Insulīns aktivizē insulīna receptorus (InsRs) hipotalāmā, lai pēc maltītes norādītu sāta sajūtu. Tomēr pieaugošais aptaukošanās biežums, kas izraisa hroniski paaugstinātu insulīna līmeni, nozīmē, ka insulīns var darboties arī smadzeņu centros, kas regulē motivāciju un atalgojumu. Šeit mēs ziņojam, ka insulīns var pastiprināt no potenciālā atkarīgā dopamīna (DA) izdalīšanos kodola accumbens (NAc) un caudāta – putamenā, izmantojot netiešu mehānismu, kas ietver striatāla kolinergiskos interneuronus, kas izpaužas InsRs. Turklāt divas dažādas hroniskas diētas manipulācijas ar žurkām, pārtikas ierobežojums (FR) un obesogēns (OB) uzturs, pretstatā striatālā DA izdalīšanās jutībai pret insulīnu, palielina reakcijas spēju FR, bet atbildes reakcijas zudums OB. Uzvedības pētījumi rāda, ka intelektuālie insulīna līmeņi NAc apvalkā ir nepieciešami, lai iegūtu priekšroku pāris glikozes šķīduma aromātam. Kopā šie dati liecina, ka striatāla insulīna signalizācija uzlabo DA izdalīšanos, lai ietekmētu pārtikas izvēli.

Ir labi pierādīts, ka ilgstošs plazmas insulīna pieaugums ēdienreizes laikā un pēc tās aktivizē insulīna receptorus (InsRs) hipotalāmā, kas nodrošina negatīvu atgriezenisko saiti uz apetītēm, kas samazina turpmāku ēšanu^{1, 2, 3}. Smadzeņu insulīns tiek iegūts galvenokārt no aizkuņģa dziedzera β šūnām, aktīvā transportēšana no plazmas uz smadzenēm pie asins un smadzeņu barjeras^{4, 5, 6, 7, 8}, lai gan ir arvien vairāk pierādījumu par neironu insulīna sintēzi un atbrīvošanu^{1, 9}. Jāatzīmē, ka insRs ekspresija neaprobežojas tikai ar hipotalāmu, lai gan ārējo hipotalāmu insRs funkcija paliek neatrisināta^{1, 2, 3}. Ņemot vērā pieaugošo aptaukošanās un II tipa cukura diabēta gadījumu skaitu, kad cirkulējošie insulīna līmeņi ir pastāvīgi paaugstināti un smadzeņu insulīna transports un receptoru jutīgums samazinās^{3, 8, 10, 11}ir svarīgi saprast insulīna funkciju smadzeņu reģionos, kas regulē motivāciju un atalgojumu. Īpaši interesējošie smadzeņu reģioni ietver kodolus accumbens (NAc), kas veicina gan pārtikas, gan narkotiku atalgojošo ietekmi.^{12, 13}un caudate – putamen (CPu), kam ir nozīme uzvedībā un uzvedībā¹³. InsRs tiek izteikts šajos reģionos, ar vislielāko blīvumu NAc^{3, 14}; InsRs ir arī izteikts ar dopamīna (DA) neironiem vidējā smadzenēs, ieskaitot tos, kas atrodas ventrālā tegmentālā apgabalā (VTA) un substia nigra pars compacta (SNc).¹⁵. Smadzeņu insulīna līmenis ir proporcionāls insulīna koncentrācijai plazmā un ķermeņa aptaukošanās^{6, 7, 8}, kas noved pie hipotēzes, ka insulīns šajos smadzeņu reģionos var darboties ar insRs, lai ietekmētu pārtikas atlīdzību^{3, 16, 17}.

Iepriekšējie pētījumi striatāla sinaptosomās, heterologās šūnās, smadzeņu šķēlītēs un in vivo ir pierādījuši, ka insulīna aktivācija insRs izraisa DA transportera (DAT) palielināšanos DA \ t^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Šis process ietver PI3 kināzes signalizācijas ceļu^{19, 20}un iegūst DAT ievietošanu plazmas membrānā¹⁹. Cirkulējošais insulīna līmenis dinamiski modulē striatālu DAT aktivitāti, samazinoties DA uzņemšanai un DAT virsmas ekspresijai, kas novērota diabēta dzīvnieku un pēc pārtikas ierobežojuma dzīvnieku modeļos (FR)^{20, 21}. Ir pierādīts, ka insulīna atkarīgais DAT aktivitātes pieaugums samazina izraisīto ekstracelulāro DA koncentrāciju ([DA]_o) VTA²³, atspoguļojot līdzsvaru starp DA izdalīšanos un uzņemšanu. Atbilstoši noteiktajai insulīna lomai sātībā, akūta insulīna injekcija VTA var samazināt pārtikas atlīdzību^{23, 24}, bet pelēm, kurām nav insRs VTA un SNc DA neironos, ir palielināta uztura uzņemšana un aptaukošanās²⁵. Lai gan insulīns var izraisīt ilgstošu eksitējošā ievades depresiju VTA DA neironiem²⁴atkal saskaņā ar lomu sāta sajūtā, insulīna ekspozīcija var arī palielināt DA neironu šaušanas ātrumu, iespējams, samazinot DA izdalīšanos un autoreceptoru izraisītu inhibīciju.²⁵. Tādēļ ir grūti paredzēt insulīna tīro ietekmi uz striatālu DA izdalīšanos. Patiešām, pētījumi par insulīna ietekmi uz striatālu DA izdalīšanos ex vivo šķēles¹⁹ un insulīna lokālās mikroinjekcijas ietekme NAc uz pārtikas atlīdzību²⁶ šķiet pretrunīgi. Lai to atrisinātu, mēs izvērtējām asinsvadu DA izdalīšanos un uzņemšanu NAc un CPu neskartajā mikrovides vidē ex vivo striatāla šķēles, izmantojot ātrās skenēšanas ciklisko voltammetriju (FCV), un noteica insulīna signalizācijas ietekmi NAc uz atlīdzības uzvedību in vivo.

Mūsu pētījumi liecina, ka insulīna primārais efekts NAc un CPu ir veicināt DA izdalīšanos, neskatoties uz vienlaicīgu DA uzņemšanas pieaugumu. Šī DA izdalīšanās dinamiskā regulēšana ietver insulīna atkarīgu striatāla kolinergisko interneuronu (ChIs) uzbudinājuma palielināšanos, kas izraisa pastiprinātu DA izdalīšanos, aktivizējot nikotīnskābes acetilholīna (ACh) receptorus (nAChR). Insulīna ietekmi uz ChI un DA izdalīšanos mediē InsRs. Konkrētāk, insulīna ietekme uz DA izdalīšanos tiek pastiprināta no FR žurku šķēlītēm, bet žurkām uzklāta obesogēna (OB) diēta. Šie dati liecina par DA izlaišanas pastiprināšanu ex vivo šķēles ar insulīnu noved pie prognozes, ka insulīns var darboties kā atlīdzības signāls in vivo. Patiešām, paralēlās uzvedības pētījumi liecina par insulīna lomu NAc apvalkā aromatizējošu preparātu kondicionēšanā. Kopā šie rezultāti norāda uz jaunu insulīna lomu kā atlīdzības signālu, kas var ietekmēt pārtikas izvēli

Insulīns, kas iedarbojas uz InsRs, palielina izraisīto striatālu DA izdalīšanos

Sākotnējā vietējā līmeņa pārbaude [DA]_o ar FCV. \ t ex vivo striatāla šķēles no žurkām ar ad libitum (AL) piekļuve pārtikai un ūdenim atklāja negaidītu konstatējumu, ka akūta insulīna lietošana dažādās fizioloģiski nozīmīgās koncentrācijās^{1, 4} palielināts viena impulsa izraisīts [DA]_o (1a – c) ar EK insulīnu₅₀ 2 – 12 nM vērtības (koncentrācija, kurā iedarbība bija maksimāla).1b). Paaugstināts pamudinājums [DA]_o bija īpaši pārsteidzošs, ņemot vērā to, ka līdz ar to ievērojami palielinājās maksimālais \ tV_maks) par DAT-mediēto uzņemšanu katrā apakšreģionā (Tabula 1), kas novestu pie sacensību samazinājuma [DA]_o, kā ziņots iepriekš^{22, 23}. Tā vietā mēs atklājām, ka tas ir izraisījis [DA]_o 20-55% maksimāli palielināja 30 nM insulīnu; reģions ar vislielāko proporcionālo efektu bija NAc apvalks, kas ir striatāla apakšreģions ar augstāko InsR izteiksmi^{1, 14}. Šķēlēs, kas identiskiem apstākļiem pakļauti 30 nM insulīnam, neuzrādīja nekādas izmaiņas striatālā DA saturā (1a papildinājums), kas nozīmē, ka insulīns maina dinamiska izdalīšanās regulējumu, nevis vienkārši regulē DA sintēzi. Jāatzīmē, ka insulīna ietekme uz dzemdībām [DA]_o bija pazaudēta ≥100 nM suprafizioloģiskā koncentrācijā (1b). Tas nebija rezultāts paaugstinātai DAT aktivitātes aprites izlaišanai, jo insulīna iedarbība V_maks tika zaudētas arī šādās koncentrācijās (Tabula 1). Kopumā šie dati rāda, ka neskartā striatāla mikroekonomikā dominējošā insulīna iedarbība uz dzemdībām [DA]_o ir palielināt izdalīšanos, neraugoties uz vienlaicīgu DA uzņemšanas pieaugumu.

  

  

(a) Vidējā viena impulsa izraisītā [DA]_o NAc čaulā, NAc kodolā un CPu pirms un pēc insulīna (Ins), kas ilustrēts 30 nM; kļūdas joslas izlaistas, bet skatiet (b); bultiņas norāda stimula laiku. Paaugstināts insulīna daudzums [DA]_o čaulā (ar 55 ± 10%), kodolu (pēc 37 ± 5%) un CPu (ar 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Insulīna ietekme bija atkarīga no fizioloģiskā diapazona (1 – 30 nM) apvalkā (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), kodols (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) un CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), bet zaudēts pie ≥100 nM. (c) Reprezentatīvi pīķa izraisītie ieraksti [DA]_o pretstatā vienai vietai NAc kodolā bez zāļu lietošanas (Con), insulīna lietošanas laikā (30 nM) vai insulīna ievadīšanas gadījumā InsR inhibitora HNMPA (5 μM) klātbūtnē. (d) Vidējā maksimālā vērtība (DA)_o dati par insulīna (30 nM) HNMPA, InsR antagonista S961 (1 μM) un PI3K inhibitora LY294002 (1 μM) iedarbības novēršanu, bet ne ar IGF-1R inhibitoru PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 pretstatā tikai insulīnam) Priekš 1a – d, n= vietu skaits katrā apakšreģionā no 3 – 6 žurkām katrai zāļu vai insulīna koncentrācijai; vienvirziena ANOVA, Tukey godīga nozīmīguma tests (HSD). Skatīt 1b, c NAc apvalka un CPu datiem.

