ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ (2006) പ്രകാരം ഡെൽറ്റ ഫോസ്ബി സ്ഥിരതയുടെ നിയന്ത്രണം

ജെ ന്യൂറോസി. 2006 May 10;26(19):5131-42.

അലെറി പി.ജി., റുഡെങ്കോ ജി, നെസ്റ്റ്ലർ ഇജെ.

ഉറവിടം

ഡിപ്പാർട്ട്മെന്റ് ഓഫ് സൈക്കിയാട്രി, സെന്റർ ഫോർ ബേസിക് ന്യൂറോ സയൻസ്, ദി യൂണിവേഴ്സിറ്റി ഓഫ് ടെക്സസ് സൗത്ത് വെസ്റ്റേൺ മെഡിക്കൽ സെന്റർ, ഡാളസ്, ടെക്സസ് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്, യു‌എസ്‌എ.

വേര്പെട്ടുനില്ക്കുന്ന

ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകം ഡെൽറ്റ ഫോസ്ബി (ഫോസ്ബിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അല്ലെങ്കിൽ ഫോസ്ബി [ഹ്രസ്വ രൂപം] എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) തലച്ചോറിലെ ദീർഘകാല പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയുടെ ഒരു പ്രധാന മധ്യസ്ഥനാണ്, ദുരുപയോഗം, സമ്മർദ്ദം, ഇലക്ട്രോകൺ‌വാൾ‌സീവ് പിടിച്ചെടുക്കൽ എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി തരം സൈക്കോ ആക്റ്റീവ് ഉത്തേജകങ്ങളിലേക്ക് വിട്ടുമാറാത്ത എക്സ്പോഷർ വഴി. . ഡെൽറ്റ ഫോസ്ബിയുടെ ഒരു പ്രത്യേകത, ഒരിക്കൽ പ്രേരിപ്പിച്ചാൽ, കൂടുതൽ ഉത്തേജനത്തിന്റെ അഭാവത്തിൽ താരതമ്യേന നീണ്ട കാലയളവിൽ ഇത് തലച്ചോറിൽ നിലനിൽക്കുന്നു എന്നതാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ വ്യക്തമായ സ്ഥിരതയ്ക്ക് അടിസ്ഥാനമായ സംവിധാനങ്ങൾ അജ്ഞാതമായി തുടരുന്നു. ഇവിടെ, ഡെൽറ്റാ ഫോസ്ബിന് താരതമ്യേന സുസ്ഥിരമായ ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്റ്റർ ആണെന്ന് തെളിയിക്കുന്നു. സെൽ സംസ്ക്കരണത്തിൽ ഏകദേശം എൺപത് സെൽഷ്യസ് എന്ന അർദ്ധായുസ്. കൂടാതെ, ഡെൽറ്റ ഫോസ്ബി തലച്ചോറിലെ ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണെന്നും ഡെൽറ്റ ഫോസ്ബിയിലെ ഉയർന്ന സംരക്ഷിത സെറീൻ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ (സെർഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്) ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ അതിനെ പ്രോട്ടീസോമൽ നശീകരണത്തിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ഈ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ കെയ്‌സിൻ കൈനാസ് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്ന നിരവധി തെളിവുകൾ ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു. ഈ കണ്ടെത്തലുകൾ, ഡെൽറ്റാ ഫോസ്ബിന് ഫോസ്ഫോറലിസ്റ്റാണ് എന്നും ഫോസ്ഫോറലേഷൻ അതിന്റെ സ്ഥിരതയ്ക്ക് സഹായിക്കുന്നുവെന്നും തെളിയിക്കുന്ന ആദ്യ തെളിവുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു, മസ്തിഷ്കത്തിൽ ദീർഘകാലമായി നിലനിൽക്കുന്ന അനുകരണങ്ങളിൽ മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാനുള്ള ശേഷിയിലാണ് അത്.

അവതാരിക

ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകം osFosB, ഫോസ്ബിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അല്ലെങ്കിൽ ഫോസ്ബി [ഹ്രസ്വ രൂപം] എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഇത് സി ടെർമിനസ്-വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ സ്പ്ലൈസ് വേരിയന്റാണ്. fosb (ഡോബ്രാസാൻസ്കിയും മറ്റുപേരും., 1991; നകബേപ്പും നഥാനയും, 1991; യെൻ മറ്റുള്ളവരും., 1991). മുഴുനീള ഫോസ്ബിയെപ്പോലെ, os ഫോസ്ബിക്കും ഒരു ഡി‌എൻ‌എ-ബൈൻഡിംഗ് അടിസ്ഥാന ഡൊമെയ്‌നും ഒരു ലൂസിൻ സിപ്പറും ഉണ്ട്, അതിലൂടെ അത് ജൂൺ പ്രോട്ടീനുകളുമായി ഡൈമൈറൈസ് ചെയ്യുകയും ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീൻ-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് (എപി-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്) ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ കോംപ്ലക്സുകൾ രൂപപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് നിരവധി ജീനുകളുടെ ആവിഷ്കാരത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു (മോർഗനും കുറാനും, 1995; റൈൽ‌സ്കി, കാക്സ്‌മറെക്, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്). ഫോസ്ബിയുടെ സി ടെർമിനസിൽ ട്രാൻസാക്റ്റിവേഷൻ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ഒരു ഭാഗം ഇല്ലെങ്കിലും, സംസ്ക്കരിച്ച സെല്ലുകളിലും തലച്ചോറിലും ശക്തമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആക്റ്റിവേറ്ററായും റെപ്രസറായും os ഫോസ്ബി പ്രവർത്തിക്കുന്നു (ഡോബ്രാസാൻസ്കിയും മറ്റുപേരും., 1991; നകബേപ്പും നഥാനയും, 1991; ചെൻ et al., 1997; മക്ലംഗ്ഗും നെസ്റ്റ്ലറും, 2003; കുമാർ et al., 2005).

Δസമ്മർദ്ദം, ചില നിഖേദ്, ആന്റി സൈക്കോട്ടിക്, ആന്റീഡിപ്രസന്റ് മരുന്നുകൾ, ദുരുപയോഗ മരുന്നുകൾ, പ്രകൃതിദത്ത പ്രതിഫലങ്ങൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ പലതരം സൈക്കോ ആക്റ്റീവ് ഉത്തേജനങ്ങളിലേക്ക് എക്സ്പോഷർ ചെയ്യുന്നത് വിട്ടുമാറാത്തതും എന്നാൽ നിശിതവുമല്ല, തലച്ചോറിലെ ഒരു പ്രദേശ നിർദ്ദിഷ്ട രീതിയിലാണ് ഫോസ്ബിയെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നത്. (പ്രതീക്ഷയും മറ്റും., 1994b; ഹായ്റോ ആൻഡ് ഗ്രേബെൽ, 1996; മൊറാറ്റല്ല et al., 1996; Bing et al., 1997; മാൻഡൽചെസ് മറ്റുള്ളവരും., 1997; കേൽസ് മറ്റ് പേരുകൾ, 1999; വെർമെ, et al., 2002; ആൻഡേഴ്സൺ മറ്റുള്ളവരും, 2003; കോൾബി et al., 2003; പീക്ക്മാൻ et al., 2003; പെറൊറ്റി et al., 2004; സക്കറിയൗ, മറ്റ് എട്ട്., 2006). OssFosB യുടെ ഇൻഡക്ഷൻ തലച്ചോറിലെ ഈ ഉത്തേജനങ്ങളുടെ പല പ്രവർത്തന ഫലങ്ങളുമായി നേരിട്ട് ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. അധിക ഉത്തേജനത്തിന്റെ അഭാവത്തിൽപ്പോലും osFosB യുടെ സ്ഥിരത മറ്റ് എല്ലാ ഫോസ് ഫാമിലി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളിൽ നിന്നും വേർതിരിച്ചറിയുന്നു, അവ നിശിത ഉത്തേജനങ്ങളോട് പ്രതികരിക്കുന്നതിന് അതിവേഗം പ്രചോദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, ഏതാനും മണിക്കൂറുകൾക്കുള്ളിൽ ബേസൽ ലെവലിലേക്ക് ക്ഷയിക്കുന്നു, കൂടാതെ വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനത്തിനുശേഷം ഡിസെൻസിറ്റൈസേഷൻ കാണിക്കുന്നു (മറ്റുള്ളവരും പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു., XX; ഡുവൂനിസ് et al., 1993; പെർസിക്കോ മറ്റുള്ളവരും, 1993; ഹായ്റോ ആൻഡ് ഗ്രേബെൽ, 1996; പെറൊറ്റി et al., 2004). ചില വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന സ്ഥിരതയുള്ള ന്യൂറോണൽ അഡാപ്റ്റേഷനുകൾക്ക് അടിവരയിടുന്ന ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ ദീർഘകാലം നിലനിൽക്കുന്ന ചില മാറ്റങ്ങൾക്ക് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാൻ ഇത് ΔFosB ആകർഷകമായ സ്ഥാനാർത്ഥിയാക്കുന്നു.

കാരണം ΔFosB ന്റെ ദീർഘമായ സാന്നിദ്ധ്യം അതിന്റെ mRNA ന്റെ ഉദ്വമനത്തിന്റെ അഭാവത്തിൽ സംഭവിക്കുന്നു (ചെൻ et al., 1995), ആന്തരികമായി അസ്ഥിരമായിരിക്കുന്ന മുഴുനീള ഫോസ്ബിയും മറ്റ് എല്ലാ ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളും പോലെയല്ല, os ഫോസ്ബി അസാധാരണമായി സ്ഥിരതയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമായിരിക്കാം (പ്രതീക്ഷയും മറ്റും., 1994b; ചെൻ et al., 1997; നെസ്റ്റ്ലർ et al., 2001; മക്ക്ലുങ്ങ് et al., 2004). മാത്രമല്ല, അക്യൂട്ട്-വേഴ്സസ് ക്രോണിക്-സ്റ്റിമുലേറ്റഡ് ബ്രെയിൻ ടിഷ്യുവിന്റെ ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വിശകലനം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് osFosB പ്രത്യക്ഷത്തിൽ മാറുന്നു എന്നാണ് M_r ക്രോണിക് ട്രീറ്റ്മെന്റിന്റെ സമയത്ത് ~33 kDa മുതൽ (തന്മാത്ര പിണ്ഡം) നിശിതമായ നിലയിലെ ~35-37 kDa വരെ (മറ്റുള്ളവരും പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു., XX; ചെൻ et al., 1995). ഈ വിവിധ ഐസോഫോമുകൾക്കായി കൂടുതൽ എന്ആർഎൻഎസുകളുണ്ടാക്കാൻ യാതൊരു തെളിവുമില്ല. കാരണം ΔFOSB posttranslationally modified ആണ്, ഇത് അസാധാരണമായ സ്ഥിരതയ്ക്ക് കാരണമാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ ഊഹിച്ചു. എന്നാൽ ഇന്നുവരെ, ΔFosB യുടെ വിറ്റുവരവിന്റെയോ പോസ്റ്റ്റ്റേറ്റർമാർക്ക് പരിഷ്ക്കരണത്തിന്റെയോ ബയോകെമിക് വിശകലനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടില്ല. StudyFosB ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണെന്നും അതിന്റെ സ്ഥിരതയിൽ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നുണ്ടോ എന്നും നിർണ്ണയിക്കുകയായിരുന്നു ഇപ്പോഴത്തെ പഠനത്തിന്റെ ലക്ഷ്യം.

മുമ്പത്തെ വിഭാഗം അടുത്ത വിഭാഗം

വസ്തുക്കളും രീതികളും

സസ്തനി സെൽ ലൈനുകളും ഡി‌എൻ‌എ നിർമാണങ്ങളും.

എൽ-ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ (എൽ-ഗ്ലിൻ) അടങ്ങിയ ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ഡിഎംഇഎമ്മിൽ പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ (ക്ലോൺടെക്, മ ain ണ്ടെയ്‌ൻ‌വ്യൂ, സി‌എ) സംസ്ക്കരിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ ബോവിൻ സെറം (എഫ്ബി‌എസ്), എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% കുതിര സെറം (ഇൻ‌വിട്രോജൻ, കാൾ‌സ്ബാഡ്, സി‌എ എന്നിവയിൽ നിന്ന്) , 12 U / ml പെൻസിലിൻ, 5 μg / ml സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (രണ്ടും സിഗ്മ-ആൽ‌ഡ്രിക്ക്, സെന്റ് ലൂയിസ്, MO എന്നിവയിൽ നിന്ന്). ഹെൽ സെല്ലുകൾ (അമേരിക്കൻ ടൈപ്പ് കൾച്ചർ ക്ലോഡ്, മാനസ്സാസ്, വിഎ) എൽ-ഗ്ലെനിന്റെ അടങ്ങിയ ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ഡിഎംഇമത്തിൽ സംസ്കൃതം ചെയ്തു. കൂടാതെ, എൺപതു% എഫ്.ബി.എസ്, പെൻസിസിലിൻ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ എന്നിവയും അനുബന്ധമായി ചേർത്തിരുന്നു. രണ്ട് സെൽ ലൈനുകളും 10 ° C ൽ ഈർപ്പമുള്ള 100% CO ൽ പരിപാലിച്ചു₂ അന്തരീക്ഷം.

ഡി‌എൻ‌എയുമായുള്ള ക്ഷണികമായ കൈമാറ്റങ്ങൾ‌ക്കായി, പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അല്ലെങ്കിൽ ഹെല സെല്ലുകൾ ആറ് കിണറുകളുള്ള പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് (പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾക്ക് കൊളാജൻ I ഉപയോഗിച്ച് പൂശുന്നു) വിത്ത് നൽകി, അങ്ങനെ അടുത്ത ദിവസം എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്% സംഗമസ്ഥാനത്ത് എത്തുകയും പിന്നീട് ലിപോഫെക്റ്റാമൈൻ എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് (ഇൻ‌വിട്രോജൻ) ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ചില പരീക്ഷണങ്ങളിൽ (കാണുക അത്തിപ്പഴം. 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFOSB പിക്സിഎക്സ്എക്സ് സെല്ലുകളിൽ റിഗ്ര്ടിനന്റ് ഹെർപെസ് സിംപ്ലക്സ് വൈറസ് (HSV) അണുബാധയിലൂടെ പ്രകടിപ്പിച്ചു.

OsFosB, FosB cDNA- കൾ ഞങ്ങളുടെ സ്വന്തം pTetop- നിർമ്മിതികളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ചു (ചെൻ et al., 1997), പി‌സി‌ഡി‌എൻ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് വെക്റ്ററിലേക്ക് (ഇൻ‌വിട്രോജൻ) ഉപക്ലോൺ ചെയ്തു. ഈ pcDNA3.1-osFosB / FosB നിർമ്മിതികൾ സസ്തന കോശങ്ങളിലെ ആവിഷ്കാരത്തിനും സൈറ്റ്-സംവിധാനം മ്യൂട്ടജെനിസിസിനായുള്ള ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായും ഉപയോഗിച്ചു. പുനർ‌സംയോജനം HSV-osFosB മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ തയ്യാറാക്കി (നെവ് et al., 1997), ഒപ്പം തയ്യാറെടുപ്പിന് ∼1 × 10 എന്ന ശീർഷകം ഉണ്ടായിരുന്നു⁸ pfu / ml.

പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ.

അണുബാധ / കൈമാറ്റം കഴിഞ്ഞ് ഏകദേശം 24 h, ആറ് കിണറുകളിലുള്ള പ്ലേറ്റുകളിലെ സെല്ലുകൾ (പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അല്ലെങ്കിൽ ഹെല) രണ്ട് മൂന്ന് തവണ എക്സ്ബി‌എൻ‌എം‌എക്സ് മില്ലി പി‌ബി‌എസ് ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുകയും 12 ° C ന് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് എച്ച് സി‌എൻ‌എസ് / മെറ്റ്-ഫ്രീ ഡി‌എം‌എം (ഇൻവിട്രോജൻ) മെറ്റ്, സിസ് എന്നിവയുടെ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ പൂളുകൾ ഇല്ലാതാക്കുന്നതിന് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ഡയാലിസ്ഡ് എഫ്ബി‌എസ് (ഹൈക്ലോൺ, ലോഗൻ, യുടി) അനുബന്ധമായി. ഈ “പട്ടിണി” കാലയളവിന്റെ അവസാനത്തിൽ, മരുന്നുകൾ (സെല്ലുകൾക്ക് ചികിത്സ നൽകണമെങ്കിൽ) ചേർക്കുകയും സെല്ലുകൾ 2-37 μCi ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്യുകയും (പൾസ്) ³⁵എസ് പ്രോട്ടീൻ ലേബലിംഗ് മിക്സ് (പെര്ക്കിന്ലര്, വെല്ലസ്ലി, എം‌എ) പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച എല്ലാ പ്രോട്ടീനുകളെയും ലേബൽ ചെയ്യുന്നതിന് 1 at C ലെ ∼37 h ന്. പിന്നീട് PBS- ന്റെ 2 മില്ലിമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾ രണ്ടുമൂന്നു തവണ കഴുകി റേഡിയോൾബെൽ നീക്കം ചെയ്തു ³⁵എസ്-ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകളെ (ചേസ്) പിന്തുടർന്ന് മീഡിയം “കോൾഡ്” (നോൺ‌ റേഡിയോ ആക്റ്റീവ്) മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% എഫ്ബി‌എസ് നൽകി വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ കോശങ്ങൾ വിളവെടുത്തു. ചിരിക്കുമ്പോൾ ഉടൻ സെൽ ട്രീറ്റ്മെൻറുകൾ പരിപാലിക്കപ്പെട്ടു. ഈ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ എല്ലാ കണക്കുകളും അവയുടെ വിറ്റുവരവ് താരതമ്യേന മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് വിവിധ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സമാന അനുപാതങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.

