-DNMT1, 3a un 3b. DNMT1 darbojas, lai uzturētu DNS metilēšanu, bet DNMT3a un 3b spēlē lomu de novo DNS metilēšanas veicināšanā [21]. Lai izpētītu γ-oryzanola iespējamo ietekmi uz DNMT in vivo, mēs novērtējām DNMT līmeni HFD baroto peles smadzenēs. Lai gan HFD pati par sevi neietekmēja DNRT mRNS un olbaltumvielu līmeni ne striatumā, ne hipotalāmā, papildinājums ar γ-orianzolu ievērojami samazināja DNMT līmeni striatumā, bet ne hipotalāmā (1. att.). (Att.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Šie dati liek domāt, ka γ-orianzols var regulēt DNMT līmeņus specifiskā veidā. Līdzīgā veidā 5-aza-dC ievērojami samazināja DNMT3a un 3b mRNS līmeni striatumā (ESM Fig. 1a – d).
Pamatojoties uz iepriekšējo pētījumu, kas pierāda, ka DNMT1 mRNS līmenis vismaz daļēji pozitīvi regulēts ar kodolreceptoru ERRγ [22], mēs pārbaudījām γ-orianzola iespējamo ietekmi uz ERRy aktivitāti. Ne-zīdītāju šūnās, kas konstitutīvi ekspresē aktīvo ERRγ, 4-hidroksamamoksifēns, spēcīgs ERRγ invertors, ievērojami samazināja ERRγ aktivitāti. Jāatzīmē, ka γ-oryzanols daļēji samazināja ERRγ aktivitāti (aptuveni 40% samazinot iedzimto vērtību). (Zīm.3a) .3a). Svarīgi, ka ERRγ bija izteikti izteikta striatumā, bet ne hipotalāmā (1. att.). (Zīm.3b – d) .3b – d). Pretēji situācijai striatumā, γ-oryzanols ievērojami palielināja DNMT1 proteīnu līmeni tikai hipotalāmā (1. att.). (Zīm.2k, 2k, l). Šos rezultātus vismaz daļēji var izskaidrot ar mūsu konstatējumu, ka STAT3α, pozitīvs DNMT1 līmeņa regulators [23], bija bagātīgi izteikts hipotalāmā, bet ne striatumā (1. att.). (Att. 33e – g).
Lai vēl vairāk novērtētu γ-orianzola ietekmi uz DNMT aktivitāti in vivo, SAH veidošanās, DNS metilēšanas blakusprodukts un arī spēcīgs DNMT inhibitors tika novērtēts ar γ-orazanolu apstrādātajās pelēs, kas tika barotas ar HFD. Nav konstatētas būtiskas izmaiņas SAH veidošanās procesā ne striatumā, ne hipotalāmā starp HFD barotām un barojošām pelēm (1. att.). (Zīm. 2f, 2f, j). Ievērojami, γ-orianzols būtiski samazināja SAH veidošanos striatumā (1. att.). (Zīm.2f) 2f) bet ne hipotalāmā (Zīm. (Zīm.2j), 2j) norādot, ka γ-orianzols var nomākt DNMT aktivitātes striatuma specifiskā veidā ar HFD barotām pelēm.
Enzīmu analīze par γ-oryzanola inhibējošām īpašībām DNMT in vitro
Pēc tam mēs novērtējām γ-orianzola ietekmi uz DNMT aktivitāti in vitro. Tika novērtēts γ-orzanola, ferulīnskābes, 5-aza-dC, haloperidola (reprezentatīvs D2R antagonists), hinpirola (reprezentatīvs D2R agonists) un SAH inhibējošais potenciāls. Kā pozitīvu kontroli, SAH devas atkarīgā veidā spēcīgi vājināja DNMT darbību (1. att.). (Zīm.4a – f) .4a – f). Kā gaidīts, haloperidols un hinpirols neietekmēja DNMT darbību (ESM 1. att.). 2). Ievērojami, γ-orianzols ievērojami inhibēja DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) un 3b (maksimālā inhibīcija 57%) (Zīm. (Zīm.4d – f) .4d – f). Pretstatā tam, ferulīnskābes, γ-orianzola metabolīta, inhibējošā aktivitāte bija daudz zemāka nekā γ-orzanolā (1. att.). (Att. 44d – f).
