PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
വേര്പെട്ടുനില്ക്കുന്ന
ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ കൊക്കെയ്ൻ-വ്യതിയാനങ്ങൾ ന്യൂറോണൽ മോർഫോളജിയിലും സ്വഭാവത്തിലും മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തുന്നു, അത് കൊക്കെയ്ൻ ആസക്തിക്ക് കാരണമാകാം. കൊക്കെയ്ൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സ്ട്രക്ചറൽ, ബിഹേവിയറൽ പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയിൽ ഹിസ്റ്റോൺ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ലൈസിൻ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് (എച്ച്എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്എക്സ്എം‌എൻ‌എം‌എക്സ്) ഡൈമെഥിലൈസേഷനും ലൈസിൻ ഡൈമെഥൈൽട്രാൻസ്ഫെറസ് ജിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയ്ക്കും ഒരു പ്രധാന പങ്ക് ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷൻ ന്യൂക്ലിയസ് അക്കുമ്പെൻസിലെ ആഗോളതലത്തിലുള്ള H3K9 ഡൈമെഥിലൈസേഷൻ കുറച്ചു. ടിഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ അടിച്ചമർത്തലിലൂടെ ഹിസ്റ്റോൺ മെത്തിലൈലേഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിന് മധ്യസ്ഥത വഹിച്ചു, ഇത് കൊക്കെയ്ൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ Δ ഫോസ്ബി നിയന്ത്രിച്ചു. സോപാധികമായ മ്യൂട്ടജെനിസിസും വൈറൽ-മെഡിറ്റേറ്റഡ് ജീൻ ട്രാൻസ്ഫറും ഉപയോഗിച്ച്, ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സാ തരംതാഴ്ത്തൽ ന്യൂക്ലിയസ് അക്യുമ്പൻസ് ന്യൂറോണുകളുടെ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയും കൊക്കെയ്നിനുള്ള മുൻ‌ഗണനയും വർദ്ധിപ്പിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതുവഴി കൊക്കെയിന്റെ ദീർഘകാല പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ ഹിസ്റ്റോൺ മെത്തിലൈലേഷന് ഒരു നിർണായക പങ്ക് സ്ഥാപിച്ചു.
അവതാരിക
തലച്ചോറിന്റെ റിവാർഡ് സർക്യൂട്രിയുടെ പ്രധാന ഘടകമായ ന്യൂക്ലിയസ് അക്കുമ്പെൻസിലെ (എൻഎസി) ഉള്ളിലെ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ സ്ഥിരമായ മാറ്റങ്ങളും ന്യൂറോണൽ മോർഫോളജിയും ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ എക്സ്പോഷറിന്റെ സവിശേഷതയാണ് (1-2). കൊക്കെയ്ൻ ആസക്തിയുടെ വശങ്ങൾക്ക് അടിവരയിടുന്ന ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ അസാധാരണമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ മാറ്റങ്ങളിൽ ക്രോമാറ്റിൻ പുനർ‌നിർമ്മാണം പ്രധാനമാണ്. (3-9). എൻഎസിയിലെ ക്രോമാറ്റിൻ ഘടനയുടെ കൊക്കെയ്ൻ നിയന്ത്രണം, ഭാഗികമായി, ക്രോമാറ്റിൻ എൻസൈമാറ്റിക് മെഷിനറികളുടെ നേരിട്ടുള്ള കൊക്കെയ്ൻ-പരിഷ്ക്കരണങ്ങളിൽ നിന്ന്, ഹിസ്റ്റോൺ അസറ്റിലൈസേഷനിലും ഫോസ്ഫോറിലേഷനിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുന്നു (4, 7-9); എന്നിരുന്നാലും, ഹിസ്റ്റോൺ മെത്തിലൈലേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്ന എൻസൈമുകളുടെ പങ്ക് ഇതുവരെ അന്വേഷിച്ചിട്ടില്ല.
മൈക്രോറേകളിലേക്ക് (ചിപ്പ്-ചിപ്പ്) ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഒരു സമീപകാല ജീനോം-വൈഡ് പ്രൊമോട്ടർ വിശകലനം, അടിച്ചമർത്തൽ ഹിസ്റ്റോൺ H3 ലൈസിൻ 9 (H3K9), 27 (H3K27) മെത്തിലൈലേഷൻ എന്നിവയിൽ മാറ്റം വരുത്തിയ പാറ്റേണുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.6). അതിനാൽ ഞങ്ങൾ H3K9 അല്ലെങ്കിൽ H3K27 മെത്തിലൈലേഷൻ (നിയന്ത്രിക്കാൻ അറിയപ്പെടുന്ന) നിരവധി ലൈസിൻ മെത്തിലിൽ‌ട്രാൻ‌സ്ഫെറസുകളും (കെ‌എം‌ടികളും) ഡീമെത്തിലൈസുകളും (കെ‌ഡി‌എം) പ്രൊഫൈൽ ചെയ്തു.ചിത്രം XXXA). കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷന് ശേഷം ആവർത്തിച്ചുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റെഗുലേഷൻ G9a, GLP എന്നീ രണ്ട് എൻസൈമുകൾ മാത്രമേ പ്രദർശിപ്പിച്ചിട്ടുള്ളൂ.. G9a, GLP എന്നിവ H3K9 (H3K9me2) ന്റെ ഡൈമെഥിലൈസേഷനെ പ്രത്യേകമായി ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ, കൊക്കെയ്ൻ അവയുടെ തരംതാഴ്ത്തൽ ആഗോളതലത്തിൽ യൂക്രോമാറ്റിക് H3K9me2 ന്റെ ഈ ഘട്ടത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (ചിത്രം. 1B). ഇതിനു വിപരീതമായി, ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ എക്സ്പോഷർ മൂലം ആഗോളതലത്തിലുള്ള ഹെറ്ററോക്രോമാറ്റിക് H3K27 മെത്തിലൈലേഷൻ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു (ചിത്രം. ഓൺലൈൻ മെറ്റീരിയലിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നതിൽ S1). ഇവയുടെ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള കാറ്റലറ്റിക് പ്രവർത്തനം കാരണം vitro ലെ ഒപ്പം ഇൻ വിവോ (10), NAc- ൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ എക്സ്പോഷറിനെത്തുടർന്ന് G9a അടിച്ചമർത്തലിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രാധാന്യത്തെക്കുറിച്ച് കൂടുതൽ അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പുറപ്പെട്ടു. ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷന് ശേഷം ജി‌എൻ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌ഐ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌എ‌ഐ‌എമ്മിഎയുടെ അളവ് പോലെ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് മണിക്കൂറുകൾ ഗണ്യമായി കുറച്ചു.ചിത്രം S2). ഗ്ക്സനുമ്ക്സഅ മ്ര്ന പദപ്രയോഗം എൻഎസി ൽ ക്സനുമ്ക്സ% കണ്ട് കുറയുകയുണ്ടായി എങ്കിലും, ഇംമുനൊഹിസ്തൊഛെമിചല് വിശകലനം (ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ഭരണം ഗ്ക്സനുമ്ക്സഅ പ്രോട്ടീൻ അളവ് കൂടുതൽ കഴിയാൻ ക്സനുമ്ക്സ% കുറവ്, ഹ്ക്സനുമ്ക്സക്ക്സനുമ്ക്സമെക്സനുമ്ക്സ നിരീക്ഷിച്ചിരുന്നു ക്സനുമ്ക്സ% കുറയുന്നു ഒരുക്കിയിരിക്കുന്നതു വെളിപ്പെടുത്തിചിത്രം. 1B). കൊക്കെയ്ൻ ആവർത്തിച്ച് സ്വയംഭരണം ചെയ്തതിനെത്തുടർന്ന് ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിൽ G9a mRNA എക്സ്പ്രഷനെ 20% കുറച്ചിരുന്നു (ചിത്രം S3).
എൻ‌എക്രോയിലെ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ ജീനോം-വൈഡ് വ്യതിയാനങ്ങളുമായി യൂക്രോമറ്റിക് എച്ച്എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എൻഎൻഎക്സിലെ മാറ്റങ്ങൾ പരസ്പര ബന്ധമുണ്ടോ എന്ന് തിരിച്ചറിയാൻ, മുൻ കൊക്കെയ്ൻ എക്സ്പോഷറിന്റെ ചരിത്രത്തോടുകൂടിയോ അല്ലാതെയോ മൃഗങ്ങളിൽ കൊക്കെയ്ൻ ഒരു ചലഞ്ച് ഡോസ് ഉപയോഗിച്ച് സൃഷ്ടിച്ച ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകൾ പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങൾ മൈക്രോഅറേ വിശകലനങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. ജീൻ ലിസ്റ്റുകൾ പട്ടികകൾ S1 - S3). ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ലഭിച്ച മൃഗങ്ങൾ, കൊക്കെയ്ൻ വെല്ലുവിളിക്ക് ശേഷം 1 മണിക്കൂറിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ച ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രദർശിപ്പിച്ചു.ചിത്രം 1C). ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്നിൽ നിന്ന് പിന്മാറിയ 1 ആഴ്ചയ്ക്കുശേഷം നൽകിയ കൊക്കെയ്ൻ വെല്ലുവിളിക്കുള്ള പ്രതികരണമായാണ് ഈ വർദ്ധിച്ച ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഇപ്പോഴും സംഭവിച്ചത്. മുമ്പത്തെ റിപ്പോർട്ടുകൾക്ക് അനുസൃതമായി, ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷനെ തുടർന്ന് ഒരു ചെറിയ ശതമാനം ജീനുകൾ (~ 10%) ഡിസെൻസിറ്റൈസ്ഡ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 1C; കാണുക പട്ടിക S1) (5). ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്നിന് ശേഷം നിരീക്ഷിച്ച മെച്ചപ്പെടുത്തിയ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ ജിഎക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എയുടെ നിയന്ത്രണത്തെക്കുറിച്ച് നേരിട്ട് അന്വേഷിക്കുന്നതിന്, എലികൾക്ക് ജിഎഫ്പി അല്ലെങ്കിൽ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഹെർപ്പസ് സിംപ്ലക്സ് വൈറസ് (എച്ച്എസ്വി) വെക്റ്ററുകളുടെ ഇൻട്രാ-എൻഎസി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ ലഭിച്ചു, കൂടാതെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ അമിതപ്രയോഗം ഉണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ സലൈൻ അല്ലെങ്കിൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും ചെയ്തു. കൊക്കെയ്ൻ പ്രേരിത ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത് തടയാൻ പര്യാപ്തമായിരുന്നു. ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്നിനെത്തുടർന്ന് ക്രമരഹിതമായി തിരഞ്ഞെടുത്ത ഒരു കൂട്ടം ജീനുകളിൽ നിന്ന്, ഉയർന്ന അളവിലുള്ള ആവിഷ്കാര നിലവാരം കാണിക്കുന്നു, G9a ഈ ജീനുകളുടെ 9% ന്റെ മെച്ചപ്പെട്ട പ്രകടനത്തെ ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (പട്ടിക S4).