മൃഗങ്ങളും വിട്ടുമാറാത്ത ഇലക്ട്രോകൺ‌വാൾ‌സീവ് പിടിച്ചെടുക്കൽ ചികിത്സയും.

മുതിർന്ന സ്പ്രാഗ് ഡാവ്‌ലി ആൺ എലികളെ (200-300 g; ചാൾസ് റിവർ ലബോറട്ടറീസ്, കിംഗ്സ്റ്റൺ, RI) ദിവസേന ഒരിക്കൽ 7-9 d നായി ഇലക്ട്രോകൺ‌വാൾ‌സീവ് പിടിച്ചെടുക്കൽ (ECS) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഇസി‌എസ് നടപ്പാക്കി (മറ്റുള്ളവരും പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു., XX) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു യുഗോ ബേസിൽ (Comerio VA, ഇറ്റലി) താഴെക്കൊടുത്തിരിക്കുന്ന സജ്ജീകരണങ്ങളുള്ള ECS യൂണിറ്റ്: ഫ്രീക്വൻസി, പമ്പുകൾ / സെ. പൾസ്, 100 എംഎം; ഷോക്ക് ദൈർഘ്യം, 0.5 s; നിലവിലെ, 1.0 mA. വൈദ്യുതപ്രവാഹമില്ലാതെ ഇയർ-ക്ലിപ്പ് ഇലക്ട്രോഡുകൾ പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് ഷാം കൺട്രോൾ മൃഗങ്ങളെ സമാന്തരമായി പരിഗണിച്ചു.

³² പി മെറ്റബോളിക് ലേബലിംഗ്.

മസ്തിഷ്ക കഷ്ണങ്ങളുടെ ലേബലിംഗിനായി, എലികൾ ശിരഛേദം ചെയ്യപ്പെട്ടു, തലച്ചോറുകൾ വേഗത്തിൽ വിച്ഛേദിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് frontm ഫ്രന്റൽ കോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകൾ ഒരു ഡി‌എസ്‌കെ മൈക്രോസ്‌ലൈസർ (ടെഡ് പെല്ല, റെഡ്ഡിംഗ്, സി‌എ) ഉപയോഗിച്ച് തയ്യാറാക്കി. കഷ്ണങ്ങൾ പ്ലാസ്റ്റിക് ട്യൂബുകൾക്കുള്ളിൽ ഫോസ്ഫേറ്റ് കുറവുള്ള കൃത്രിമ സി.എസ്.എഫ് (എ.സി.എസ്.എഫ്) ൽ പ്ലാസ്റ്റിക് ട്യൂബുകൾക്കുള്ളിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ഒ.എൻ.₂/ കോ₂ മിശ്രിതം (ഹെമ്മിംഗ്സ് മറ്റുള്ളവരും., 1989). Okadaic ആസിഡ് (1.3 ng / ml) സാന്നിധ്യത്തിൽ അല്ലെങ്കിൽ അഭാവത്തിൽ, കഷണങ്ങൾ (രണ്ട് ട്യൂബ് ട്യൂബ്) 8-10 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ 100 mCi ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തു. ഈ ഇൻകുബേഷൻ അവസാനത്തോടെ, തണുത്ത എസിഎസ്എഫ് ഉപയോഗിച്ച് മൂന്നു തവണയെങ്കിലും വെട്ടി കഴുകുക. കൂടാതെ, 250 μl തണുത്ത റേഡിയോഇൻമോൺക്രീപ്പിഷൻ അസ്സെ (RPA) ബഫറിലുള്ള പിപിഎസ്, പിഎച്ച് 7.4, XNUM മില്ലീമീറ്റർ NaCl, 150% (v / v ) എസ്ടെൽ, 1% (w / v) സോഡിയം ഡിക്സോമൈല്ലാറ്റ്, 0.5% (w / v) SDS, 0.1 മില്ലീമീറ്റർ EDTA] സപ്പോർട്ടുചെയ്തത് എസ്.ഡി.എസ് ഉപയോഗിച്ച് 1% വരെ, സസ്തനി സെല്ലുകൾക്ക് പ്രോട്ടീൻ ഇൻഹൈറ്ററി കോക്ക്ടെയിൽ (0.6 μl / ml; സിഗ്മ-അൽഡ്രീക്ക്), ഫോസ്ഫേറ്റസ് ഇൻഹൈറ്റിറ്റർ കോക്ടെയിലുകളിൽ ഒന്നാമത്തേതും (5: 1; സിഗ്മ-അൽഡ്രീക്), എൺപത് മില്ലീമീറ്റർ പിഎംഎസ്എഫ്, കൂടാതെ ഗ്ലൂറസോൾ 100%. 1 മിനുട്ടിൽ ഹോമോജെനേറ്റുകൾ തിളപ്പിച്ച് 2 at ൽ കേന്ദ്രീകൃതമാക്കൽ വഴി മായ്‌ച്ചു g XNUM മിനിറ്റിനുള്ളിൽ. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന സൂപ്പർനേറ്ററുകൾക്ക് പ്രോട്ടീൻ കോൺസൺട്രേഷൻ BCA പ്രോട്ടീൻ അസെ (Pierce, Holmdel, NJ) ഉപയോഗിച്ചാണ് കണക്കാക്കുന്നത്.

വേണ്ടി ³²ഇൻഫെക്ഷൻ / ട്രാൻസ്ഫക്ഷൻ കഴിഞ്ഞ് ~ 2/10 എച്ച് സംസ്ക്കര സെല്ലുകളുടെ ലേബലിംഗും, ഫോസ്ഫേറ്റ് ഇല്ലാത്ത മീഡിയയിൽ സെല്ലുകൾ രണ്ടോ മൂന്നോ തവണ കഴുകി, ഈ മാധ്യത്തിൽ ~ എം.എ.എൻ. എച്ച്. ഈ പട്ടിണി കാലയളവിനുശേഷം, ന്റെ 24 - 1 mCi ³²PH₃PO₄ (പെര്ക്കിന്ലര്) ഓരോ കിണറിലേക്കും ചേർത്തു, കൂടാതെ സെല്ലുകളെ 4-12 h നായി ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നത് ഏത് തരത്തിലുള്ള പരീക്ഷണത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (അത്തിപ്പഴം കാണുക. സവിശേഷതകൾക്കായി 1-7). പിഎസ്എസുകളുമായി മൂന്നു തവണ കഴുകി കളയുകയും, 15 μl അനുബന്ധമായ RIPA ബഫറുള്ള എൺപത് മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ഐസ് കഷണത്തിലാക്കി. ലിസറ്റുകൾ സ്കാഷ്ചെയ്ത് ശേഖരിക്കപ്പെടുകയും, 50 തവണയിൽ തിളപ്പിച്ച്, ഡിഎൻഎയെ പിടിക്കാൻ 10 ga സൂചി ഉപയോഗിച്ച് 25 തവണ പാസാക്കുകയും, 10 മണിക്ക് തിളപ്പിക്കുകയും, 15,000- നും 15 മണിക്ക് 30- ൽ rpm ന് സെന്റീഫൈഗുഡ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ക്ലിയർ lysates (supernatants) ഒരു പുതിയ ട്യൂബ് ലേക്കുള്ള കൈമാറി ഒരു ബി.സി.എ പ്രോട്ടീൻ അസ്സേ (പിയേഴ്സ്) ചെയ്തു. ഈ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ എല്ലാ കണക്കുകളും അവയുടെ ആപേക്ഷിക ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ അളവുകളുടെ താരതമ്യം ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് മൊത്തം വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (ഡബ്ല്യുടി), എസ്എക്സ്നുംക്സ os ഫോസ്ബി പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ കാണിക്കുന്നു.

കെമിക്കൽസ്, സെൽ കൾച്ചർ ട്രീറ്റ്മെന്റ്.

ഒകാഡൈക് ആസിഡ് (OA; സിഗ്മ-ആൽ‌ഡ്രിച്ച്) എത്തനോൾ ലയിപ്പിക്കുകയും 100 ng / ml എന്ന അന്തിമ സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. 5,6-Dichloro-1-d-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ (DMSO; സിഗ്മ-ആൽ‌ഡ്രിച്ച്) ലയിപ്പിക്കുകയും 50 ofm ന്റെ അന്തിമ സാന്ദ്രതയിൽ സെൽ സംസ്കാരത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. Spermine (Sigma-Aldrich) വെള്ളത്തിൽ പിരിച്ചുവിടുകയും 200 μm എന്ന അവസാന സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. കാലിഫോസ്റ്റ്-സി (ബയോമോൾ) DMSO ൽ പിരിച്ചുവിടുകയും 0.2 μm യിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു, എന്നാൽ phorbol 12-myristate 13- അസറ്റേറ്റ് (PMA, Promega, Madison, WI) DMSO ൽ പിരിച്ചുവിടുകയും 0.1 μm ൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. mysteroylated-autocamtide-2- ബന്ധപ്പെട്ട ഇൻഫിബറ്റീരിയ പെപ്റ്റൈഡ് (m-AIP, Biomol) വെള്ളത്തിൽ പിരിച്ചുവിടുകയും 1- ഉം 10 μm- ന്റെ അവസാന കോൺസൺഷനിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. ബ്രോഡ്-സ്പെക്ട്രം പ്രോട്ടീൻ കൈനാസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകളായ H-7, H-8 (ബയോമോൾ) എന്നിവ വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കുകയും യഥാക്രമം 150, 200 μm എന്നിവയുടെ സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. എം‌ജി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് (കാൽ‌ബിയോകെം, സാൻ ഡീഗോ, സി‌എ), എപോക്സോമൈസിൻ (പെപ്റ്റൈഡ്സ് ഇന്റർനാഷണൽ, ലൂയിസ്‌വില്ലെ, കെ‌വൈ) എന്നിവ രണ്ടും ഡി‌എം‌എസ്‌ഒയിൽ ലയിപ്പിക്കുകയും യഥാക്രമം 132, 12.5 μm എന്നിവയുടെ സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളിലും, ചികിത്സകളിലുടനീളം സ്ഥിരമായി ഡിഎംഎസ്ഒ നിലനിർത്തുന്നതിന് ആവശ്യമായ സെല്ലുകളിലേക്ക് ഡിഎംഎസ്ഒ (വാഹനം) ചേർത്തു. വേണ്ടി ³²P ലേബലിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങൾ, ലേബലുകൾ മുമ്പിൽ ഉടൻ ചേർത്തു മരുന്നുകൾ ലേബൽ കാലയളവിൽ ശേഷിക്കുന്ന. പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, സിസ് / മെറ്റ് "പട്ടിണി" സമയത്ത് മരുന്നുകൾ ചേർത്തു, ലേബൽ കാലയളവിൽ സൂക്ഷിച്ചു, പിന്നീട് വീണ്ടും ചേസ് മീഡിയത്തിലേക്ക് കൂട്ടിച്ചേർത്തു. ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വിറ്റുവരവിന് നഷ്ടപരിഹാരം നൽകിക്കൊണ്ട് പ്രോമാസോം ഇൻഹെബിറ്ററുകൾ ഓരോ 3- 4 മില്ലിയിലും പരന്നിരുന്നു.

Os ഫോസ് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷൻ, ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ്, ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രഫി.

ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷനായി, ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷനുമായി (ഐപി) മുന്നോട്ടുപോകുന്നതിനുമുമ്പ് എസ്‌ഡി‌എസ് ഏകാഗ്രത 1% ലേക്ക് എത്തിക്കുന്നതിന് പ്ലെയിൻ‌ ആർ‌പി‌എ ഉപയോഗിച്ച് ലൈസേറ്റുകൾ 5: 0.1 ലയിപ്പിച്ചിരുന്നു. നിർദ്ദിഷ്ട ബൈൻഡിംഗ് പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നതിന്, കുറഞ്ഞത് 4 h വരെ നോൺ ഇമ്മ്യൂൺ IgG, പ്രോട്ടീൻ G- സെഫറോസ് (സിഗ്മ-ആൽ‌ഡ്രിക്ക്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി ഉപയോഗിച്ചാണ് ലൈസേറ്റുകൾ ആദ്യം മായ്ച്ചത്. Δ ഫോസ്ബിയെ ക്ലിയർ ചെയ്ത ലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്ന് ഒരു ആട് പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിരോധശേഷി നൽകി, ഇത് ഫോസ്ബി, ഫോസ്ബി (എസ്‌സി-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്ജി; സാന്താക്രൂസ് ബയോടെക്നോളജി, സാന്താക്രൂസ്, സി‌എ) എന്നിവയിലെ ഒരു ആന്തരിക എപ്പിറ്റോപ്പിനെ തിരിച്ചറിയുന്നു. മൊത്തം പ്രോട്ടീനിലുള്ള 48-0.5 μg) മൊത്തം വോള്യം 1 മില്ലി. ഒരു റോട്ടറിൽ കുറഞ്ഞത് 10 h വരെ ഐപികൾ സ N മ്യമായി കലർത്തി, തുടർന്ന് 50 proteinl പ്രോട്ടീൻ ജി-സെഫറോസ് ചേർക്കുകയും കുറഞ്ഞത് മറ്റൊരു 300 h നായി IP കൾ ചേർക്കുകയും ചെയ്തു. 0.5 at ൽ കറങ്ങിക്കൊണ്ട് IP- കൾ വലിച്ചെറിഞ്ഞു g 3 ° C യിൽ 5- XNUM മിനിറ്റിന്, 4 മില്ലിമീറ്റർ തണുത്ത പ്ലെയിൻ RIPA യിൽ മൂന്ന് തവണ കഴുകി, രണ്ടുതവണ തണുത്ത PBS അടങ്ങിയ, 0.5% Tween 0.1 അടങ്ങിയ. ഐ.പി-കൾ ഒരു പുതിയ ട്യൂബിൽ പതിച്ച XMSX മില്ലി തണുത്ത PBS- ൽ പുനർ പൂർപ്പിക്കുകയുണ്ടായി, കൂടാതെ ഇമ്യൂണോപ്രിസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ 20-0.5 μl ന്റെ XAMEX പ്രോട്ടീൻ സാമ്പിൾ ബഫർ കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. ഈ ഐപി പ്രോട്ടോക്കോൾ ഫലമായി ഫലപ്രദവും ഫലപ്രദവുമായ ഒഴുക്കിനെ ലസിറ്റിലുള്ള എല്ലാ ΔFosB ലും ബാധിച്ചു. ഒരു ഐ‌എൻ‌എമ്മിനെ ഒരു എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്% ട്രിസ്-എച്ച്സി‌എൽ മാനദണ്ഡ ജെല്ലിൽ (ബയോ-റാഡ്, ഹെർക്കുലീസ്, സി‌എ) ലോഡുചെയ്തുകൊണ്ട് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ എസ്‌ഡി‌എസ്-പേജിന് വിധേയമാക്കി, തുടർന്ന് പിവിഡിഎഫ് അല്ലെങ്കിൽ നൈട്രോസെല്ലുലോസിലേക്ക് മാറ്റി. കൈമാറ്റത്തിനുശേഷം, മെംബ്രൺ വായു-ഉണങ്ങിയതും ³²പി ³⁵കോഡക് (റോച്ചസ്റ്റർ, NY) autoradiographic ഫിലിം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു എസ്-റേഡിയോ ബയോളഡ് പ്രോട്ടീൻ ബാൻഡുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു. കൂടാതെ ഒരു കൊടുങ്കാറ്റ് (അമർഷം ബയോസയൻസസ്, പിസ്കറ്റേയ്, എൻജെ) ഫോസ്ഫോരിമാജർ ഉപയോഗിച്ച് ഫോസ്ഫോർമിംഗിങ് വഴി എസ്. സെൽ lysates അല്ലെങ്കിൽ തലച്ചോറ് homogenates ലെ മൊത്തം (unphosphorylated ആൻഡ് phosphorylated) ΔFosB രോഗപ്രതിരോധം പ്രോട്ടീന്റെ (പ്രതിരോധം കണ്ടെത്തുന്നു ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരേ മെംബരൺ ഉപയോഗിച്ച് immunoblotting വഴി കണ്ടെത്തി ³²പി-ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീൻ), അല്ലെങ്കിൽ തുല്യ അളവിലുള്ള ലൈസേറ്റ് / ഹോമോജെനേറ്റ് പ്രോട്ടീൻ എസ്‌ഡി‌എസ്-പേജിന് വിധേയമാക്കി പിവിഡിഎഫ് അല്ലെങ്കിൽ നൈട്രോസെല്ലുലോസിലേക്ക് മാറ്റുന്നു. പി‌ബി‌എസിലെ 1% (w / v) നോൺ‌ഫാറ്റ് ഡ്രൈ പാൽ (ബയോ-റാഡ്) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻ‌ക്യുബേറ്റ് ചെയ്താണ് മെംബ്രൺ ആദ്യം തടഞ്ഞത്. 0.1 h ന് 20 h ന് 1% (v / v) ട്വീൻ 25 (സിഗ്മ). ഈ അൾട്രാവയലറ്റ് ആസിനോ ആസിഡുകളായ FosB / ΔFosB (4: 1) ഉപയോഗിച്ചിരുന്ന അമിനോ ആസിഡുകളേക്കാൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന ഞങ്ങളുടെ സ്വന്തം മുയൽ ആൻറി ഫോസ്ബി പോളിക് കോണെൽ ആൻറിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഈ അൾട്രാവയലറ്റ് സ്ഫോടനം നടന്നത്. പ്രാഥമിക ഇൻകുബേഷനു ശേഷം, 8 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ചർമ്മം തടയുന്നതിനുള്ള നാല് തവണ കഴുകി, എന്നിട്ട് ~ 16 ° C ൽ ഒരു കോലാട്ടിൻ ആന്റി-മുയൽ ഐ.ജി.ജി ഉപയോഗിച്ച് HARDERADIS പെറോക്സൈഡസുമായി ചേർന്ന് ~ XXX ~ H ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ലബോറട്ടറീസ്, ബർലിംഗാം, സി‌എ). മെംബ്രുകൾ പിന്നീട് ബബിളിനെ തടയുന്നതിന് 1 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ മൂന്ന് തവണ കഴുകി, ഒരു മിനിറ്റ് പി.ബി.എസ്സിനൊപ്പം. കോഡക് എം ആർ ഫിലിമിൽ മെച്ചപ്പെട്ട ചെമ്മിലിമൈനൻസ് (പിയേഴ്സ്) കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ ECL- പ്ലസ് റാഗന്റ്സ് (അമെർസം ബയോസയൻസസ്), സ്റ്റോം ഫോസ്ഫോർമർ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലൂറോസെസൻസ് കണ്ടുപിടിച്ചുകൊണ്ട് ആകെ ΔFosB പ്രോട്ടീൻ ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.