Mēs tālāk pētījām γ-orianzola inhibējošās īpašības DNMT. SAH veidošanās tika mērīta, lai novērtētu γ-orianzola inhibējošo aktivitāti DNMT in vitro. Dati par SAH veidošanos DNMT-mediētās DNS metilēšanas laikā liecina par Michaelis – Menten kinētikas piesātināto modeli gan γ-orzanola klātbūtnei, gan trūkumam (1. att.). (Zīm.4g – i) .4g – i). DNMT1-mediētās DNS metilēšanas laikā Eadie-Hofstee analīze parādīja, ka γ-orianzols neietekmēja \ t V maks SAH veidošanās (nesējs, 597 pmol / min; γ-orizanols 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oricanols 20 μmol / l, 608 pmol / min), savukārt γ-orizanols acīmredzami palielināja K m (nesējs, 0.47 μg / ml; γ-orizanols 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-orizanols 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Zīm. (Zīm.4j) .4j). Šie rezultāti liecina, ka γ-oryzanols inhibē DNMT1 vismaz daļēji konkurētspējīgā veidā. No otras puses, DNMT3a- un 3b-mediētās DNS metilēšanas gadījumā γ-oryzanols samazināja \ t V maks SAH veidošanās (DNMT3a: nesējs, 85.3 pmol / min; γ-orizanols 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-orizanols 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: transportlīdzeklis, 42.3 pmol / min; γ -orizanols 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-orizanols 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) un līdzīgi K m šai reakcijai (DNMT3a: nesējs, 0.0086 μg / ml; γ-orizanols 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oricanols 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: nesējs, 0.0122 μg / ml; γ- orizanols 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-orizanols 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Zīm. (Zīm.4k, 4k, l). Šie rezultāti liecina, ka γ-orianzols inhibē DNMT3a un 3b vismaz daļēji nekonkurējošā veidā.
γ-oryzanol palielina D2R līmeni HFD baroto pelēm
Pēc tam mēs pārbaudījām iespēju, ka γ-orianzols palielinās striatāla D2R saturu, inhibējot DNMT. HFD barotām pelēm γ-orianzola perorāla ievadīšana nozīmīgi samazināja striatālu DNS metilēšanu D2R promotora reģionā (1. att.). (Zīm.5a), 5a), bet tas netika izdarīts hipotalāmā (1. att.). (Zīm.5f) .5f). Saskaņā ar šiem konstatējumiem D2R mRNS un proteīna līmenis tika savstarpēji palielināts (1. att.). (Zīm. 5b, 5b, g, k, l). Līdzīgi datiem par apstrādi ar 5-aza-dC (1. att.). (Att. 1), 1), nav acīmredzamas ietekmes uz RNS un proteīna līmeni Drd1, Th un Slc6a3 (DAT) striatumā, un neietekmē. \ T Drd1, Th un Slc6a3 hipotalāmā. (Att.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka D2R un DNMT1 līmeni regulē ER stress un iekaisums vismaz daļēji caur NF-KB [17, 24, 25]. Tāpēc mēs pārbaudījām ar ER saistīto un ar iekaisumu saistīto gēnu līmeni. Kā jau iepriekš tika pierādīts [26], HFD palielināja gēnu, kas kodē TNF-α, ekspresiju (Tnfa), monocītu ķīmijtraktantu proteīns –1 (MCP-1) (\ tCcl2), C / EBP homologs proteīns (\ tKarbonāde), ER-lokalizēta DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) un X-box saistošā proteīna 1 splaissXbp1s) hipotalāmā, bet ne striatumā (1. att.). (Zīm.6) .6). Jāatzīmē, ka HFD papildināšana ar γ-orianzolu ievērojami samazināja palielināto ekspresiju Ccl2, Karbonāde, Dnajb9 un Xbp1s ekskluzīvi hipotalāmā, bet ne striatumā (1. att.). (Att. 66).
diskusija
Galvenais konstatējums šajā pētījumā ir tāds, ka γ-oryzanols darbojas kā spēcīgs DNMT inhibitors peles strijā, tādējādi vismaz daļēji mazinot HFD izvēli ar striatāla D2R epigenetisko modulāciju. HFD barotām pelēm striatumā D2R līmenis bija ievērojami samazinājies, bet D1R, TH un DAT līmenis nemainījās (1. att.). (Zīm.1b – e, 1b – e, k – m). Šie dati saskan ar domu, ka striatāla D2R regulējumam ir izšķiroša loma uztura atlīdzības uztverē, kad notiek HFD, kas noved pie HFD pārmērīga patēriņa aptaukošanās dzīvniekiem [3]. Šajā pētījumā HFD barotām pelēm ārstēšana ar 5-aza-dC ievērojami palielināja striatāla D2R līmeni (1. att.). (Zīm. 1b, 1b, k, l) iespējams, samazinot DNS metilēšanas līmeni D2R promotora rajonā (1. att.). (Zīm.1a), 1a) un līdz ar to samazināja uztura tauku izvēli (1. att.). (Att.1n) .1n). Šis konstatējums arī atbalsta striatāla D2R kritisko lomu uztura atlīdzības uztverē, kad tiek izmantots HFD.
