फॉस्फोरीलायझेशन (2006) द्वारे डेल्टाफॉसबी स्थिरताचे नियमन

जे न्युरोसी 2006 May 10;26(19):5131-42.

स्रोत

मानसोपचार विभाग, बेसिक न्यूरोसाइन्स सेंटर, टेक्सास विद्यापीठ दक्षिणपश्चिम वैद्यकीय केंद्र, डॅलस, टेक्सास 75390-9070, यूएसए.

सार

लिप्यंतरण घटक डेल्टाफॉसबी (याला फॉसबीएक्सएनएक्स किंवा फॉस्बी [लहान फॉर्म] म्हणून देखील संदर्भित केले जाते) हे मेंदूच्या प्रत्यारोपणामुळे दीर्घकालीन काळातील प्लास्टीनिटीचे महत्त्वपूर्ण मध्यस्थ आहे जे अनेक प्रकारचे मनोविश्लेषित उत्तेजनासह दुर्व्यवहार करते, यात दुर्व्यवहार, तणाव, आणि इलेक्ट्रोकोनव्हल्व्हिव्हव्ह सेझ . डेल्टाफॉसबीची एक विशिष्ट वैशिष्ट्य म्हणजे, एकदा प्रेरित झाले की, पुढील उत्तेजिततेच्या अनुपस्थितीत ते दीर्घ काळापर्यंत मेंदूमध्ये टिकते. तथापि, या स्पष्ट स्थिरतेखाली असलेल्या यंत्रणेस अज्ञात राहिले आहे. येथे, आम्ही दर्शवितो की सेल संस्कृतीमध्ये अंदाजे 10 एच अर्ध्या आयुष्यासह डेल्टाफॉसबी प्रमाणित स्थिर लिप्यंतरण घटक आहे. याव्यतिरिक्त, आम्ही दर्शवितो की डेल्टाफॉसबी हे मेंदूमध्ये फॉस्फोप्रोटीन आहे आणि डेल्टाफॉसबी मधील उच्च संरक्षित सेरिन रेजिड्यू (सेरॉक्सNUMएक्स) चे फॉस्फोर्लायलेशन हे प्रोटीसोमल डिग्रेडेशनपासून रक्षण करते. कॅसिन किनेझ 27 द्वारे हे फॉस्फोरायलेशन मध्यस्थ केले आहे असे सुचविताना आम्ही कित्येक पुरावा प्रदान करतो. डेल्टाफॉसबी हे फॉस्फोरिलेट होते आणि हे सिद्ध करते की फॉस्फोरीलायझेशन त्याच्या स्थिरतेमध्ये योगदान देते, हे मेंदूतील दीर्घकालीन स्थायी बदलांमध्ये मध्यस्थी करण्याची क्षमता आहे.

परिचय

लिप्यंतरण घटक ΔFOSB, फॉस्बीएक्सएनएक्स किंवा एफओएसबी [शॉर्ट फॉर्म] असेही निर्दिष्ट केले जाते, ते लवकर प्रारंभिक जीनचे सी टर्मिन्स-ट्राँकेटेड स्प्लिसे वेरिएंट आहे. फॉस्ब (डोब्राझांस्की इट अल., एक्सएमएक्स; नाकाबेपु आणि नाथान्स, एक्सएमएक्स; येन एट अल., एक्सएमएक्स). पूर्ण-लांबीच्या FOSB प्रमाणे, ΔFOSB मध्ये डीएनए-बाईंडिंग मूलभूत डोमेन आणि ल्युसीन जिपर आहे ज्याद्वारे ते जून प्रोटीन्ससह सक्रिय होते जे ऍक्टिव्हिटी प्रोटीन-एक्सNUMएक्स (एपी-एक्सएनएक्सएक्स) ट्रान्सक्रिप्शन कारक कॉम्प्लेक्स बनवतात जे अनेक जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते (मॉर्गन आणि कुरान, 1995; रिलस्की आणि कॅझमेरेक, 2004). एफओएसबीच्या सी टर्मिनसमध्ये आढळणार्या ट्रान्सॅक्टिवेशन डोमेनचा भाग नसला तरीही Δएफओएसबी सशक्त ट्रांसक्रिप्शनर एक्टिव्हेटर आणि सुसंस्कृत पेशींमध्ये आणि दम्यामध्ये दडपशाही म्हणून कार्य करते.डोब्राझांस्की इट अल., एक्सएमएक्स; नाकाबेपु आणि नाथान्स, एक्सएमएक्स; चेन एट अल., एक्सएमएक्स; मॅकक्लंग आणि नेस्लर, 2003; कुमार et al., 2005).