പ്രാണികളുടെ കോശങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പുന omb സംയോജന ΔFosB യുടെ അമിതപ്രയോഗവും ശുദ്ധീകരണവും.

T ബാക്-ടു-ബാക് ബാക്കുലോവൈറസ് എക്സ്പ്രഷൻ സിസ്റ്റം (ഇൻവിട്രോജൻ) ഉപയോഗിച്ചും നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ചും എൻ ടെർമിനസ് ഹെക്സ-ഹിസ്-ടാഗുചെയ്ത പ്രോട്ടീൻ (എൻ-ഹിസ് (എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്) os ഫോസ്ബി) ആയി എസ്‌എഫ്‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് പ്രാണികളിലെ സെല്ലുകളിൽ അമിതമായി സമ്മർദ്ദം ചെലുത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, F എഫ്എഫ്എസ്ബി സി ഡി ഏഎൻ (ശേഷിപ്പുകൾ 9- 6) മുൻപ് എൻ-ടെർമിനൽ ടാഗ് MGHHHHHAG ന് പി.എഫ്.സ്റ്റാറ്റ്ബിക്എംഎക്സ്.എം.എക്സ്ക്സ് വെക്റ്ററിലാണ് സബ്കൺ ചെയ്തത്. ഇത് വീണ്ടും ബംബുലോയറസ് ഉണ്ടാക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു. SF2 സെല്ലുകൾ റാക്കോബിൻറേറ്റ് വൈറസ് ബാധിച്ചു, കൂടാതെ N-His (237) ΔFosB ഒരു സെൽഫ് ക്ലൈറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ക്രോമോറ്റോഗ്രാഫിക് പടികളിലൂടെ ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ടു. നിക്കോൾ കോളം (ക്യുയാജൻ, വലെൻസിയ, സിഎ) ബയോസയൻസസ്), ജെൽ-ഫിൽട്ടേഷൻ കോളം (അമെർസം ബയോസയൻസസ്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വലുപ്പമുള്ള ഒഴിവാക്കൽ.

ഇൻ విటോ ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ പഠനങ്ങൾ.

ഇൻ విటോ ടൈം കോഴ്സിനും സ്റ്റൈക്കിയോമെട്രി വിശകലനത്തിനുമുള്ള ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ 30 μl ന്റെ ഒരു വോള്യത്തിൽ 10 μm സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് (N-His (6) osFosB അല്ലെങ്കിൽ പോസിറ്റീവ് കൺട്രോൾ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ്), 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, കൈനർ നിർമ്മാതാവ് വിതരണം ചെയ്ത ബഫർ, ഇനിപ്പറയുന്ന കാൻസലുകളിൽ ഒന്ന്: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; അപ്സ്റ്റേറ്റ്), PKC (1.6 ng / μl; കാൽബിക്ഹാം) അല്ലെങ്കിൽ പിഎക്സ്എംസക്സ് XXXXK (70 mU / μl; അപ്സ്റ്റേറ്റ്). ടൈം കോഴ്സ് പ്രതികരണങ്ങൾ നിയമാനുസൃത സമയ പോയിന്റുകളിൽ റിമോട്ട് സെല്ലിൽ നിന്നും 6 μl അലക്കിട്ടുകൾ നീക്കം ചെയ്ത് ലാമെൽലി പ്രോട്ടീൻ സാമ്പിൾ ബഫർ കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള 2.5 × തുല്യ അളവ് കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും ചെയ്തു. CK5 റിങിനുള്ള മൈക്കിസിസ്-മെന്റൻ ചലന പരാമീറ്ററുകൾ പ്രായോഗികമായി നിർവചിച്ചിരിക്കുന്ന ലീനിയർ സ്ഥിരതയുള്ള അവസ്ഥയിൽ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുകയുണ്ടായി. 4 nl / μl എൻസൈം, 2 μm ATP, 15 μCi / [l [γ- എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന 10 μl ന്റെ അളവിൽ 2 മിനുട്ടിനായി ഈ പ്രതികരണങ്ങൾ നടത്തി.³²പി] ATP, N-His (6) ΔFOSB സാന്ദ്രതകൾ 2.5 - 30 മില്ലീമീറ്റർ മുതൽ. എല്ലാ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളും ഒരു വാട്ടർ ബാത്തിൽ 30 at C ൽ നടത്തി. SDS-PAGE ന് ശേഷം ജൈവ-കൂമോ കോസിസ്സിയുമായി (ജൈവ-റാഡി) ജെൽ താങ്ങുക, ജെൽ ഉണങ്ങി, ³²ഫോസ്ഫറൈമിംഗ് വിശകലനം (താഴെ കാണുക, ഡാറ്റാ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ, കണക്കുകൂട്ടലുകൾ, സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്സ്) എന്നിവയാണ് പി-ഫോസ്ഫേറ്റ് ഇൻഫോകേഷൻ.

ദ്വിമാന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പും ഫോസ്ഫോമിനോ ആസിഡ് വിശകലനവും.

ഈ വിശകലനം നടത്തിയത് രണ്ടുപേരും വിശദീകരിച്ചു പ്ലോഗ് ആന്റ് ഡൺ (2000). ചുരുക്കത്തിൽ, വരണ്ട ജെൽ ശകലങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു ³²പി-ലേബൽ osFosB (ഒന്നുകിൽ നിന്ന് vitro ലെ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ഉപാപചയ ലേബൽ ചെയ്ത സെല്ലുകളുടെ ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളിൽ നിന്ന്), എക്‌സൈസ് ചെയ്യുകയും പുനർനിർമിക്കുകയും കഴുകുകയും ട്രിപ്റ്റിക് ദഹനത്തിന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്തു. ട്രൈപ്റ്റിക്ക് ഡെലിസ്റ്റ് ഉൽപന്നങ്ങൾ അടങ്ങിയിട്ടുള്ള സൂപ്പർമാർട്ടന്റ് ലിയോഫിലലൈസ് ചെയ്തു, ലൈഫോലൈറ്റ് പല തവണ കഴുകി, ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ബഫറിലെ 10 μl ൽ വീണ്ടും പുനർ നിർമിച്ചു, pH 1.9. സെൽലോസ് ഥീൻ ലെയർ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (ടിഎൽസി) പ്ലേറ്റ് (അനലറ്റെക്ക്, നെവർക്, ഡി.ഇ.) ൽ മാതൃക (3 μl) കണ്ടെത്തി, ടിഎൽസിയുടെ ആരോഹണത്താൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസ്സിന്റെയും മറ്റു മാനങ്ങളിലൂടെയും ഒരു വ്യത്യാസത്തിൽ വേർതിരിക്കപ്പെട്ടു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പുകൾ ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫിയും ഫോസ്ഫോറിമേജിംഗും ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. ഫോസ്ഫോഅമിനോ ആസിഡ് വിശകലനത്തിനായി, ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ബഫറിൽ പുനർവിന്യസിച്ച ട്രിപ്റ്റിക് ഡൈജസ്റ്റുകളുടെ എക്സ്എൻയുഎംഎക്സ് എച്ച്എൽ എച്ച്എക്സ്എൽ ജലവിശ്ലേഷണം വഴി എക്സ്എൻഎംഎക്സ് എക്സ് സിയിൽ എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് മിനിറ്റിൽ ഒരു എൻ‌എന് കീഴിൽ₂ അന്തരീക്ഷം. വെള്ളത്തിൽ ആറിരട്ടി ലയിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് പ്രതികരണം നിർത്തി, മിശ്രിതം ലയോഫിലൈസ് ചെയ്തു. ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ബഫറിന്റെ XMX μl ൽ, ലൈഫോലൈറ്റ് വീണ്ടും പുനർ നിർണയിച്ചു, പി.എച്ച്.എൻ.എൻ.എക്സ്.എൽ, ഒപ്പം സെൽ ബുസ് ടിഎൽഎൽ പ്ലേറ്റിലും ഫോസ്ഫോ സെർ, ഒപ്പം, -ടെർ സ്റ്റാൻഡേർഡുകളിലും. ടി‌എൽ‌സി പ്ലേറ്റിന്റെ നീളത്തിന്റെ പകുതിയോളം ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ബഫർ, പി‌എച്ച് എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഉപയോഗിച്ച് ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നടത്തുകയും തുടർന്ന് പ്ലേറ്റ് പി‌എച്ച് എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ബഫറിലേക്ക് മാറ്റുകയും ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് പൂർ‌ത്തിയാക്കുകയും ചെയ്തു. അസെറ്റോണിൽ 5% (v / v) നിൻ ഹൈഡ്രൈൻ ലായനിയിലൂടെ ടിഎൽഎൽ പ്ലേറ്റിൽ സ്പ്രേ ചെയ്താണ് ഫോസ്ഫോമമിക് ആസിഡ് മാനദണ്ഡങ്ങൾ ദൃശ്യവത്കരിച്ചത്. ³²പി-ലേബൽ ചെയ്ത അമിനോ ആസിഡ് സാമ്പിളുകൾ ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫിയും ഫോസ്ഫോറിമേജിംഗും ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.

siRNA- ഇൻഡ്ഡ് CK2A നോക്ക് ഡൗൺ.

CK2 (ലെവൽ‌) തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ‌ ഒരു ആർ‌എൻ‌എ ഇടപെടൽ‌ രീതി ഉപയോഗിച്ചുഡി മൈറയും മറ്റു ചിലരും, 2005). പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ കൊളാജൻ ഐ-കോട്ടുചെയ്ത ആറ് കിണറുകളുള്ള പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് വിത്ത് അടുത്ത ദിവസം ∼12-70% സംഗമസ്ഥാനത്ത് എത്തിച്ചേരുന്നു, അവ 80 nm (അന്തിമ ഏകാഗ്രത) ഉപയോഗിച്ച് അസ്ഥിരമായി കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുമ്പോൾ, സി‌ആർ‌എൻ‌എ അല്ലെങ്കിൽ സി‌ആർ‌എൻ‌എ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു. Transfection Agent SilentFectin (Bio-Rad) ന്റെ 20 μl ഉപയോഗിച്ചുകൊണ്ട് നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ചുകൊണ്ടാണ് RET CK2 ന്റെ α ഉപശീർഷകം. ഏകദേശം 5 h ന് ശേഷം, മുകളിൽ പറഞ്ഞതുപോലെ സെല്ലുകൾ osFosB പ്ലാസ്മിഡ് ഉപയോഗിച്ച് തൽക്ഷണം കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു. ഏകദേശം എൺപത് എച്ച് പിന്നീട് (~ എസ്.എൻ.എ.എ.എ ട്രാൻസ്ഫിക്കേഷനുശേഷം ~~~~~), സെല്ലുകൾ ഒന്നുകിൽ ³²പി ഉപരിതലത്തിൽ വിവരിച്ച പോലെ ഉപാപചയ ലേബലിങ്ങ് അല്ലെങ്കിൽ പൾസ്-ഷേയ്സ് അനാലിസിസ്. താഴെപ്പറയുന്ന നാല് CK2 siRNA- കൾ സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3, 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ', 5'P-UAGUCAUAUAAUCUUCCGUU3', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 (Dharmacon, Lafayette, CO). ഒരു നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണം, ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു സൈലൻസർ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണം #3 siRNA- ൽ നിന്നുള്ള ഓസ്റ്റിൻ (ഓസ്റ്റിൻ, TX). ഒരു CNX: 2 ഡില്യൂഷനിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് CK2 ആന്റി പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (അപ്‌സ്റ്റേറ്റിൽ നിന്നുള്ള കാറ്റലോഗ് # 06-873) ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് CK1 നോക്ക്-ഡ of ണിന്റെ വ്യാപ്തി നിരീക്ഷിച്ചു. ing- ട്യൂബുലിൻ ഒരു ലോഡിംഗ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിക്കുകയും ഒരു മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് (അപ്‌സ്റ്റേറ്റിൽ നിന്നുള്ള കാറ്റലോഗ് # 1000-05) ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഒരു 661: 1 ഡില്യൂഷനിൽ കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു.

സൈറ്റ്-നിർദ്ദേശിച്ച mutagenesis.

ദ്രുത മാറ്റുക സൈറ്റ്-ഡയറക്റ്റ്ഡ് മുതജനസിസ് കിറ്റ് (Stratagene, La Jolla, CA) ഉപയോഗിച്ചുകൊണ്ട് നിർമ്മാതാക്കളുടെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ചുകൊണ്ടാണ് എസ്.എക്സ്.എക്സ്.എക്സ്. മൗസ് ΔFOSB പ്രോട്ടീനിലെ Ser27 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ പരിചയപ്പെടുത്താൻ താഴെപ്പറയുന്ന മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിച്ചു. Ser27 മുതൽ Ala: (റിവേഴ്സ് പ്രൈമർ) 27'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3. Ser27 മുതൽ Asp വരെ (ഫോർ‌വേഡ് പ്രൈമർ) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. പരിവർത്തനം ചെയ്ത അടിത്തറകൾ ബോൾഡിലാണ്, കൂടാതെ Ser27 കോഡൺ ഇറ്റാലൈസ് ചെയ്യുന്നു.

ബയോഇൻഫർമാറ്റിക്സ്.

പ്രോസൈറ്റ് () ഉൾപ്പെടെയുള്ള പ്രത്യേക ഡാറ്റാബേസുകളിൽ മൗസ് പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസ് സമർപ്പിച്ചുകൊണ്ട് osFosB- നുള്ള സാധ്യതയുള്ള ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകളും കൈനാസുകളും തിരഞ്ഞു.http://www.expasy.org/prosite/), പ്രവചിക്കുക പ്രോട്ടീൻ (Rost et al., 2004), കൂടാതെ NetPhosK (ബ്ലൊം et al., 2004).

ഡാറ്റ അളവ്, കണക്കുകൂട്ടലുകൾ, സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾ.