G9a എക്സ്പ്രഷന്റെ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ-അടിച്ചമർത്തലിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന അപ്‌സ്ട്രീം ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇവന്റുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിന്, ഉടനടി ആദ്യകാല ജീനിന്റെ ഉയർന്ന സ്ഥിരതയുള്ള സ്പ്ലൈസ് ഉൽ‌പ്പന്നമായ osFosB- നുള്ള സാധ്യമായ പങ്ക് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. fosB. കൊക്കെയ്ൻ ആവർത്തിച്ച് തുറന്നുകാണിച്ചതിന് ശേഷം എൻഎസിയിൽ ഫോസ്ബി അടിഞ്ഞു കൂടുന്നു, അവിടെ ഇത് വർദ്ധിച്ച കൊക്കെയ്ൻ റിവാർഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (11). ടാർഗെറ്റ് ജീനിനെ ആശ്രയിച്ച് ഫോസ്ബിക്ക് ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആക്റ്റിവേറ്റർ അല്ലെങ്കിൽ റെപ്രസ്സറായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയും (3, 5, 6, 12). ബിട്രാൻസ്ജെനിക് എൻ‌എസ്‌ഇ-ടിടിഎ Et tetOP-FosB എലികൾ, അതിൽ എൻ‌എസിയിലും മുതിർന്ന മൃഗങ്ങളുടെ ഡോർസൽ സ്ട്രിയാറ്റത്തിലും os ഫോസ് എക്സ്പ്രഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കാവുന്നതാണ് (13), NAc ലെ H3K9me2, KMT എന്നിവയുടെ കൊക്കെയ്ൻ നിയന്ത്രണത്തിൽ osFosB എക്സ്പ്രഷന്റെ സ്വാധീനം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. H3K9me2 (രണ്ടിന്റെയും അളവ് കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഫോസ്ബി അമിതപ്രയോഗം മതിയായിരുന്നു)ചിത്രം. 1D), G9a എക്സ്പ്രഷൻ (ചിത്രം. 1E), അതുവഴി ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയിന്റെ ഫലങ്ങൾ അനുകരിക്കുന്നു. ഇതിനു വിപരീതമായി, brainFosB ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ ജി‌എൽ‌പി പ്രകടനത്തെ കുറച്ചിട്ടില്ല, മാത്രമല്ല യഥാക്രമം H39K1, H2K3 എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള പ്രധാന ട്രൈമെത്തിലൈറ്റിംഗ് എൻസൈമുകളായ SUV9H3, EZH27 എന്നിവയിൽ യാതൊരു സ്വാധീനവും ചെലുത്തിയില്ല (ചിത്രം S4). ഒരു സ്വതന്ത്ര os ഫോസ് ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ഈ ഡാറ്റ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന്, വൈൽഡ് ടൈപ്പ് മുതിർന്ന എലികൾക്ക് ജിഎഫ്പി അല്ലെങ്കിൽ os ഫോസ്ബി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന അഡെനോ-അസ്സോസിയേറ്റഡ് വൈറസ് (എഎവി) വെക്റ്ററുകളുടെ ഉഭയകക്ഷി ഇൻട്രാ-എൻഎസി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ ലഭിച്ചു. BrainFosB- യുടെ വൈറൽ-മെഡിയേറ്റഡ് അമിതപ്രയോഗം ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ G9a എക്സ്പ്രഷന്റെ അളവ് കുറഞ്ഞു (ചിത്രം. 1E).
G9a യുടെ അത്തരം വ്യക്തവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ നിയന്ത്രണം, NAc ന്യൂറോണുകളിൽ പ്രത്യേകമായി G9a എക്സ്പ്രഷനിൽ മാറ്റം വരുത്തുന്നത് കൊക്കെയ്നുമായുള്ള പെരുമാറ്റ പ്രതികരണങ്ങളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. വൈൽഡ്‌ടൈപ്പ് എലികൾക്ക് ജി‌എസ്‌പി അല്ലെങ്കിൽ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന എച്ച്എസ്വി വെക്റ്ററുകളുടെ ഇൻട്രാ-എൻഎസി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ ലഭിച്ചു, തുടർന്ന് പക്ഷപാതമില്ലാത്ത കൊക്കെയ്ൻ കണ്ടീഷൻഡ് പ്ലേസ് പ്രിഫറൻസ് മാതൃക ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു, ഇത് മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിഫലത്തിന്റെ പരോക്ഷമായ അളവ് നൽകുന്നു. പെരുമാറ്റ പരിശോധനയെത്തുടർന്ന് NAc ന്യൂറോണുകളിലെ G9a ന്റെ വൈറൽ അമിതപ്രയോഗം സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം XXXA). ജിഎഫ്പി അമിതമായി എക്സ്പ്രസ് ചെയ്യുന്ന മൃഗങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ അമിതപ്രയോഗം കൊക്കെയ്നിനുള്ള മുൻഗണന ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു (ചിത്രം. 2B), കൂടാതെ NAc- ൽ H3K9me2 ലെവലുകൾ വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 2C). G9a (G9aH1093K) (GXNUMXaHXNUMXK) ന്റെ കാറ്റലിറ്റിക്കലി ഡെഡ് മ്യൂട്ടന്റിന്റെ അമിതപ്രയോഗം (14) കൊക്കെയ്ൻ മുൻഗണനയെ ബാധിച്ചില്ല (ചിത്രം. 2B) കൂടാതെ ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ H3K9me2 ലെവലിനെ ബാധിച്ചിട്ടില്ല (ചിത്രം 2C).
കൊക്കൈനിന്റെ പെരുമാറ്റ ഫലങ്ങളിൽ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ പങ്ക് കൂടുതൽ പഠിക്കുന്നതിനും കൂടുതൽ വ്യക്തമായി എൻഎസിയിലെ മുതിർന്നവർ‌ക്കുള്ള ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ എക്സ്പ്രഷന്റെ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ-പ്രേരണ അടിച്ചമർത്തലിനെ അനുകരിക്കുന്നതിനും.fl / fl എലികൾ14) ഒരു നിയന്ത്രണമായി ക്രെ റീകമ്പിനേസ് അല്ലെങ്കിൽ ജിഎഫ്പി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന എഎവി വെക്റ്ററുകളുടെ ഇൻട്രാ-എൻഎസി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ ലഭിച്ചു. NAc- ലെ G9a- യുടെ AAV-Cre നോക്ക്ഡ down ൺ, ഇത് ഇമ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കലായി സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം S5), പ്ലേസ് കണ്ടീഷനിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ കൊക്കെയ്നിന്റെ സ്വാധീനം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും എൻഎസിയിലെ എച്ച്എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അളവ് കുറയുകയും ചെയ്തുചിത്രം 2D, E.). വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ G9a, GLP എന്നിവയുടെ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇൻഹിബിറ്റർ, BIX01294 (15-16), കൊക്കെയ്നുമായുള്ള പെരുമാറ്റ പ്രതികരണങ്ങളെ എൻസൈം ഗർഭനിരോധനം സമാനമായി ബാധിക്കുന്നുണ്ടോ എന്നറിയാൻ ഉപയോഗിച്ചു. വാസ്തവത്തിൽ, G9a, GLP എന്നിവയുടെ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഗർഭനിരോധനം കൊക്കെയ്നിനുള്ള മുൻഗണന ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും NAc- ൽ H3K9me2 കുറയുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 2F, G.).
കൊക്കെയിന്റെ ആവർത്തിച്ചുള്ള ഭരണം എൻഎസി മീഡിയം സ്പൈനി ന്യൂറോണുകളിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് മുള്ളുകളുടെ സാന്ദ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു (17), ഈ ന്യൂറോണുകളിലേക്ക് എക്‌സിറ്റേറ്ററി ഗ്ലൂട്ടാമറ്റെർജിക് സിനാപ്‌സുകളിലെ പ്രവർത്തനപരമായ മാറ്റങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഒരു പ്രക്രിയ (18-19) കൂടാതെ മരുന്നിനോടുള്ള പെരുമാറ്റ പ്രതികരണങ്ങളും (17, 20). ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ എൻഎസിയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ പ്രവർത്തനം കുറയ്ക്കുന്നത് എൻഎസി ന്യൂറോണുകളുടെ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത നിയന്ത്രിക്കാനുള്ള കൊക്കെയ്നിന്റെ കഴിവിനെ മധ്യസ്ഥമാക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിച്ചു. G9a വിരുദ്ധ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്മ്യൂണോപ്രസിപ്പിറ്റേഷൻ (ChIP) ഉപയോഗിച്ച്, NAc- ൽ നിരവധി പുട്ടേറ്റീവ് G9a ജീൻ ടാർഗെറ്റുകൾ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അവ ഓരോന്നും മുമ്പ് കൊക്കെയ്ൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡെൻഡ്രിറ്റിക് പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട് (ചിത്രം XXXA) (20-26). ഈ ജീൻ പ്രൊമോട്ടറുകളിൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷൻ G9a ബൈൻഡിംഗും H3K9me2 ന്റെ അളവും ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം. 3B). ഇതിനു വിപരീതമായി, അക്യൂട്ട് കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷൻ ഈ ചില ജീൻ പ്രൊമോട്ടർമാരിൽ ജിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയെ അതിവേഗം റിക്രൂട്ട് ചെയ്തു, കൊക്കെയ്ൻ ഒരു തീവ്രമായ ഡോസ് കഴിഞ്ഞ് എൻഎസി എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് മണിക്കൂറിൽ നിരീക്ഷിച്ച വർദ്ധിച്ച ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ എക്സ്പ്രഷനുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം S6). നിർദ്ദിഷ്ട ജീൻ പ്രമോട്ടർമാരുമായി ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സാ ബൈൻഡിംഗ് അതിന്റെ ആവിഷ്കാരത്തിലെ മാറ്റങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെങ്കിലും, അത്തരം സംഭവങ്ങൾ എൻഎസിയിലെ ആഗോള തലത്തിലുള്ള ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നുണ്ടോ എന്നും കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ നിശിതത്തെത്തുടർന്ന് ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്എ റിക്രൂട്ട്‌മെന്റിലെ വ്യത്യാസങ്ങളാണോ എന്നും വ്യക്തമല്ല. വേഴ്സസ് ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷൻ.