Mūsu in vitro tests parādīja, ka γ-orianzola inhibējošā aktivitāte pret DNMT bija acīmredzami spēcīgāka par tā metabolīta ferulīnskābes iedarbību (1. att.). (Zīm.4d – f), 4d – f), kas liecina par γ-orianzola pilnas struktūras nozīmi tā inhibējošajā darbībā uz DNMT. HFD barotām pelēm mūsu pētījumi liecina, ka pēc perorālas ievadīšanas γ-oryzanols sasniedz smadzenes kā pilnīgu struktūru un samazina DNMT līmeni un aktivitātes striatumā, līdz ar to samazinās DNS metilēšana promotora rajonā. D2R striatumā. Turklāt mūsu in vitro pētījumi ir parādījuši, ka γ-oryzanols darbojas kā daļējs antagonists pret ERRγ, kas galvenokārt kalpo kā pozitīvs regulators DNMT1 ražošanai [22] un līdz ar to samazināja DNMT1 aktivitāti (1. att.). (Zīm.3a) .3a). Jāatzīmē, ka ERRγ bija izteikti izteikta striatumā, bet ne hipotalāmā pelēm. (Zīm.3b) .3b). Šie dati liecina, ka γ-orianzols var samazināt DNMT1 mRNS līmeni vismaz daļēji, inhibējot ERRγ. Atšķirībā no striatuma, γ-orianzols neuzrādīja ietekmi uz D2R līmeni hipotalāmā no HFD barotām pelēm (1. att.). (Zīm. 5g, 5g, k, l).
No otras puses, mēs pierādījām, ka γ-orianzols ievērojami palielināja DNMT1 līmeni hipotalāmā, bet ne striatumā (1. att.). (Zīm.2k, 2k, l). Ir pierādīts, ka STAT3 palielina DNMT1 saturu ļaundabīgās T-limfomas šūnās [23]. Jo īpaši mēs iepriekš pierādījām, ka γ-orianzols ievērojami palielināja leptīna inducēto STAT3 fosforilāciju hipotalāmā no HFD barotām pelēm [14]. Jāatzīmē arī tas, ka STAT3α bija izteikti izteikta hipotalāmā, bet ne striatumā pelēs (1. att.). (Zīm.3e – g) .3e – g). Šie dati mudina spekulēt, ka acīmredzamā γ-orianzola ietekme uz DNMT1 līmeni starp hipotalāmu un striatumu var būt daļēji attiecināma uz reģiona specifisko STAT3α un ERRγ saturu peles smadzenēs ( Att. (Zīm.3b – g) .3b – g). Kopīgi šķiet, ka pelēm ir ERRy un STAT3α savstarpējas ekspresijas modelis starp striatumu un hipotalāmu. Pamatojoties uz mūsu rezultātiem, ir saprātīgi spekulēt, ka striatumā, kur ERRy produkcija ir bagāta, y-oryzanol var labāk samazināt DNMT1 mRNS līmeni un fermentu aktivitāti kā ERRγ negatīvo regulatoru. Turpretī hipotalāmā, kur dominējošā ir STAT3α ražošana, y-oryzanol var paaugstināt DNMT1 līmeni.
Nesen veikts pētījums parādīja, ka stresa D2R signalizācijas vājināšanās, ko izraisa HFD dispersija, regulē barošanas uzvedību [3], kas liecina par striatālu DNMT inhibīcijas potenciālo nozīmi aptaukošanās ārstēšanā. No otras puses, iepriekšējais pētījums parādīja iespēju, ka melanokortīna receptoru 4 gēna DNS metilēšanas stāvoklis, kas ekspresēts specifiskos hipotalāmajos kodolos, varētu modificēt aptaukošanās transgēnās formas agouti dzīvotspējīgās dzeltenās pelēs [27]. Lai gan ir pamatoti turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu pamatā esošos mehānismus, šie pētījumi liecina par audu, gēnu un secību specifiskās DNS metilēšanas nozīmi HFD izraisīta aptaukošanās patofizioloģijā.