പിവിഡിഎഫ് അല്ലെങ്കിൽ നൈട്രോസെല്ലുലോസ് മെംബ്രണിലെ പ്രോട്ടീന്റെ അളവ് ഒരു കൊടുങ്കാറ്റ് ഫോസ്ഫോർ ഇമേജറും അതിനൊപ്പമുള്ള ഇമേജ് ക്വാന്റ് സോഫ്റ്റ്വെയറും (അമേർഷാം ബയോസയൻസസ് / മോളിക്യുലർ ഡൈനാമിക്സ്) ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി. സെൽ‌ കൾ‌ച്ചറിലും ബ്രെയിൻ‌ സ്ലൈസ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പഠനത്തിലും, ലഭിച്ച മൂല്യങ്ങൾ‌ ³²പി-ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീനെ മൊത്തം osFosB- നായി ലഭിച്ച മൂല്യങ്ങളാൽ വിഭജിക്കുകയും ഒരു അനുപാതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. ൽ vitro ലെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പഠനങ്ങൾ, തുക ³²OLFosB (stoichiometry) ന്റെ ഒരു മോളിന് pFosB എന്ന് ലേബൽ ചെയ്തത് മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ കണക്കാക്കി (സാഹിൻ മറ്റുള്ളവരും., 2004). എല്ലാ ഉപകരണങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച ഉപകരണത്തിന്റെ രേഖീയ പരിധിക്കുള്ളിലാണ് എടുത്തത്. മൈക്കിളിസ്-മെന്റൻ മോഡൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് ചലനാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾ കണക്കാക്കിയത് V = V_{മാക്സ്}[S] / ([S]+K_M) ഒപ്പം V_{മാക്സ്} = k₂[E_ആകെ]. അർദ്ധായുസ്സ് (t_1/2) ΔFosB, FosB എന്നിവ പൾസ്-ചേസ് പ്ലോട്ടുകളിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കി (ഡാറ്റാ പോയിന്റുകൾക്ക് ഏറ്റവും യോജിച്ച നോൺ‌ലീനിയർ റിഗ്രഷൻ ഉപയോഗിച്ച്) കൂടാതെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ അളവ് ഒറിജിനലിന്റെ 50% ആയ സമയവുമായി യോജിക്കുന്നു. എല്ലാ കണക്കുകളിലും, കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഫലങ്ങൾ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളുടെ പ്രതിനിധികളാണ്. എല്ലാ ഗ്രാഫുകളിലും, കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM- കൾ (3 are) ആണ് n 16). ജോഡിയാക്കാത്തവ ഉപയോഗിച്ച് വ്യത്യാസങ്ങളുടെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളുടെ പ്രാധാന്യം വിലയിരുത്തി t പരിശോധന, ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾക്കായി ശരിയാക്കി, നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു p ≤ 0.05.

മുമ്പത്തെ വിഭാഗം അടുത്ത വിഭാഗം

ഫലം

അസാധാരണമാംവിധം സ്ഥിരതയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമാണ് ഫോസ്ബി

OssFosB താരതമ്യേന സ്ഥിരതയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് spec ഹിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും (നെസ്റ്റ്ലർ et al., 2001), പ്രോട്ടീന്റെ വിറ്റുവരവ് പ്രൊഫൈലിന്റെ നേരിട്ടുള്ള വിശകലനം ഇന്നുവരെ നടത്തിയിട്ടില്ല. ഈ ചോദ്യത്തിന്, പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി, അവ ന്യൂറോൺ പോലുള്ള സെൽ ലൈനായി വ്യാപകമായി ഉപയോഗിച്ചു, അതിൽ rec ഫോസ്ബി ഒരു പുന omb സംയോജിത ഹെർപ്പസ് സിംപ്ലക്സ് വൈറസ് (എച്ച്എസ്വി- os ഫോസ്ബി) അണുബാധയിലൂടെ തൽക്ഷണം പ്രകടിപ്പിച്ചു. പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച പ്രോട്ടീനുകളെ ഉപാപചയമായി ലേബൽ ചെയ്തു ³⁵എസ്-മെറ്റ് / സിസ്, ന്റെ അധ d പതന രീതി ³⁵എസ്-ലേബൽ osFosB (³⁵റേഡിയോലേബൽഡ് അമിനോ ആസിഡുകൾ നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്ന് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റ് ചെയ്താണ് എസ്-ഫോസ്ബി നിരീക്ഷിച്ചത്. എസ്‌ഡി‌എസ്-പേജും ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫിയും നടത്തിയ ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളുടെ വിശകലനത്തിൽ പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിലെ Δ ഫോസ്ബിയുടെ അർദ്ധായുസ്സ് ∼12 h (ചിത്രം. 1). ഈ കണ്ടെത്തലുകൾ കാണിക്കുന്നത് ΔFosB- യുടെ അർദ്ധായുസ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളേക്കാൾ കൂടുതലാണ് (ചർച്ച കാണുക), മുഴുനീള ഫോസ്ബി ഉൾപ്പെടെ, സെൽ സംസ്കാരത്തിലെ അർദ്ധായുസ്സ് ∼90 മി. (ഡോബ്രാസാൻസ്കിയും മറ്റുപേരും., 1991; കാർലെ et al. 2004). കൂടാതെ, osFosB യുടെ അധ d പതനം ഒരു ഫസ്റ്റ് ഡിഗ്രി എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ക്ഷയ വക്രത്തിന് യോജിക്കുന്നില്ല എന്നതും ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, മറിച്ച് ഇത് ബൈപാസിക് ആണ്, ഇത് മന്ദഗതിയിലുള്ള തരംതാഴ്ത്തൽ നിരക്ക് ആരംഭിക്കുന്നു. ഒന്നിൽ കൂടുതൽ osFosB സ്പീഷീസുകളുടെയും കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ ഒന്നിൽ കൂടുതൽ അധ d പതന പാതയുടെയും അസ്തിത്വം ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 1.

അസാധാരണമാംവിധം സ്ഥിരതയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമാണ് ഫോസ്ബി. സെൽ സംസ്കാരത്തിൽ Δ10 h ആണ് ΔFosB- യുടെ അർദ്ധായുസ്സ്. എച്ച്എസ്വി- os ഫോസ്ബിയുമായുള്ള അണുബാധയിലൂടെയോ Δ ഫോസ്ബി അടങ്ങിയ പ്ലാസ്മിഡുമായി ക്ഷണികമായ കൈമാറ്റം വഴിയോ പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിൽ ഫോസ്ബി പ്രകടിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ സെല്ലുകൾ പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് വിധേയമാക്കി. OsFosB അമിതമായി എക്സ്പ്രസ് ചെയ്യുന്നതിന് ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതി പരിഗണിക്കാതെ തുല്യ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു. ΔFosB ഡീഗ്രേഡേഷന്റെ സമയ കോഴ്സും (പ്രതിനിധി ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാം) ചിത്രം കാണിക്കുന്നു. കുറഞ്ഞത് അഞ്ച് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച കുറഞ്ഞത് 12 വ്യക്തിഗത ഡാറ്റ പോയിന്റുകളുടെ ശരാശരി ± SEM ആണ് പ്ലോട്ട് ചെയ്ത ഡാറ്റ. താരതമ്യത്തിനായി, മുഴുനീള ഫോസ്ബിയുടെ റിപ്പോർട്ടുചെയ്ത അർദ്ധായുസ്സ് സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.

തലച്ചോറിലെ ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണ് ഫോസ്ബി

OsFosB- യുടെ പോസ്റ്റ് ട്രാൻസ്ലാൻ‌ഷണൽ പരിഷ്‌ക്കരണം അതിന്റെ വ്യക്തമായ സ്ഥിരതയ്ക്ക് കാരണമായേക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ hyp ഹിച്ചു. ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ സ്ഥിരത ഉൾപ്പെടെ പല തരത്തിൽ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (അവലോകനത്തിനായി, കാണുക ഡെസ്റ്റെറോ മറ്റുള്ളവരും., 2000; വിറ്റ്മാർഷും ഡേവിസും, 2000), osFosB ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. ഇതിനായി, വിട്ടുമാറാത്ത ഇസി‌എസ് ഉപയോഗിച്ച് എലിയുടെ തലച്ചോറിൽ os ഫോസ്ബി എക്സ്പ്രഷൻ പ്രചോദിപ്പിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് ഉയർന്ന തോതിലുള്ള os ഫോസ്ബിയെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ചികിത്സയാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് ഫ്രന്റൽ കോർട്ടെക്സിൽ (മറ്റുള്ളവരും പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു., XX). അവസാന ഇസി‌എസ് ചികിത്സയ്ക്ക് ഒരു ദിവസം കഴിഞ്ഞ്, os ഫോസ്ബി അളവ് ഉയർന്ന നിലയിൽ നിൽക്കുമ്പോൾ, നേർത്ത ഫ്രന്റൽ കോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകൾ തയ്യാറാക്കി ഉപാപചയമായി ലേബൽ ചെയ്തു ³²പി-ഓർത്തോഫോസ്ഫേറ്റ്. ഒരു സമാന്തര കഷ്ണം റേഡിയോലേബൽ ചെയ്തിട്ടില്ല, കൂടാതെ മൊത്തം osFosB ലെവലുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഇവ ഉപയോഗിച്ചു. ഒരു നിർദ്ദിഷ്ട ആന്റി-ഫോസ്ബി / os ഫോസ്ബി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപ്പിറ്റേഷനും എസ്ഡിഎസ്-പേജ് വഴി ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകളെ വേർതിരിക്കുന്നതിനും ശേഷം, ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ³²പി-ലേബൽ ചെയ്ത os ഫോസ്ബി ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ചാണ് കണ്ടെത്തിയത്, അതേസമയം മൊത്തം ΔFosB ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗിലൂടെ കണ്ടെത്തി. ഈ വിശകലനം തലച്ചോറിൽ osFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി ³²കാലാനുസൃതമായി ചികിത്സിക്കുന്ന മസ്തിഷ്ക സാമ്പിളുകളിൽ ∼35 kDa യുടെ പി-ലേബൽ ബാൻഡ് ഉണ്ട്, പക്ഷേ ഇത് ഷാം-ചികിത്സിച്ച നിയന്ത്രണങ്ങളിൽ ഫലത്തിൽ കണ്ടെത്താനാകില്ല (ചിത്രം. 2A). വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനത്തിന്റെ അഭാവത്തിൽ, osFosB യുടെ അടിവശം വളരെ കുറവാണ് എന്ന വസ്തുതയുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. ഇമ്മ്യൂണോപ്രസിപ്പിറ്റേഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രത്യേകത വ്യക്തമാക്കുന്നത് നോൺ ഇമ്മ്യൂൺ ഐ.ജി.ജി പ്രിസിപിറ്റേറ്റിലെ സിഗ്നലിന്റെ അഭാവമാണ്.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 2.

തലച്ചോറിലെ ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണ് ഫോസ്ബി. A, Oss ഫോസ്ബി തലച്ചോറിൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണ്. മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ വിട്ടുമാറാത്ത ഇസി‌എസ് ചികിത്സയിലൂടെ എൻ‌ഡോജെനസ് os ഫോസ്ബിയെ എലി തലച്ചോറിൽ പ്രേരിപ്പിച്ചു. ഫ്രന്റൽ കോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകൾ ഉപാപചയമായി ലേബൽ ചെയ്തു ³²PH₃PO₄ മണിക്കൂറുകളോളം. കഷ്ണങ്ങളുടെ ഏകീകൃതവൽക്കരണത്തിനുശേഷം, osFosB രോഗപ്രതിരോധ ശേഷിയില്ലാത്തതും ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് osFosB (³²ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫി (ടോപ്പ് പാനൽ) P-osFosB) കണ്ടെത്തി. ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് (ചുവടെയുള്ള പാനൽ) ഉപയോഗിച്ച് നോൺ‌ റേഡിയോ ആക്റ്റീവ് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളിലെ ആകെ ΔFosB കണ്ടെത്തി. നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ എന്ന നിലയിൽ, ഒരു ഷാം ചികിത്സിക്കുന്ന മൃഗത്തിന്റെയും രോഗപ്രതിരോധ ശേഷിയില്ലാത്ത IgG ന്റെയും ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റ് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. B, സ്ഥാനാർത്ഥി ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകളും മൗസിനായുള്ള അനുബന്ധ പ്രവചന സ്‌കോറുകളുള്ള കൈനാസുകളും os ഫോസ്ബി പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസ് ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക് വിശകലനത്തിലൂടെ ലഭിച്ചു. ഉയർന്ന പ്രവചന സ്‌കോറുകളുള്ള കാൻഡിഡേറ്റ് സൈറ്റുകൾ പ്രോട്ടീൻ ശ്രേണിയിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യുകയും പട്ടികയിൽ പട്ടികപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. പ്രോട്ടീൻ ശ്രേണിയിൽ ഡി‌എൻ‌എ-ബൈൻഡിംഗ് (ബേസിക്) ഡൊമെയ്‌നും ലൂസിൻ സിപ്പറും ബോൾഡിലാണ്. C, D, Ser / Thr ഫോസ്ഫേറ്റസ് ഇൻഹിബിറ്റർ OA ആണ് ഫോസ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത്. C, ³²അഭാവത്തിൽ (Ctr) ലേബൽ ചെയ്തിട്ടുള്ള ഫ്രന്റൽ കോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകളിൽ നിന്നുള്ള ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളിലെ P-osFosB ലെവലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 100 ng / ml OA (ഗ്രാഫ്, ടോപ്പ് പാനൽ) എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യം ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫി വഴി കണ്ടെത്തി. താഴെയുള്ള പാനൽ ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി ലേബൽ ചെയ്യാത്ത കഷ്ണങ്ങളിൽ നിന്ന് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മൊത്തം ΔFosB കാണിക്കുന്നു. D, PC12 സെല്ലുകൾ‌ക്ക് HSV-osFosB അല്ലെങ്കിൽ‌ HSV-LacZ (വെക്റ്റർ‌) ബാധിക്കുകയും ഉപാപചയമായി ലേബൽ‌ ചെയ്യുകയും ചെയ്‌തു ³²PH₃PO₄ 100 ng / ml OA യുടെ അഭാവത്തിൽ (Ctr) അല്ലെങ്കിൽ സാന്നിധ്യത്തിൽ. ³²ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫി (ഗ്രാഫ്, ടോപ്പ് പാനൽ) വഴി ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റുകളിലെ പി- os ഫോസ്ബി അളവ് കണ്ടെത്തി. താഴെയുള്ള പാനൽ ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ മൊത്തം ΔFosB കാണിക്കുന്നു.

ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷനിൽ ഏത് കൈനെയ്‌സും സൈറ്റും (സൈറ്റുകളും) ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്നതിനുള്ള ആദ്യപടിയായി, ഞങ്ങൾ അതിന്റെ അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണി നിരവധി ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക് വിശകലനങ്ങൾക്ക് വിധേയമാക്കി. ΔFosB- ൽ ടൈർ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ കാൻഡിഡേറ്റ് സൈറ്റുകൾ ഇല്ലെങ്കിലും, അതിൽ നിരവധി CaMKII സൈറ്റുകൾ, മൂന്ന് CK2 സൈറ്റുകൾ, വളരെ ഉയർന്ന ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രവചന സ്കോറുകളുള്ള രണ്ട് PKC സൈറ്റുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ നിരവധി Ser / Thr കൈനാസ് സമന്വയ സൈറ്റുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഇത് വെളിപ്പെടുത്തി.ചിത്രം. 2B). ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക്സിലൂടെ പ്രവചിച്ചതുപോലെ, osFosB സെർ അല്ലെങ്കിൽ ത്രീ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ മാത്രമേ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുള്ളൂവെങ്കിൽ, അതിന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ Ser / Thr ഫോസ്ഫേറ്റസുകളുടെ പ്രവർത്തനം കൊണ്ട് ഗണ്യമായി മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യണം. ഈ സിദ്ധാന്തം പരീക്ഷിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ഫ്രന്റൽ കോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തു ³²ഒരു സെർ / ത്രീ പ്രോട്ടീൻ ഫോസ്ഫേറ്റസ് ഇൻഹിബിറ്ററായ ഒ‌എയുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ പി-ഓർത്തോഫോസ്ഫേറ്റ്. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 2C, OA ഒരു വലിയ (∼2.5- മടങ്ങ്) വർദ്ധനവിന് കാരണമായി ³²P-osFosB. ഇത് മൊത്തം osFosB ലെവലിൽ ഒരു ചെറിയ വർദ്ധനവിന് കാരണമായി, ഇത് OA യുടെ അർബുദ ഫലങ്ങളെ ഫോസ് പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടെ നിരവധി പെട്ടെന്നുള്ള ആദ്യകാല ജീനുകളെ പ്രേരിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (മില്ലർ മറ്റുള്ളവരും., 1998; ചോ et al., 2004). ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് os ഫോസ്ബി ലെവലിൽ മൊത്തത്തിലുള്ള വർദ്ധനവ് (∼60%) ആണ് അറ്റ ഫലം.