Δफॉस्बी दीर्घकालीन नंतर ब्रेन-विशिष्ट रीतीने उच्च पातळीवर प्रेरित होते परंतु तीव्र नाही, मानसिक-उत्तेजक उत्तेजनांमध्ये तणाव, काही विकृती, एंटीसाइकोटिक आणि अँटिडप्रेस औषध, दुरूपयोगाची औषधे आणि नैसर्गिक बक्षिसे यांचा समावेश आहे. (होप एट अल., एक्सएमएनएक्सबी; हिरोई आणि ग्रेबील, 1996; मोराटल्ला एट अल., एक्सएमएक्स; Bing et al., 1997; मंडेलझीस इट अल., एक्सएमएक्स; केल्झ एट अल., एक्सएमएक्स; वर्मे एट अल., एक्सएमएक्स; अँडर्सन एट अल., एक्सएमएक्स; कोल्बी एट अल., एक्सएमएक्स; पीकमॅन एट अल., एक्सएमएक्स; पेरोटी एट अल., एक्सएमएक्स; झचिरू इट अल., एक्सएमएक्स). Δएफओएसबीचा अंतर्भाव हे मेंदूतील यापैकी अनेक उत्तेजनांच्या कार्यात्मक प्रभावाशी थेट संबंधित आहे. Stimफॉसबीच्या दृढतेमुळे अतिरिक्त उत्तेजनाच्या अनुपस्थितीत तो इतर सर्व पारिवारिक प्रतिलेखन घटकांपासून वेगळा असतो, जो तीव्र उत्तेजनाच्या प्रतिसादात वेगाने प्रेरित होतो, काही तासांमध्ये बेसल पातळीवर परत फिरतो आणि क्रॉनिक उत्तेजनानंतर सामान्यतः डिसेंसिटायझेशन दर्शवितो (होप इट अल., एक्सएमएक्स; दौनीस इट अल., एक्सएमएक्स; पर्सिको एट अल., एक्सएमएक्स; हिरोई आणि ग्रेबील, 1996; पेरोटी एट अल., एक्सएमएक्स). यामुळे ch FosB एक आकर्षक उमेदवाराला जीन अभिव्यक्तीमध्ये दीर्घकालीन बदल घडवून आणण्यासाठी काही ठराविक मध्यस्थी बनवते जे विशिष्ट क्रॉनिक उत्तेजनामुळे स्थिर न्यूरोनल अनुकूलीत होते.