എൻഎസിയിലെ പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നിരവധി ജീനുകളെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ നിയന്ത്രിച്ചതിന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, കൊക്കെയ്ൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് രൂപപ്പെടുന്നത് തടയാൻ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ചികിത്സയെത്തുടർന്ന് ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ എക്സ്പ്രഷന്റെ പരിപാലനം പര്യാപ്തമാണോ എന്ന് ഞങ്ങൾ നേരിട്ട് പരിശോധിച്ചു. എൻഎസിയിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് ഇൻഡക്ഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് തെളിയിച്ച ഒരു കൊക്കെയ്ൻ ചികിത്സാ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു (20), HSV-GFP അല്ലെങ്കിൽ HSV-G9a കുത്തിവച്ച മൃഗങ്ങളിലെ നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. മുമ്പത്തെ കണ്ടെത്തലുകളുമായി യോജിച്ച്, കൊക്കെയ്ൻ ചികിത്സയെത്തുടർന്ന് എൻഎസിയിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഇത് G9a അമിതപ്രയോഗം പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു (ചിത്രം 3C). കൊക്കെയിന്റെ അഭാവത്തിൽ എൻഎസി ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കുന്നതിന് ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ അമിതപ്രയോഗം മാത്രം പര്യാപ്തമല്ല. ഈ ഡാറ്റ പൂർ‌ത്തിയാക്കുന്നതിന്, G9afl / fl എലികൾക്ക് എച്ച്എസ്വി-ക്രീയുടെ ഇൻട്രാ-എൻഎസി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ ലഭിച്ചു, നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുകയും കൊക്കെയ്ന്റെ അഭാവത്തിൽ എച്ച്എസ്വി-ജിഎഫ്പി സ്വീകരിക്കുന്ന മൃഗങ്ങളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. G9a എക്സ്പ്രഷന്റെ നോക്ക്ഡ down ൺ NAc മീഡിയം സ്പൈനി ന്യൂറോണുകളിൽ നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 3C).
ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ΔFosB മദ്ധ്യസ്ഥമാക്കിയതിനുശേഷം എൻഎസിയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ നിയന്ത്രണം കുറച്ചതിന്റെ തെളിവുകൾ കണക്കിലെടുത്ത്, അടുത്തതായി ഈ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകം എൻഎസി ഡെൻഡ്രിറ്റിക് മുള്ളുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തിലും ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.. ഡെൻ‌ട്രിറ്റിക് പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയുമായി os ഫോസ്ബി മുമ്പ് ബന്ധപ്പെട്ടിട്ടില്ലെങ്കിലും, സി‌ഡി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്, എൻ‌എഫ്‌ κ ബി സബ്‌യൂണിറ്റുകൾ ഉൾപ്പെടെ അതിന്റെ ടാർഗെറ്റുകൾ പലതും ഇതിൽ ഉൾ‌പ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (20-23), എൻഎസി ന്യൂറോണുകളിലെ ഫോസ്ബിയുടെ നിരന്തരമായ ആവിഷ്കാരം ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം വർദ്ധിച്ച ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. (27). ആദ്യം, കൊക്കെയ്ന്റെ അഭാവത്തിൽ ബിട്രാൻസ്ജെനിക് എലികളിൽ osFosB ന്റെ ഇൻഡക്ഷൻ കണ്ടെത്തി, ഇത് G9a, H3K9me2 എക്സ്പ്രഷൻ (ചിത്രം 1D, E.), പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നിരവധി ജീനുകളുമായി G9a ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് കുറഞ്ഞു, അവയിൽ പലതും osFosB- യുടെ തന്നെ നേരിട്ടുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളാണെന്ന് തെളിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് (ചിത്രം. 3D) (3, 6). NAc ലെ osFosB യുടെ വൈറൽ അമിതപ്രയോഗം അടിസ്ഥാനപരമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചുവെന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തതായി കാണിച്ചു, ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷനെ തുടർന്ന് നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമാണ് (ചിത്രം. 3E). നേരെമറിച്ച്, os ഫോസ്ബി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രവർത്തനത്തെ എതിർക്കുന്ന ഒരു പ്രധാന നെഗറ്റീവ് മ്യൂട്ടന്റ് പ്രോട്ടീനായ Δ ജുൻഡിന്റെ എൻഎസിയിലെ അമിതപ്രയോഗം, എൻഎസിയിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് രൂപപ്പെടുന്നത് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്നിന്റെ കഴിവ് തടഞ്ഞു. (ചിത്രം 3C).
Oc ഫോസ് എൻഎസിയിലെ ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സ എക്സ്പ്രഷനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്നും os ഫോസ്ബിയും ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയും ഒരേ ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണം Δ ഫോസ്ബിയും ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയും തമ്മിലുള്ള മറ്റ് ഇടപെടലുകൾ പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങളെ നയിച്ചു. അക്യൂട്ട് കൊക്കെയ്നിന് ശേഷം, G9a ലെവലുകൾ വർദ്ധിപ്പിച്ചപ്പോൾ, G9a നെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് fosB ജീൻ വർദ്ധിപ്പിച്ചു, ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്നിന് ശേഷം, G9a എക്സ്പ്രഷൻ അടിച്ചമർത്തുമ്പോൾ, G9a എന്നതുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു fosB ജീൻ കുറഞ്ഞു (ചിത്രം XXXA). ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ നിരീക്ഷിക്കാതിരുന്നതിന് ശേഷം അത്തരം G9a ബൈൻഡിംഗ് കുറയുന്നു സി-ഫോസ്, ഇവിടെ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ G9a ബൈൻഡിംഗ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം S7). അതിൽ നിന്നും വ്യത്യസ്തമായി, ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല fosB, c-fos ക്രോണിക് സൈക്കോസ്തിമുലന്റ് എക്സ്പോഷർ വഴി അടിച്ചമർത്തപ്പെടുന്നു, പ്രേരിപ്പിക്കുന്നില്ല (5). X ബിട്രാൻസ്ജെനിക് എലികളിലെ ഫോസ് അമിതപ്രയോഗം G9a ബൈൻഡിംഗ് ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നതിന് പര്യാപ്തമായിരുന്നു fosb ജീനിചിത്രം. 3D). കൂടാതെ, ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷനെ തുടർന്ന് വർദ്ധിച്ച osFosB എക്സ്പ്രഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിന് G9a അമിതപ്രയോഗം മതിയായിരുന്നു (പട്ടിക S4). ഗുരുതരമായ കൊക്കൈയിൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേറ്ററിനായി ΔFosB ന്റെ തുടക്കത്തിൽ G9a തുടക്കത്തിൽ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്ന ഒരു ഓട്ടോറോഗ്ലോട്ടറി ലൂപ്പിന് ഈ ഡാറ്റ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ΔFosB തുടർച്ചയായി മയക്കുമരുന്ന് exposure ൽ സഞ്ചരിക്കുമ്പോൾ, അത് G9a അടിച്ചമർത്തുന്നു, അങ്ങനെ അതുവഴി കൂടുതൽ ഉത്പാദനം വർദ്ധിപ്പിക്കും.
ഉപസംഹാരമായി, കൊക്കെയ്നോടുള്ള പ്രതികരണമായി ന്യൂറോണൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ എൻഎസിയിലെ ഹിസ്റ്റോൺ ലൈസിൻ മെത്തിലൈലേഷൻ വിമർശനാത്മകമായി ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചു. ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ അഡ്മിനിസ്ട്രേഷൻ തുടർന്നുള്ള G9a, H3X9XXXX- ന്റെ അടിച്ചമർത്തലുകളിൽ കൊഞ്ചൈൻ മുൻഗണന പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുണ്ട്, ഭാഗികമായി, ഡിൻഡ്രറ്റിക് പ്ലാസ്റ്റിക്റ്റിന്റെ തെറ്റായ രൂപങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കുന്ന അറിയപ്പെടുന്ന നിരവധി ജീനുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ സജീവമാക്കൽ വഴി. അത്തരം സംവിധാനങ്ങളിലൂടെ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്ന ജീനുകളെക്കുറിച്ച് നന്നായി മനസ്സിലാക്കുന്നത് മയക്കുമരുന്ന് ആസക്തിയുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ജൈവശാസ്ത്രപരമായ അടിത്തറയെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ അറിവ് മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും ആസക്തി വൈകല്യങ്ങളുടെ കൂടുതൽ ഫലപ്രദമായ ചികിത്സാരീതികൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് സഹായിക്കുകയും ചെയ്യും.
വസ്തുക്കളും രീതികളും
മൃഗങ്ങളും ചികിത്സകളും
മറ്റൊരു വിധത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ, ഒരു കോളനിയിൽ ഒരു കൂട്ടിൽ നാലോ അഞ്ചോ എലികളെ പാർപ്പിച്ചിരുന്നു 12 മണിക്കൂർ ലൈറ്റ് / ഡാർക്ക് സൈക്കിൾ (7: 00 AM മുതൽ 7: 00 PM വരെ ലൈറ്റുകൾ) നിരന്തരമായ താപനിലയിൽ (23 ° C) പരസ്യം libitum വെള്ളവും ഭക്ഷണവും ലഭ്യമാക്കുക. യുടി സൗത്ത് വെസ്റ്റേൺ മെഡിക്കൽ സെന്ററിനും മൗണ്ട് സീനായി സ്കൂൾ ഓഫ് മെഡിസിനും എല്ലാ മൃഗങ്ങളെ പ്രോട്ടോക്കോളുകൾക്കും അംഗീകാരം നൽകി.