പരീക്ഷണാത്മക കൃത്രിമത്വത്തിന് കൂടുതൽ അനുയോജ്യമായ പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിൽ, os ഫോസ്ബി തലച്ചോറിൽ കാണുന്നതിനു സമാനമായ ഒരു ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പാറ്റേൺ കാണിച്ചിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. HSV-osFosB- യിലെ അണുബാധ വഴി ഞങ്ങൾ PC12 സെല്ലുകളിൽ osFosB പ്രകടിപ്പിക്കുകയും സെല്ലുകളെ ഉപാപചയമായി ലേബൽ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു ³²OA യുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ പി-ഓർത്തോഫോസ്ഫേറ്റ്. HSV-osFosB- ബാധിച്ച കോശങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പ്രോട്ടീന്റെ വിജയകരമായ പ്രകടനവും ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷനും ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിലെ സാന്നിധ്യം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം. 2D, ചുവടെയുള്ള പാനൽ), ∼35 kDa ബാൻഡിന്റെ ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫ് (മുകളിലെ പാനൽ), വെക്റ്റർ-ബാധിച്ച സെല്ലുകളിൽ ഇല്ല. തലച്ചോറിൽ നിരീക്ഷിച്ചതുപോലെ, OA മൊത്തം osFosB ലെവലിൽ ഒരു ചെറിയ വർദ്ധനവിന് കാരണമായി, പക്ഷേ അതിലും ഉയർന്ന (ഏകദേശം ഇരട്ടി) വർദ്ധനവ് ³²P-osFosB, ഇതിന്റെ ഫലമായി osFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷനിൽ ഗണ്യമായ (∼50%) അറ്റ വർദ്ധനവുണ്ടായി. കൂടാതെ, ബയോ ഇൻഫോർമാറ്റിക് പ്രവചനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന, ടൈർ ഫോസ്ഫേറ്റസ് ഇൻഹിബിറ്ററുമൊത്തുള്ള പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളുടെ ചികിത്സയിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിച്ചില്ല ³²P-osFosB ലെവലുകൾ (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല). ഈ കണ്ടെത്തലുകൾക്കൊപ്പം, ഫോസ്ബി തലച്ചോറിലെയും പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിലെയും സെർ കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ ത്രീ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്നും രണ്ടാമത്തേത് Δ ഫോസ്ബിയുടെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനും ഡീഗ്രേഡേഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും കൂടുതലായി പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു നല്ല സെൽ കൾച്ചർ സിസ്റ്റമാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.

CK2 പക്ഷേ PKC അല്ലെങ്കിൽ CaMKII ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ ΔFosB അല്ല vitro ലെ

മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ, osFosB അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസിന്റെ വിശകലനം CK2, PKC, CaMKII ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകൾക്കായുള്ള ഉയർന്ന പ്രവചന സ്കോറുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി. ഇനിപ്പറയുന്നവയിൽ ഏത് കൈനെയ്‌സുകളാണ് osFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യാമെന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഒരു ശ്രേണി നടത്തി vitro ലെ ശുദ്ധീകരിച്ച കൈനാസുകളും ശുദ്ധീകരിച്ച പുന omb സംയോജനവും ഉപയോഗിച്ച് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ osFosB. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 3A, മൂന്ന് കാൻഡിഡേറ്റ് കൈനസുകളിൽ, സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് os ഫോസ്ബി മാത്രം. കൂടാതെ, മറ്റ് നിരവധി കൈനെയ്‌സുകൾ പരീക്ഷിച്ചു (ഉദാ. GSK2, p3S70K) എന്നാൽ ഗണ്യമായി ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു osFosB (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല). ടൈം കോഴ്‌സ് വിശകലനത്തിലൂടെ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് പ്രതികരണത്തിന്റെ അധിക സ്വഭാവം ഈ കൈനേസിന് moFosB ന്റെ ഒരു മോളിന് ∼6 മോൾ ഫോസ്ഫേറ്റ് സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിന് ഉത്തേജനം നൽകുമെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം. 3B). CK2 ന് osFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയും vitro ലെ ഗണ്യമായ സ്റ്റൈക്കിയോമെട്രിയിലേക്ക് (∼50%) ഫിസിയോളജിക്കലി പ്രസക്തമായ പ്രതികരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ശുദ്ധീകരിച്ച osFosB യുടെ വർദ്ധിച്ച അളവിൽ സാന്നിധ്യത്തിൽ CK2 ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ ഈ പ്രതികരണത്തിന്റെ ഗതികത പഠിച്ചു, ഒപ്പം CK2 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ osFosB a V_{പരമാവധി} 5.8 pmol · മി^-1 · .G^-1 എൻസൈമിന്റെ, a K_M 18.4 μm, a k_{പൂച്ച} 0.2 / s ന്റെ (ചിത്രം. 3C). ഈ ചലനാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾക്കായി ലഭിച്ച മൂല്യങ്ങൾ ഈ പ്രതികരണത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തിയെ കൂടുതൽ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, ദി K_M DARPP2 നായുള്ള CK32 ന്റെ ഏറ്റവും അറിയപ്പെടുന്ന സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിലൊന്നായ 3.4 μm ആണ്, k_{പൂച്ച} ∼0.3 / s ആണ് (ജിറാൾട്ട് മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്); ദി K_M ATX പരിധികൾക്കായി X10 - 40 μm (കോച്ചെറ്റ് മറ്റുള്ളവരും., 1983; സിൽ‌വ-നെറ്റോ മറ്റുള്ളവരും, 2002), കൂടാതെ കെയ്‌സിൻ ∼10 - 50 fromm മുതൽ (മെഗിയോ മറ്റുള്ളവരും., 1977; പിയറിൻ മറ്റുള്ളവരും., 1987). ഒന്നിച്ച്, ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KFosB എന്നത് CK2 നായുള്ള ഒരു നല്ല അടിമണ്ണ് ആണ് vitro ലെ.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 3.

CK2 പക്ഷേ PKC അല്ലെങ്കിൽ CaMKII ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ ΔFosB അല്ല vitro ലെ. ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫ് (മുകളിലെ പാനൽ) ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ഉൽപ്പന്നം കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ കൂമാസ്സി സ്റ്റെയിൻ ജെൽ (ചുവടെയുള്ള പാനൽ) പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ മൊത്തം osFosB കാണിക്കുന്നു. A, ശുദ്ധീകരിച്ച പുന omb സംയോജനം osFosB ന് വിധേയമായി vitro ലെ വിവിധ കാൻഡിഡേറ്റ് കൈനെയ്‌സുകളുടെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ (അവയിൽ മൂന്നെണ്ണം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു). B, ടൈം കോഴ്സും സ്റ്റൈക്കിയോമെട്രിക് വിശകലനങ്ങളും സൂചിപ്പിക്കുന്നത് CK2 ന് osFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയും vitro ലെ ∼50% ന്റെ സ്റ്റൈക്കിയോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച്. C, CK2 പ്രതികരണത്തിന്റെ ചലനാത്മക വിശകലനത്തിൽ ΔFosB ഒരു നല്ല വിശ്വാസമാണെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി vitro ലെ കെ.ഇ. പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ രേഖീയവൽക്കരണം ഇരട്ട-പരസ്പര പ്ലോട്ടിൽ (ചുവടെ) കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, പക്ഷേ ചലനാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾ മൈക്കിളിസ്-മെന്റൻ വക്രത്തിൽ (മുകളിൽ) നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞു.

കേടുകൂടാത്ത സെല്ലുകളിലെ osFosB യുടെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനും സ്ഥിരതയും CK2 മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു

ΔFosB- യുടെ CK2- മെഡിയേറ്റഡ് ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തി വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് താരതമ്യ ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പിംഗ് നടത്തി vitro ലെ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ്, പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്-സെൽ-ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് os ഫോസ്ബി. SDS-PAGE നും ജെൽ എല്യൂഷനും ശേഷം ³²P-osFosB (മുതൽ vitro ലെ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റിൽ നിന്ന് ³²പി-ലേബൽ ചെയ്ത സെല്ലുകൾ), പ്രോട്ടീൻ ട്രിപ്സിൻ ഉപയോഗിച്ച് ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെട്ടു, തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡുകൾ ദ്വിമാന വിഭജനത്തിന് വിധേയമാക്കി. ഈ വിശകലനം സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് പ്രതികരണത്തിൽ നിന്നുള്ള പ്രധാന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിൽ (ഫോസ്ബി ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ്) നിന്നുള്ള രണ്ട് പ്രധാന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡുകളുമായി ഒത്തുചേർന്നുവെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം. 4A), PKC അല്ലെങ്കിൽ CaMKII (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല) പ്രതികരണത്തിന്റെ ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡുകൾ ചെയ്തിട്ടില്ല. പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് മാപ്പിൽ രണ്ടാമത്തെ os ഫോസ് ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് ഉണ്ടായിരുന്നു, പക്ഷേ സമാനമായ ഒരു ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് സൃഷ്ടിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ച ഏതെങ്കിലും കൈനസുകളുടെ കഴിവില്ലായ്മ കാരണം vitro ലെ, ഈ രണ്ടാമത്തെ ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡിൽ മറ്റ് ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായ ഒരു ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റ് അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടോ അല്ലെങ്കിൽ അതേ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഒരു പ്രത്യേക ട്രിപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് ഇപ്പോൾ അറിയില്ല.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 4.

കേടുകൂടാത്ത സെല്ലുകളിലെ osFosB യുടെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനും സ്ഥിരതയും CK2 മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു. A, CK2, പക്ഷേ PKC സെല്ലുകളിൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ΔFosB ആയി തോന്നുന്നില്ല. CK2 അല്ലെങ്കിൽ PKC മുഖേന osFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്ത ദ്വിമാന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പുകൾ vitro ലെ അല്ലെങ്കിൽ കേടുകൂടാത്ത PC12 സെല്ലുകൾ വഴി. അമ്പടയാളങ്ങൾ CK2- ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡിന്റെ സംയോജനം കാണിക്കുന്നു, പക്ഷേ PC12 സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച osFosB ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡുകളിലൊന്നായ PKC- ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് അല്ല. B, C ശക്തിയേറിയ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ആക്റ്റിവേറ്റർ സ്പെർ‌മൈൻ (എസ്‌പി) ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകളെ ചികിത്സിക്കുന്നതിലൂടെ പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിലെ ഫോസ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ ഡി‌ആർ‌ബിയുമായുള്ള ചികിത്സയിലൂടെ കുറയുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇതിനു വിപരീതമായി, പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളിലെ ഫോസ്ബി ഫോസ്ഫറൈസേഷനെ ഒരു പി‌കെ‌സി ആക്റ്റിവേറ്റർ (പി‌എം‌എ) അല്ലെങ്കിൽ പി‌കെ‌സി-നിർദ്ദിഷ്ട ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ കാൽ‌ഫോസ്റ്റിൻ-സി (കാൾഫ്) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ ബാധിച്ചിട്ടില്ല. ഒരു പ്രതിനിധി ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാം (മുകളിലെ പാനൽ), ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ട് (ചുവടെയുള്ള പാനൽ) എന്നിവ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. സി-എഫ്, OsFosB സ്ഥിരതയിൽ CK2 പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പ്രഭാവം. കണക്കുകൾ ΔFosB ഡീഗ്രേഡേഷന്റെ സമയ കോഴ്സും (പ്രതിനിധി ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാം) കാണിക്കുന്നു. ΔFosB ക്ഷണികമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ ഡി‌ആർ‌ബിയുടെ അഭാവത്തിലോ സാന്നിധ്യത്തിലോ നടത്തിയ പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് വിധേയമാക്കി (C), CK2 ആക്റ്റിവേറ്റർ ശുക്ലം (D), അല്ലെങ്കിൽ ബ്രോഡ്-സ്പെക്ട്രം കൈനാസ് ഇൻഹിബിറ്റർ H-8 (E), ഇത് ഡി‌ആർ‌ബിയുടെ നിർ‌ദ്ദിഷ്‌ട ഇഫക്റ്റുകൾ‌ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് ഉപയോഗിച്ചു. F, ΔFosB സ്ഥിരതയിൽ CK2 ന്റെ കാറ്റലറ്റിക് സബ്‌യൂണിറ്റ് തട്ടിയെടുക്കുന്നതിന്റെ ഫലം. പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ‌ നോൺ‌ടാർ‌ഗെറ്റിംഗ് സി‌ആർ‌എൻ‌എ (സി‌ടി‌ആർ‌) അല്ലെങ്കിൽ‌ സി‌ആർ‌എൻ‌എ ടാർ‌ഗെറ്റുചെയ്യുന്ന എലി സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് എച്ച് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു, പിന്നീട് Δ ഫോസ്ബി പ്ലാസ്മിഡ് ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു. മുകളിലെ പാനലിൽ മുഴുവൻ സെൽ ലൈസേറ്റുകളുടെയും ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ CK12, osFosB പ്രോട്ടീൻ അളവുകളിൽ CK2 siRNA യുടെ സ്വാധീനം കാണിക്കുന്നു. - ട്യൂബുലിനുള്ള അനുബന്ധ ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ട് ഒരു ലോഡിംഗ് നിയന്ത്രണമായി കാണിക്കുന്നു.

CK2 ന്റെ ioFosB കൈനാസായി ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തിയെ കൂടുതൽ അഭിസംബോധന ചെയ്യാൻ, CK12 പ്രവർത്തനം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്ന രണ്ട് മരുന്നുകളുപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ osFosB- എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് PC2 സെല്ലുകളെ ചികിത്സിച്ചു. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 4B, PC സെൽ‌-പെർ‌മിബിൾ CK12 ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ DRB ഉപയോഗിച്ച് പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ‌ ചികിത്സിച്ചുകൊണ്ട് ഫോസ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ കുറഞ്ഞു.മെഗിയോ മറ്റുള്ളവരും., 1990; Szyszka et al., 1995), കൂടാതെ ശക്തമായ CK2 ആക്റ്റിവേറ്ററായ അറിയപ്പെടുന്ന പോളിമൈൻ സ്പെർമിനിനുള്ള ചികിത്സയിലൂടെ വർദ്ധിച്ചുകച്ചേത് ആൻഡ് ചാമ്പസ്, 1983; മെഗിയോ മറ്റുള്ളവരും., 1983). ഇതിനു വിപരീതമായി, പി‌കെ‌സി ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ കാൽ‌ഫോസ്റ്റിൻ-സി ഉപയോഗിച്ചുള്ള പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകളുടെ ചികിത്സ (കോബായാഷി et al., 1989; തമക്കിി et al., 1990) അല്ലെങ്കിൽ PKC ആക്ടിവേറ്റർ PMA (ഷ്മിഡ് ആൻഡ് ഹെക്കർ, 1975; കൂടാതെ മറ്റ് പലരും, 1989) ΔFosB ഫോസ്ഫോരിലേഷനിലെ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുന്നില്ല. പി.എം.പിയുടെ കാര്യത്തിൽ, ചെറിയ (പ്രത്യേകിച്ച് ഗണ്യമായ) വർധന ³²ഈ മരുന്ന് മൂലമുണ്ടായ മൊത്തം osFosB ലെവലിന്റെ വർദ്ധനവ് P-osFosB ന് കാരണമാകും; വാസ്തവത്തിൽ, ഫോസ്ബോൾ എസ്റ്റേഴ്സ് ഫോസ്ബി ഉൾപ്പെടെ നിരവധി ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളുടെ ആവിഷ്കാരത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് റിപ്പോർട്ടുചെയ്‌തു (യോസയും മറ്റുമാണ്., 1992; സൂഹ്.മെൽ, 9). കൂടാതെ, നിർദ്ദിഷ്ട സെൽ-പെർമിബിൾ CaMKII ഇൻഹിബിറ്റർ m-AIP ഉള്ള സെല്ലുകളുടെ ചികിത്സ (ഇഷിദയും ഫുജിസാവയും, 1995; സ്റ്റീവൻസ് et al., 1999) ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ കുറയുന്നതിന് കാരണമായില്ല (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല). ഈ ഫലങ്ങൾ ഒരുമിച്ചു ചേർന്നതാണ് vitro ലെ കണ്ടെത്തലുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് കൂടാതെ സിഎക്സ്എക്സ്എൻ എക്സ്പാൻ സിദ്ധാന്തം ΔFosB ആയിരിക്കാം, എന്നാൽ PKC അല്ലെങ്കിൽ CaMKII അല്ല. CK2 ഗർഭനിരോധനം osFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷനെ പൂർണ്ണമായും തടയുന്നില്ല എന്ന വസ്തുത പ്രോട്ടീനിൽ അധിക ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകളുടെ നിലനിൽപ്പിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

ΔFosB യുടെ വിറ്റുവരവിലും അതുവഴി അതിന്റെ സ്ഥിരതയിലും CK2 ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തതായി പരിശോധിച്ചു. ഇതിനായി, CK12 ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ അല്ലെങ്കിൽ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച CK2 ആക്റ്റിവേറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച osFosB- എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് PC2 സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 4C, സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഇൻ‌ഹിബിറ്റർ ഡി‌ആർ‌ബിയുമായുള്ള സെല്ലുകളുടെ ചികിത്സ Δ ഫോസ്ബിയുടെ വിറ്റുവരവ് നിരക്കിനെ സാരമായി ബാധിച്ചു, അതിന്റെ അപചയ വക്രത്തിന്റെ ആകൃതിയിലുള്ള മാറ്റത്തിന് തെളിവാണ്, ബൈഫാസിക് മുതൽ ഒരു വക്രം വരെ ഒരു എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ക്ഷയത്തോട് അടുക്കുന്നു. നേരെമറിച്ച്, CK2 ആക്റ്റിവേറ്റർ ശുക്ലത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം osFosB യുടെ അപചയനിരക്കിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കി, ഇത് പിന്തുടരലിന്റെ ആദ്യ മണിക്കൂറുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചു (ചിത്രം. 4D).