कारण एफओआरबीची दीर्घ उपस्थिति त्याच्या एमआरएनएच्या पुढील प्रक्षेपणाच्या अनुपस्थितीत होते कारण (चेन एट अल., एक्सएमएक्स), आम्ही असा अंदाज केला की, पूर्ण-लांबीच्या फॉस्बी आणि इतर सर्व पारिवारिक प्रथिने विपरीत, जे आंतरिकदृष्ट्या अस्थिर आहेत, Δएफओएसबी एक विलक्षण स्थिर स्थिरलेखन घटक असू शकते (होप एट अल., एक्सएमएनएक्सबी; चेन एट अल., एक्सएमएक्स; नेस्लर एट अल., एक्सएमएक्स; मॅकक्लंग एट अल., एक्सएमएक्स). याव्यतिरिक्त, तीव्र-विरुद्ध क्रॉनिक-उत्तेजित ब्रेन टिश्यूच्या इम्यूनोब्लोटिंगचे विश्लेषण असे सूचित करते की Δएफओएसबी स्पष्टपणे बदलते M_r (आण्विक वस्तुमान) तीव्र स्थितीत ~ xNUMX केडीए पासून ~ xNUMX-33 केडीए पर्यंत तीव्र क्रियांमध्ये (होप इट अल., 1994a; चेन एट अल., एक्सएमएक्स). अतिरिक्त एमआरएनए अस्तित्त्वात असल्याचा पुरावा नसल्यामुळे या वेगवेगळ्या आइसोम्ससाठी एन्कोड होऊ शकले असते, अशी आम्ही कल्पना केली होती की Δएफओएसबी पोस्ट्रान्सॅन्सलशनल सुधारित आहे आणि कदाचित हे कदाचित त्याच्या असाधारण स्थिरतेमध्ये योगदान देते. आजपर्यंत, Δएफओएसबीच्या टर्नओव्हर किंवा पोस्ट ट्रान्सॅन्सलॅशनल बदलांचे कोणतेही बायोकेमिकल विश्लेषण केले गेले नाही. Studyएफओएसबी एक फॉस्फोप्रोटीन आहे की नाही आणि फॉस्फोरीलेशन त्याच्या स्थिरतेमध्ये भूमिका बजावते की नाही हे सध्याचे अभ्यासाचे ध्येय होते.

मागील विभाग पुढील विभाग

सामुग्री आणि पद्धती

स्तनधारी सेल रेषा आणि डीएनए रचना.

एल-ग्लूटामाइन (एल-ग्ल्न) असलेले उच्च-ग्लूकोज डीएमईएममध्ये एक्ससीएक्सएक्सएक्स पेशी (क्लोन्टेक, माउंटनव्ह्यू, सीए) सुसंस्कृत होते आणि एक्सएमएक्सएक्स% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस), एक्सएमएक्सएक्स% घोडा सीरम (इनव्हिट्रोजन, कार्ल्सबाड, सीए) , 12 यू / एमएल पेनिसिलिन, आणि 5 μg / मिली स्ट्रेप्टोमाइसिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ) दोन्ही. हेला सेल्स (अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन, मॅनसस, व्हीए) उच्च-ग्लूकोज डीएमईएममध्ये एल-ग्लिन असलेले सुसंगत आणि एक्सएमएक्सएक्स% एफबीएस, पेनिसिलिन आणि स्ट्रिप्टोमाइसिनसह पूरक आहेत. दोन रेषा 10% सी मध्ये आर्द्र 100% सी मध्ये दोन्ही सेललाइन ठेवण्यात आल्या होत्या₂ वातावरण.

डीएनएच्या क्षैतिज संक्रमणांसाठी, पीसीएक्सएनएक्सएक्स किंवा हेला पेशींना सहा-तळाच्या प्लेट्सवर (पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींसाठी कोलेजन 1 सह लेपित केले गेले) बीड करण्यात आले जेणेकरून दुसऱ्या दिवशी 12-12% संगम वर पोहचण्यासाठी आणि त्यानंतर लिपोफाटामाइन 90 (Invitrogen) वापरुन संक्रमण केले गेले. काही प्रयोगांमध्ये (पहा तुकडे 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), Δएफओएसबी रीकॉम्बिनेट हर्पीस सिम्प्लेक्स व्हायरस (एचएसव्ही) सह संक्रमणाद्वारे पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये संक्रमितपणे व्यक्त केले गेले.

Osएफओएसबी आणि एफओएसबी सीडीएनए आमच्या स्वतःच्या पीटीओटी-कॉन्सट्रक्ट्समधून मिळविल्या गेल्या.चेन एट अल., एक्सएमएक्स), आणि एक पीसीडीएनएक्सएक्सएक्स वेक्टर (Invitrogen) मध्ये घसरले. हे पीसीडीएनएक्सएक्सएक्स-Δएफओएसबी / एफओएसबी रचनांचा वापर स्तनपायी पेशींमध्ये अभिव्यक्तीसाठी आणि साइट-निर्देशित म्युटेजेनेसिससाठी टेम्पलेट म्हणून केला गेला. रेकोम्बिनेट एचएसव्ही-Δएफओएसबी पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे तयार करण्यात आले होते (नेव्ह ऍट अल., एक्सएमएक्स), आणि तयारीची ~ xNUMX × 1 ची टिटर होती⁸ पीएफयू / एमएल.