കൊക്കെയ്ൻ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി [ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിട്രി, വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ്, ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ (qPCR), മൈക്രോഅറേ വിശകലനം, ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്മ്യൂണോപ്രസിപ്പിറ്റേഷൻ (ChIP)], 8- മുതൽ 10 വരെ ആഴ്ച പ്രായമുള്ള ആൺ C57BL / 6J എലികൾ ഉപയോഗിച്ചു. 'സ്യൂയിൻ' (ഐഇഎക്സ്), 'അക്യൂട്ട്' കൊക്കെയ്ൻ (7 ചികിത്സാരീതിയിലുള്ള ഉപ്പു, + ഒന്ന് ചികിത്സ, കോകൈൻ- HCl, ip) അല്ലെങ്കിൽ 'ആവർത്തിച്ചുള്ള' കൊക്കൈൻ (6 ചികിത്സാരീതികൾ, 30 മില്ലിഗ്രാം / കിലോ) കൊക്കെയ്ൻ- HCl, ip). അന്തിമ ചികിത്സയെത്തുടർന്ന് 20 മണിക്കൂറിലോ 7 മണിക്കൂറിലോ എലികളെ ബലികഴിച്ചു. മഗ്നീഷറി പഠനത്തിന് മൃഗങ്ങൾ ദിവസേന 'ഉപ്പ്' (20 ചികിത്സാരീതികൾ ഉപ്പ്, ip), 'അക്യൂട്ട്' കൊക്കൈൻ (1 ചികിത്സാരീതിയിലുള്ള സലൈൻ + 24 ചികിത്സ, കോകൈൻ- HCl, ip), 'ആവർത്തിച്ചു + 15 ചികിത്സകൾ സലൈൻ + 14 ചികിത്സകൾ 1 mg / kg കൊക്കെയ്ൻ- HCl, ip) അല്ലെങ്കിൽ 'ആവർത്തിച്ചുള്ള പിൻവലിക്കൽ + അക്യൂട്ട്' കൊക്കെയ്ൻ (20 ചികിത്സകൾ 7 mg / kg കൊക്കെയ്ൻ-HCl + 8 ചികിത്സകൾ സലൈൻ + 20 ചലഞ്ച് ചികിത്സ 7 mg / kg കൊക്കെയ്ൻ-എച്ച്സി‌എൽ, ip) അന്തിമ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം എൺപത് മണിക്കൂർ ത്യാഗം ചെയ്തു. പെരുമാറ്റ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, എലിയെല്ലാം പോസ്റ്റ്-ശസ്ത്രക്രിയ നടത്തിയിരുന്നു, കൂടാതെ താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ തന്നെ 20 മില്ലിഗ്രാം / കിലോ കൊക്ക്-എച്ച്. HSV-GFP, HSV-G7a-GFP അണുബാധയെത്തുടർന്നുള്ള ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനത്തിനും മൈക്രോഅറേ മൂല്യനിർണ്ണയത്തിനും എലികളെ 'സലൈൻ' (1 ചികിത്സകൾ സലൈൻ, ഐപി) അല്ലെങ്കിൽ 'ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ' (20 ചികിത്സകൾ 1 mg / kg കൊക്കെയ്ൻ-എച്ച്സി‌എൽ, ഐപി ), ഈ കുത്തിവയ്പ്പ് പ്രോട്ടോക്കോൾ മുമ്പ് ഹെർപെസ് സിംപ്ലക്സ് വൈറസ് (എച്ച്എസ്വി) ട്രാൻസ്ജെൻ എക്സ്പ്രഷൻ (HSV) ട്രാൻസ്ജെൻ എക്സ്പ്രഷനിയുടെ കാലഘട്ടത്തിലെ ന്യൂക്ലിയസ് അംബുംബൻസ് (എൻ സി) ന്യൂറോണുകളിൽ നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് സൂചിപ്പിച്ചിരുന്നു.അനുബന്ധ ref S1). ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിച്ച എലികളെ അവസാന ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം 4 മണിക്കൂർ ബലിയർപ്പിച്ചു.
എൻഎസി ന്യൂറോണുകളിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന G9a ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിന്റെ പ്രാദേശിക ഇല്ലാതാക്കൽ ഉണ്ടാകുന്നതിനായി, ഫ്ളാക്സ്ഡ് G9A അനല്ലേലിനായി ഞങ്ങൾ ഒരു മിതമായ മൗസ് ഹോമോസൈഗസാണ് ഉപയോഗിച്ചത്, അവ മറ്റെവിടെയെങ്കിലും വിശദമായി വിവരിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (S2). ക്രീ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് റീകമ്പിനേഷൻ എക്സോൺ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് മുതൽ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് വരെ ഫ്രെയിം-ഓഫ്-ഫ്രെയിം സ്പ്ലിസിംഗ് ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്നു. ഞങ്ങൾ C22BL / 25J എലികളിലേക്ക് പൂർണ്ണമായി backcrossed ആയ G9a ഫ്ലോക്സഡ് എലികൾ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. അഡെനോ-അസ്സോസിയേറ്റഡ് വൈറസ് (എഎവി) വെക്റ്ററുകൾ (സെറോടൈപ്പ് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്) ഉപയോഗിച്ച് എൻ‌എൻ‌സിയിലേക്ക് എലികൾ സ്റ്റിറോടാക്സിക്കലായി കുത്തിവയ്ക്കുകയായിരുന്നു. ക്രമീഡിയറ്റഡ് റീഗബാമിനേഷന്റെ ഫലപ്രാപ്തിയെ പരിശോധിക്കുന്നതിനായി ഇമ്മാനൂനിസ്റ്റ് ഗവേഷണ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു. അനുബന്ധ ചിത്രം S5). ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്കു ശേഷമുള്ള എഎവി കുത്തിവച്ച മൃഗങ്ങളെ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു, കാരണം ജി‌എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എ ഫ്ലോക്‍സ്ഡ് എലികളിലെ പുന omb സംയോജനം ഈ സമയത്ത് സ്ഥിരവും പരമാവധി ആയിരുന്നു, പ്രസിദ്ധീകരിച്ച റിപ്പോർട്ടുകൾക്ക് അനുസൃതമായി (S3-S4). G9a ഉം ΔJunD overexpression പരീക്ഷണവും ജിഎഫ്പി, വൈറൽ ടൈപ്പ് ജിഎക്സ്എൻഎക്സ്എ-ജിഎഫ്പി, കാറ്റലോറ്റിങ്ടസ് ഡെഡ് ജിഎക്സ്എൻഎക്സ്എ.എക്സ്.എക്സ്.എക്സ്.എക്സ്-ജി.എഫ്.പി അല്ലെങ്കിൽ ΔJunD-GFP S2 G9a കൺസ്ട്രക്റ്റുകളുടെ വികസനം സംബന്ധിച്ച വിശദാംശങ്ങൾക്ക്). ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി വഴി നിരീക്ഷിച്ചതുപോലെ, എച്ച്എസ്വി അമിതമായി എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് എലികളെ ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് ശേഷമുള്ള എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ദിവസങ്ങളിൽ ഉപയോഗിച്ചു. HSV എക്സ്പ്രഷനുകളുടെ സ്വഭാവന സ്വഭാവം, AAV expression ന്റെ കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ള സ്വഭാവം എന്നിവ കാരണം, വേഗത്തിലും ഹ്രസ്വകാല ട്രാൻസ്ഗെയ്ൻ എക്സ്പ്രസുകളിലുമുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിൽ HSV സന്നിവേശങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു, അതേസമയം AAV വെക്റ്ററുകൾ ട്രാൻസ്ഗെനിൻ എക്സ്പ്രഷനുകളുടെ ദീർഘകാല ആവശ്യത്തിനായി ഉപയോഗിച്ചു. കുത്തിവച്ചുള്ള മസ്തിഷ്കമേഖലയിലെ ന്യൂറോണൽ സെൽ ബോഡികളെ മാത്രം ബാധിക്കുന്നതായി വിപുലമായ മുൻ പഠനങ്ങളിൽ രണ്ട് വെക്റ്ററുകളും തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.
BXXXXX / GLP ഇൻഫിപിറ്റർ, BIXXNUMA (9 ng / μl) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുകൊണ്ടുള്ള പെരുമാറ്റ പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, എൻസൈറ്റിനൊപ്പം രണ്ട് subcutaneous മിനി പമ്പുകൾ, അതുപോലെ ഇരു കക്ഷികളുടെ ഗൺകുളുകളുമൊക്കെയായി എലികൾ സ്റ്റെരോകാക്സിക്കായി സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടു. വാഹനത്തിന്റെ (01294 μl / hour) നിരന്തരമായ ഡെലിവറിക്ക് (25 ഹൈഡ്രോക്സൈപ്രോയ്ഡ് β-cyclodextrin) അല്ലെങ്കിൽ മരുന്നിന്റെ അളവ് 12 ദിവസത്തേക്ക് മരുന്നുകൾക്ക് മുൻകൂട്ടി തയ്യാറാക്കിയതിന് മുമ്പ് തന്നെ മിനി-പമ്പുകൾ സജീവമാക്കി.
OsFosB അമിതപ്രയോഗ പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് [വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ്, qPCR, ChIP], പുരുഷ ബിട്രാൻസ്ജെനിക് എൻ‌എസ്‌ഇ-ടിടിഎ × tetOP-ΔFosB എലികൾ ഉപയോഗിച്ചു (10 ആഴ്ച പഴക്കമുള്ളത്), അതിനാൽ ടെട്രാസൈക്ലൈൻ ഡെറിവേറ്റീവ് ഡോക്സിസൈക്ലിൻ (ഡോക്സിസൈക്ലിനിൽ നിന്ന് 8 ആഴ്ചകൾ) ഇല്ലാത്തപ്പോൾ, മൃഗങ്ങൾ striFosB (S5). ഈ എലികളിലെ ΔFOSB അമിത മർദ്ദം qPCR വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു. എൻ‌എസ്‌ഇ- ഉപയോഗിച്ച് കണ്ടെത്തലുകൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന്ടിടിഎ × tetOP-ΔFosB എലികൾ, ങാഫോസ് ബി-ജിഎഫ്പി, അഥവാ ΔFosB-GFP എന്നിവ പ്രകടമാക്കുന്ന AAV വെക്റ്ററുകളിൽ സ്റ്റെറേറ്റക്സിസിനായി ഇൻട്രാ-എൻസി ആകാം. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, എ.ജി.ഫോസ്ബി എക്സ്പെരിഷൻ, XMX ആഴ്ചയ്ക്കുള്ള പോസ്റ്റ്-ശസ്ത്രക്രിയയിൽ, എ.വി.ഒ. വിക്റ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, വൈറസ്ബാധ, ബിറ്റ്റോൻജെൻസിക് ΔFosB അണ്ഡാഗ്പ്രസയിങ് എലിസുകളെ തമ്മിൽ നേരിട്ട് താരതമ്യം ചെയ്യാൻ അനുവദിച്ചു. ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്കു ശേഷമുള്ള 8 ആഴ്ചകളിൽ qPCR ഉപയോഗിച്ച് വൈറൽ അമിതപ്രയോഗം സ്ഥിരീകരിച്ചു (ഇഞ്ചക്ഷൻ സൈറ്റിന് കീഴിൽ 57- ഗേജ് NAc പഞ്ചുകൾ വിച്ഛേദിക്കപ്പെട്ടു). QPCR നായി ഉപയോഗിക്കാത്ത AAV-GFP, AAV-osFosB-GFP അമിതമായി എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് എലികളെ സലൈൻ (6 ചികിത്സകൾ സലൈൻ, ഐപി) അല്ലെങ്കിൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ (8 ചികിത്സകൾ 8 mg / kg കൊക്കെയ്ൻ- HCl, ip) 15 ആഴ്ച്ച മുതൽ ആരംഭിക്കുന്നു. ശസ്ത്രക്രിയ. അന്തിമ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷമുള്ള 14 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, തലച്ചോറുകൾ 14% പാരഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിക്കുകയും വൈബ്രാറ്റോമിൽ വിഭജിക്കുകയും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.
വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനം
സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ മൗസിന്റെ തലച്ചോറ് മെട്രിക്സ് ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച 14 മില്ലീമീറ്റർ കൊറോണൽ സെക്ഷനുകളിൽ നിന്ന് എൻഎൻഎൻ പഞ്ച് എടുത്ത്, പ്രോമെസ്, ഫോസ്ഫാറ്റസ് ഇൻഹെബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന 1 HE HEPES lysis ബഫറിൽ (1% SDS) വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. 1-മൊത്തം പ്രോട്ടീന്റെ 30 μg സാമ്പിളുകൾ 18% SDS ജെല്ലുകളിൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസ് ചെയ്തു. പ്രോട്ടീനുകൾ പിവിഡിഎഫ് മെംബ്രണുകളിലേക്ക് മാറ്റുകയും എച്ച്എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്എക്സ്എൻഎൻഎക്സ്എം‌എക്സ് (മ mouse സ് മോണോക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്: എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്), ആന്റി-എ-ട്യൂബുലിൻ (മ mouse സ് മോണോക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്: എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്), ടോട്ടൽ ആന്റി ഹിസ്റ്റോൺ എച്ച്എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്, റാബിറ്റ് പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-ജിഎഫ്പി (പഞ്ച് ചെയ്ത ടിഷ്യുവിൽ തുല്യ വൈറൽ എക്സ്പ്രഷൻ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന് ഉപയോഗിക്കുന്നു) (മുയൽ പോളിക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്: എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്), ആന്റി-എച്ച്എക്സ്എൻ‌എം‌എൻ‌എക്സ്എക്സ്എൻ‌എൻ‌എം‌എക്സ്എൻഎൻഎൻഎൻഎക്സ് (മുയൽ പോളിക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്: എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്) അല്ലെങ്കിൽ ആന്റി-ആക്ടിൻ ആന്റിബോഡികൾ (മൗസ് മോണോക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌എം‌എം‌എക്സ്) 3 ° C (എല്ലാ ചർമ്മങ്ങളും 9% പാലിലോ 2% ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിനിലോ തടഞ്ഞു). പെറോക്സിഡേസ്-ലേബൽ ചെയ്ത ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികളുമായി മെംബ്രൺ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു (1: 500-1: 60,000 ഉപയോഗിക്കുന്നത് പ്രാഥമിക ആൻറിബോഡിയെ ആശ്രയിച്ച്) സൂപ്പർ സിക്കെൻസ്റ്റ് വെസ്റ്റ് ഡൂര ഉപഗ്രഹം ഉപയോഗിച്ച് ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യവത്കരിച്ചു. NIH Image J സോഫ്റ്റ്വെയറുകളുമായി BANDS കണക്കുകൂട്ടിയെടുത്തു, ആക്ടിനോ അല്ലെങ്കിൽ β- ട്യൂബുലിൻ അല്ലെങ്കിൽ തുല്യ ലോഡിംഗ് നിയന്ത്രിക്കാൻ ആകെ ഹിസ്റ്റോൺ എച്ച്എക്സ്എൻഎൻഎസുകളായി H3XXXXXXXXXXX പതിപ്പുകൾക്ക് ക്രമീകരിക്കപ്പെട്ടു. ആവർത്തിച്ചുള്ള കൊക്കെയ്ൻ ആക്റ്റിന്റെ അളവുകളെ സ്വാധീനിച്ചില്ല (ചിത്രം S8) അല്ലെങ്കിൽ മൊത്തം ഹിസ്റ്റോൺ 3 (ചിത്രം S1) NAc- ൽ. കൂടാതെ, HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP അണുബാധ എന്നിവ NAc ലെ മൊത്തം levels- ട്യൂബുലിൻ അളവിനെ ബാധിച്ചില്ല (ചിത്രം S8).
ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോഹമിസ്ട്രി
എലികളെ മാരകമായ അളവിൽ ക്ലോറൽ ഹൈഡ്രേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് മയപ്പെടുത്തി, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ സിംഗിൾ അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ ഇമ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% പാരഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു (S6). ചുരുക്കത്തിൽ, 30 μm ലെ വിഭാഗീയതയ്ക്ക് മുൻപ്, കൃത്യമായ മസ്തിഷ്കത്തിൽ മുക്കാൽ മണിക്കൂറുകളോളം സൂര്യന്റെ അന്തരീക്ഷത്തിൽ മുട്ടയിട്ടു. (ഡിഎൻഎൻററിക് സ്പൈൻ വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന മരുന്നുകൾ, 35% സക്രോസസ് അഭാവത്തിൽ 100 μm വിഭാഗങ്ങളിൽ ഒരു വൈബ്രറ്റ് വിഭാഗത്തിൽ വിഭാഗിച്ചു). ഫ്രീ-ഫ്ലോട്ടിംഗ് എൻഎസി വിഭാഗങ്ങൾ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്എക്സ് പി‌ബി‌എസ് ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, തടഞ്ഞു (എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% സാധാരണ കഴുത സെറം, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% ട്രൈടോൺ‌എക്സ്, എക്സ്എൻഎംഎക്സ്എക്സ് പി‌ബി‌എസ്), പിന്നീട് ജിഎഫ്പി വിരുദ്ധ (ചിക്കൻ പോളിക്ലോണൽ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്: എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്) കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ ആന്റി-ജിഎക്സ്എൻ‌എം‌എൽ‌എ (മുയൽ പോളിക്ലോണൽ) , 30: 1) പരിഹാരം തടയുന്നതിനുള്ള ആന്റിബോഡികൾ. Dendritic spines for analyzed വിഭാഗങ്ങൾ മുത്തശ്ശി polyclonal ആന്റി- GFP ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ചുരുക്കി: 3: 0.1. ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേഷനെത്തുടർന്ന്, എൻ‌എൻ‌എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൻഎക്സ്എക്സ്എക്സ് മോർഫോളജി പഠനങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന വിഭാഗങ്ങൾ ഊഷ്മാവിൽ രാത്രി മുഴുവൻ ദ്വിതീയ ആൻറിബോഡിയത്തിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. 1 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ DAPI (1: 8000) അടങ്ങിയ 9 PBS- ൽ വിഭാഗങ്ങളെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് ആണവ സഹസംവിധാനം നേടിയെടുക്കപ്പെട്ടു. വിഭാഗങ്ങൾ വീണ്ടും കഴുകിയതും തുടർന്ന് എഥനോൾ ഡിഹൈഡ്രേഷൻ തുടർന്ന് ഡിപിഎക്സ് ഉപയോഗിച്ച് മൗനമായി. എല്ലാ വിഭാഗങ്ങളും മെക്കാനിക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് പകർത്തിയത്.
ആർഎൻഎ ഒറ്റപ്പെടലും qPCR ഉം
ഉഭയകക്ഷി 14-ഗേജ് എൻഎസി പഞ്ചുകൾ ട്രൈസോളിൽ ഏകീകൃതമാക്കുകയും നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ആർഎൻഎ മൈക്രോ നിരകൾ ഉപയോഗിച്ച് ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ആർഎൻഎ 260/280, 260/230 റേഷൻ> 1.8 ആണെന്ന് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തു. ആർഎൻഎ ഒരു ബയോ-റാഡ് ഐ‌സ്ക്രിപ്റ്റ് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്തു. എസ്‌വൈ‌ബി‌ആർ ഗ്രീൻ ഉപയോഗിച്ച് സി‌ഡി‌എൻ‌എ qPCR കണക്കാക്കി. ഓരോ പ്രതികരണവും തനിപ്പകർപ്പായോ ത്രിരൂപത്തിലോ പ്രവർത്തിപ്പിക്കുകയും ΔΔCt രീതി പിന്തുടർന്ന് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ഗ്ലൈസെരാൾഡിഹൈഡ് -3-ഫോസ്ഫേറ്റ് ഡൈഹൈഡ്രജനോയിസ് (ജി‌എ‌പി‌ഡി‌എച്ച്) ഒരു സാധാരണവൽക്കരണ നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.S7). കാണുക അനുബന്ധ പട്ടിക S5 mRNA പ്രാഥമിക ശ്രേണികൾക്കായി.
ഡി.എൻ.എ. മൈക്രോറിൻ വിശകലനം
മൈക്രോഅറേ പഠനത്തിനായി നാല് ഗ്രൂപ്പുകൾ (ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും 3 സ്വതന്ത്ര ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകൾ) ഉപയോഗിച്ചു, ആകെ 12 മൈക്രോറേകൾ. അവസാന കൊക്കെയ്ൻ കുത്തിവയ്പ്പിനെത്തുടർന്ന് 1 മണിക്കൂർ, മൃഗങ്ങളെ അതിവേഗം ശിരഛേദം ചെയ്യുകയും തലച്ചോറുകൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും ഐസ് സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്തു. എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്-ഗേജ് സൂചി പഞ്ച് ഉപയോഗിച്ചാണ് എൻ‌എ‌സിയുടെ വിഭജനം എടുത്തത്, ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതുവരെ ഉണങ്ങിയ ഐസ് ഉപയോഗിച്ച് വേഗത്തിൽ മരവിപ്പിച്ചു. ഒരു ഗ്രൂപ്പിലെ ഓരോ എട്ട് മൃഗങ്ങളിലുമായി രണ്ട് ദ്വാരങ്ങളുണ്ടായിരുന്നു. മുമ്പ് വിശദീകരിച്ച പ്രകാരം RNA ഒറ്റപ്പെടുത്തൽ, മൈക്രോറേയ് പ്രോസസ്സിംഗ്, ഡാറ്റാ അപഗ്രഥനംS8). ചുരുക്കത്തിൽ, മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുകയും എജിലന്റിന്റെ ബയോഅനലൈസർ ഉപയോഗിച്ച് ഗുണനിലവാരം പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്തു. യുടി സ South ത്ത് വെസ്റ്റേണിന്റെ മൈക്രോഅറേ കോർ സ്റ്റാൻഡേർഡ് നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇല്ലുമിന മൗസ് ഡബ്ല്യുജി -6 വി 2.0 അറേകളിലേക്കുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ, ലേബലിംഗ്, ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ എന്നിവ നടത്തി. അസംസ്കൃത ഡാറ്റ പശ്ചാത്തലം കുറയ്ക്കുകയും ബീഡ്സ്റ്റുഡിയോ സോഫ്റ്റ്വെയർ ഉപയോഗിച്ച് ക്വാണ്ടൈൽ സാധാരണമാക്കുകയും ചെയ്തു. ജീൻസ്‌പ്രിംഗ് സോഫ്റ്റ്വെയർ ഉപയോഗിച്ച് സാധാരണ ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്യുകയും 1.3 മടങ്ങ് മാറ്റ കട്ട്ഓഫിന്റെ പ്രാധാന്യ മാനദണ്ഡങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ജനലിസ്റ്റുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും ഒപ്പം പി <0.05 ന്റെ കർശനമല്ലാത്ത പി-മൂല്യം കട്ട്ഓഫിനൊപ്പം.