പല കൈനസ് ആക്റ്റേറ്റർമാരും ഇൻഹെബിറ്ററുകളും പോലെ, ബീജഗണിതവും ഡി.ആർ.ബിയും കൃത്രിമഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കും. വാസ്തവത്തിൽ, ഡിആർബി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്റ്റർ IIH (TFIIH) -ഒരു സഹകരണകൈനുകൾയാങ്കുലോവ് et al., 1995), ഇത് ആർ‌എൻ‌എ പോളിമറേസ് II- മെഡിറ്റേറ്റഡ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനെ തടയുന്നു. ഈ പ്രഭാവം osFosB- യുടെ സ്ഥിരതയെ ബാധിച്ചേക്കാമെന്നതിനാൽ, വിശാലമായ സ്പെക്ട്രം കൈനാസ് ഇൻഹിബിറ്റർ H-8 (ഹിഡാക്കയും കോബയാഷിയും, 1992) TFosB വിറ്റുവരവിൽ ഒരു സാന്ദ്രതയിൽ (200 μm) TFIIH- അനുബന്ധ കൈനെയ്‌സിനെ തടയാൻ അറിയാമെങ്കിലും CK2 അല്ല (യാങ്കുലോവ് et al., 1995). കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 4E, H-8 ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ ΔFosB യുടെ വിറ്റുവരവ് നിരക്കിനെ ബാധിച്ചില്ല. മറ്റൊരു വിശാലമായ സ്പെക്ട്രം കൈനാസ് ഇൻഹിബിറ്ററായ എച്ച്-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സിനൊപ്പം സമാന ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു, ഇത് ടി‌എഫ്‌ഐ‌ഐ‌എച്ച്-അനുബന്ധ കൈനെയ്‌സിനെ തടയുന്നു, പക്ഷേ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് അല്ല (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല). ഡി.ആർ.ബി മൂലമുണ്ടാകുന്ന ΔFOSB സ്ഥിരതയിലെ കുറവ് CK7- ന്റെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതിന് മിക്കവാറും സാധ്യതയുണ്ടെന്ന് വ്യാഖ്യാനത്തെ ഈ ഡാറ്റ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.

OsFosB വിറ്റുവരവിൽ CK2 ന്റെ പങ്ക് കൂടുതൽ സ്ഥാപിക്കുന്നതിന്, siRNA വഴി CK2 നെ തട്ടിമാറ്റുന്നതിന്റെ അനന്തരഫലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. പി‌സി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഞങ്ങൾ ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തിയത്, അത് നിയന്ത്രണത്തിലൂടെ (നോൺ‌ടാർ‌ഗെറ്റിംഗ്) സി‌ആർ‌എൻ‌എ അല്ലെങ്കിൽ സി‌ആർ‌എൻ‌എ അല്ലെങ്കിൽ സി‌ആർ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് (സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്), എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് എച്ച് എന്നിവയുടെ കാറ്റലറ്റിക് സബ്‌യൂണിറ്റിന്റെ എം‌ആർ‌എൻ‌എ ലക്ഷ്യമിടുന്നു. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 4F, ΔFosB ലെവലിനെ (ടോപ്പ് പാനൽ) ബാധിക്കാതെ CK2α siRNA യുമായുള്ള കൈമാറ്റം കാര്യക്ഷമമായും പ്രത്യേകമായും CK2α പ്രോട്ടീൻ അളവ് തകർക്കുന്നു. പൾസ്-ചേസ് വിശകലനത്തിൽ CK2 നെ തട്ടിമാറ്റിയത് ΔFosB വിറ്റുവരവ് നിരക്കിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവിന് കാരണമായി എന്ന് പ്രോട്ടീന്റെ വേഗത്തിലുള്ള അപചയത്തിന് തെളിവാണ്. CK2 പ്രവർത്തനം തടയുന്നത് (DRB ചികിത്സയിലൂടെയോ അല്ലെങ്കിൽ siRNA വഴിയോ) osFosB യുടെ വിറ്റുവരവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ബൈപാസിക് കർവിന്റെ സ്ലോ-റേറ്റ് ഘടകം അപ്രത്യക്ഷമാവുകയും ചെയ്യുന്നു, അതേസമയം CK2 സജീവമാക്കൽ വക്രത്തിന്റെ മന്ദഗതിയിലുള്ള ഘട്ടം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ശക്തമായ പിന്തുണ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു osFosB സ്ഥിരത നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ CK2 ഒരു പങ്കുവഹിക്കുന്നു എന്ന ആശയം.

Ser2- ലെ CK27 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ osFosB

CK2 ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് സൈറ്റിനെ (സൈറ്റുകളെ) തിരിച്ചറിയാൻ ആരംഭിക്കുന്നതിന്, CK2 പുന rec സംയോജിത ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ഫോസ്ഫോ-അമിനോ ആസിഡ് വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി. vitro ലെ പിസിഎക്സ്എംഎക്സ് സെല്ലുകളിൽ ΔFosB ഫോസ്ഫോരിലേറ്റിന്റെ. ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി, രണ്ട് സന്ദർഭങ്ങളിലും, മാത്രം ഫോസ്ഫോ അമിനോ അമ്ലം phospho-Ser ആണ്ചിത്രം. 5A). ഈ കണ്ടെത്തൽ, കൂടാതെ ശേഖരിച്ച സ്റ്റോയിചയോമെട്രിക് ഉപയോഗിച്ച് CK2 vitro ലെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രതികരണം (∼50%) (ചിത്രം. 3B) കൂടാതെ CK2 ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പിൽ ഒരു പ്രധാന സ്ഥലത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം (ചിത്രം. 4A), ΔFosB ന്റെ CK2 ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ ഒരു സെറിൻ ശേഷിക്ക് പരിമിതമാണെന്ന് കരുതുന്നു. ഈ നിഗമനത്തിൽ ഫോസ്ഫോറലേഷൻ കൺസെൻസസ് സൈറ്റ് വിശകലനം (ചിത്രം. 2B), ഇത് CK27 നായി ഒരു കാൻഡിഡേറ്റ് സെറീൻ മാത്രം പ്രവചിക്കുന്നു, അതായത് Ser2. ഫോസ് കുടുംബാംഗങ്ങൾക്കിടയിലെ പരിണാമത്തിലൂടെ Ser27 വളരെയധികം സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് ടാക്സോണമിക് വിശകലനം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം. 5B), ഇത് ഒരു പ്രധാന ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രവർത്തനം വഹിച്ചേക്കാം എന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 5.

Ser2- ലെ CK27 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ osFosB. A, CK2- ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ഫോസ്ഫോമിനോ ആസിഡ് വിശകലനം (vitro ലെ), പിസിഎക്സ്എമ്മിൻറെ സെൽ ഫോസ്ഫോരിലേറ്റഡ് ΔFOSB എന്നിവ കാണിക്കുന്നത്, രണ്ട് സന്ദർഭങ്ങളിലും, പ്രധാന ബാക്കിയായ ഫോസ്ഫോരിലേറ്റുചെയ്തത് സെർറാണ്. B, FosB / osFosB അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസിന്റെ ക്രോസ്-സ്പീഷീസ് വിശകലനത്തിൽ ഫോസ് കുടുംബാംഗങ്ങൾക്കിടയിൽ മനുഷ്യനിൽ നിന്ന് സീബ്രാഫിഷ് വരെ (ഇരുണ്ട ഹൈലൈറ്റ്) സെർക്സ്നൂംക്‌സിന്റെ ഉയർന്ന സംരക്ഷണം കണ്ടെത്തി. എന്നിരുന്നാലും, CK27 ഒരു കൺസെൻസസ് സൈറ്റിന് ആവശ്യമായ നിലവിലെ + 3 അസിൻസി അവശിഷ്ടം സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നില്ല (വെളിച്ചം ഹൈലൈറ്റ്). C, ഹെല സെല്ലുകൾ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് os ഫോസ്ബി (ഡബ്ല്യുടി) അല്ലെങ്കിൽ os ഫോസ്ബി ഉപയോഗിച്ച് സെർക്സ്നൂംഎക്സിനെ അല (എസ്എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്എ) എന്നതിന് പകരമായി ഒരു പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷൻ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു. കളങ്ങൾ മെറ്റാബോക്സിൽ ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു ³²PH₃PO₄ CK2 സജീവമാക്കുന്നതിന് വാഹനം അല്ലെങ്കിൽ ശുക്ലം (SP) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്നു. ലഭിച്ച ΔFosB ഇമണോപ്പ്രസിട്ടറ്റുകളുടെ ഒരു പ്രതിനിധി ഓട്ടോമോഡിയോഗ്രാം (ടോപ്പ് പാനൽ), ഇമ്യൂണോബോട്ട് (താഴെ പാനൽ) എന്നിവ കാണിക്കുന്നു. മോക്ക്-ട്രാൻസ്ഫെക്റ്റ് സെല്ലുകളുടെ (വെക്റ്റർ) ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേറ്റ് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.

ΔFosB- യിൽ Ser27 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഈ അവശിഷ്ടം അലയിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യുകയും പ്രോട്ടീന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ നിലയിലെ അനന്തരഫലങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഇതിനായി, WT അല്ലെങ്കിൽ S27A മ്യൂട്ടന്റ് osFosB എന്നിവ താൽ‌ക്കാലികമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ‌ ഹെല സെല്ലുകൾ‌ (ഉയർന്ന ദക്ഷതയോടെ കൈമാറ്റം ചെയ്യാൻ‌ കഴിയും) ഉപയോഗിച്ചു. ട്രാൻസ്ഫെക്ഷന് ശേഷം ഏകദേശം 24 h, സെല്ലുകൾ ഉപാപചയമായി ലേബൽ ചെയ്തു ³²പി-ഓർഫോഫോസ്ഫേറ്റ്, മുഴുവൻ സെൽ lysates തയ്യാറാക്കി. ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷനും SDS-PAGE ഉം പിന്തുടരുന്നു, ³²ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ചും പി Δ ഫോസ്ബി ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് ഉപയോഗിച്ചും കണ്ടെത്തി. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 5C (ചുവടെയുള്ള പാനൽ), വെക്റ്റർ കൈമാറ്റം ചെയ്ത സെല്ലുകളിൽ osFosB കണ്ടെത്തിയില്ല, അതേസമയം WT അല്ലെങ്കിൽ S27A മ്യൂട്ടൻറ് ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ട സെല്ലുകൾ osFosB വിജയകരമായി പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിച്ചു. S27A മ്യൂട്ടേഷനിൽ ഗണ്യമായ (∼30%) കുറവുണ്ടായതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി ³²പി-ΔFOSB നിലകൾ (ചിത്രം. 5C, മുകളിലെ പാനലും ഗ്രാഫും), ജീവനുള്ള സെല്ലുകളിൽ, XFosB Ser27 ൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സെല്ലുകളിൽ‌ Ser27 യഥാർത്ഥത്തിൽ CK2 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ടോയെന്ന് സ്ഥാപിക്കാനുള്ള ശ്രമത്തിൽ, WT, S2A osFosB എന്നിവയുടെ ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള CK27 ആക്റ്റിവേറ്റർ ശുക്ലത്തിന്റെ കഴിവിനെ ഞങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്തു. PC12 സെല്ലുകളിൽ ഞങ്ങൾ മുമ്പ് നിരീക്ഷിച്ചതുപോലെ (ചിത്രം. 4B), ശുക്ലമുള്ള ഹെല സെല്ലുകളുടെ ചികിത്സ ഡബ്ല്യുടി പ്രോട്ടീന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു. S27A മ്യൂട്ടേഷനിൽ ഈ പ്രഭാവം ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു എന്ന വസ്തുത (ചിത്രം. 5C) ΔFosB യിലെ സെർക്എക്സ്എക്സ്എക്സ് വ്യാകരണത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു CX27- ന്റെ ഒരു ശാരീരിക അടിത്തറ.

Ser27 ന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ osFosB യുടെ സ്ഥിരതയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു

Ck2 സജീവമാകുമ്പോൾ CXXXX തടഞ്ഞുവെയ്ക്കുകയും വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്താൽ ΔFosB യുടെ സ്ഥിരത കുറയുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം. 4), കൂടാതെ സെർ‌ക്സ്‌എൻ‌എം‌എക്സിലെ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ os ഫോസ്ബി (ചിത്രം. 5), ഈ സൈറ്റിന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ തടയുന്നത് പ്രോട്ടീനെ അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രവചിച്ചു. WT അല്ലെങ്കിൽ S27A mutant ΔFosB സൂചിപ്പിക്കുന്ന പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ, പ്രവചിക്കപ്പെട്ടത് പോലെ, S27A മൃതദേഹം ΔFOSB യുടെ അപചയത്തിന്റെ അളവിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവുണ്ടാക്കി, പ്രോട്ടീൻ അർദ്ധ ജീവിതത്തിൽ (ചിത്രം. 6A). ഈ റെഗുലേറ്ററി സംവിധാനം കൂടുതൽ ന്യൂറോൺ പോലുള്ള പിസിഎക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സെൽ ലൈനിലും സംഭവിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. Hela സെല്ലുകളിൽ നാം കണ്ടതുപോലെ, S12A പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷൻ PC27 സെല്ലുകളിൽ ΔFosB- യുടെ അർദ്ധ ജീവിതത്തിൽ നാടകീയമായ കുറവുണ്ടാകുന്നു (~ 12 മുതൽ ~~NUMX വരെ)ചിത്രം. 6B). ഈ അസ്ഥിരീകരണം CK2 ഗർഭനിരോധനം അല്ലെങ്കിൽ നോക്ക്-ഡ down ൺ മൂലമുണ്ടായതിന് സമാനമാണ് (ചിത്രം. 4Ser2 ന്റെ CK27- മധ്യത്തിലുള്ള ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ ΔFosB യുടെ സ്ഥിരതയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു എന്ന ആശയത്തിന് കൂടുതൽ പിന്തുണ നൽകുന്നു. OsFosB പ്രോട്ടീൻ വിറ്റുവരവിലെ Ser27 ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെ റെഗുലേറ്ററി റോളിനുള്ള കൂടുതൽ തെളിവുകൾ ഒരു ഫോസ്ഫോമിമെറ്റിക് Ser27 to Asp mutation (S27D) ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ചു. S27D മ്യൂട്ടേഷനെ ഫോസ്ഫോമിമെറ്റിക് ആയി കണക്കാക്കുന്നു, കാരണം ഇത് അമിനോ ആസിഡ് 27 ൽ നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജ് (കാർബോക്സൈൽ) ഗ്രൂപ്പിനെ സ്ഥാപിക്കുകയും അതുവഴി സെർക്സ്നൂംഎക്സിന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷനെ ഭാഗികമായി അനുകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 6CS27D മ്യൂട്ടേഷൻ S27A മ്യൂട്ടേഷന്റെ വിപരീത ഫലമായുണ്ടാക്കി, WT പ്രോട്ടീനെക്കാളും പ്രോട്ടീൻ കൂടുതൽ സ്ഥിരത കൈവരിച്ചു. CK2 സജീവമാക്കിയതിനുശേഷം ലഭിച്ച ഇഫക്റ്റിന് സമാനമായി (ചിത്രം. 4D), S27D മ്യൂട്ടേഷൻ കുതിച്ചുചാട്ടത്തിന് ഇടയാക്കി, അങ്ങനെ ആദ്യ മണിക്കൂറിൽ തന്നെ ΔFosB ലെവൽ വർദ്ധിച്ചു.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 6.

Ser27 ന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ osFosB യുടെ സ്ഥിരതയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു. A, C, ΔFosB ന്റെ വിറ്റുവരവ് നിരയിൽ Ser27 phosphorylation ന്റെ ഫലത്തെ കാണിക്കുന്ന പൾസ്-ചേസ് അനാലിസിസ്. ഡിലാഡേഷൻ പ്രൊഫൈലും അർദ്ധവാസി ΔFosB (WT), സെലക്സ് എക്സൽ മുതൽ അല മോർട്ടാൻറ് (S27A), ഫോസ്ഫോമിമിറ്റി Ser27 മുതൽ ASP MUTANT വരെ (S27D) എന്നിവയും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇതേ കണ്ടെത്തലുകൾ ഹെല സെല്ലുകളിലും ലഭിച്ചു (A), PC12 സെല്ലുകൾ (B, C).