• Pilna izmēra attēls (98 KB)

 

 

Tā kā insulīns var iedarboties arī uz insulīnam līdzīgiem augšanas faktora 1 receptoriem (IGF-1R), lai gan koncentrācija pārsniedz 100 nM (ref. 1), mēs centāmies apstiprināt, ka insulīna pastiprinātā iedarbība uz dzemdībām [DA]_o bija atkarīgs no InsR. Tas izrādījās gadījums, jo iedarbību novērsa intracelulārs InsR inhibitors, hidroksi-2-naftalenilmetilfosfonskābe (HNMPA) un InsR antagonists, S961, bet ne selektīvs IGF-1R inhibitors, pikropodofilīns²⁴ (PPP; 1c, d un 1b, c). Pēc tam mēs pārbaudījām PI3 kināzes iesaistīšanos, kas uzsāk signalizācijas ceļu, kas atbild par insulīna atkarīgo DAT regulēšanu.¹⁹. Pie 1 μM koncentrācijas P13K inhibitors LY249002 vien neietekmēja pīķa izdalīšanos [DA]_o or V_maks (n= 29 – 76 vietas (NAc kodols) uz vienu narkotiku, P> 0.05, vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA); dati nav parādīti), tomēr novērsa insulīna ietekmi uz izraisīto [DA]_o visos striatāla apakšreģionos (1d un 1b, c).

InsRs lokalizācija uz DA axoniem un ChIs

Novērotais pieaugums 2006. \ T V_maks DA uzņemšanai ar fizioloģiskajiem insulīna līmeņiem ir jāietver insRs uz DA asīm, tāpat kā iepriekšējie rezultāti dažādos striatāla preparātos.^{18, 19, 20, 21, 22}. Lai gan ir pierādīta insrtu funkcionālā izteiksme uz vidus smadzeņu DA neironiem^{15, 23, 24, 25}, Nav ziņots par InsR ekspresiju uz striatāla DA asīm. Mēs to risinājām, izmantojot imūnhistoķīmiju. Spēcīgs InsR imunoreaktivitāte visā striatuma kvantitatīvā novērtējumā par insR lokalizāciju uz DA axoniem, kas tika identificēti ar imūnoreaktivitāti attiecībā uz DA sintēzes enzīmu, tirozīna hidroksilāzi (TH). Tāpēc mēs pieņēmām iepriekš paziņoto protokolu²⁷, kas ietvēra InsR puncta skaitīšanu, kas pārklājās ar TH + profiliem normālā attēla skatā, un skaitot vēlreiz pēc tam, kad tikai InsR attēls tika pagriezts ar 90 °. Ja acīmredzamā InsR un TH + profila pārklāšanās nav specifiska, šai procedūrai būtu jāsniedz statistiski līdzīgs skaitlis neatkarīgi no tā, vai tas ir normāls vai 90 °. Tomēr šī analīze parādīja InsR puncta pārklāšanās samazināšanos ar THN profiliem 14 ± 9% (n= 42 lauki, P<0.01, savienots pārī ar divām astēm t-pārbaude; dati nav parādīti), apstiprinot InsR klātbūtni DA asīs. Tomēr intriģējošā veidā, striatuma InsR imūnatzīmēšana atklāja atšķirīgu InsR ekspresiju uz lielām šūnu struktūrām, kas tika identificētas kā striatāla ChI, koolimolizējot holīna acetilransferāzi (ChAT), primāro fermentu, kas nepieciešams ACh sintēzei. Izmantojot elektrofizioloģiskos kritērijus²⁸ lai identificētu ChI provizoriskos pilnšūnu ierakstīšanas pētījumos, vairāki neironi tika aizpildīti ar biocītu un pēc tam apstrādāti imūnhistoķīmijai; visi šie (4 / 4) bija imūnsistēmas gan InsR, gan ChAT (2a). Turpmākais InsR un ChAT lokalizācijas novērtējums NAc apstiprināja, ka praktiski visi ChAT + neironi izteikti InsR (96%; n= 27 / 28 neironi četrās daļās no divām žurkām).

  

  

(a) ChI, kas piepildīts ar biocitīnu, pēc tam imūnsaraksts ar ChAT, un InsR (pārstāv 4 / 4 biocītu pildītas ChI); apvienotais attēls rāda koplokalizāciju; mēroga josla, 10 μm. (b-e) Striatāla ChI reakcija uz virkni depolarizējošo strāvas impulsu (3 s ilgums; 200, 300 un 400 pA; 120 s intervāli) pirms un pēc insulīna (30 nM). (b) Spiksu frekvences pielāgošana ChI (augšējā daļā) tiek novērota darbības potenciāla (AP) izvadīšanas zudumā pašreizējās injekcijas laikā, turpretī spicums saglabājas visā strāvas impulsa laikā insulīnā (zemāks); pilnīga datu kopa, kas parādīta d. (c) Insulīna inducētā AP skaita reprezentatīvais laika gaita ar katru pašreizējo soli ChI b. (d) AP numuru kopsavilkums strāvas impulsu laikā, kas piegādāti pirms insulīna iedarbības un tās maksimālā \ tn= 21 pāra stimulācijas, 7 neironi, 5 žurkas)e) Vidējās atbildes, kas parāda insulīna (+ Ins) ietekmi kontroles apstākļos (Con; n21 pāra stimulācijas, 7 neironi, ***P<0.001, savienots pārī ar divām astēm t-test), HNMPA klātbūtnē (5 μM) (n12 pāra stimulācijas, 4 neironi, 4 žurkas, \ t P>0.05, savienots ar divpusējiem t-test) un PPP (1 μM) klātbūtnē (n18 pāra stimulācijas, 6 neironi, 6 žurkas, **P<0.01, Wilcoxon saskaņoto pāru parakstītais rangu tests). (f) Vidējā viena impulsa izraisītā [DA]_o NAc kodolā pirms un pēc insulīna (30 nM) mekamilamīnā (Mec; 5 μM) vai DHβE (1 μM), kas normalizēts atbilstoši 100% maksimālajai kontrolei (n20 – 40 vietas katrā apakšreģionā katrā stāvoklī no 3 – 4 žurkām, \ t P> 0.05 pret kontroli, nesavienots t-pārbaude). (g) Vidējā viena impulsa izraisītā [DA]_o priekšgala šķēlītēs no heterozigota kontroles (Het) un ChAT KO peles pirms un pēc insulīna (30 nM), normalizētas atbilstoši 100% maksimālajai kontrolei. Paaugstināts insulīna daudzums [DA]_o heterozigotiskajās pelēs ar 190 ± 23% NAc apvalkā, 140 ± 8% NAc kodolā un 137 ± 12% CPu (n= 15 – 25 vietas katrā apakšreģionā no 3 – 4 pelēm uz vienu genotipu, **P<0.01, ***P<0.001 salīdzinājumā ar kontroli pārī t-test), bet neietekmēja radīto [DA]_o jebkurā. \ t ChAT KO peles (P> 0.1).

• Pilna izmēra attēls (167 KB)

 

 

Insulīns palielina ChI uzbudināmību

Lai pārbaudītu InsRs funkcionalitāti striatāla ChI, mēs pārbaudījām insulīna ietekmi uz ChI uzbudināmību, izmantojot pilnšūnu strāvas stiprinājuma ierakstu. ChI uzbudināmība tika novērtēta, izmantojot virkni 3 s depolarizējošo strāvas impulsu, lai izceltu darbības potenciāla vilcienu, kas droši parādīja smailes frekvences adaptāciju (2b), bieži vien ar strāvas impulsa beigu zudumu. Pārsteidzoši, insulīna (30 nM) samazināja smailes frekvences pielāgošanu, kā rezultātā pakāpeniski palielinājās darbības potenciāla skaits (2c), ar maksimālo palielinājumu (2d, e) parasti novēro starp insulīna iedarbību 20 un 50 min. Insulīna trūkuma dēļ kontroles ChIs nemainīja izraisīto darbības potenciālu skaitu.P> 0.05, pārī savienoti ar divām astēm t-pārbaude; dati nav parādīti); salīdzinot ar kontroles neironiem, kas tiek kontrolēti vienā un tajā pašā laika intervālā, insulīnam pakļautie neironi parādīja ievērojami lielāku izmaiņu skaitu izraisīto darbības potenciālu (kontrole) n= 12 stimulu pāri no četriem neironiem, insulīns n= 21 stimulu pāri no septiņiem neironiem, F_1,25= 5.63, P<0.05, jauktu pasākumu divvirzienu ANOVA; dati nav parādīti). Insulīna ietekmi uz darbības potenciāla skaita palielināšanos novērsa HNMPA, bet ne IGF-1R selektīvais inhibitors PPP (2e), parādot, ka palielināts ChI uzbudinājums ar insulīnu bija InsR.

Insulīna pastiprināšanās, ko izraisa [DA]_o nepieciešama nAChRs un ACh

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka ChIs un ACh spēcīgi regulē striatālu DA izdalīšanos caur nAChR uz DA asīm^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Pateicoties akūtai insulīna iedarbībai, lielā InsR izpausme uz ChI un ChI uzbudināmības uzlabošanās liecināja, ka šie neironi varētu būt jauni insulīna mērķi, kas varētu izraisīt pastiprinātu DA izdalīšanos. Lai to pārbaudītu, mēs pārbaudījām insulīna ietekmi mekamilamīna, neselektīva nAChR antagonista vai dihidro-β-eritroidīna (DHβE) klātbūtnē, kas ir selektīvs antagonists β2 apakšvienības saturošajiem (β2 *) nAChRs, kas ir bagātināti DA asis³⁵. Izgudrots [DA]_o šo antagonistu klātbūtnē viegli konstatēja, lai gan abas zāles samazināja viena impulsa izraisīto amplitūdu [DA]_o (piemēram, 13 – 26% NAc kodolā), kā ziņots iepriekš^{29, 30, 31, 32}. Lai atbalstītu ACh un nAChR lomu, insulīna ietekme uz dzemdībām [DA]_o tika novērsta vai nu mekamilamīns, vai DHβE (2f). Lai apstiprinātu striatāla ACh signalizācijas iesaistīšanos insulīna pastiprinātā DA izdalīšanā, mēs pārbaudījām insulīna iedarbību ex vivo striatāla šķēles no pelēm, kurās ChAT ekspresija bija ģenētiski ablēta priekšpuses struktūrās (priekšgala ChAT KO pelēm), ieskaitot striatumu³². Lai gan šajās pelēs ChIs ir neskarts, ACh sintēze tiek atcelta, kas noved pie samazināta, bet vēl viegli konstatējama viena impulsa izraisīta [DA]_o, kā aprakstīts iepriekš³². Kontrolējamos heterozigotiskos pakaišus, insulīns (30 nM) palielinājās (DA)_o NAc apvalkā un kodolā un CPu ar 37 – 90% (2g), pārsniedzot pastiprināšanos, kas novērota žurku striatumā (piemēram, \ t Fig. 1). Tomēr insulīna ietekme uz dzemdībām [DA]_o netika novērots visā striatāla kompleksā priekšgalā ChAT KO pelēm, pierādot, ka insulīna mediētā DA izdalīšanās uzlabošanai nepieciešama striatāla ACh, bet nav kopīgi atbrīvoti raidītāji no ChI, piemēram, glutamāts³⁶.