നിരവധി കാരണങ്ങളാൽ ഈ ഡാറ്റയിൽ ഞങ്ങൾ ഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസം നിലനിർത്തുന്നു. ഒന്നാമത്തേത് എല്ലാ മൃഗങ്ങളെയും ഒരേ രീതിയിലായിരുന്നു കൈകാര്യം ചെയ്തിരുന്നത്. എല്ലാ ആർഎൻഎ, ശ്രേണി സംവിധാനവും ഒരേ സമയം നിർവ്വഹിക്കപ്പെട്ടു. രണ്ടാമതായി, ഞങ്ങൾ ത്രിമാന മാതൃകകൾ നടത്തി, ഓരോ മാതൃക സാമ്പിളിൽ ഒന്നിലധികം മൃഗങ്ങളെയും പൂരിപ്പിച്ചു, അതുവഴി വ്യക്തിഗത വൈവിധ്യവും, സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ ശക്തിയുംS9). മൂന്നാമതായി, ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഡാറ്റാ അനാലിസിസ് മാനദണ്ഡങ്ങൾ മൈക്രോഅറേ ക്വാളിറ്റി കൺട്രോൾ പ്രോജക്റ്റ് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, കാരണം ഉയർന്ന അളവിലുള്ള ഇന്റർസൈറ്റ് പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും അന്തർ-ഇൻട്രാപ്ലാറ്റ്ഫോം പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും നൽകുന്നതിന് ഈ മാനദണ്ഡങ്ങൾ സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.S10-S11).
വൈറൽ സദിശങ്ങളുടെ നിർമ്മാണം
വൈറൽ വെക്റ്റർ ഇൻസ്റീഷൻ സൈസ് കൺട്രെയിന്റ്സ്, ഡയാലിറ്റോൺ G9a (G9a) അല്ലെങ്കിൽ കാറ്റലിസ്റ്റ് ഡെത്ത് ജിഎക്സ്എൻഎക്സ്എ (G9aH9) എന്ന കോഡുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് മനുഷ്യ ജീവന്റെ ആദ്യകാല സൈറ്റോമോഗലോവിറസ് പ്രൊമോട്ടർ (CMV) ന്റെ നിയന്ത്രണത്തിൽ ജിഎഫ്പി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന bicistronic p1093 + HSV പ്ലാസ്മിഡിൽ ഉൾപ്പെടുത്തി. ഉൾപ്പെടുത്തൽ വലുപ്പം ~ 1005 kb ആയിരുന്നു, അത് AAV-9 വെക്റ്റുകളുടെ പരമാവധി ചേർക്കൽ വലുപ്പം കവിയുന്നു). IE3.96 / 2 പ്രൊമോട്ടർ G4a എക്സ്പ്രഷൻ നൽകുന്നു. ബ്ലന്റ് എൻഡ് ലിഗേഷനുകൾ വഴി ക്ലേനോവ്, PXI, ഇക്കോആർഐ, എക്കോആർഐ ദഹിപ്പിച്ചത് G5A (പിസിഡിഎൻ.എൻ.എൻ.എൻ.എൻ.എക്സ്.എൽ.എൻ മുതൽ), ഇക്കോആർഐ ദഹനത്തിനു ശേഷമുള്ള പാക്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എക്സ്എൽ എന്നിവയുപയോഗിച്ച് സിഗ്നലിനൊപ്പം ബ്ലാക്റോണിക് എക്സ്ക്ലൂസീവ് പി.എക്സ്.എൻ.എൻക്സ് + എച്ച്എസ്വി പ്ലാസ്മിഡിലേക്ക് പിഴവുകൾ വരുത്തി. HSV-ΔJunD-GFP ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന്, EcoRI നിയന്ത്രണ സൈറ്റുകൾ ചുറ്റുമുള്ള ΔJunD ന്റെ കോഡിംഗ് ശ്രേണി ECRRI സൈറ്റ് അടങ്ങിയ പ്രൈമർ ഓലിഗോൺക്ലിയോടൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പി.സി.ആർ വികസിപ്പിച്ചതാണ്. പിസിആർ ഉത്പന്നം പിന്നീട് പി.എക്സ്.എൻ.എൻക്സ്ക്സ് വെക്റ്റർ ഓഫ് ഇക്കോറിക് സൈറ്റിൽ എത്തിച്ചേർന്നു. എ.വി. വെക്റ്റർ ഉപയോഗിച്ച് വിവര്ത്തന-മധ്യേയുള്ള ജീനിലുള്ള ഡെലിവറിക്കാണ് എൻഎസി ന്യൂറോണുകളുടെ ക്രീം റാക്കോബിനാഷിന്റെ ലോക്കൽ എക്സ്പ്രഷൻ.S12). ജിഎഫ്പി അല്ലെങ്കിൽ ക്രേയ്‌ക്കുള്ള ജി‌എഫ്‌പിയുടെ എൻ-ടെർമിനൽ ഫ്യൂഷൻ ഒരു പുനർ‌സംയോജിത AAV-2 വെക്റ്ററിലേക്ക് ഒരു സി‌എം‌വി പ്രൊമോട്ടർ ഉൾ‌ക്കൊള്ളുന്ന ഒരു സ്പ്ലൈസ് ദാതാവിന്റെ സ്വീകർ‌ത സീക്വൻസും പോളിഅഡൈനിലേഷൻ സിഗ്നലും ഉൾക്കൊള്ളുന്നു. എല്ലാ വെക്ടർ ഇൻറീറേഷനുകളും dideoxy-sequencing വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ട്രിപ്പിൾ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ, ഹെൽപ്പർ-ഫ്രീ രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് വൈറൽ വെക്റ്ററുകൾ നിർമ്മിച്ചത് (S13). ശുദ്ധീകരിച്ച വൈറസ് −80 at C ൽ സൂക്ഷിച്ചു. HEK293 സെല്ലുകളിൽ വിശകലനം ചെയ്ത പകർച്ചവ്യാധി titer വഴി വൈറൽ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തി. AAV-osFosB-GFP വൈറസുകളും സമാനമായി തയ്യാറാക്കി. ക്രോസ് എക്സ്പ്രെഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിനും ന്യൂറോണൽ വിഷബാധ തടയാനും വേണ്ടി, ഐഎസ്എസ്എൻഎക്സ് / എക്സ്എംഎൽ പ്രൊമോട്ടർക്ക് എതിരായി, ഐഎസ്എസ് പ്രൊമോട്ടറായ HSV ക്രൈസിനുള്ള ക്രസ്റ്റ് എക്സ്പ്രഷൻ പ്രവർത്തിപ്പിക്കുകയുണ്ടായി. S14 വൈറൽ നിർമ്മാണത്തിനായി). എല്ലാ സാഹചര്യങ്ങളിലും, വൈറൽ അമിതപ്രയോഗം സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടു, രണ്ടും vitro ലെ ഒപ്പം ഇൻ വിവോ qPCR വഴി, ശസ്ത്രക്രിയയെത്തുടർന്ന് NAc- നിയന്ത്രിത പദപ്രയോഗം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് വൈറസുകൾ ഇമ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കലായി സ്ഥിരീകരിച്ചു.
സ്റ്റീരിയോളജിക്കൽ ശസ്ത്രക്രിയ
കെറ്റാമൈൻ (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) അനസ്തേഷ്യയിൽ, എലിയെ ഒരു ചെറിയ-മൃഗാ സ്റ്റീരിയോടജിക് ഉപകരണത്തിൽ നിലയുറപ്പിച്ചു, ഒപ്പം മാരകമായ ഉപരിതലവും വെളിപ്പെട്ടു. 0.5 μl / min എന്ന നിരക്കിൽ ഒരു 10 ° കോണിലുള്ള (AP + 1.6, ML + 1.5, DV - 4.4) എൻഎസിയിൽ XMX μl ൻറെ വൈറസ് ബാധയ്ക്കായി 32 കപ്പാസിറ്റി സൂചികൾ ഉപയോഗിച്ചു. എച്ച്എസ്വി കുത്തിവയ്പ്പുകൾ സ്വീകരിക്കുന്ന മൃഗങ്ങളെ ശസ്ത്രക്രിയയെത്തുടർന്ന് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ദിവസത്തേക്ക് വീണ്ടെടുക്കാൻ അനുവദിച്ചു, അതേസമയം എഎവി വെക്ടറുകൾ സ്വീകരിക്കുന്ന പെരുമാറ്റ പരിശോധനയ്ക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന എലികളെ പ്ലേസ് കണ്ടീഷനിംഗിന് വിധേയമാക്കുന്നതിന് മുമ്പ് എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ദിവസങ്ങളിൽ വീണ്ടെടുക്കാൻ അനുവദിച്ചു. ഈ സമയങ്ങൾ രണ്ട് വെക്റ്ററുകളുടെ പരമാവധി വൈറൽ-മെഡിയേറ്റഡ് ട്രാൻസ്ജെൻ എക്സ്പ്രഷന്റെ കാലഘട്ടങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. BIX0.1 സന്നിവേശത്തിനായി, രണ്ട് മിനി പമ്പുകൾ ഓരോന്നും മൗസിന്റെ പിൻഭാഗത്ത് സബ്ക്യുട്ടേനിയായി സ്ഥാപിച്ചു. എൻ‌എ‌സിക്ക് മുകളിൽ രണ്ട് ചെറിയ തലയോട്ടി ദ്വാരങ്ങൾ തുരന്നുകൊണ്ടും ബ്രെഗ്മയിൽ നിന്ന് കന്നൂല വിതരണം ചെയ്തുകൊണ്ടും (എപി + എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്; എം‌എൽ + എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്; ഡിവി - എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്) കാൻ‌യുല പ്ലെയ്‌സ്‌മെന്റുകൾ നേടാനായി. ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് ശേഷം കൊയ്നേയ്ൻ സ്ഥലത്ത് ആരംഭിക്കുന്നതിനു മുമ്പ് ശസ്ത്രക്രിയയിൽ നിന്ന് ശസ്ത്രക്രീയയിൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുക്കാൻ അനുവദിച്ചു.