Ser27 ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ΔFosB- യുടെ പ്രോട്ടിയാസോമൽ അപചയം തടയുന്നു

Ser27 ന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ osFosB സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന സംവിധാനം വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്, എം‌ടി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് എന്ന പ്രോട്ടീസോം ഇൻ‌ഹിബിറ്ററുകളുടെ കഴിവ് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.പല്ലംബല്ല et al., 1994; സുബുക്കി et al., 1996), എപ്പോക്സോമിസിൻ (ഹനാഡ മറ്റുള്ളവരും., 1992; കിം et al., 1999) WT, S27A മ്യൂട്ടന്റ് osFosB എന്നിവയുടെ നിലവാരത്തകർച്ച മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന്. WT അല്ലെങ്കിൽ S12A ΔFOSB പ്രകടമാക്കൽ, ഡിഎംഎസ്ഒ അല്ലെങ്കിൽ രണ്ട് പ്രോട്ടോമാമസ് ഇൻഹെബിറ്ററുകളിൽ ഒന്നുമാറ്റി ചികിൽസിക്കുന്ന HSCNUMX സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. ഈ പ്രോട്ടീനുകൾ ഡബ്ല്യുടി പ്രോട്ടീൻ തരംതാഴ്ത്തിയതിനാൽ രണ്ട് പ്രോട്ടോമോം ഇൻഹെബിറ്ററുകളിൽ ഒന്നിന്റെ സാന്നിധ്യം താരതമ്യേന അസ്വീകാര്യമാണ് (ചിത്രം. 7A), S27A മ്യൂട്ടന്റ് ഈ മരുന്നുകളോട് സംവേദനക്ഷമമാണ് (ചിത്രം. 7B). ഇത് WT പ്രോട്ടീനിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, S27A മാറ്റുന്നതാണ് പ്രോട്ടാസോമൽ ഡീഗ്രഡേഷന്റെ ലക്ഷ്യം എന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. തീർച്ചയായും, MG132 അല്ലെങ്കിൽ epoxomicin ഒന്നോ അതിലധികമോ സെല്ലുകൾ ചികിത്സയ്ക്ക് ΔFosB യുടെ തരം താഴ്ച്ചയിലെ എസ്.എക്സ്.എം.എൻ. മ്യൂട്ടേഷന്റെ ഫലത്തെ പുനരുൽപ്പാദിപ്പിച്ചു. ഇത് എസ്എക്സ്എംഎക്സ്എ എക്സ് ജാലകത്തിന്റെ അർദ്ധായുസ്സിൻറെ ഉയരം കൂട്ടിയതുമൂലമാണ് MXXXX മുതൽ ~ എപ്പോക്സിമിസിനു വേണ്ടിയുള്ള എൺഎക്സ്എക്സ് എച്ച്.ചിത്രം. 7B). ഈ കണ്ടെത്തലുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, സെർക്സ്നൂംക്സിലെ osFosB ന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ പ്രോട്ടീസിനെ പ്രോട്ടീസോമൽ നശീകരണത്തിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുന്നു, അതിനാൽ അതിന്റെ അസാധാരണ സ്ഥിരതയ്ക്ക് അത്യാവശ്യമാണ്.

വലിയ പതിപ്പ് കാണുക:

PowerPoint സ്ലൈഡായി ഡൗൺലോഡുചെയ്യുക

ചിത്രം 7.

പ്രോട്ടാസോമൽ ഡീറാഡറേഷൻ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് സെസ്ക്സ്.എൻ.എക്സ്.എസിന്റെ ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ ΔFosB സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നു. A, B, HSV- ബാധിച്ച പി.സി.എക്സ്എൻഎക്സ് സെല്ലുകളുള്ള പൾസ്-ചേസ് അനാലിസിസ് ഡഗ്ഡ്രേഷൻ പ്രൊഫൈൽ കാണിക്കുന്നു, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ΔFOSB- യുടെ അർദ്ധായുസ് (A) അല്ലെങ്കിൽ S27A osFosB (B(MG132, എപ്പോക്സോമിസിൻ (എപ്പോക്സോ) എന്നീ രണ്ടു പ്രോട്ടോസോം ഇൻഹൈറ്റൈറ്റുകളുടെ അഭാവത്തിൽ അല്ലെങ്കിൽ സാന്നിധ്യത്തിൽ. വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് Δ ഫോസ്ബിയുടെ വിറ്റുവരവിൽ ഒരു മരുന്നും കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നില്ല എന്ന വസ്തുത ശ്രദ്ധിക്കുക, അതേസമയം പ്രോട്ടീസോം ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ചുള്ള കോശങ്ങളുടെ ചികിത്സ S27A osFosB യുടെ സ്ഥിരതയ്ക്ക് കാരണമായി. Cദീർഘകാല തലച്ചോറിലെ പ്ലാസ്റ്റിക് പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിക്കാൻ ΔFosB- യുടെ കഴിവിൽ Ser27 ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ എന്ന പങ്കിനുള്ള ഒരു മാതൃക. പ്രേരിപ്പിച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, S2 ന്റെ CK27- മെഡിറ്റേറ്റഡ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ osFosB യുടെ ഒരു ഭാഗം തലച്ചോറിൽ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നു. ഇത് അതിന്റെ ശേഖരണത്തിന് കാരണമാകുന്നു, ഇത് ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ ദീർഘകാലം നിലനിൽക്കുന്ന മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുന്നു. ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ സ്ഥിരമായ ഈ മാറ്റങ്ങൾ സ്ഥിരമായ പെരുമാറ്റ അഡാപ്റ്റേഷനുകൾക്ക് കാരണമാകുന്നു. നേരെമറിച്ച്, സെർ / ത്രർ ഫോസ്ഫേറ്റസുകളായ പി‌എക്സ്എൻ‌എൻ‌എം‌എക്സ് കൂടാതെ / അല്ലെങ്കിൽ പി‌പി‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്എയുടെ എസ്‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്‌സിന്റെ ഡീഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രോട്ടീന്റെ അസ്ഥിരീകരണത്തിനും പ്രോട്ടീസോമൽ മെഷിനറികൾ അതിന്റെ പ്രോസസ്സിംഗിനും കാരണമാകുന്നു.

മുമ്പത്തെ വിഭാഗം അടുത്ത വിഭാഗം

സംവാദം

നിലവിലെ പഠനത്തിൽ, cellFosB ന് സെൽ‌ കൾ‌ച്ചറിൽ‌ ∼10 h ന്റെ അർദ്ധായുസ്സുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ‌ കാണിക്കുന്നു, ഇത് മുഴുനീള ഫോസ്ബിയുമായും മറ്റ് ഇൻ‌ഡ്യൂസിബിൾ ട്രാൻ‌സ്‌ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുമായും താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ സ്ഥിരത കൈവരിക്കുന്നു, സെൽ‌ കൾ‌ച്ചറിലെ അർ‌ദ്ധായുസ്സ് ഹ്രസ്വമായിരിക്കും കുറച്ച് മിനിറ്റുകൾക്കുള്ളിൽ, അപൂർവ്വമായി 3 കവറും (ഹാനി ആൻഡ് ഐസ്മാൻ, 1984; ഡോബ്രാസാൻസ്കിയും മറ്റുപേരും., 1991; റോബർട്സ് ആൻഡ് വൈറ്റ്‌ലാവ്, 1999; ഫെറാറ മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്; ഹിരാത മറ്റുള്ളവരും., 2004). കൂടാതെ, osFosB തലച്ചോറിൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണെന്നും അതിന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ PP1 / PP2A ഇൻഹിബിറ്റർ ഒകാഡൈക് ആസിഡിനോട് സംവേദനക്ഷമമാണെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. നമ്മുടെ കോശ സംസ്ക്കരണ പഠനങ്ങൾ ΔFosB യുടെ സ്ഥിരത, CK2 ഉപയോഗിച്ച്, പ്രോട്ടീനിന്റെ സ്ഥിരതയിൽ ഉയർന്ന CK2 പ്രവർത്തനം ഉള്ളതാണെന്ന് തെളിയിക്കുന്നു. അവസാനമായി, ഏറ്റവും കൂടുതൽ സംരക്ഷിത എൻ ടെർമിനസ് സെറിൻ (S2) ന് CK27 ഫോസ്ഫോരിലേറ്റുകൾ ΔFosB എന്നും എസ്എക്സ്എൻഎക്സിൻറെ പ്രോസ്പോസ്സോമൽ ഡഗ്റാഡേഷൻ മുതൽ എസ്എഫ്എഫ്എസ്ബി സംരക്ഷിക്കുന്നു എന്നും ഇത് തെളിയിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഒരു മാതൃക ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു, അതിലൂടെ SKNNX- ൽ S27- ൽ osFosB ഫോസ്ഫോറിലൈസേഷൻ osFosB- യുടെ വിറ്റുവരവിന്റെ നിർണ്ണായക നിയന്ത്രണ സംവിധാനമാണ് (ചിത്രം. 7C). Os ഫോസ്ബിയുടെ അത്തരം ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ-മെഡിറ്റേറ്റഡ് സ്റ്റെബിലൈസേഷൻ പ്രവർത്തനപരമായി പ്രധാനമാണ്, കാരണം പ്രത്യേക തലച്ചോറിലെ പ്രദേശങ്ങളിൽ osFosB യുടെ വർദ്ധിച്ച അളവ് നിരവധി ന്യൂറോണൽ ജീനുകളെ നേരിട്ട് നിയന്ത്രിക്കുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇൻ വിവോ കൂടാതെ നിരവധി ന്യൂറോ സൈക്കിയാട്രിക് ഡിസോർഡേഴ്സിന്റെ മൃഗങ്ങളുടെ മാതൃകകളിൽ ശക്തമായ പെരുമാറ്റ ഫലങ്ങൾ ചെലുത്താനും (ആമുഖം കാണുക).

CREB (cAMP പ്രതികരണ ഘടകം ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീൻ) പോലുള്ള ചില ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രവർത്തനം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള വേഗതയേറിയതും പഴയപടിയാക്കാവുന്നതുമായ മാർഗമാണ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ എങ്കിലും (ബോഹ്മാൻ, 1990), ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ അപചയം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നത് കൂടുതൽ ശക്തമായ (എളുപ്പത്തിൽ പഴയപടിയാക്കാനാകാത്ത) നിയന്ത്രണ രീതി നൽകുന്നു (ഡെസ്റ്റെറോ മറ്റുള്ളവരും., 2000). അവയുടെ അപചയത്തിന്റെ തലത്തിൽ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രവർത്തനം നിയന്ത്രിക്കുന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളിൽ NFκB ഉൾപ്പെടുന്നു (ഡെസ്റ്റെറോ മറ്റുള്ളവരും., 2000), സി-മൈക്ക് (Sears മറ്റുള്ളവരും., 1999), സി-ഫോസ് (ഫെറാറ മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്), മറ്റുള്ളവരുമായി. പല സന്ദർഭങ്ങളിലും, ഫോസ്ഫോളാലേഷൻ ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകം സ്ഥിരതയുടെ ഒരു പ്രധാന റഗുലേറ്റർ ആണ്, കാരണം സി-ഫോസ് (സി-ഫോസ്)ഒകസാകിയും, സാഗത, ങും; സുറുമി മറ്റുള്ളവരും., 1995), ഫോസുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ആന്റിജൻ- 1 (Fra-1) (വിയലും മാർഷലും, 2003), Fra-2 (മനാബെ മറ്റുള്ളവരും, 2001), c-jun (ഫുച്ചുസ് et al., 1996), ജുനബ് (ഫുച്ചുസ് et al., 1997), ATF2 (ഫുച്ചുസ് et al., 2000), p53 (ബുഷ്മാൻ മറ്റുള്ളവരും., 2001). ഞങ്ങളുടെ പഠനങ്ങൾ ഈ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ്-ആശ്രിത സ്ഥിരതയിലൂടെ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രവർത്തനം നിയന്ത്രിക്കുന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ പട്ടികയിലേക്ക് osFosB ചേർക്കുന്നു.

സി‌കെ 2 എന്നത് സർവ്വവ്യാപിയായതും ഘടനാപരമായി സജീവവുമായ സെർ‌ / ത്രർ‌ കൈനെയ്‌സാണ്, ഇതുവരെ 300 നിർ‌ദ്ദിഷ്‌ട സബ്‌‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ‌ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ സെൽ‌ മരണവും അതിജീവനവും ഉൾപ്പെടെ ഒന്നിലധികം ജൈവ പ്രക്രിയകളിൽ‌ ഉൾ‌പ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (ലിച്ച്ഫീൽഡ്, 2003; അൻ‌ഗെർ മറ്റുള്ളവരും., 2004), സെല്ലുലാർ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണങ്ങൾ (യനാഗവ മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്; കാറ്റോ മറ്റുള്ളവരും., 2003), ഡി‌എൻ‌എ റിപ്പയർ, ക്രോമാറ്റിൻ പുനർ‌നിർമ്മാണം (ബാർസ് മറ്റുള്ളവരും., 2003; ക്രോൺ മറ്റുള്ളവരും., 2003). CK2 ന്റെ പുട്ടേറ്റീവ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിൽ മൂന്നിലൊന്നിൽ കൂടുതൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീനുകളാണ് (മെഗിയോയും പിന്നയും, 2003). വാസ്തവത്തിൽ, CK2 ഒരു പ്രമുഖ ന്യൂക്ലിയർ കൈനാസാണ് (ക്രെക്ക് മറ്റുള്ളവരും., 1992) (അവലോകനത്തിനായി, കാണുക യു മറ്റുള്ളവരും., 2001) കൂടാതെ നിരവധി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ bZIP ഡൊമെയ്‌നുകളുമായി സംവദിക്കാനും (യമാഗുച്ചി et al., 1998). CK2- മെഡിയേറ്റഡ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ IkB () ഉൾപ്പെടെ നിരവധി പ്രോട്ടീനുകളുടെ അപചയത്തെ (ഇത് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയോ കുറയ്ക്കുകയോ) മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.ഷ്വാർസ് മറ്റുള്ളവരും., 1996), PTEN (ടോറസും പുലിഡോ, 2001), ലെൻസ് കണക്‌സിൻ (Yin et al., 2000), ക്രോമാറ്റിൻ-അനുബന്ധ പ്രോട്ടീൻ HMG1 (വിസ്‌നിയുസ്‌കി മറ്റുള്ളവരും, 1999), കൂടാതെ എച്ച്എം‌ജിബി (ട്രാൻ‌സ്‌ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ)സ്റ്റെമ്മർ മറ്റുള്ളവരും., 2002), Myf-5 (വിന്റർ മറ്റുള്ളവരും., 1997), സി-മൈക്ക് (ചന്നവജാലയും സെൽഡിനും, 2002). തലച്ചോറിൽ CK2 ധാരാളം അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട് (അൽകാസർ മറ്റുള്ളവരും., 1988; ജിറാൾട്ട് മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്), ന്യൂറോണൽ അതിജീവനം ഉൾപ്പെടെ തലച്ചോറിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പല വശങ്ങളിലും ഇതിന്റെ പ്രവർത്തനം ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട് (ബോഹിംഗ് മറ്റുള്ളവരും, 2003), വ്യത്യാസം (നതാൽ മറ്റുള്ളവരും., 2004), അയോൺ ചാനൽ പ്രവർത്തനം (ജോൺസും യാക്കലും, 2003; Bildl et al., 2004), ഒപ്പം ദീർഘകാല പൊട്ടൻഷ്യേഷനും ന്യൂറോണൽ പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയും (ഡയസ്-നിഡോ മറ്റുള്ളവരും, 1992; ലിബർമാൻ ആൻഡ് മോഡി, 1999; റെയ്കാർട്ട് മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്).