पल्स-पाठलाग प्रयोग.

संसर्ग / संक्रमणानंतर सुमारे 24 एच, सहा-चांगले प्लेटमध्ये सेल्स (पीसीएक्सएनएक्स किंवा हेला) पीबीएसच्या 12 मिलीसह दोन ते तीन वेळा धुऊन होते आणि सीस / मेट-फ्री डीएमईएमच्या 2 मिली मध्ये xXX ° C साठी 37 ° C वर उकळले गेले. (Invitrogen) मेट आणि सीसच्या इंट्रासेल्युलर पूल कमी करण्यासाठी 1% डायलझेड एफबीएस (हायक्लोन, लोगान, यूटी) सह पूरक. या "उपासमार" कालावधीनंतर, औषधे (पेशींचा उपचार करायचा असल्यास) जोडले गेले आणि 2-5 μCi सह पेशी (नाडी) लेबल केली गेली ³⁵एस प्रोटीन लेबलिंग मिक्स (पेर्किन एल्मर, वेलेस्ले, एमए) एक्सएनएक्सएक्स डिग्री सेल्सिअस एक्सचेंजच्या सर्व नव्या संश्लेषित प्रोटीन्सवर लेबल करण्यासाठी. नंतर रेडियोलॅबल को पीबीएसच्या 1 मिली सह, दोन ते तीन वेळा धुऊन काढले गेले ³⁵एस-लेबल्ड प्रोटीन्सचा पाठलाग (पाठलाग) "शीत" (नॉनरायडिओक्टिव्ह) माध्यमाने 5% एफबीएससह पूरक आणि वेगवेगळ्या वेळी पॉईल्सची कापणी करून बदलून (पाठलाग) केला. संपूर्ण चाचण्यांमध्ये सेल उपचारांचे पालन केले गेले. या प्रयोगांमधील सर्व आकडे त्यांच्या प्रवाहाच्या दराशी तुलना करण्यासाठी विविध प्रथिनेंप्रमाणे प्रारंभिक प्रमाणात दर्शवतात.

जनावरे आणि क्रॉनिक इलेक्ट्रोकोनव्हलसिव्ह जप्ती उपचार.

प्रौढ स्प्रेग डॉली नर चटई (200-300 ग्रॅम; चार्ल्स रिव्हर लेबोरेटरीज, किंगस्टन, आरआय) यांना दररोज एकदा 7-9 डी साठी इलेक्ट्रोकोनव्हलसिव्ह सेझर्स (ईसीएस) सह उपचार देण्यात आला. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे ईसीएस सादर केले गेले (होप इट अल., 1994a) वापरून उगो बेसिल (कॉमेरियो व्ही, इटली) ईसीएस युनिट खालील सेटिंग्जसह: वारंवारता, 100 डाल्स / एस; 0.5 एमएस सह pulse; शॉक कालावधी, 1.0 एस; आणि चालू, 75 एमए. शाम नियंत्रण प्राण्यांना कोणत्याही विद्युतीय प्रवाहविना कान-क्लिप इलेक्ट्रोड लागू करुन समानांतरपणे उपचार केले गेले.

³² पी चयापचय लेबलिंग.