Insulīna ietekme uz dzemdībām [DA]_o ir atkarīgs no diētas

Plazmas un smadzeņu insulīna koncentrācija ir proporcionāla ķermeņa aptaukošanās^{6, 7, 8}un var izraisīt smadzeņu jutības pret insulīnu kompensācijas. Tādēļ mēs pārbaudījām hipotēzi, ka diēta ietekmē insulīna spēju veicināt DA izdalīšanos, izmantojot striatāla šķēles no žurkām, kas tiek turētas vai nu ar hronisku FR vai OB diētu, salīdzinot ar AL kontroli. Kā gaidīts, plazmas insulīna līmenis korelēja ar ķermeņa svaru, zemāks insulīns FR nekā AL vai OB žurkām (3a un Tabula 2). Neskatoties uz šīm atšķirībām cirkulējošajā insulīnā, maksimālā \ t_o NAc čaulā un kodolā, un CPu bija ievērojami zemāks ex vivo striatāla šķēles no abām uztura grupām, salīdzinot ar AL (3b un Papildinājums 2 a, b), kas norāda, ka faktori papildus insulīnam ir absolūti radušies [DA]_o. Striatāla DA saturs diētas grupās neatšķīrās, norādot uz izmaiņām atbrīvošanas regulējumā, nevis DA sintēze2c). Atbilstoši izmaiņām dinamiskajā regulējumā striatāla DA izdalīšanās jutība pret insulīnu bija ievērojami atkarīga no diētas. FR žurkām insulīna koncentrācija ≤1 nM, kas neietekmēja AL (1b), palielināts pamudinājums [DA]_o (3c), kas atspoguļo paaugstinātu jutību pret insulīnu ar EK₅₀ vērtības FR striatum (0.4 – 0.6 nM), kas bija aptuveni vienāda lieluma zemākas nekā AL (salīdziniet 1b un 3c). Acīmredzamā kontrastā insulīna efekts tika zaudēts OB striatum; pat 30 nM insulīns, kam bija maksimāla iedarbība AL striatumā (1b), nebija ietekmes uz OB (3c).

  

  

(a) Plasma insulīna koncentrācija ir pozitīvi korelēta ar ķermeņa masu barošanas grupās (R= 0.76). (b) Vidējā viena impulsa izraisītā [DA]_o NAc kodolā (skat Papildu attēls 2a, b NAc apvalks un CPu) bija zemāks FR (38 ± 4%) un OB (25 ± 4%) pret AL (n= 50 – 60 vietas no 5 – 6 žurkām uz vienu uztura grupu; F_2,156= 23.337, vienvirziena ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB pret FR (P<0.08). (c) Paaugstināta jutība [DA]_o insulīns tika uzlabots FR, bet pazudis OB (n= 21 – 49 vietas katrā apakšreģionā uz 2 – 4 žurkām vienā barības grupā, vienvirziena ANOVA, Tukey HSD), ar lielāku jutību FR pret AL žurkām visos apakšreģionos (P<0.001 katram reģionam; divvirzienu ANOVA; Procesors: F_{(conc × diēta; 3,286)}= 10.253; kodols: F_{(conc × diēta; 3,353)}= 6.166; apvalks: F_{(conc × diēta; 3,195)}= 10.735).

• Pilna izmēra attēls (124 KB)

 

 

Šie dati norāda uz apgrieztu saikni starp striatāla InsR jutību un ķermeņa aptaukošanos. Alternatīvi, tomēr šīs diētas atkarīgās atšķirības var atspoguļot izmainīto nAChR jutību. Tāpēc mēs noteicām koncentrācijas reakciju pret nikotīnu NAc kodolā no katras diētas grupas. Nikotīns izraisa nAChR desensibilizāciju, ko var kvantificēt, salīdzinot [DA] attiecību._o izraisa īss piecu impulsu vilciens ar 100 Hz uz vienu impulsu izraisītu [DA]_o (5 p: 1 p attiecība) kā nAChR aktivācijas / desensibilizācijas indekss^{30, 31}. Izmantojot šo pieeju, nav konstatētas atšķirības starp nAChR jutīguma uztura grupām NAc kodolā (Papildu attēls 3a – c). Turklāt kontroles 5 p: 1 p attiecība neatšķīrās starp diētas grupām NAc kodolā (Papildu attēls 3d) vai CPu (nav ilustrēts), kas nozīmē, ka diēta nemaina nAChR atkarīgo DA izdalīšanas regulējumu. Tātad, striatāla InsR jutība ir uzlabojusies FR pret AL žurkām, bet OB žurkām nav, ar insulīna fizioloģisko koncentrāciju zaudējot striatāla DA izdalīšanos.

NAc čaumalas insulīns modulē nosacīto garšas izvēli

Pārtikas izvēli rada gan pirms-, gan pēc tam, kad ir norijuši; mehānismi katram no tiem nav pilnībā atrisināti, bet pašreizējie pierādījumi ietver NAc DA signalizāciju abos^{37, 38}. Ņemot vērā to, ka plazmas un cerebrospinālā šķidruma (CSF) insulīna līmenis strauji palielinās pēc perifēra glikozes līmeņa paaugstināšanās⁶un ka insulīna paaugstināšanās striatumā var tikt konstatēta plazmas insulīna līmeņa paaugstināšanās laikā 5 min⁷ir loģiski, ka hipotēze, ka perifēra insulīna izdalīšanās maltītes laikā varētu uzlabot NAc DA izdalīšanos un sekmēt pēcdzemdību atalgojuma mehānismus. Mēs pielāgojām iepriekš aprakstīto aromāta preferenču protokolu³⁷ ar saharīna saldinātu glikozes šķīdumu žurkām, lai pārbaudītu hipotēzi, ka endogēnā insulīna efekta bloķēšana, izmantojot lokālo insulīna antivielas (InsAb) lietošanu NAc, samazinātu pāra garšas izvēli. InsAb efektivitāte insulīna iedarbības bloķēšanā tika pārbaudīta in vitro DA absorbcijas tests striatāla sinaptosomās. Insulīns (30 nM) nozīmīgi palielināja V_maks sinaptosomās no NAc vai CPu (4), kas atbilst mūsu V_maks dati no striatāla šķēlītēm (Tabula 1) un ar iepriekšējiem pētījumiem^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Insulīna trūkuma dēļ ne InsAb, ne kontroles antivielu imūnglobulīns G (IgG) nemainīja V_maks DA uzņemšanai pret kontroli. IgG klātbūtnē insulīns joprojām izraisīja ievērojamu pieaugumu V_maks; tomēr insulīna ietekme uz V_maks tika zaudēts InsAb klātbūtnē (4).

Lai samazinātu audu bojājumus un saglabātu audu mērķa jutību, tika pārbaudītas divas subjektu grupas, kurās mēs mainījām iekšējo NAc mikroinjicēšanu ar izspēles mikroinjekcijas procedūru, nevis izmantojot vienu personu grupu un savienojot vienu aromatizētu šķīdumu ar InsAb un otru ar transportlīdzekli. Līdz ar to vienas pudeles kondicionēšanas sesiju laikā eksperimentālā grupa saņēma InsAb mikroinjekcijas, kas savienotas pārī ar vienu no divām garšvielām, un uz mainīgajām sesijām mock mikroinjekcijas, kas savienotas pārī ar citu garšu (4a, pa kreisi). Kontroles grupa saņēma izspēles mikroinjekcijas, kas mainījās ar vai nu fosfāta bufera sāls (PBS) vai IgG mikroinjekcijām. Abi aromatizētie šķīdumi kondicionēšanas laikā satur glikozi. Kontroles mikroinjicētā grupā nebija sagaidāma diferenciāla izvēle starp flavors, bet tika sagaidīts, ka InsAb-microinjected grupā priekšroka tiek dota pret makroinjicēšanas pārī aromātu.

  

  

(a) Diagramma, kas ilustrē vienas pudeles kondicionēšanu (pa kreisi) un divu pudeļu pārbaudi (pa labi). (b) Viena pudeles kondicionēšanas sesiju laikā patērētais daudzums (ml). Būtiska mijiedarbība starp infūzijas kondicionēšanas sesiju un mikroinjekcijas ārstēšanu (n= 19 – 20 žurkām katrā grupā; F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 jaukta ANOVA ar atkārtotiem pasākumiem infūzijas kondicionēšanas sesijā). InsAb mikroinjekcija ievērojami samazināja patēriņu, salīdzinot ar kontroli trešajā periodā (t(40) = 3.026, **P<0.01) un ceturtais (t(40) = 3.052, **P<0.01, aizsargāts ar vienu asti t-tests) infūzijas. Mock injekcijām nebija ietekmes uz patēriņu nevienā no grupām (F_3,111= 1.110, 2 × 4 sajaukts ANOVA ar atkārtotiem mērījumiem mērīšanas kondicionēšanas sesijā). (c) Tilpums, kas patērēts divu pudeļu aromāta preferenču testā. Kondicionēšanas laikā bija ievērojama mijiedarbība starp aromātu un mikroinjekciju.F_1,37= 5.36, P<0.05, divvirzienu jaukta ANOVA ar atkārtotiem garšas mērījumiem). InsAb grupa patērēja ievērojami mazāk InsAb pāra garšas, salīdzinot ar mock-pair garšu (t(18) = 2.82, ** P<0.01, aizsargāts ar vienu asti t-pārbaude); kontroles grupai nebija garšas izvēles (t(19) = 0.803, P> 0.05, aizsargāts t-pārbaude). Salīdzinot grupas, InsAb žurkas dzēra ievērojami mazāk infūzijas pārī aromātu (t(40) = 1.96, *P<0.05) un ievērojami vairāk ar izdomātu pāra garšu (t(40) = 1.77, *P<0.05, aizsargāts ar vienu asti t-test) nekā kontroles.

• Pilna izmēra attēls (161 KB)

 

 

Viena pudeles kondicionēšanas sesiju laikā InsAb mikroinjekcija ievērojami samazināja patēriņu salīdzinājumā ar transportlīdzekli trešās un ceturtās infūzijas laikā (4b). Turpretim abas grupas patērēja tādu pašu šķīduma daudzumu visās četrās pilienu iesmidzināšanas sesijās (F_3,111= 0.127, P>0.05, jaukta divvirzienu ANOVA) (4b). Pēc pavisam astoņām kondicionēšanas sesijām aromāta izvēle tika novērtēta divu pudeļu testā, kurā žurkām vienlaicīgi bija pieejami abi aromatizētie šķīdumi (4a). Statistiskā analīze atklāja būtisku mijiedarbību starp garšu un mikroinjekciju apstrādi, kas saņemta kondicionēšanas laikā (4c). InsAb grupa patērēja ievērojami mazāk no InsAb pārī savienotā aromāta, salīdzinot ar mock-pair garšu (4c), bet transportlīdzekļu grupai nebija garšas izvēles (\ t4c), kas nozīmē, ka neskarts insulīna signāls veicināja salda kaloriju šķīduma izvēli. Salīdzinot ar transportlīdzekli, InsAb-mikroinjekcijas žurkas dzēra ievērojami mazāk infūzijas pārī aromātu un ievērojami vairāk no izsmidzināto aromātu.4c). IgG mikroinjekcija (t(9) = 0.792. P>0.05, aizsargāts t-testi) vai PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, aizsargāts t- testi) neietekmēja garšas izvēli (dati nav parādīti), iebilstot pret iespēju, ka InsAb mikroinjekcijas nespecifiska ietekme samazināja patēriņa vai garšas izvēli. Jāatzīmē arī tas, ka InsAb grupas priekšroka testā nav priekšroka mazākai jaunajai garšai, jo InsAb grupai nebija mijiedarbības starp sesiju un sesijas veidu (faktiskā infūzija pret infūziju).F_3,54= 1.584, P> 0.05, divvirzienu ANOVA). Tas nozīmē, ka InsAb grupa nepatērēja vairāk ar paraugu, kas sajaukts ar infūziju, salīdzinājumā ar InsAb pārī aromātu; drīzāk atšķirības starp ārstēšanas grupām parādījās tikai infūzijas kondicionēšanas sesiju laikā. Kopumā šie dati norāda, ka NAc esošajam insulīnam ir nozīme, pastiprinot priekšroku aromātam, kas norāda uz glikēmisko slodzi.