ന്യൂറോണൽ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ സി.കെ.എക്സ്.എൻ.എം.എക്‌സിന്റെ പങ്കിന് ഈ തെളിവുകൾ വർദ്ധിച്ചുവരുന്നുണ്ടെങ്കിലും, അതിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന കാര്യങ്ങളെക്കുറിച്ച് വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ. CK2 ഘടനാപരമായി സജീവമാണെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു, നിർദ്ദിഷ്ട സബ്സ്റ്റേറ്റുകളെ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവ് നിയന്ത്രിക്കുന്നത് അതിന്റെ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ലോക്കലൈസേഷനിലെ മാറ്റങ്ങളെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (ഉദാ. സൈറ്റോസോൾ vs ന്യൂക്ലിയസ്) (അഹമ്മദും ത aw ഫിക്കും, എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്; യു മറ്റുള്ളവരും., 1999). വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനത്തിനുശേഷം തലച്ചോറിൽ osFosB ശേഖരിക്കപ്പെടാൻ പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന സിഗ്നലുകൾ എന്താണെന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു പ്രധാന ചോദ്യം ഈ വിവരങ്ങൾ ഉയർത്തുന്നു (ചിത്രം. 7C). ആവർത്തിച്ച് സജീവമാക്കുന്നത് ഒരു ആവശ്യകതയാണ് fosB osFosB mRNA യുടെ ജീനും ഇൻഡക്ഷനും (ചെൻ et al., 1995). DataFosB- യുടെ CK2 ഫോസ്ഫറൈസേഷൻ അതിന്റെ സ്ഥിരതയ്ക്ക് നിർണ്ണായകമാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ osFosB- യുടെ ദീർഘകാല പ്രത്യാഘാതങ്ങൾക്ക് രണ്ടാമത്തെ സിഗ്നൽ ആവശ്യമായിരിക്കുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു, അതായത്, CK2 പ്രോട്ടീന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന ഒരു സിഗ്നൽ. അജ്ഞാതമായ ചില സംവിധാനം ഉപയോഗിച്ച് സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് സജീവമാക്കുന്നത് അല്ലെങ്കിൽ ന്യൂക്ലിയസിലേക്കുള്ള അതിന്റെ സ്ഥാനമാറ്റം ഇതിൽ ഉൾപ്പെടാം. മറ്റൊരു തരത്തിൽ, osFosB യുടെ CK2 ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ഘടനാപരമായിരിക്കാം, അതായത് ഓരോ ഉത്തേജകത്തിനും മറുപടിയായി osFosB പ്രോട്ടീൻ വിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, അതിന്റെ ഒരു ഭാഗം ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യുകയും അതുവഴി സ്ഥിരത കൈവരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അങ്ങനെ ആവർത്തിച്ചുള്ള ഉത്തേജനത്തിലൂടെ അത് ബാധിച്ച ന്യൂറോണുകളിൽ ഉയർന്ന അളവിൽ അടിഞ്ഞു കൂടുന്നു.

ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ കാണിക്കുന്നത് ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷന് ഉത്തരവാദിത്തമുള്ള ഒരേയൊരു കൈനേസും സൈറ്റും CK2 ഉം S27 ഉം ആയിരിക്കില്ല, കാരണം CK2 ന്റെ തടസ്സത്തിനും S27A മ്യൂട്ടേഷനും ΔFosB ഫോസ്ഫോറിലേഷനെ പൂർണ്ണമായും തടയാൻ കഴിഞ്ഞില്ല. അതേ ടോക്കൺ അനുസരിച്ച്, S27A മ്യൂട്ടേഷന്റെ ഫലമായി ഫോസ്ഫോ- XFosB- ൽ 30% കുറവുണ്ടാകുന്നു എന്ന വസ്തുത പ്രോട്ടീനിലെ പ്രധാന ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റാണ് S27 എന്ന് വാദിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ΔFosB- യിലെ മറ്റ് പുട്ടേറ്റീവ് കൈനെയ്‌സുകളെയും ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകളെയും ഞങ്ങൾ അന്വേഷിക്കുന്നു. ആത്യന്തികമായി, S27 ന്റെയും ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകളുടെയും ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വിശകലനം ചെയ്യുന്നത് പ്രധാനമാണ്. ഇൻ വിവോ വിവിധതരം വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനത്തിന് ശേഷം, ഉദാഹരണത്തിന്, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി അല്ലെങ്കിൽ ഫോസ്ഫോസ്പെസിഫിക് ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച്.

മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ, osFosB- ലെ S27 പരിണാമത്തിലുടനീളം മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളിൽ വളരെ സംരക്ഷിതമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, CK2 നായുള്ള സമവായ സൈറ്റ് അല്ല: കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ചിത്രം 5B, C-FosB അല്ലെങ്കിൽ Fra-2 അല്ല, FosB / osFosB (ഒപ്പം സീബ്രാഫിഷ് സീനോളോഗ്) മാത്രം, + 3 ൽ ഒരു അസിഡിക് ശേഷിപ്പുണ്ട്, ഇത് CK2 ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെ പ്രധാന നിർണ്ണായകമാണ് (മാരിൻ മുതലായവ., 1986; മെഗിയോ മറ്റുള്ളവരും., 1994). അതിനാൽ, മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകൾ ΔFosB പോലെ സ്ഥിരതയില്ലാത്തത് എന്തുകൊണ്ടെന്ന് S2 ലെ CK27 ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെ അഭാവം വിശദീകരിക്കും. എന്നിരുന്നാലും, ΔFosB- ന് സമാനമായ CK2 അഭിപ്രായ സമന്വയ സൈറ്റുള്ള മുഴുനീള FosB സമാനമായ സ്ഥിരത കൈവരിക്കാത്തത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് ഇത് വിശദീകരിക്കുന്നില്ല. ഈ സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടത്തിൽ സി‌കെ‌എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ് മുഴുനീള ഫോസ്ബി ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് അറിയില്ല. FosB- യുടെ ഏക റിപ്പോർട്ടുകൾ (സ്‌കിന്നർ മറ്റുള്ളവരും., 1997), സി-ഫോസ് (ഒകസാകിയും, സാഗത, ങും; ചെൻ et al., 1996) ഈ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സി-ടെർമിനൽ മേഖലയിലെ സൈറ്റുകളെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വിവരിക്കുന്നു, അത് osFosB- യിൽ ഇല്ല. CK2 ന്റെ മുഴുനീള ഫോസ്ബിയുടെയും മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളുടെയും ഫോസ്ഫറൈസേഷന് നേരിട്ടുള്ള അന്വേഷണം ആവശ്യമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, അവ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണെങ്കിൽപ്പോലും, മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളിൽ അവയുടെ സി ടെർമിനിയിൽ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള അപചയത്തിന് പ്രോട്ടീനുകളെ ലക്ഷ്യമിടുന്ന സവിശേഷതകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട്.പാപ്പാവാസിലിയോ മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്; Jariel-Encontre et al., 1997; അക്വാവിവ മറ്റുള്ളവരും, 2002). ഉദാഹരണത്തിന്, എല്ലാ ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളുടെയും സി ടെർമിനസിൽ ∼21 അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, എന്നാൽ ΔFosB- ൽ ഇല്ലെങ്കിൽ, സി-ഫോസിനായി അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന ഡൊമെയ്‌നായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു (അക്വാവിവ മറ്റുള്ളവരും, 2001). ഈ ശ്രേണി സമാനമായി മുഴുനീള ഫോസ്ബിയെ അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (കാർലെ et al., 2004), ΔFosB- ൽ ഈ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ അഭാവം അതിന്റെ സ്ഥിരതയ്‌ക്ക് പൂർണ്ണമായി കാരണമാകില്ല. പകരം, ഈ സി ടെർമിനസ് ഡൊമെയ്‌നിന്റെയും സെർക്സ്നൂം ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെയും അഭാവം the ഫോസ്ബിയും ഫോസ്ബിയും തമ്മിലുള്ള സ്ഥിരതയിലെ ഏകദേശം അഞ്ചിരട്ടി വ്യത്യാസത്തിന് പൂർണ്ണമായും കാരണമാകുമെന്ന് തോന്നുന്നു.

ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളുടെ അപചയം സങ്കീർണ്ണവും പൂർണ്ണമായി മനസ്സിലാക്കാൻ കഴിയാത്തതുമാണെങ്കിലും, പ്രോട്ടിയാസോമൽ ഡീഗ്രേഡേഷൻ ഉൾപ്പെടുന്ന പ്രധാന പാതയാണെന്ന് തോന്നുന്നു (സാൽ‌വത് മറ്റുള്ളവരും., 1999; അക്വാവിവ മറ്റുള്ളവരും, 2002; ഫെറാറ മറ്റുള്ളവരും, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്). ഇവിടെ അവതരിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, പ്രോട്ടീസോമൽ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ osFosB ഡീഗ്രേഡേഷന്റെ തോതിൽ കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്തുന്നില്ല, മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി osFosB 26S പ്രോട്ടിയാസോമിനെ ഒഴിവാക്കുന്നുവെന്നും ഇത് സ്ഥിരത കൈവരിക്കുന്നതിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുവെന്നും വാദിക്കുന്നു. അതിനാൽ രണ്ട് പ്രധാന ഘടകങ്ങളുടെ സംയോജനമാണ് ΔFosB യുടെ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ സ്ഥിരതയ്ക്ക് കാരണമായ ഒരു സ്കീം ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നത്: (1) സി-ടെർമിനൽ അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന ഡൊമെയ്‌നിന്റെ അഭാവവും (2) CX27 ന്റെ S2 ന്റെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനും.

ചുരുക്കത്തിൽ, ഇന്നത്തെ പഠനം ഉടനടി ആദ്യകാല ജീനിന്റെ ഉൽ‌പ്പന്നമായ osFosB എന്തുകൊണ്ടാണെന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള യാന്ത്രിക ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുന്നു fosB, മറ്റെല്ലാ ഫോസ് കുടുംബാംഗങ്ങളിൽ നിന്നും വ്യത്യസ്തമായി താരതമ്യേന ദീർഘകാലം നിലനിൽക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ ആണ്. മറ്റ് ഫോസ് ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകൾ ദ്രുതഗതിയിലുള്ളതും എന്നാൽ ക്ഷണികവുമായ ഉത്തേജക-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കപ്ലിംഗിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുമെന്ന് കരുതുന്നുണ്ടെങ്കിലും (മോർഗനും കുറാനും, 1995), വിട്ടുമാറാത്ത ഉത്തേജനം മൂലം ഉണ്ടാകുന്ന ദീർഘകാല ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ മാറ്റങ്ങൾക്ക് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാനുള്ള കഴിവ് ΔFosB- യുടെ ആപേക്ഷിക സ്ഥിരത നൽകുന്നു. തലച്ചോറിലെ സുസ്ഥിരമായ തന്മാത്രാ സ്വിച്ചായി os ഫോസ്ബി പ്രവർത്തിക്കുന്നു എന്ന കാഴ്ചപ്പാടിനെ ഇത് പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, ക്രമേണ നിശിത പ്രതികരണങ്ങളെ ക്രോണിക് അഡാപ്റ്റേഷനുകളായി പരിവർത്തനം ചെയ്യുന്നു. Os ഫോസ്ബിയുടെ സ്ഥിരത നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന സംവിധാനമായി സെർക്സ്നൂം ഫോസ്ഫോറിലേഷനെ തിരിച്ചറിയുന്നത് os ഫോസ്ബിയുടെ പ്രവർത്തനം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനും അതുവഴി ന്യൂറൽ, ബിഹേവിയറൽ പ്ലാസ്റ്റിറ്റിയിൽ അതിന്റെ ദീർഘകാല ഫലങ്ങൾ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിനുമുള്ള മാർഗ്ഗങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പുതിയ വഴികൾ തുറക്കുന്നു.

മുമ്പത്തെ വിഭാഗം അടുത്ത വിഭാഗം

അടിക്കുറിപ്പുകൾ

നവംബർ 21, 2005 ലഭിച്ചു.
പുനരവലോകനം ഫെബ്രുവരി 21, 2006 ലഭിച്ചു.
അംഗീകരിച്ച ഏപ്രിൽ 29, XX.

നാഷണൽ അലയൻസ് ഫോർ റിസർച്ച് ഓൺ സ്കീസോഫ്രീനിയ ആൻഡ് ഡിപ്രഷൻ യംഗ് ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ അവാർഡ്, പി‌ജി‌യുവിന് നാഷണൽ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓൺ ഡ്രഗ് അബുസ് (നിഡ) നാഷണൽ റിസർച്ച് സർവീസ് അവാർഡ്, നാഷണൽ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് മെന്റൽ ഹെൽത്ത്, നിഡ എന്നിവയിൽ നിന്ന് ഇജെ‌എൻ‌ വി ഡോ. ജെയിംസ് ബിബിന് നൽകിയ സഹായത്തിന് നന്ദി vitro ലെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പരിശോധനകൾ, ഉപാപചയ ലേബലിംഗിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന മസ്തിഷ്ക കഷ്ണങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിനുള്ള സഹായത്തിനായി ഡോ. മിംഗ്-ഹു ഹാൻ, പുനർസംയോജന എച്ച്എസ്വികളുടെ പാക്കേജിംഗിനുള്ള സഹായത്തിനായി ഡോ. റേച്ചൽ നെവ്.
ജി. റുഡെൻകോയുടെ ഇപ്പോഴത്തെ വിലാസം: ലൈഫ് സയൻസസ് ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടും ഫാർമക്കോളജി വകുപ്പും, മിഷിഗൺ സർവകലാശാല, 210 വാഷ്‌ടനേവ് അവന്യൂ # 3163 എ, ആൻ അർബർ, എംഐ 48109-2216.
കറസ്പോണ്ടൻസ് എറിക് ജെ. നെസ്‌ലർ, എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ് ഹാരി ഹൈൻസ് ബൊളിവാർഡ്, ഡാളസ്, ടി‌എക്സ് എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്-എക്സ്എൻ‌എം‌എക്സ്. ഇമെയിൽ: [ഇമെയിൽ പരിരക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നു]

മുമ്പത്തെ വിഭാഗം

അവലംബം

അക്വാവിവ സി, ബ്രോക്ലി എഫ്, ഫെരാര പി, ബോസിസ് ജി, സാൽ‌വത് സി, ജാരിയൽ‌-എൻ‌കോൺ‌ട്രെ I, പിയാചിക് എം (2001) ജി (എക്സ്എൻ‌യു‌എം‌എക്സ്-ടു-എസ് ഘട്ടം സംക്രമണ സമയത്ത് സി-ഫോസ് പ്രോട്ടോ-ഓങ്കോപ്രോട്ടീന്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പ്രോട്ടീസോമൽ നശീകരണത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന സി-ടെർമിനൽ ട്രൈപെപ്റ്റൈഡ് മോട്ടിഫിന്റെ തിരിച്ചറിയൽ. ഓൻഗോജീൻ 20:7563-7572.

വേര്പെട്ടുനില്ക്കുന്ന

അവതാരിക

വസ്തുക്കളും രീതികളും

സസ്തനി സെൽ ലൈനുകളും ഡി‌എൻ‌എ നിർമാണങ്ങളും.

പൾസ്-ചേസ് പരീക്ഷണങ്ങൾ.

മൃഗങ്ങളും വിട്ടുമാറാത്ത ഇലക്ട്രോകൺ‌വാൾ‌സീവ് പിടിച്ചെടുക്കൽ ചികിത്സയും.

32 പി മെറ്റബോളിക് ലേബലിംഗ്.

കെമിക്കൽസ്, സെൽ കൾച്ചർ ട്രീറ്റ്മെന്റ്.

Os ഫോസ് ഇമ്യൂണോ പ്രെസിപിറ്റേഷൻ, ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ്, ഓട്ടോറാഡിയോഗ്രഫി.

പ്രാണികളുടെ കോശങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പുന omb സംയോജന ΔFosB യുടെ അമിതപ്രയോഗവും ശുദ്ധീകരണവും.

ഇൻ విటോ ഫോസ്ഫോരിലേഷൻ പഠനങ്ങൾ.

ദ്വിമാന ഫോസ്ഫോപെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പും ഫോസ്ഫോമിനോ ആസിഡ് വിശകലനവും.

siRNA- ഇൻഡ്ഡ് CK2A നോക്ക് ഡൗൺ.

സൈറ്റ്-നിർദ്ദേശിച്ച mutagenesis.

ബയോഇൻഫർമാറ്റിക്സ്.

ഡാറ്റ അളവ്, കണക്കുകൂട്ടലുകൾ, സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾ.

ഫലം

അസാധാരണമാംവിധം സ്ഥിരതയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമാണ് ഫോസ്ബി

തലച്ചോറിലെ ഒരു ഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണ് ഫോസ്ബി

CK2 പക്ഷേ PKC അല്ലെങ്കിൽ CaMKII ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ ΔFosB അല്ല vitro ലെ

കേടുകൂടാത്ത സെല്ലുകളിലെ osFosB യുടെ ഫോസ്ഫറൈസേഷനും സ്ഥിരതയും CK2 മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു

Ser2- ലെ CK27 ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ osFosB

Ser27 ന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ osFosB യുടെ സ്ഥിരതയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു

Ser27 ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ΔFosB- യുടെ പ്രോട്ടിയാസോമൽ അപചയം തടയുന്നു

സംവാദം

അടിക്കുറിപ്പുകൾ

അവലംബം

ഈ ലേഖനം പരാമർശിക്കുന്ന ലേഖനങ്ങൾ

നേരിട്ടുള്ള ലിങ്കുകൾ

³² പി മെറ്റബോളിക് ലേബലിംഗ്.