मेंदूच्या स्लाइसच्या लेबलिंगसाठी, उंदीरांची निर्मीती करण्यात आली, मेंदू लवकर पडू लागले आणि 300 μm फ्रन्टल कॉर्टिकल स्लाइस डीएसके मायक्रोसिसर (टेड पेला, रेडिंग, सीए) ने तयार केले. फॉस्फेट-कमकुवत कृत्रिम सीएसएफ (एसीएसएफ) च्या 2 मिली मध्ये प्लॅस्टिक नलिकाच्या आत स्लाइस्स उकळले होते आणि ते ओएनएक्ससह सतत सौम्य बबलिंगमध्ये 30 डिग्री सेल्सियसवर ठेवलेले होते.₂/ सीओ₂ मिश्रण (हेमिंग्ज इट अल., एक्सएमएक्स). ओकेडाइक ऍसिड (1.3 एनजी / एमएल) च्या अनुपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत 8-10 एच साठी स्लाइस (प्रत्येक ट्यूबमध्ये दोन स्लाइस) 100 एमसीआयसह लेबल केले होते. या उष्मायनाच्या शेवटी, ठिबक एसीएसएफ सह कमीतकमी तीन वेळा कापले गेले आणि नंतर थंड रेडिओइम्यूनोपेरेयेज परफेर (आरआयपीए) बफरच्या 250 μl मध्ये सोनिकरणाने होमोजिनायझेशन केले [पीबीएस, पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (डब्ल्यू / व्ही) सोडियम डीऑक्सिओक्लाट, 0.1% (डब्ल्यू / व्ही) एसडीएस, एक्सएमएक्स एमएम ईडीटीए] 1% पर्यंत एसडीएससह वापरण्यापूर्वी पूरक, स्तनपायी पेशींसाठी प्रोटीझ इनहिबिटर कॉकटेल (0.6 μl / मिली; सिग्मा-एल्ड्रिच), फॉस्फेटेस इनहिबिटर कॉकटेल I आणि II (5: 1; सिग्मा-अॅड्रिच येथे वापरले), 100 मिमी पीएमएसएफ, आणि 1% ग्लिसरॉल. नंतर होम्योजेनेट्स 2 मिनिटांसाठी उकडले गेले आणि 15 × येथे सेंट्रीफ्यूगेशनने साफ केले g 15 मिनिटांसाठी परिणामी सुपरर्नंट्समध्ये प्रोटीन एकाग्रता बीसीए प्रोटीन अॅसे (पियर्स, होल्मडेल, एनजे) वापरून मूल्यांकन केले गेले.

साठी ³²संस्कृत पेशींचे लेबलिंग, ~ एक्सएनएक्सएक्स एच संक्रमण / संक्रमणानंतर, दोन ते तीन वेळा फॉस्फेट-मुक्त माध्यमाने आणि या माध्यमात ~ xNUMX एच साठी उकळलेले होते. या उपासमार कालावधीनंतर, 24-1 एमसीआय ³²पीएच₃PO₄ (पेर्किन एल्मर) प्रत्येक प्रकारात जोडण्यात आले होते आणि पेशींचे प्रकार 4-12 एच साठी लेबल केले होते (परीक्षणासाठी फिग्ज. 1-7 पहा). नंतर पीबीएस सह तीन वेळा धुलाई आणि एक्सआयएमएक्स मिनिटसाठी बर्फवर लिसले गेले. पूरक पूरक आरआयपीए बफरच्या 15 μl सह. लॅसेट्स स्क्रॅपिंग करून गोळा करण्यात आले आणि 50 GA सुईने XERX मि साठी उकळलेल्या डीएनएपर्यंत 10 वेळा पास केले आणि 25-10 मिनिट 15,000-15 मिनिटांसाठी 30 आरपीएमवर सेंट्रिफ्यूग केले. क्लीअर लाईसेट्स (सुपरर्नंट्स) नवीन ट्यूबमध्ये हस्तांतरित करण्यात आले आणि बीसीए प्रथिने ऍसे (पिअर्स) केले गेले. या प्रयोगांमधील सर्व आकडेवारी त्यांच्या संबंधित फॉस्फरिलायझेशन पातळ्यांशी तुलना करण्यासाठी संपूर्ण वन्य-प्रकार (डब्ल्यूटी) आणि एसएक्सएनएक्सएए Δएफओएसबी प्रथिने सारख्या प्रमाणात दर्शवितात.

रसायने आणि सेल संस्कृती उपचार.