Šeit mēs ziņojam, ka insulīns pastiprina striatālu DA izdalīšanos no nAChR atkarīgā veidā, modulējot ChI uzbudināmību caur InsRs. Mūsu rezultāti liecina, ka insulīns var kalpot kā atalgojuma signāls, papildus tam, ka tā ir pierādījusi sāta sajūtu. Konkrēti, insulīna iedarbība uz DA izdalīšanos ir modulēta ar uzturu, ievērojami paaugstinot jutību pret insulīnu pēc FR, bet pilnīga insulīna regulējuma zaudēšana OB uztura ziņā. Šķiet, ka šīs izmaiņas atspoguļo InsR jutības izmaiņas, kas ir apgriezti saistītas ar cirkulējošo insulīna līmeni, ņemot vērā, ka plazmas insulīna līmenis ir atkarīgs no uztura, bet nAChR jutība nebija. Visbeidzot, mūsu aromāta preferenču pētījumi dzīvnieku uzvedībā nozīmē, ka insulīna signalizācija NAc apvalkā ietekmē pārtikas izvēli, kas ne tikai ietver insulīnu ar pārtiku saistītās mācībās, bet arī apstiprina tās kā atalgojuma signāla lomu.

Net [DA]_o atspoguļo līdzsvaru starp DA izdalīšanos un DA uzņemšanu caur DAT. Iepriekšējie pierādījumi, ka insulīns var regulēt DAT aktivitāti^{18, 19, 20, 21, 22, 23} noveda pie prognozes, ka insulīna palielināšanās izraisīs neto samazinājumu (DA)_o palielinot DA uzņemšanu. Tomēr mēs atklājām, ka striatumā insulīna iedarbība ir daudz sarežģītāka. Lai gan insulīna iedarbība palielinājās V_maks attiecībā uz DAT insulīna primārais efekts bija uz DA izdalīšanos, nevis uz DA uzņemšanu, ar pastāvīgu palielināšanos (DA)_o insulīna koncentrāciju fizioloģiskajā diapazonā NAc korpusā un kodolā un CPu. Kaut arī palielinājās pamudinātais skaits [DA]_o atgriezās pie kontroles līmeņiem pie 100 nM suprafizioloģiskās koncentrācijas, V_maks arī nemainījās no kontroles, izskaidrojot dominējošo ietekmi uz DAT kā skaidrojumu. Tā vietā, iedarbības zudums, kā arī izdalīšanās, ietver insRs desensibilizāciju vai lejupvērstu signalizācijas ceļu samazināšanu augstās insulīna koncentrācijās. Patiešām, pēc insulīna piesaistes perifēriskajos audos insRs notiek strauja endocitoze un degradācija¹ar jauniem pierādījumiem par neironu InsR jutības zudumu pēc īstermiņa iedarbības ar augstu insulīna līmeni vai augstu kaloriju diētu;^{10, 11, 39}.

Šeit dominējošais insulīna efekts, kas uzlabo striatālo DA izdalīšanos, ir pretrunā ar divu citu neseno rezultātu ex vivo šķēles pētījumi. Pirmajā gadījumā insulīns izraisīja elektriski izraisītu [³H] DA no striatāla šķēlītēm, lai gan palielinājās [³H] DA pārplūde tika konstatēta, kad DAT tika inhibēts²². Ņemot vērā, ka tas tika atbrīvots [³H] DA ir jāizvairās no DAT-mediētas uzņemšanas visā audos, kas jānosaka superfūzijas šķīdumā, šis protokols ir īpaši jutīgs pret DAT regulējumu. Mūsu rezultāti parāda, ka insulīna pastiprināšana DA izdalīšanos caur ChIs un nAChR aktivācija papildus DAT-mediētās uzņemšanas uzlabošanai izskaidro šķietami paradoksālu insulīna pastiprināšanos [³H] DA pārplūde, kas redzama, kad tika bloķēti konkurējošie efekti uz DAT²². Otrajā pētījumā tika izmantota FCV, lai atklātu tiešu somatodendritu DA izdalīšanos VTA, bet konstatēja arī insulīna dominējošo ietekmi uz DA uzņemšanu, kas atspoguļojās samazinātajā izraisītajā [DA]_o (skat. 23). Atšķirības vairākos faktoros, sākot ar vietējo mikrocirkulāciju un somatodendritisku, salīdzinot ar axonal DA atbrīvošanas mehānismiem⁴⁰, varētu veicināt šo reģionālo atšķirību. Kā tālāk aprakstīts tālāk, tomēr reģionāli atkarīgās insulīna lomas, iespējams, būs komplementāras, nevis pretrunīgas.

Iepriekš tika pieņemts, ka jebkura no insulīna atkarīgas DA signālu regulēšanas loma ir saistīta ar tiešu InsRs aktivizāciju uz DA neironiem. Šeit mēs parādām, ka InsRs ir izteikti arī striatāla ChI, un ka insulīns modulē ChI uzbudināmību, lai pastiprinātu striatālu DA izdalīšanos, kas var būt izšķiroša loma insulīna ietekmei uz uzturu. Striatāla ChI saņem projekcijas no talamala intralamināro kodolu neironiem, kam piemīt sprādziena šaušana, reaģējot uz ievērojamiem sensoriem stimuliem, un palīdz vadīt sprādziena pauzes uzvedības modeļus, kas ir svarīgi uzmanības, pastiprinājuma un asociatīvās mācīšanās virzienā⁴¹. Tādēļ insulīna iedarbība uz striatāliem uz striatāla ChI varētu palielināt jutekļu uztveres ietekmi uz striatālu reakciju uz talamisko šaušanu, veicinot palielinātu uztvertās maltītes atalgojuma vērtības uztveri. Straujās DA atbrīvošanas tieša veicināšana ar ChI aktivizāciju ir ļāvusi domāt, ka faktoriem, kas stimulē ChI, būs priviliģēta loma kā DA atbrīvošanas izraisītāji.³³. Mūsu dati ir pirmie pierādījumi tam, pateicoties tam, ka ChI uzbudināmība ir uzlabota ar insulīnu, un ACh signālu pārraide veicina dinamiska palielināšanos DA atbrīvošanā.

Paaugstināta DA izdalīšanās insulīna klātbūtnē arī ir pret ACh signālu pastiprināšanos tādā mērā, kas izraisa nAChR desensibilizāciju vai musharīna ACh receptoru (mAChR) aktivāciju, no kurām katra var nomākt vienu impulsu izraisītu [DA]_o (Atsauces 29, 30, 31, 42). Tādējādi šeit aprakstītie mehānismi atšķiras no ACH aktivācijas, kas saistīta ar mAChR, kas ir saistīta ar nepatiku un sāta sajūtu.⁴³.

Viena impulsa izraisītais [DA]_o gan FR, gan OB žurkām bija zemāka nekā AL žurkām; lai gan šie rezultāti atbilst iepriekšējiem ziņojumiem^{44, 45, 46}, mūsu pētījumi sniedz pirmo sistemātisku triju striatāla apakšreģionu salīdzinājumu abās uztura grupās konstanta laika posmā. Nav izskaidroti mehānismi, kas ir atkarīgi no diētas atkarīgas pārmaiņas DA izdalīšanā, un tie neietilpst šajos pētījumos. Tomēr, ņemot vērā, ka plazmas insulīna līmenis ir pretrunā ar FR un OB uzturu, ir maz ticams, ka tas samazinās (DA)_o abās grupās ir atkarīgs no uztura atkarīga insulīna līmeņa.

No otras puses, izmaiņas InsR jutībā ar uzturu un no tā atkarīgajiem uztura atkarīgajiem plazmas insulīna līmeņiem ir visizteiktākais skaidrojums paaugstinātai jutībai pret insulīnu FR un atbildes reakcijas uz insulīnu zudumu OB. Nav pierādījumu par alternatīvu nAChR jutības izskaidrojumu ne FR, ne OB žurkām, salīdzinot ar AL. Lai gan mūsu rezultāti ir viens no pirmajiem, kas norāda uz paaugstinātu striatāla InsR jutību ar FR¹⁸svara zudums var būt saistīts ar samazinātu insulīna līmeni CSF⁷, kas veicinātu DA izdalīšanās jutību pret insulīnu FR. Un otrādi, insulīna atbildes reakcijas zudums OB žurkām atbilst iepriekšējiem pierādījumiem par mazinātu smadzeņu InsR jutību, ko izraisa svara pieaugums vai OB uzturs^{3, 10, 11}.

mūsu ex vivo gabalu dati apstiprina hipotēzi, ka insulīns var liecināt par atalgojumu, kā arī sāta sajūtu. Mēs pārbaudījām šo hipotēzi, bloķējot endogēnā insulīna ietekmi ar divpusējo InsAb mikroinjicēšanu NAc apvalkā aromāta preferenču kondicionēšanas laikā. Atbilstoši lomai atalgojumā, insulīna efekta bloķēšana samazināja priekšroku glikozes saturoša šķīduma aromātam, salīdzinot ar aromātu, kas saistīts ar neskartu insulīna signalizāciju. Insulīna bloķēšana NAc apvalkā samazināja arī pāra šķīduma patēriņu vienas pudeles kondicionēšanas laikā, bet izspēles vai kontroles mikroinjekcijas neietekmēja patēriņu. Šie dati liecina, ka insulīnam NAc apvalkā ir svarīga nozīme pārtikas preferencēs. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka neskartas DA signālierīces NAc ir nepieciešamas, lai iegūtu aromātu^{37, 38}, apstiprinot NAC DA lomu uzturvielu risinājumu pastiprinošās ietekmes risināšanā. Ņemot to vērā, priekšroka glikozes šķīdumam, kas savienots ar neskartu insulīna pieejamību, ir pret insulīna primāro ietekmi uz DAT-mediēto DA uzņemšanu NAc apvalkā, jo tas varētu samazināt [DA]_o tāpēc samazina aromāta aromātu patēriņu. Mūsu rezultāti atbilst arī tiem, kas iegūti iepriekšējā pētījumā, kurā insulīna mikroinjekcija NAc apvalkā palielināja laiku, kad dzīvnieki bija iesaistīti perorālā saharozes pašregulācijā, un palielinot saharozes patēriņu.²⁶, kas bija pretējs paredzamajai DA palielināšanās sekai. Kopumā šie uzvedības dati atbilst prognozētajai insulīna ietekmei uz striatāla ChI un pastiprinātu DA izdalīšanos. Tomēr šie rezultāti neizslēdz citu striatāla mikroprocesoru elementu iesaistīšanu kontrolētajā uzvedībā, ņemot vērā plašu InsR izteiksmi visā striatumā.^{1, 14}.

Šeit sniegtie pētījumi ir pirmie pierādījumi tam, ka insulīnam ir nozīme, informējot par ēdienreizes kaloriju vērtību un tādējādi arī atalgojuma ietekmi, kam ir nozīmīga ietekme uz insulīna ietekmi gan aptaukošanās, gan aptaukošanās pacientiem. Vairāki pētījumi liecina, ka pārtikas pēcreģistrācijas ietekme, neskatoties uz to, vai garšas transdukcijas ceļi ir neskarti⁴⁷, palielināt NAc DA atbrīvošanu un pozitīvu uzvedības pastiprināšanu^{37, 47}. Tādējādi pēcabsorbcijas insulīna atbildes reakcija var kodēt maltītes glikēmisko iznākumu un veicināt pārtikas preferences un uzvedību, kas ļauj patērēt. Tomēr ekstremālas cirkulējošā insulīna līmeņa izmaiņas un centrālā InsR jutība varētu ietekmēt patoloģisku, kā arī adaptīvu uzvedību. Piemēram, FR subjektiem hipoinsininācija un kompensējoša InsR jutīguma regulēšana varētu būt faktors to izvietošanā pret iekļūšanu.⁴⁸. Savukārt centrālā insulīna nejutība pret II tipa diabētu vai aptaukošanos, kas atspoguļota šeit OB žurkām, varētu mazināt atalgojuma sajūtu pēc norīšanas, kā arī tādu pārtikas produktu uzņemšana, kuriem ir augsts glikēmijas indekss.^{49, 50}. Tāpēc vai nu striatāla insulīna jutības palielināšanās, vai samazinājums varētu veicināt patoloģisku ēšanu, kā rezultātā rodas ēšanas un / vai aptaukošanās.