Nesen mēs ziņojām, ka HFD palielināja D2R līmeni peles aizkuņģa saliņās [17, 24]. Iespējams, ka šādu palielināšanos vismaz daļēji ietekmē ER stress un iekaisums caur NF-κB, jo D2R promotora reģionā ir vairāki NF-KB reakcijas elementi [17, 24]. Turklāt nesen veikts pētījums parādīja, ka TNF-α un IL-1β palielina DNMT1 līmeni un aktivitāti taukaudos no HFD barotām pelēm [25]. Svarīgi, ka šis pētījums parādīja, ka HFD inducē ER stresu un iekaisumu, galvenokārt hipotalāmā, bet ne striatumā. (Zīm.6) .6). Veicot turpmāku izmeklēšanu, mūsu eksperimentālajā paradigmā ir jāgaida padziļināti audu, reģiona un vietnes specifiskās DNS metilēšanas un demetilācijas mehānismi.
Kopā ar mūsu iepriekšējo ziņojumu, kas parāda, ka γ-oryzanols mazina HFD izvēli ar hipotalāmu regulējumu ER spriegumam pelēm [14], γ-oryzanols ir arī unikāla īpašība, kas uzlabo gan hedonisko, gan metabolisko traucējumu regulēšanu barošanas uzvedībā. Tā kā zināms, ka dažas izstrādātās pretapaugļošanās zāles izraisa būtisku negatīvu ietekmi [8], paredzams, ka dabiska uz pārtiku balstīta pieeja smadzeņu atalgojuma sistēmai droši ārstēs aptaukošanos - diabēta sindromu [16]. Šajā paradigmā γ-oryzanols ir daudzsološs pretvēža kandidāts ar atšķirīgu īpašību kā epigenetisko modulatoru.
Pateicības
Esam pateicīgi S. Okamoto (Ryukyus universitāte, Japāna) par manuskripta pārskatīšanu. Pateicamies par sekretariāta palīgu M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato un C. Noguchi (Ryukyus universitāte, Japāna).
Saīsinājumi
| 5-aza-dC | 5-aza-2-deoksicitidīns |
| D1R | Dopamīna D1 receptoru |
| D2R | Dopamīna D2 receptoru |
| DAT | Dopamīna pārvadātājs |
| DNMT | DNS metiltransferāze |
| ER | Endoplazmatiskais tīkls |
| ERR | Estrogēnu saistītu receptoru |
| HFD | Augsta tauku satura diēta |
| SAH | S-Adenosil-l-homocisteīns |
| SAM | S-Adenosilmetionīns |
| STAT3α | Signāla pārveidotājs un transkripcijas 3α aktivators |
| TH | Tirozīna hidroksilāze |
Piezīmes
Datu pieejamība
Pašreizējā pētījumā radītās un / vai analizētās datu kopas ir pieejamas no atbilstošā autora par saprātīgiem pieprasījumiem.
Finansējums
Šo darbu daļēji atbalstīja Japānas Zinātnes atbalsta sabiedrības (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 un 24591338), Zinātnes, tehnoloģiju un inovāciju padomes (CSTI), Starpministriju stratēģiskās inovācijas veicināšanas programmas. (SIP) „Tehnoloģijas nākamās paaudzes lauksaimniecības, mežsaimniecības un zivsaimniecības izveidei”, Lotte fonds, Japānas lietišķās enzimoloģijas fonds, Jaunā enerģētikas un rūpniecības tehnoloģiju attīstības organizācija (NEDO), Dzīvības zinātnes tīkla izveides projekts (farmācijas nozare) ) (Okinawa prefektūra, Japāna) un Okinawa prefektūras medicīnas klasterizācijas veicināšanas projekts, Japāna, kā arī Okinawa prefektūras dotācija uzlabotas medicīnas veicināšanai (Okinavas prefektūra, Japāna).
Interešu interese
Autori paziņo, ka ar šo manuskriptu nav interešu dualitātes.
Iemaksas paziņojums
CK un HM izstrādāja pētījumu. CK un TK veica eksperimentus un analizēja datus. Datu interpretāciju veicināja TK, CS-O, CT, MT, MM un KA. CK un HM uzrakstīja manuskriptu. Visi autori veicināja datu interpretāciju. Visi autori pievienojās manuskripta pārskatīšanai un apstiprināja tā galīgo versiju. HM ir šī darba garantētājs, tam bija pilnīga piekļuve visiem datiem un pilnībā uzņemas atbildību par datu integritāti un datu analīzes precizitāti.
Zemsvītras piezīmes
Elektroniskais papildu materiāls
Šī raksta tiešsaistes versija (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) satur salīdzinoši pārskatītu, bet neizmainītu papildu materiālu, kas ir pieejams autorizētiem lietotājiem.
Atsauces