ओकाडाइक ऍसिड (ओए; सिग्मा-एल्डरिच) इथॅनॉलमध्ये विरघळली गेली आणि 100 एनजी / एमएलच्या एकाग्रतेत वापरली गेली. 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-benzimidazole (डीआरबी; बायोमॉल, प्लाईमाउथ मीटिंग, पीए) डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ सिग्मा-एल्डरिच) मध्ये विसर्जित करण्यात आली आणि 50 μm च्या अंतिम एकाग्रतेत सेल संस्कृतीत वापरली गेली. शुक्राणु (सिग्मा-एल्डरिच) पाण्यामध्ये विरघळली गेली आणि 200 μm च्या अंतिम एकाग्रतेत वापरली गेली. कॅल्फोस्टिन-सी (बायोमॉल) डीएमएसओमध्ये विरघळली गेली आणि 0.2 μm मध्ये वापरली गेली, तर फॉरबोल 12-myristate 13-Acetate (पीएमए; प्रोमेगा, मॅडिसन, डब्ल्यूआय) डीएमएसओमध्ये विसर्जित करण्यात आली आणि 0.1 μm वर वापरली गेली. मायस्ट्रायलेटेड-ऑटोकामाइट-एक्सएमएक्स-संबंधित अवरोधक पेप्टाइड (एम-एआयपी; बायोमॉल) पाण्यामध्ये विरघळली गेली आणि 2 आणि 1 μm च्या अंतिम एकाग्रतेवर वापरली गेली. ब्रॉड-स्पेक्ट्रम प्रोटीन किनेस इनहिबिटर एच-एक्सएनएक्सएक्स आणि एच-एक्सएनएक्सएक्स (बायोमॉल) पाण्यामध्ये विरघळले गेले आणि क्रमशः 10 आणि 7 μm च्या एकाग्रतेत वापरले गेले. एमजीएक्सएनएक्सएक्स (कॅलिबोकेम, सॅन डिएगो, सीए) आणि एपोक्सोमिसीन (पेप्टाइड्स इंटरनॅशनल, लुईव्हविले, केवाय) ही दोन्ही डीएमएसओमध्ये विसर्जित झाली आणि क्रमशः 8 आणि 150 μm च्या एकाग्रतेत वापरली गेली. सर्व प्रयोगांमध्ये, डीएमएसओ (वाहन) उपचारांमध्ये सतत डीएमएसओ राखण्यासाठी आवश्यक असलेल्या पेशींमध्ये जोडण्यात आले. च्या साठी ³²पी लेबलिंग प्रयोग, औषधांपूर्वी औषधे तत्काळ जोडली गेली आणि उर्वरित लेबलिंग कालावधीसाठी ठेवली गेली. नाडी-पाठलाग प्रयोगांसाठी, लेबल / कालखंडात "उपासमार" या वेळी औषधे जोडण्यात आली आणि लेबलिंग कालावधीमध्ये ठेवली गेली आणि त्यानंतर पाठलाग माध्यमामध्ये परत केली. या पेप्टाइड्सच्या द्रुत टर्नओव्हरची भरपाई करण्यासाठी प्रत्येक 3-4 एच चे प्रोटेसिओम इनहिबिटरस पाठवले गेले.

Δएफओएसबी इम्यूनोपेरेयरे, इम्यूनोब्लोटिंग, आणि ऑटोरियोग्राफी.