Kopumā mūsu rezultāti atklāj jaunu insulīna lomu kā atlīdzības signālu. Šāda loma kontrastē ar tās pazīstamo funkciju kā sāta signālu, ieskaitot jaunākos konstatējumus, ka VTA mikroinstalētais insulīns var samazināt hedonisku barošanu un priekšroku norādēm, kas saistītas ar pārtikas atlīdzību^{23, 24}. Tas izraisa jautājumu par to, kā šķietami pretrunīgas insulīna lomas šajās DA atkarīgās funkcijās. Atbilde var būt, ka šīs sekas ir papildinošas, nevis pretrunīgas. Pašreizējie rezultāti liecina, ka insulīns striatumā ziņo par norīšanas maltītes vērtību. Divkāršā nozīme signālu sāta piesātinājumā var vienkārši ļaut insulīnam kalpot svarīgam ēdienreizes pārtraukšanas mērķim, vienlaicīgi izveidojot atmiņu par tās uztura un tādējādi atalgojošajām īpašībām, tādējādi pastiprinot iekšķīgas uzvedības atkārtošanos.

Dzīvnieku pārvietošana

Dzīvnieku procedūras atbilst NIH vadlīnijām un apstiprināja NYU Medicīnas skolas dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja. Visi dzīvnieki atradās 12 h gaismā: tumšā ciklā, ar gaismas signāliem no 06: 00 uz 18: 00; ex vivo šķēlītes tika sagatavotas starp 08: 00 un 12: 00. Tika veikti mehāniski pētījumi ar AL žurkām un pelēm ex vivo šķēles no dzīvniekiem, kas novietoti pa pāriem, savukārt žurkas tika atsevišķi novietotas visiem diētas grupu salīdzinājumiem un uzvedības pētījumiem.

Žurku diētas

Pieaugušie tēviņi Sprague – Dawley žurkas (Taconic) bija 8 – 10 nedēļas veci, uzsākot 21 – 30 dienas diētu. Žurkas tika daļēji randomizētas uztura grupām: subjekti tika vērtēti pēc sākotnējā svara, tad katrs secīgais žurku trio tika sadalīts nejauši starp uztura grupām. AL žurkām bija brīva piekļuve žurku govīm tajā pašā laika periodā, kā pāru žurkām uz FR vai OB uztura. Visām žurkām bija brīva piekļuve ūdenim. Pārtikas ierobežojumi tika īstenoti kā iepriekš⁵¹; īsi, žurkas saņēma 40 – 50% no AL uzņemšanas standarta žurkām, līdz ķermeņa masa tika samazināta par 20%, pēc tam pārtika tika titrēta, lai saglabātu šo svaru. OB žurkām bija brīva piekļuve žurkām un šokolādei. Nodrošiniet, ka tas ir ļoti garšīgs šķidrums ar vidēji augstu tauku un cukura saturu⁵².

Forebrain ChAT knockout pelēm

Peles ar nosacītu peldējušu alēli ChAT (ChAT^flox) šķērsoja a Nkx2.1^Cre transgēnas līnijas, lai iegūtu peles, kurās ACh sintēzes ablācija ir ierobežota ar priekšdziedzeri³². Nav mutantu transgenisku pakaišu biedri bija kontroles; viņu genotipi Cre⁺;ChAT^{flox / +} un Cre^-;ChAT^{flox / flox} tiek saukti par “heterozigotiem”. Pieaugušo tēviņu pelēm, kas tika izmantotas šķēles pētījumos, bija ad libitum piekļuve chow un ūdenim.

Ex vivo šķēles sagatavošana un fizioloģiskie risinājumi

Žurkas vai peles tika dziļi anestezētas ar 50 mg kg^-1 pentobarbitāls (intraperitoneāls (ip)) un atdalīts. Voltammetrijai koronālās priekšgala šķēles (300 – 400-μm biezums) tika izgrieztas uz Leica VT1200S vibrējošā asmens mikrotoma (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) ledus aukstā HEPES buferētā mākslīgā CSF (aCSF), kas satur (mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glikoze (10); HEPES skābe (6.7); KCl (5); HEPES nātrija sāls (3.3); CaCl₂ (2); un MgSO₄ (2), līdzsvarots ar 95% O₂/ 5% CO₂. Pēc tam šajā šķīdumā 1 h temperatūrā pirms eksperimentiem tika saglabātas šķēles^{30, 32, 53}. Elektrofizioloģijai pēc anestēzijas žurkas tika perfūzētas transkardiāli ar ledus aukstu šķīdumu, kas satur (mM): saharozi (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glikoze (7); askorbāts (1); un piruvāts (3) un līdzsvarots ar 95% O₂/ 5% CO₂. Šajā šķīdumā šķēles tika sagrieztas, pēc tam pārvietotas uz reģenerācijas kameru modificētā aCSF, kas satur (mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glikoze (25); askorbāts (1); piruvāts (3); un myo-inositols (4), līdzsvarots ar 95% O₂/ 5% CO₂; šis šķīdums sākotnēji bija 34 ° C, pēc tam pakāpeniski atdzisis līdz istabas temperatūrai⁵⁴. Visi voltammetriskie un fizioloģiskie eksperimenti tika veikti iegremdēšanas kamerā pie 32 ° C, kas bija superfuse pie 1.5 ml min.^-1 ar aCSF, kas satur (mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); glikoze (10) un liellopu seruma albumīns (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml^-1) līdzsvarots ar 95% O₂/ 5% CO₂; šķēlītēm tika atļauts šajā vidē līdzsvarot 30 min pirms eksperimentiem.

Ātra skenēšana cikliskā voltammetrija

Pētītie DA izdalīšanās pētījumi tika veikti, izmantojot FCV smadzeņu šķēlītēs^{32, 53} sagatavoti no vīriešu dzimuma žurkām vai. \ t ChAT priekšgala knockout pelēm un heterozigota kontrolēm (5 – 8 nedēļas). Pētījumi ChAT knockout pelēm tika akls, bet žurku uztura grupām bija acīmredzami fenotipi, kas nepieļāva aklošanos. Voltammetriskie mērījumi tika veikti ar Millar Voltammeter (pieejams pēc īpaša pieprasījuma Dr. Julian Miller St Bartholomew's un Londonas Universitātes Karaliskajā medicīnas un zobārstniecības skolā). FCV izmantoja parasto trijstūra viļņu formu, ar skenēšanas diapazonu –0.7 līdz + 1.3 V (pret Ag / AgCl), skenēšanas ātrumu 800 V s^-1un 100 ms paraugu ņemšanas intervāls^{30, 32, 53}. Dati tika iegūti, izmantojot DigiData 1200B A / D paneli, ko kontrolēja Clampex 7.0 programmatūra (Molecular Devices). DA izdalīšanās tika izraisīta, izmantojot koncentrisku stimulējošu elektrodu; stimulēšanas pulsa amplitūda bija 0.4 – 0.6 mA un ilgums bija 100 μs^{30, 32, 53}. NAc kodolā un CPu tika izmantota lokāla viena impulsa stimulācija; tomēr, lai pastiprinātu radīto, tika izmantots īss augstfrekvences impulsu vilciens (pieci impulsi pie 100 Hz) [DA]_o NAc apvalkā. Abi stimulu paradigmas izraisa DA izdalīšanos, kas ir darbības potenciāls un Ca²⁺ atkarīgs, neietekmējot vienlaicīgi atbrīvoto glutamātu un GABA^{42, 55}, un to veicina vienlaicīgi atbrīvota ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Lai noteiktu izmērīto summu [DA]_oelektrodi tika kalibrēti ar zināmām DA koncentrācijām 32 ° C temperatūrā pēc katra eksperimenta ar aCSF un katras zāles, ko lietoja noteiktā eksperimentā⁵³.

Voltammetrijas eksperimenti, lai novērtētu insulīna iedarbību uz dzemdībām [DA]_o tika iegūti, izmantojot kādu no diviem protokoliem. Sākotnējie eksperimenti, lai noteiktu insulīna (Sigma, I5523) iedarbības laika gaitu, tika veikti, veicot monitoringu [DA]_o katru 5 min vienā vietā. Pēc konsekventas izsaukšanas tika izmantots insulīns [DA]_o iegūta (parasti 4 – 5 mērījumi); insulīna iedarbība bija maksimāla pēc 50 – 60 min, un pēc tam tika izraisīta [DA]_o saglabājās šajā līmenī eksperimenta laikā (parasti 90 min kopējā insulīna iedarbība; 1c). Pēc tam insulīna iedarbība tika novērtēta, veicot ierakstu [DA]_o 4 – 5 diskrētās vietās šķēlītēs (+ 1.5 mm no bregmas) katrā no trijiem striatāla apakšreģioniem kontroles apstākļos (aCSF vai aCSF plus zāles) un atkal maksimālā insulīna efekta laikā (paraugu ņemšana 60 – 80 min), tad šie paraugi tika aprēķināti katram apakšreģionam. Insulīna iedarbība laika gaitā samazinājās pēc šķēles sagatavošanas; lai samazinātu laiku ex vivo un, lai optimizētu dzīvnieku lietošanu, parasti vienā ieraksta kamerā testēja divus no attiecīgā dzīvnieka šķēles. Narkotikas, ko lieto insulīna iedarbības apstrīdēšanai, tika ievadītas 15 min pirms insulīna, izmantojot aCSF, ieskaitot HNMPA trisacetoksimetilesteri (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), pikropodofilotoksīns (PPP; Tocris), mekamilamīns (Tocris) un DHβE (Tocris). Kā aprakstīts rezultātos, iespējams pārbaudīt nikotīno ACh receptoru iespējamo mainīgo jutību starp uztura grupām, salīdzinot pīķa attiecību [DA]_o ko izraisa 5 p (100 Hz) ar 1 p izraisīto (5 p: 1 p attiecība)^{30, 31} NAc kodolā 0 – 500 nM nikotīna (Sigma) klātbūtnē.

Noteikšana V _maks no dzemdībām [DA]_o pārejas striatāla šķēlītēs

Lai novērtētu insulīna izraisītās izmaiņas DAT-mediētā DA uzņemšanā, krītošās fāzes sākuma daļa [DA]_o Lai iegūtu ekstraktu, Michaelis – Menten vienādojumam tika piestiprinātas līknes V_maks (maksimālā uzņemšanas ātruma konstante)⁵⁶. K_m (kas ir apgriezti saistīts ar DAT afinitāti DA) tika fiksēts pie 0.2 μM un ir zināms, ka tas ir līdzīgs visos striatāla apakšreģionos⁵⁷ insulīnu (sk 4 parakstu).