ശീതീകരിച്ച സ്ഥലം മുൻഗണന
സ്ഥലം കണ്ടീഷനിംഗ് നടപടിക്രമം മുമ്പ് വിവരിച്ചപോലെ നടത്തി, താഴെപ്പറയുന്ന മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തി (S7). ചുരുക്കത്തിൽ, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP അല്ലെങ്കിൽ HSV-GFP എന്നിവയുടെ ഇൻട്രാ-എൻഎസി കഷായങ്ങൾക്ക് 1093 ദിവസത്തിനുശേഷം, എലികളെ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത പരിതസ്ഥിതികളുള്ള കണ്ടീഷനിംഗ് ചേമ്പറുകളിൽ സ്ഥാപിച്ചു. രണ്ട് കണ്ടീഷനിംഗ് അറകളിലും കാര്യമായ മുൻഗണന കാണിക്കുന്ന എലികളെ പഠനത്തിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കി (<എല്ലാ മൃഗങ്ങളിലും <10%). ഇപ്പോഴും നിലനിൽക്കുന്ന ഏതെങ്കിലും ചേംബർ ബയസ് ക്രമീകരിക്കുന്നതിന് കണ്ടീഷനിംഗ് ഗ്രൂപ്പുകൾ സമതുലിതമാക്കി. തുടർന്നുള്ള ദിവസങ്ങളിൽ മൃഗങ്ങളെ ഉപ്പുവെള്ളം കുത്തിവച്ച് ഉച്ചതിരിഞ്ഞ് ഒരു അറയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഒതുക്കി കൊക്കെയ്ൻ (10 മില്ലിഗ്രാം / കിലോ, ഐപി) കുത്തിവയ്ക്കുകയും 30 മിനിറ്റ് വൈകുന്നേരം മറ്റ് അറയിലേക്ക് 2 ദിവസം (രണ്ട് സലൈൻ, രണ്ട് കൊക്കെയ്ൻ ജോടിയാക്കൽ). പരീക്ഷണ ദിവസം, എലികളെ 20 മിനിറ്റ് ചികിത്സയില്ലാതെ ഉപകരണത്തിലേക്ക് തിരികെ വയ്ക്കുകയും ഏത് വശമാണ് അവർ ഇഷ്ടപ്പെടുന്നതെന്ന് വിലയിരുത്തുകയും ചെയ്തു. മയക്കുമരുന്ന് ചികിത്സയുടെ ഫലപ്രാപ്തി ഉറപ്പാക്കുന്നതിന് കൊക്കെയ്ൻ ജോടിയാക്കിയ അറകളിലെ ബീം ബ്രേക്കുകൾ വഴി കൊക്കെയ്നിനുള്ള ലോക്കോമോട്ടർ പ്രതികരണങ്ങൾ വിലയിരുത്തി. AAV, BIX01294 സി‌പി‌പി പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, അല്പം പരിഷ്‌ക്കരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ചു. മൃഗങ്ങളെ വീണ്ടും സലൈൻ അല്ലെങ്കിൽ കൊക്കെയ്ൻ (10 മില്ലിഗ്രാം / കിലോ, ഐപി) ഉപയോഗിച്ച് കുത്തിവയ്ക്കുകയും 30 മിനിറ്റ് സെഷനുകളിൽ പ്രത്യേക അറകളിൽ ഒതുക്കുകയും ചെയ്തു, പകരം 4 ദിവസത്തേക്ക് ഒരു ദിവസത്തിൽ ഒരിക്കൽ മാത്രമേ വ്യവസ്ഥ ചെയ്തിട്ടുള്ളൂ, തുടർന്ന് 5 ആം ദിവസത്തെ പരിശോധനയ്ക്ക് ശേഷം (മൃഗങ്ങൾക്ക് നിബന്ധന നൽകി വൈകുന്നേരവും കണ്ടീഷനിംഗ് ചികിത്സകളും മാറിമാറി). എല്ലാ ഗ്രൂപ്പുകൾ‌ക്കും, വൈറൽ അല്ലെങ്കിൽ ഇൻഹിബിറ്റർ ചികിത്സയിലൂടെ ലോക്കോമോഷനെ ബാധിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് ഉറപ്പുവരുത്തുന്നതിനായി ഉപ്പുവെള്ളത്തിനുള്ള പ്രതികരണമായി ബേസ്‌ലൈൻ ലോക്കോമോഷൻ വിലയിരുത്തി.
കോശൈൻ ഇൻക്രജൻസ് കൊക്കെയ്ൻ സ്വയം നിയന്ത്രിക്കൽ
പരീക്ഷണത്തിന്റെ തുടക്കത്തിൽ 230-250 ഗ്രാം ഭാരം വരുന്ന പുരുഷ ക o മാരക്കാരനായ ലോംഗ്-ഇവാൻസ് എലികൾ ലഭിച്ചു. വിപരീത 12 മണിക്കൂർ ലൈറ്റ് / ഡാർക്ക് സൈക്കിളിൽ (9: 00 am- ൽ ലൈറ്റുകൾ ഓഫ്) ഈർപ്പം, താപനില നിയന്ത്രിത പരിതസ്ഥിതിയിൽ അവരെ പാർപ്പിച്ചു. പരസ്യം libitum ഭക്ഷണത്തിലേക്കും വെള്ളത്തിലേക്കും പ്രവേശനം. എലികളെ അവരുടെ പുതിയ പരിതസ്ഥിതിയിൽ ആകർഷിക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും പരീക്ഷണം ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പായി 1 ആഴ്ചയിൽ ദിവസവും കൈകാര്യം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ലബോറട്ടറി മൃഗങ്ങളുടെ പരിപാലനത്തിനും ഉപയോഗത്തിനുമുള്ള നാഷണൽ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് ഹെൽത്ത് ഗൈഡ് അനുസരിച്ചാണ് എല്ലാ നടപടിക്രമങ്ങളും നടത്തിയത്, മ Mount ണ്ട് സീനായിയുടെ മൃഗസംരക്ഷണ-ഉപയോഗ സമിതി അംഗീകരിച്ചു. ലോക്കോമോട്ടറിന്റെ സ്വഭാവം അളക്കുന്നതിന് ഇൻഫ്രാറെഡ് ബീമുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സ്വയംഭരണ ഉപകരണങ്ങൾ ഘടിപ്പിച്ചിരുന്നു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ സ്വയംഭരണം നടത്തി (S15-S16) ഐസോഫ്ലൂറൻ (2.4–2.7%) അനസ്തേഷ്യയ്ക്ക് കീഴിൽ വലത് ജുഗുലാർ സിരയിൽ കത്തീറ്ററുകൾ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. 0.1 യു ഹെപ്പാരിൻ, ആംപിസിലിൻ (10 മില്ലിഗ്രാം / കിലോ) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഉപ്പുവെള്ള ലായനിയിൽ 50 മില്ലി കത്തീറ്ററുകൾ ഒഴിച്ചു. ശസ്ത്രക്രിയയിൽ നിന്ന് സുഖം പ്രാപിച്ച് ഒരാഴ്ചയെത്തുടർന്ന്, പ്രകാശ / ഇരുണ്ട ചക്രത്തിന്റെ ഇരുണ്ട ഘട്ടത്തിൽ സ്വയംഭരണ പരിശീലനം ആരംഭിച്ചു. ഒരു നിശ്ചിത അനുപാതം -3 (FR0.75) ശക്തിപ്പെടുത്തൽ ഷെഡ്യൂൾ പ്രകാരം മൃഗങ്ങൾക്ക് കൊക്കെയ്ൻ (1 mg / kg / infusion) ദിവസേന 1 മണിക്കൂർ പ്രവേശനം അനുവദിച്ചു, അവിടെ 1 സജീവ ലിവർ പ്രസ്സ് ഫലമായി മരുന്നിന്റെ ഒരു ഇൻഫ്യൂഷൻ കാരണമായി. എലികൾ 6 ദിവസത്തിനുശേഷം കൊക്കെയ്ൻ കഴിക്കുന്നത് സ്ഥിരപ്പെടുത്തി (തുടർച്ചയായ 15 ദിവസങ്ങളിൽ <3% പ്രതികരണ നിരക്കിന്റെ വ്യതിയാനം, കുറഞ്ഞത് 75% ശക്തിപ്പെടുത്തിയ ലിവറിൽ പ്രതികരിക്കുന്നു). അന്തിമ സ്വയംഭരണ സെഷനുശേഷം 24 മണിക്കൂറിനുശേഷം, എലികൾ പെട്ടെന്ന് ശിരഛേദം ചെയ്യപ്പെടുകയും തലച്ചോറുകൾ അതിവേഗം നീക്കം ചെയ്യുകയും ആർഎൻഎ ഒറ്റപ്പെടലിനും ക്യുപി‌സി‌ആറിനുമായി പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
ക്രോമോറ്റിൻ രോഗപ്രതിരോധം (ChIP)
പുതിയ NAc പഞ്ചുകൾ ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ചെയ്യുകയും മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ChIP- നായി തയ്യാറാക്കുകയും ചെയ്തു (S17-S18) ചെറിയ പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങളോടെ. ചുരുക്കത്തിൽ, ഓരോ മൃഗത്തിനും 4 14- ഗേജ് NAc പഞ്ചുകൾ ശേഖരിച്ചു, ഓരോ സാമ്പിളിലും 5 മൃഗങ്ങൾ ശേഖരിച്ചു, 1% ഫോർമാൽഡിഹൈഡുമായി ക്രോസ്-ലിങ്ക് ചെയ്യുകയും 2 M C യിൽ മരവിപ്പിക്കുന്നതിനുമുമ്പ് 80 M ഗ്ലൈസിൻ ഉപയോഗിച്ച് ശമിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. സാമ്പിൾ sonication- ന് മുമ്പുള്ള 1 ദിവസം, ആടുകളുടെ ആന്റി-റാബിറ്റ് / മൗസ് (വർഷപാത ആന്റിബോഡിയെ ആശ്രയിച്ച്) GGNUMXa (മുയൽ പോളിക്ലോണൽ ChIP ഗ്രേഡ്) അല്ലെങ്കിൽ H9K3me9 (മൗസ് മോണോക്ലോണൽ ChIP ഗ്രേഡ്) ബ്ലോക്ക് ലായനിയിൽ നിരന്തരമായ ഭ്രമണത്തിൻ കീഴിൽ 2 at C ന് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ആന്റിബോഡികൾ. ടിഷ്യു സോണിക്കേഷനും ക്രോമാറ്റിൻ ഷെയറിംഗും മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ നടത്തി (S17). സോണിക്കേഷനെത്തുടർന്ന്, ക്രോമാറ്റിന്റെ തുല്യ സാന്ദ്രത പുതിയ ട്യൂബുകളിലേക്ക് മാറ്റുകയും അന്തിമ ഉൽ‌പ്പന്നങ്ങളുടെ X 5% 'ഇൻ‌പുട്ട്' നിയന്ത്രണങ്ങളായി സംരക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു. സംയോജിത കൊന്ത / ആന്റിബോഡി മിശ്രിതങ്ങൾ നന്നായി കഴുകിയതിനുശേഷം, ഓരോ ക്രോമാറ്റിൻ സാമ്പിളിലും തുല്യ അളവിലുള്ള ആന്റിബോഡി / കൊന്ത മിശ്രിതങ്ങൾ (~ 7.5 antig ആന്റിബോഡി / സാമ്പിൾ) ചേർത്ത് 16 at C ൽ നിരന്തരമായ ഭ്രമണത്തിന് കീഴിൽ ~ 4 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. പിസിആർ ശുദ്ധീകരണ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഡി‌എൻ‌എ ശുദ്ധീകരണത്തിന് മുമ്പായി സാമ്പിളുകൾ രാത്രി മുഴുവൻ 65 at C ൽ കഴുകുകയും ക്രോസ്-ലിങ്ക് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഡി‌എൻ‌എ ശുദ്ധീകരണത്തെത്തുടർന്ന്, സാമ്പിളുകൾ qPCR ന് വിധേയമാക്കി, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ അവയുടെ ഉചിതമായ 'ഇൻ‌പുട്ട്' നിയന്ത്രണങ്ങളിലേക്ക് നോർ‌മലൈസ് ചെയ്തു (S17). സിഗ്നൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ ഉചിതമായ സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിനായി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് മ mouse സ് പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-ഐജിജി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ചുള്ള സാധാരണ മൗസ് ഐ ജി ജി ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷനുകളും നടത്തി. കൊക്കെയ്ൻ, osFosB അമിതപ്രയോഗ പരീക്ഷണങ്ങൾ എന്നിവയ്ക്കുള്ള നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി അഡെനൈൻ ഫോസ്ഫോറിബോസൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസ് (എപിആർടി) ഉപയോഗിച്ചു. കാണുക അനുബന്ധ പട്ടിക S5 പ്രൊമോട്ടർ പ്രൈമർ സീക്വൻസുകൾക്കായി.
ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനം
വിവോയിലെ ന്യൂറോണൽ മോർഫോളജി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ G9a യുടെ പങ്ക് പഠിക്കുന്നതിന്, ഇനിപ്പറയുന്ന പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങളോടെ മുമ്പ് വിവരിച്ച രീതികൾ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു (S1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-unJunD-GFP (എല്ലാ വൈറസുകളും വൈൽഡ് ടൈപ്പ് C57Bl / 6J എലികളിൽ ഉപയോഗിച്ചു), അല്ലെങ്കിൽ HSV-Cre-GFP (G9a- ൽ ഉപയോഗിച്ചുfl / fl എലികൾ), വൈറൽ എക്സ്പ്രഷൻ പരമാവധി ആയിരിക്കുമ്പോൾ, എലികൾ പെർഫ്യൂസ് ചെയ്യുകയും തലച്ചോറുകൾ ക്രയോപ്രോട്ടോക്റ്റഡ് ചെയ്യുകയും പിന്നീട് വൈബ്രടോമിൽ 100 atm ൽ വിഭജിക്കുകയും ചെയ്തു. മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ ജി‌എഫ്‌പിക്കെതിരെ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് വിഭാഗങ്ങൾ രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി നേടി (ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി കാണുക). നട്ടെല്ല് നമ്പറുകളിൽ G9a അമിതപ്രയോഗത്തിന്റെയും നോക്കൗട്ടിന്റെയും ഫലങ്ങൾ വിലയിരുത്തുന്നതിനും un JunD അമിതപ്രയോഗത്തിന്റെ ഫലവും വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഒരു ന്യൂറോണിന് ഏകദേശം 1-2 ന്യൂറൈറ്റുകളിലെ മുള്ളുകളുടെ എണ്ണം ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി, GFP- പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന NAc മീഡിയത്തിൽ നിന്നുള്ള സെക്കൻഡറി ഡെൻഡ്രൈറ്റുകളുടെ 299 μm എങ്കിലും തുല്യമാണ്. സ്പൈനി ന്യൂറോണുകൾ (എം‌എസ്‌എൻ). എൻഎസിയിലെ മറ്റ് ന്യൂറോണൽ പോപ്പുലേഷനുകളിൽ നിന്ന് എം‌എസ്‌എൻ‌മാർ രൂപാന്തരപരമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ എച്ച്എസ്വി പ്രാഥമികമായി ഈ മസ്തിഷ്ക മേഖലയിലെ ന്യൂറോണുകളെ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന DARPP-32 നെ ബാധിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്ന മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളും (S19), ഈ പഠനങ്ങളിൽ എം‌എസ്‌എൻ‌മാരെ പ്രത്യേകമായി വിലയിരുത്തിയെന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പുണ്ട്. ഓരോ മൃഗത്തിനും, ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും (6 ഗ്രൂപ്പുകൾ) 8-3 മൃഗങ്ങളിലെ ~ 4-7 ന്യൂറോണുകൾ ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു, അതിനുശേഷം സ്ഥിതിവിവര വിശകലനത്തിനായി ഓരോ മൃഗത്തിനും ശരാശരി മൂല്യം ലഭിച്ചു. എൻഎസി നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയിൽ os ഫോസ് അമിതപ്രയോഗത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ പരിശോധിക്കുന്നതിനായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പരീക്ഷണങ്ങൾ മുകളിൽ വിവരിച്ചതിന് സമാനമാണ്, എഎവി വെക്റ്ററുകൾ ജിഎഫ്പി അല്ലെങ്കിൽ os ഫോസ്ബി-ജിഎഫ്പി പ്രകടിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചത് ഒഴികെ (എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ആഴ്ചകൾ). എല്ലാ എച്ച്എസ്വി ചിത്രങ്ങളും എക്സ്എൻഎംഎക്സ്എക്സ് ഓയിൽ-ഇമ്മേഴ്ഷൻ ഒബ്ജക്റ്റോടുകൂടിയ ഒരു കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് പകർത്തിയത് (എഎൻവി ചിത്രങ്ങൾ എക്സ്എൻഎംഎക്സ്എക്സ് ഓയിൽ-ഇമ്മേഴ്ഷൻ ഒബ്ജക്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് പകർത്തി). 8 അനിയന്ത്രിതമായ യൂണിറ്റിലെ പിൻ‌ഹോളും ഒരു 100 × 63 ഫ്രെയിം വലുപ്പവും ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ നേടി. എൻ‌ഐ‌എച്ച് ഇമേജ് ജെ സോഫ്റ്റ്വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നീളം അളക്കുന്നത്, പരീക്ഷണാത്മക സ്കാനിംഗിന് മുമ്പ് സ്ലൈഡുകൾ കോഡ് ചെയ്തതിനാൽ നട്ടെല്ല് നമ്പറുകൾ പ്രാഥമിക പരീക്ഷകൻ അന്ധമായി കണക്കാക്കി. ഡെൻഡ്രൈറ്റിന്റെ 1 μm ന് മുള്ളുകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം കണക്കാക്കി.
സ്ഥിതിവിവര വിശകലനം
രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളിൽ കൂടുതലുള്ള കണ്ടീഷൻ ചെയ്ത സ്ഥല മുൻഗണനയ്ക്കും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനത്തിനും പ്രാധാന്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ വൺ, ടു-വേ ANOVA- കൾ നടത്തി. QPCR, വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ്, ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് വിശകലനം എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള മറ്റ് താരതമ്യങ്ങൾക്കായി വിദ്യാർത്ഥികളുടെ ടി ടെസ്റ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, എച്ച്എക്സ്വി-ജിഎഫ്പിയെ എച്ച്എക്സ്വി-ക്രെയുമായി ജിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സയിൽ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നുfl / fl എലികൾ, മൈക്രോഅറേ വിശകലനങ്ങൾ (മുകളിൽ കാണുക), ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്മ്യൂണോപ്രസിപ്പിറ്റേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾ. മയക്കുമരുന്ന് ചികിത്സയുടെയും വൈറസിന്റെയും പ്രധാന പ്രധാന ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിലൂടെ os ഫോസ് അമിതപ്രയോഗത്തിന് ശേഷം ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയെക്കുറിച്ചുള്ള രണ്ട് വഴികളുള്ള ANOVA വിശകലനത്തെത്തുടർന്ന് ആസൂത്രിത വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഫിഗർ ലെജന്റുകളിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന എല്ലാ മൂല്യങ്ങളും അർത്ഥമാക്കുന്നത് mean SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). എന്നതിനായുള്ള വിശദമായ സ്ഥിതിവിവര വിശകലനങ്ങൾ അത്തിപ്പഴം. 1-3 പ്രധാന വാചകത്തിൽ നൽകിയിരിക്കുന്നത്: സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾ ഉൾപ്പെടെ വിശദമായ ചിത്രം ഇതിഹാസങ്ങൾ.
അടിക്കുറിപ്പുകൾ
കയ്യെഴുത്തുപ്രതിയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടില്ലാത്ത മെറ്റീരിയലുകളൊന്നും ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടില്ലെന്ന് ഞാൻ സാക്ഷ്യപ്പെടുത്തുന്നു കൊക്കെയ്ൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയിലെ ഹിസ്റ്റോൺ മെത്തിലിൽട്രാൻസ്ഫെറസ് ജിഎക്സ്എൻഎംഎക്സയുടെ അവശ്യ പങ്ക് മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ചത് അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റിൽ ഉൾപ്പെടെ മറ്റെവിടെയെങ്കിലും പരിഗണനയിലാണ്.
മൃഗങ്ങൾ ഉപയോഗം ഉൾപ്പെടുന്ന എല്ലാ സൃഷ്ടിയുടെ ടെക്സാസ് യൂണിവേഴ്സിറ്റിയിലെ തെക്കുപടിഞ്ഞാറേ മെഡിക്കൽ സെന്റർ, വൈദ്യശാസ്ത്ര സീനായ് സ്കൂൾ ഇരു സ്ഥാപനപരവും ഇഅചുച് മാർഗനിർദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് നടത്തിയത്.
റെഫറൻസുകൾ നോട്ട്സ്
;