Visu šūnu ierakstīšana

Smadzeņu šķēlītes tika pagatavotas no 29-35 dienas veciem vīriešu kārtas žurkām; ierakstīšanas apstākļi bija identiski tiem, ko izmantoja DA atbrīvošanas pētījumos. Visu šūnu strāvas skavas ieraksti izmantoja parastās metodes⁵⁴. Striatāla ChI tika vizualizēti, izmantojot Olympus BX51WI mikroskopu (Olympus America, Center Valley, PA) ar infrasarkano staru diferenciālo kontrastu optiku un × 40 ūdens iegremdēšanas mērķi. Satur pipetes šķīdumu (mM): K-glikonāts (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); un pieskaņots pH 7.2 – 7.3 ar KOH. Ierakstītajiem neironiem, kas jānovērtē attiecībā uz ChAT imunoreaktivitāti, 0.3% biocitīns tika iekļauts pipetes šķīdumā, un neironi tika reģistrēti īsi (~ 5 min), lai samazinātu intracelulārā satura atšķaidīšanu. Pipetes pretestība bija ~ 3 – 5 MΩ. Ieraksti tika iegūti, izmantojot Axopatch 200B pastiprinātāju (Molecular Devices, Sunnyvale CA) un zemas caurlaidības filtru pie 2 kHz. ChI tika identificēti ar noteiktajiem elektrofizioloģiskajiem kritērijiem²⁸; Lielākā daļa to sākotnēji bija toniski aktīva, bet aktivitāte mazinājās pēc plākstera. Tomēr reakcija uz pašreizējo injekciju parasti bija stabila un konsekventa laika gaitā, un tāpēc to izmantoja, lai izpētītu insulīna ietekmi uz ChI uzbudināmību (skatīt rezultātus). Eksperimentos, lai pārbaudītu InsRs un IGF-1R lomu šajā atbildē, vai nu HNMPA, vai PPP tika izmantots vismaz 20 min pirms ChI plāksteris. Maksimālais insulīna efekts parasti tika novērots pēc iedarbības ~ 16 min., Lai gan dažās šūnās palielinājums nebija maksimāls līdz 50 min vai ilgāk. Turklāt četros no sešiem neironiem, kas reģistrēti PPP, insulīns izraisīja sākotnējo smailes skaita samazināšanos pirms atgriešanās pie sākuma smailes numura. Līdz ar to visos eksperimentos insulīna iedarbība tika kvantitatīva, salīdzinot maksimālo efektu uz smailes skaitli ar spaiļu skaitu, kas radās tieši pirms insulīna lietošanas. Šķietamā laika atšķirība maksimālā efekta sasniegšanai varētu atspoguļot vairākus faktorus, tostarp ierakstītās šūnas dziļumu šķēlītē. Tāpat kā insulīna klātbūtnē, salīdzināmos laika punktos ChIs tika reģistrēti arī izsauktie darbības potenciāli.

Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija

DA saturs žurku striatāla šķēlītēs (400-μm biezums) tika noteikts, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju ar elektrochemisku noteikšanu⁵⁸. Šķēles pāri tika līdzsvarota 30 min 32 ° C temperatūrā aCSF, un pēc tam vienu šķēlīti uz pāru inkubēja papildu 60 min 32 ° C aCSF, bet otru inkubēja aCSF ar 10 vai 30 nM insulīnu. Uztura grupu salīdzinājumam tika iegūta striatāla audi starp 30 – 60 min pēc atjaunošanas. Pēc inkubācijas rūpīgi izņemta aCSF pārpalikums, svera striatāla audu paraugu (7 – 10 mg), sasaldēja uz sausā ledus un pēc tam uzglabāja pie -80 ° C. Analīzes dienā paraugi tika apstrādāti ar ledus aukstu, eluentu, dezoksidējot ar argonu⁵⁸, centrifugē mikrocentrifugā 2 min, un supernatants tiek ievadīts tieši HPLC kolonnā (BAS, West Lafayette, IN); detektors bija stiklveida oglekļa elektrods, kas iestatīts pie 0.7 V pret Ag / AgCl.

Imūnhistoķīmija

Imūnhistoķīmiskai marķēšanai žurkas tika anestēzētas ar nātrija pentobarbitālu (50 mg kg^-1, ip), tad perfūziju transcardially ar PBS (154 mM NaCl 10 mM fosfāta buferšķīdumā, pH 7.2), kam seko 4% paraformaldehīds šajā PBS; smadzenes tika noņemtas un koronālās sekcijas (20 μm) tika sagrieztas un apstrādātas tradicionāli^{27, 59}. Imunofluorescences attēlus ieguva ar Nikon PM 800 konfokālo mikroskopu, kas aprīkots ar digitālo kameru, ko kontrolēja Spot programmatūra (Diagnostic Instruments Inc.), un izmantojot x 100 mērķi (skaitliskā apertūra = 1.4) vai ar Zeiss LSM 510 konfokālo mikroskopu, izmantojot × 63 mērķis (skaitliskā apertūra = 1.2). Lāzeri bija Argons (488 nm), He / Ne (543 nm) un He / Ne (633 nm). Konfigurācijas mikroskopu programmatūra izvēlējās katram lāzeram atbilstošus filtrus. Pinhole izmērs mainījās atkarībā no izmantotā mērķa un sadaļas biezuma, kas izvēlēts z-stack paaudze; mēs izvēlējāmies optimālo pinhole vērtību, ko norāda programmatūra (parasti 30 μm). Digitālie faili tika analizēti ar dekonvolācijas programmatūru (AutoQuant Imaging), kur galīgie attēli tika apstrādāti, izmantojot Adobe Photoshop 7.0. Visi attēli tika pielāgoti spilgtumam un kontrastam; šādas korekcijas tika veiktas vienādi visām attēla daļām. Striatāla DA axoni tika identificēti, izmantojot divas TH antivielas: poliklonālo AB152 trušu anti-TH (1: 800) un monoklonālo MAB318 peles anti-TH (1: 500) (abi no Chemicon). Tika izmantotas trīs InsR antivielas: sc-57342 un sc-09 (1: 100; Santa Cruz) un PP5 (dāvana no Pfizer). Katra no tiem ir raksturota iepriekš^{60, 61}, un tika apstiprināts šajos pētījumos, ja nav imūnsarķēšanas ar antivielām sc-57342 vai PP5 atbilstošā bloķējošā peptīda klātbūtnē. ChAT antiviela bija AB144 (1: 200; Millipore), un biotīns bija no Vector (1: 200). Lietotās sekundārās antivielas bija ēzeļu anti-truša Alexa 488 (Invitrogen) vai ēzeļu anti-trušu Cy2 (Džeksona laboratorija, Bar Harbor, ME), ēzeļu anti-kazu Cy3 (Jackson) un ēzeļu anti-peles Cy5 (Jackson).

Lai novērtētu InsRs lokalizāciju TH + asīs, mēs izmantojām iepriekš aprakstītās metodes, lai identificētu Kir6.2, kas ir ATP jutīga K poru veidojoša apakšvienība, klātbūtni.⁺ kanāli DA asīs²⁷. Puncta, kas pārstāv insRs, tika sadalīta pa pielāgotajiem attēliem, norādot, ka virsotne ar TH imūnreaktivitāti zināmā mērā var notikt nejauši. Lai pārbaudītu šo pieņēmumu, mēs aprēķinājām InsR / TH superimpozīcijas 42 neatkarīgajos laukos trijās NAc imūnās iezīmētajās daļās no divām žurkām. Pēc tam InsR digitālie faili tika pagriezti 90 ° pulksteņrādītāja kustības virzienā un skaitļi atkārtoti; rotācija samazināja InsR puncta skaitu, kas lielākajā daļā laukumu bija lokalizēts ar TH (skatīt rezultātus). Samazinājums virsotņu skaitu ar rotāciju²⁷ norādīja InsR punkcijas proporciju katrā striatāla laukā, kas saistīts ar DA axoniem.

Glikozes līmenis asinīs un insulīna ELISA

Trauku asinis tika savāktas laikā, kad tika atdalītas šķēles. Glikozes līmeni asinīs noteica nekavējoties, izmantojot standarta glikozes līmeni asinīs. Insulīnam papildu asinis tika savāktas EDTA saturošajās mēģenēs un centrifugētas 1,500g 15 min; supernatantu (plazmu) savāca un uzglabāja pie –80 ° C līdz apstrādei ar ALPCO žurku insulīna ELISA komplektu.

Cannula izvietojums un histoloģiskā pārbaude

Četrdesmit pieaugušie vīrieši Sprague – Dawley žurkas (Taconic un Charles River), kas sākotnēji sver 350 – 425 g, tika anestēti ar ketamīnu (100 mg kg^-1, ip) un ksilazīnu (10 mg kg^-1, ip) un stereotaksiski implantēti ar divām hroniski iemontētām vadlīnijām (26 gabarīts), kas novietotas divpusēji 2.0 mm dorsālā infūzijas vietām NAc vidējā apvalkā.⁶² (1.6 mm priekšpusē bregmai; 2.1 mm sānu virzienā ar sagittālo šuvju, uzgaļi leņķi 8 ° pret viduslīniju, 5.8 mm ventrāla līdz galvaskausa virsmai). Žurkām tika ievadīts banamīns (2.0 mg kg^-1, subkutāni) kā pēcoperācijas pretsāpju līdzeklis pēc atveseļošanās no anestēzijas un pēc rīta. Vienu nedēļu pēc operācijas žurkas tika ievietotas FR (aprakstīts iepriekš) un saglabātas 80% apmērā pēc to pēcoperācijas atjaunošanās svara atlikušajai pētījuma daļai. Cannula izvietojums tika noteikts histoloģiski pēc uzvedības testēšanas pabeigšanas. Katrs žurks tika nogalināts ar CO₂, galvas nogrieza un smadzenes izņēma un fiksēja 10% buferētā formalīnā uz> 48 h. Saldētas koronālās sekcijas (40 μm biezas) sagrieztas uz Reichert-Jung kriostata, atkusnis uzstādīts uz stikla slaidiem, kas pārklāti ar želatīnu, un iekrāsoti ar krezilvioletu. Dati no konkrētas žurkas tika izmantoti tikai tad, ja abas kanulas atradās vidējā NAc apvalkā⁶² (ieskaitot korpusu / serdi vai čaumalu / ožas tuberkulozes robežu) (\ t5); pamatojoties uz šiem kritērijiem, no galīgās analīzes tika izslēgtas divas žurkas.

Aromatizētāju priekšnosacījumi pirms iedarbības

Žurkas saņēma vienu nakti (mājas būrī) un sešas 30-min-per dienas pirmsekspozīcijas (testēšanas kamerās) 0.2% nātrija saharīna (Sigma) ūdenī ar 48-h intervālu starp sesijām. Pēc tam žurkas saņēma divas 5-min-per diennakts sesijas ar 0.2% nātrija saharīna iedarbību 0.05% nesaldinātā vīnogu vai ķiršu Kool-Aid (Kraft Foods) ūdenī. Pirmajai Kool-Aid pirmsekspozīcijas sesijai puse no žurkām saņēma ķiršu aromātu un otru pusi saņēma vīnogu aromātu. Otrās Kool-Aid pirmsekspozīcijas sesijas laikā garšas tika atceltas, lai nodrošinātu, ka visas žurkas tiek ņemtas no katra garšas. Ieplūde tika mērīta visām pirmsekspozīcijas sesijām. Testēšanas kameras bija caurspīdīgi plastmasas būri ar svaigiem pakaišiem. Visām pirmsekspozīcijas sesijām žurkām bija pieejams viens un tas pats šķīdums abās kameras pusēs. Izņemot diennakts pirmsekspozīcijas sesiju, visas sesijas tika veiktas uzvedības procedūras telpā ar 30 min.

Viena pudele kondicionēšana

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka InsAb mikroinjekcija ventromediju hipotalāmā var bloķēt insulīna ietekmi uz barošanas uzvedību un glikagona sekrēciju.^{63, 64}. Šeit mēs izmantojām šo pieeju, lai novērtētu insulīna iespējamo lomu pārtikas izvēles stiprināšanā. Žurkas tika daļēji randomizētas, pamatojoties uz vidējo pirmsekspozīcijas uzņemšanas tilpumu divās grupās, kontroles vai eksperimentālās (InsAb). Kontroles grupā žurkas saņēma transportlīdzekli (mikroinjekcija PBS; 137 mM NaCl un 2.7 mM KCl 10 mM fosfāta buferī) vai IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 PBS, kā saņemts), mikroinjekcija NAc apvalkā pirms viena no diviem aromatizētajiem šķīdumiem, un izspēles mikroinjekcija pirms cita aromatizētā šķīduma patērēšanas. Eksperimentālajā grupā žurkas saņēma NAA apvalka mikroinjekciju no InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl^-1 PBS, kā saņemts) pirms saskares ar vienu aromatizētu šķīdumu un izspiediet mikroinjekcijas iepriekšēju iedarbību uz otru. Tika izmantoti divi priekšmetu komplekti, kas mainās starp šķidruma mikroinjekciju un izspēles mikroinjekciju, lai kopējais mikroinjekciju skaits būtu ierobežots līdz četriem, tādējādi samazinot iespējamo audu bojājumu un jutības zudumu mikroinjekcijas vietā.⁶⁵. Šķidruma mikroinjicēšanai kontroles šķīdums vai InsAb tika ievietots divos 30 cm garos PE-50 caurulītēs, kas vienā galā pievienoti 5 μl Hamilton šļircēm, kas piepildītas ar destilētu ūdeni un otrā galā ar 31 gabarīta injektoru kanāliem, kas pagarināja 2.0 mm ārpus implantētajām vadotnēm. 0.5 μl infūzijas tilpumi tika piegādāti ar 90 s ar ātrumu 0.005 μl s^-1; inžektors tika atstāts vietā, lai 60 s ļautu laiku difūzijai, tad inžektors tika nomainīts ar stilu.

Žurkas tika pārvietotas tieši uz uzvedības kamerām 2 min laikā pēc mikroinjekcijas vai izspēles mikroinjekcijas pabeigšanas. Kondicionēšanas šķīdumi satur 0.2% nātrija saharīnu, 0.05% nesaldinātu vīnogu vai ķiršu Kool-Aid un 0.8% glikozi. Piekļuve risinājumam bija ierobežota līdz 30 min sesijas laikā. Pārī aromāts un kameras puse ar dzeršanas piekļuvi bija daļēji nejauši izvēlēti un līdzsvaroti katrā grupā. Starp mikroinjekciju intervāls bija vismaz 72 h, mainoties starp infūzijas un izspēles sesijām kopumā astoņām kondicionēšanas sesijām.

Divas pudeles preferenču tests

Četrdesmit astoņas stundas pēc pēdējās kondicionēšanas sesijas žurkas tika ievietotas testēšanas kamerās ar vienlaicīgu piekļuvi abām kondicionēšanas garšām; šķīdumi bija 0.2% nātrija saharīns 0.05% vīnogu vai ķiršu Kool-Aid, bez glikozes. Testēšana notika 2 dienās (60 min dienā). Dzērienu caurules, kas satur mock-pair vai infūzijas pārī šķīdumu, stāvoklis tika mainīts, lai nodrošinātu, ka katrs žurkas tika pārbaudīts katra šķīduma patēriņam abās sprosta pusēs. Katra aromatizētā šķīduma uzņemšana tika aprēķināta abās testa dienās, lai noteiktu preferences.

[³H] DA uzņemšana striatāla sinaptosomās, lai novērtētu InsAb efektivitāti

Striatāla sinaptosomas^{21, 66} tika sagatavoti no AL žurkām (vīrieši, 350-400 g), ar NAc (čaumalu un serdi) un CPu sadalīti un sagatavoti atsevišķi. Audi no katra reģiona tika homogenizēti 15 tilpumos ledus aukstā 0.32 M saharozes šķīdumā stikla homogenizatorā ar motoru darbinātu Teflona pistoli; pēc skalošanas un centrifugēšanas gala granulu atkārtoti suspendēja ledus aukstā 0.32 M saharozē.^{21, 66}. Pirms [³H] DA uzņemšanas tests⁶⁶, sinaptosomālo alikvotu kopējais daudzums 180 μl uzņemšanas buferšķīduma tika inkubēts kratītājā 15 min 30 ° C temperatūrā 30 nM insulīna klātbūtnē vai bez tā, transportlīdzeklī (PBS) vai InsAb (galīgais atšķaidījums 1: 500) , IgG (galīgais atšķaidījums 1: 500) vai transportlīdzeklī. Iekļauts buferšķīdums (mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glikoze (10), CaCl₂ (1); nialamīds (0.01); tropolons (0.1); un askorbīnskābe (0.001), pH 7.4. [³H] DA tika uzsākts, ātri izdalot 20 μl katra sinaptosomālā suspensijas 96 iedobes plāksnēs ar dažādām DA koncentrācijām (0.003 – 1.0 μM) un [³H] DA (5 nM); pēc 5 min plāksnes kratītājā pie 25 ° C, uzņemšanu pārtrauca ar aukstu, ātru vakuuma filtrāciju⁶⁶. Skaitļi uz iedobumu tika pārvērsti par pmoliem, pēc tam koriģēti uz kopējo olbaltumvielu daudzumu minūtē. Visi testi tika veikti trīs reizes un atkārtoti vismaz četras reizes; V_maks un K_m tika aprēķināti, izmantojot Biosoft Kell Radlig programmatūru (Cambridge, UK).

Statistiskā analīze

Dati tiek doti kā vidēji ± sem; nozīmīgums tika novērtēts, izmantojot pārī vai nepārstāvētus studentus t-testi vai ANOVA, ja nav norādīts citādi. Voltammetrijas datiem, n ir ierakstīšanas vietu skaits, ņemot vērā to, ka mainīgā vietne no vietas uz vietas striatāla apakšreģionā ir lielāka nekā atšķirība starp dzīvniekiem vai atšķirībām starp šķēlītēm^{30, 32, 55, 56}; katram datu kopumam ir norādīts dzīvnieku skaits. EK₅₀ par insulīna un nikotīna iedarbību uz pīķa iznākumu [DA]_o tika aprēķināts, izmantojot Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Elektrofizioloģiskajiem datiem statistiskā nozīmība tika novērtēta, izmantojot pārī tvai Wilcoxon tests Prism 6.0, vai jaukta divvirzienu ANOVA SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Lai novērtētu insulīna iesaistīšanos aromāta preferenču kondicionēšanā, tika pabeigti divi pilni pētījumi, izmantojot protokolus, kas bija identiski, izņemot izmantoto transportlīdzekļu ārstēšanu. Pirmajā pētījumā 10 žurkām tika ievadītas PBS infūzijas un 9 saņēma InsAB infūzijas. Otrajā pētījumā 10 žurkas saņēma transportlīdzekļa infūzijas ar IgG un 10 saņēma InsAb infūzijas. Infūzijas kondicionēšanas sesiju laikā nebija būtiskas atšķirības starp divām transportlīdzekļu grupām (PBS vai IgG).F₁₉= 0.619, jaukts divvirzienu ANOVA) ar atkārtotiem pasākumiem infūzijas kondicionēšanas sesijā) vai testā (F₁₉= 0.012, divvirzienu jaukts ANOVA ar atkārtotiem garšas mērījumiem. Līdz ar to abi eksperimenti tika analizēti. Šai analīzei tika izmantota 2 × 4 jaukta ANOVA (ar atkārtotiem pasākumiem infūzijas kondicionēšanas dienā), lai noteiktu mikroinjekcijas apstrādes ietekmi kondicionēšanas laikā, kam sekoja aizsargāts t-tests (viens gals, lai noteiktu, kurā kondicionēšanas sesijā mikroinjekcijas ārstēšana samazināja uzņemšanas apjomu). Tāda pati analīze tika pabeigta attiecībā uz mock kondicionēšanas sesijām. Lai noteiktu kondicionēšanas terapijas efektu divu pudeļu aromāta preferences testā, datus analizēja, izmantojot jauktu divvirzienu ANOVA (ar atkārtotiem aromāta pasākumiem), kam sekoja aizsargāts t-tests (viens gals, lai pārbaudītu hipotēzi, ka InsAb samazinātu izvēli).

Kā minēt šo rakstu: Stouffer, MA un citi. Insulīns uzlabo striatāla dopamīna izdalīšanos, aktivizējot holīnergiskos interneuronus un tādējādi norādot atlīdzību. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Insulīna receptori un insulīna darbība smadzenēs: pārskats un klīniskā ietekme. Neirosci. Biobehav. Rev. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Raksts
   • Rādīt kontekstu
2. Gerozissis, K. Smadzeņu insulīns, enerģijas un glikozes homeostāze; gēni, vide un vielmaiņas patoloģijas. Eiro. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Raksts
6. Rādīt kontekstu
7. CAS
8. PubMed
9. Raksts
10. Rādīt kontekstu
11. CAS
12. PubMed
13. Raksts
14. Rādīt kontekstu
15. CAS
16. PubMed
17. Raksts
18. Rādīt kontekstu
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Raksts
23. Rādīt kontekstu
24. ISI
25. PubMed
26. Raksts
27. Rādīt kontekstu
28. CAS
29. PubMed
30. Raksts
31. Rādīt kontekstu
32. Rādīt kontekstu
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Raksts
37. Rādīt kontekstu
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Raksts
42. Rādīt kontekstu
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Rādīt kontekstu
47. ISI
48. PubMed
49. Raksts
50. Rādīt kontekstu
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Raksts
55. Rādīt kontekstu
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Raksts
60. Rādīt kontekstu
61. Rādīt kontekstu
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Raksts
66. Rādīt kontekstu
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Raksts
71. Rādīt kontekstu
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Raksts
76. Rādīt kontekstu
77. PubMed
78. Raksts
79. Rādīt kontekstu
80. Rādīt kontekstu
81. CAS
82. PubMed
83. Raksts
84. Rādīt kontekstu
85. ISI
86. PubMed
87. Raksts
88. Rādīt kontekstu
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Raksts
93. Rādīt kontekstu
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Raksts
98. Rādīt kontekstu
99. CAS
100. PubMed
101. Raksts
102. Rādīt kontekstu
103. Rādīt kontekstu
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Raksts
108. Rādīt kontekstu
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Raksts
113. Rādīt kontekstu
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Raksts
118. Rādīt kontekstu
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Raksts
123. Rādīt kontekstu
124. PubMed
125. Raksts
126. Rādīt kontekstu
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Raksts
131. Rādīt kontekstu
132. CAS
133. PubMed
134. Raksts
135. Rādīt kontekstu
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Raksts
140. Rādīt kontekstu
141. CAS
142. PubMed
143. Raksts
144. Rādīt kontekstu
145. ISI
146. PubMed
147. Raksts
148. Rādīt kontekstu
149. Rādīt kontekstu
150. Rādīt kontekstu
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Raksts
155. Rādīt kontekstu
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Raksts
160. Rādīt kontekstu
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Raksts
165. Rādīt kontekstu
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Raksts
170. Rādīt kontekstu
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Rādīt kontekstu
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Raksts
179. Rādīt kontekstu
180. PubMed
181. Raksts
182. Rādīt kontekstu
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Raksts
187. Rādīt kontekstu
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Raksts
192. Rādīt kontekstu
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Raksts
197. Rādīt kontekstu
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Raksts
202. Rādīt kontekstu
203. Rādīt kontekstu
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Rādīt kontekstu
208. Rādīt kontekstu
209. Rādīt kontekstu
210. Rādīt kontekstu
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Raksts
215. Rādīt kontekstu
216. CAS
217. PubMed
218. Raksts
219. Rādīt kontekstu
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Rādīt kontekstu
224. Rādīt kontekstu
225. CAS
226. PubMed
227. Raksts
228. Rādīt kontekstu
229. ISI
230. PubMed
231. Raksts
232. Rādīt kontekstu
233. Rādīt kontekstu
234. ISI
235. PubMed
236. Raksts
237. Rādīt kontekstu
238. Rādīt kontekstu
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Raksts
243. Rādīt kontekstu
244. Rādīt kontekstu
245. Vogt, MC & Bruning, JC CNS insulīna signalizācija enerģijas homeostāzes un glikozes metabolisma kontrolē - no embrija līdz vecumam. Tendences Endokrinols. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Insulīna identifikācija žurku smadzenēs. Proc. Natl akad. Sci. ASV 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Ar receptoru starpniecību transportēts insulīns pāri endotēlija šūnām. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC insulīna reakcijas un glikozes līmenis plazmā un cerebrospinālajā šķidrumā žurku badošanās un barošanas laikā žurkām. Physiol. Uzvedība 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Asins-smadzeņu barjeras diferenciālā caurlaidība diviem aizkuņģa dziedzera peptīdiem: insulīnam un amilīnam. Peptīdi 19, 883–889 (1998).
250. Bankas, WA Smadzeņu insulīna avots. Eiro. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Nemoto, T. un citi. Jauni ieskati par insulīna sintēzi un tās sekrēciju žurku hipokampā un smadzeņu garozā: amiloid-β1-42 izraisīta proinsulīna līmeņa samazināšanās, izmantojot glikogēna sintāzes kināzi-3β. Šūnu signāls. 26, 253 – 259 (2014).
252. De Souza, CT un citi. Ar taukiem bagātas diētas patēriņš aktivizē aizdegšanās reakciju un izraisa insulīna rezistenci hipotalāmā. Endokrinoloģija 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. un citi. Insulīna izraisīto reakciju mazināšana smadzeņu tīklos, kas kontrolē apetīti un atlīdzību insulīna rezistenci: smadzeņu pamats traucējumu kontrolei pārtikas uzņemšanā metaboliskajā sindromā? Diabēts 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kellija, AE un Berridža, KC Dabisko ieguvumu neirozinātne: nozīme atkarību izraisošām zālēm. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND atkarības neiroprodukti. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA un citi. Insulīna receptoru lokalizācija un raksturojums žurku smadzenēs un hipofīzē, izmantojot in vitro autoradiogrāfija un datorizēta densitometrija. Endokrinoloģija 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Insulīna un leptīna receptoru ekspresija žurku ventrālajā tegmentālajā zonā / substantia nigra (VTA / SN). Brain Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC un citi. Insulīna signalizācija un atkarība. Neirofarmakoloģija 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Enerģijas regulēšanas signāli un atlīdzība par pārtiku. Pharmacol. Bioķīmija. Uzvedība 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA un citi. Pārtikas trūkums samazina žurka dopamīna transportera mRNS un aktivitāti. Neuroendokrinoloģija 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. un citi. PI 3-kināzes regulēšana dopamīna uzņemšanai. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Williams, JM un citi. Hipinsinēmija regulē amfetamīna izraisīto dopamīna reverso transportēšanu. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Hronisks pārtikas ierobežojums un dopamīna pārvadātāja funkcija žurku striatumā. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN un citi. Insulīns modulē kokaīna jutīgu monoamīna transportera funkciju un impulsīvo uzvedību. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulīns ventral tegmental zonā samazina hedonisko barošanos un nomāc dopamīna koncentrāciju, palielinot atpakaļsaistes daudzumu. Eiro. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. un citi. Insulīns izraisa ventrālās tegmentālās zonas dopamīna neironu ilgstošu depresiju caur endokannabinoīdiem. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC un citi. Insulīna signalizācijas loma katecholamīnerģiskajos neironos enerģijas homeostāzes kontrolē. Šūnu metabs. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulīns darbojas dažādās CNS vietās, lai samazinātu akūtu saharozes uzņemšanu un saharozes pašpārvaldi žurkām. Am. J. Physiol. Regul. Integrēt. Sal. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Striatāla dopamīna izdalīšanās sekundārā regulēšana ar pre-sinaptisko K_ATP kanāliem. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Neostriatal interneuronu funkcionālā daudzveidība un specifika. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
271. Džou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogēnā nikotīniskā holīnerģiskā aktivitāte regulē dopamīna izdalīšanos striatumā. Nat. Neirosci. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rīsi, ME un Krags, SJ Nikotīns pastiprina ar atlīdzību saistītos dopamīna signālus striatumā. Nat. Neirosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. No frekvences atkarīga dopamīna izdalīšanās modulācija ar nikotīnu. Nat. Neirosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Pretstatā striatālā dopamīna izdalīšanās regulēšanai un izpētes motora uzvedībai ar priekšējo smadzeņu un smadzeņu stumbra holīnerģiskām ieejām. Nat. Komun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. un citi. Striatāla dopamīna izdalīšanos izraisa sinhrona aktivitāte holīnerģiskajos interneuronos. Neurons 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. un citi. Kolinergisko interneuronu selektīvā aktivizēšana uzlabo fāzisko dopamīna izdalīšanos: nosaka signālu atlīdzības apstrādei. Šūnu rep. 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Nikotīniskā acetilholīna receptora beta2 apakšvienības imūnreaktivitātes presinaptiska lokalizācija žurku nigrostriatal dopamīnerģiskajos neironos. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ un citi. Cholinergic interneurons mediē ātru VGluT3 atkarīgo glutamatergisko transmisiju striatumā. PLOS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. D1-vitamīnam līdzīgu receptoru aktivācija nucleus accumbens ir kritiska žurkām ar barības vielām saistītu aromātu izvēles iegūšanai, bet ne izpausmei. Eiro. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine un iemācījušies ēdiena izvēli. Physiol. Uzvedība 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Centrālā insulīna signalizāciju vājina ilgstoša insulīna iedarbība, izmantojot insulīna receptora substrāta-1 serīna fosforilāciju, proteasomu degradāciju un lizosomu insulīna receptoru degradāciju. Endokrinoloģija 151, 75–84 (2010).
282. Rīsi, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopamīna izdalīšanās bazālajās ganglijās. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smits, Y., Surmeiers, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic ieguldījums ar bazālo gangliju saistītajā uzvedības pārslēgšanā un pastiprināšanā. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. un citi. Striatāla muskarīna receptori veicina dopamīna pārneses atkarību no atšķirīgiem receptoru apakštipiem uz holīnerģiskiem interneuroniem vēdera dobumā pret muguras striatumu. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens dopamīna-acetilholīna līdzsvars pieejā un izvairīšanās. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Ierobežota ēšana ar svara zudumu selektīvi samazina ārpusšūnu dopamīnu accumbens kodolā un maina dopamīna reakciju uz amfetamīnu, morfīnu un pārtikas devu. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Geigers, BM un citi. Mesolimbiskā dopamīna neirotransmisijas trūkumi žurku uztura aptaukošanās gadījumā. Neirozinātne 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK un citi. Insulīna rezistence pasliktina nigrostriatāla dopamīna funkciju. Exp. Neurols. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE un citi. Pārtikas atlīdzība bez garšas receptoru signalizācijas. Neurons 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Saikne starp aptaukošanos un neasu striatālu reakciju uz pārtiku tiek regulēta ar TaqIA A1 alēli. Science 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ un citi. Smadzeņu dopamīns un aptaukošanās. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
292. Džonsons, PM un Kenijs, PJ Dopamīna D2 receptori atkarībai līdzīgā atlīdzības disfunkcijā un piespiedu ēšana aptaukošanās žurkām. Nat. Neirosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Tiešo dopamīna receptoru agonistu atalgojošo un kustību aktivējošo iedarbību pastiprina hroniska barības ierobežošana žurkām. Psihofarmakoloģija (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Atšķirīgu ķermeņa svara noteikto punktu aizstāvēšana aptaukošanās un izturīgām žurkām ar uzturu. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Aksonālās un somatodendritiskās dopamīna izdalīšanās monitorings, izmantojot ātrās skenēšanas ciklisko voltammetriju smadzeņu šķēlēs. Metodes Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Pamatnes nigra pars reticulata GAB regulēšana ar H neironu aktivitāti₂O₂ caur flufenamīnskābes jutīgiem kanāliem un K_ATP kanāliem. Priekšpuse. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Ierobežota somatodendritiskā dopamīna izdalīšanās regulēšana ar spriegumam jutīgu Ca²⁺ kanāli, kas kontrastē ar spēcīgu axon dopamīna izdalīšanos. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. un citi. Pastiprināta striatāla dopamīna transmisija un motora veiktspēja ar LRRK2 pārmērīgu ekspresiju pelēm tiek izvadīta ar ģimenes Parkinsona slimības mutāciju G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Atbrīvošanās un uzņemšanas parametru noteikšana no elektriski izraisītās dopamīna dinamikas, ko mēra ar reālā laika voltammetriju. J. Neurosci. Metodes 112, 119–133 (2001).
300. Čens, BT, Avšalumovs, MV un Rīsi, ME H₂O₂ ir jauns, sinogēnās dopamīna atbrīvošanās endogēns modulators. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Olbaltumvielu, kas saistītas ar dopamīna izdalīšanos no nigrālo dopamīnerģisko neironu somatodendritiskā nodalījuma, imūncioķīmiska identifikācija. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. un citi. Insulīna receptors žurku perifērajā nervā: tā atrašanās vieta un alternatīvi splicētas izoformas. Diabēts Metab. Res. 16, 354 – 363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. un citi. Insulīns izraisa hipertermiju, tieši nomācot siltu jutīgu neironu. Diabēts 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. Žurku smadzenes stereotaksiskajās koordinātās 6. edn akadēmiskais (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Palielināta barošana, reaģējot uz insulīna antivielu divpusēju injicēšanu VMH. Fiziols Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA un citi. Insulīna ietekme ventromediju hipotalāmā uz aizkuņģa dziedzera glikagona sekrēciju in vivo. Diabēts 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Zāļu atlīdzības mehānismu lokalizācija ar intrakraniālām injekcijām. Synapse 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Mijiedarbība starp 4- (2-benzhidriloksi-etil) -1- (4-fluorbenzil) piperidīna un aspartāta 68 hidroksipiperidīna analogu in cilvēka dopamīna pārvadātājs. Eiro. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Lejupielādēt atsauces

Šos pētījumus atbalstīja NIH dotācijas DA033811 (MER, KDC un MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) un NARSAD neatkarīgā pētnieka balva (KDC). S961 bija dāsna dāvana no Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. PP5 antiviela bija dāsna dāvana no Pfizer. Mēs pateicamies Dr. Charles Nicholson, NYU Medicīnas skolai, par programmatūras ieguvi V_maks vērtības no FCV datiem.