इम्यूनोप्रेपीट्ससाठी, इम्यूनोपेरेइए (आयपी) सह पुढे जाण्यापूर्वी एसडीएस सांद्रता 1% खाली आणण्यासाठी साध्या RIPA सह 5: 0.1 पातळ केले गेले. अनिश्चित बंधन मर्यादा घालण्यासाठी, गळतींना कमीतकमी 4 एच पर्यंत नॉनमिम्यून आयजीजी आणि प्रोटीन जी-सेफरोझ (सिग्मा-ऍड्रिच) सह immunoprecipitating करून प्रथम साफ केले गेले. Δएफओएसबी नंतर बकरी पॉलीक्लोनल अँटीबॉडीचा वापर करून क्लीअर लियेट्समधून निर्जलीकरण करण्यात आले ज्याने FOSB आणि ΔFosB (SC-48G; सांता क्रूझ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूझ, सीए) मध्ये 0.5-1 μg आयजीजी प्रति 10 μg लिझेट प्रोटीनवर उपस्थित अंतर्गत अंतराळ ओळखले (एकूण प्रोटीनच्या 50-300 μg) 0.5 मिली च्या एकूण खंडात. कमीतकमी 4 एच साठी रोटरवर 8 ° C वर हलक्या प्रमाणात मिश्रित केले गेले आणि नंतर प्रथिनांचे 15 μl G-Sepharose जोडले गेले आणि कमीतकमी दुसर्या 4 एच साठी आयपी मिश्रित करण्यात आले. 3000 × वर कताई करून IP पॅलेट केले गेले g 3-5 मिनिट 4 डिग्री सेल्सियससाठी, थंड ठिकाण RIPA च्या 0.5 मिली आणि 0.1% ट्विन 20 असलेल्या थंड पीबीएससह तीन वेळा धुवावे. आयपी नंतर थंड पीबीएसच्या 0.5 मिली मध्ये बदलले गेले होते, हस्तांतरित केले गेले होते, नवीन ट्यूबमध्ये पॅलेट केले गेले होते आणि त्यानंतर एक्सएमएनएक्स 15-25 μl च्या व्यतिरीक्त इम्यूनोप्रिसेप्टिड प्रोटीन लावले गेले होते. लामेल्मी प्रोटीन नमुना बफर कमी करते. या आयपी प्रोटोकॉलच्या परिणामी सर्वसाधारणपणे Δएफओएसबीच्या लिसेटमध्ये विशिष्ट आणि प्रभावी पाऊस पडतो. इम्यूनोप्रिसीटेटेड प्रोटीन्स एसडीएस-पृष्ठ अधीन होते जे संपूर्ण आयपी XXX% ट्रिस-एचसीएल मापदंड जेल (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) लोड करून आणि नंतर पीव्हीडीएफ किंवा नायट्रोसेल्यूलोज वर हस्तांतरित केले गेले. हस्तांतरणानंतर, झिल्ली वायू वाळलेली होती आणि ³²पी- आणि ³⁵एस-रेडियोलॅबल्ड प्रोटीन बँड कोडाक (रोचेस्टर, एनवाय) ऑटोरॅडोग्राफिक फिल्म वापरून, तसेच स्टॉर्म (अमेर्सहॅम बायोसाइन्सिस, पिस्केटावे, एनजे) फॉस्फर इमेजर वापरुन फॉस्फरिमेजिंगद्वारे ऑटोरायडिओग्राफीद्वारे पाळली गेली. एकूण (अनफॉसफोरिलेटेड आणि फॉस्फोरिलेटेड) Δ सेल लिसेट्स किंवा मेंदू होमोजेनेट्समध्ये फॉस्ब एकतर इम्यूनोप्रिसीटेटेड प्रोटीनचे इम्यूनोब्लोटिंग द्वारे आढळले (त्याच झिल्पाचा वापर करून शोधण्यासाठी ³²पी-लेबल असलेली प्रथिने), किंवा एलआयएसटी / होमोजेटेट प्रोटीनच्या समान प्रमाणात एसडीएस-पृष्ठ अधीन आणि पीव्हीडीएफ किंवा नायट्रोसेल्युलोजवर हस्तांतरित केले जाते. झिम्बन पहिल्यांदा पीएनबीमध्ये 1% (डब्ल्यू / व्ही) नॉनफॅट कोरडे मिल्क (बायो-रेड) सह इनक्यूबेट करून अवरोधित केले गेले जे 0.1% (v / v) ट्विन 20 (सिग्मा) 1 ° C वर 25 एच साठी पूरक आहे. नंतर झिम्बीएन / Δफॉसबी (4: 1 वाजता वापरले) च्या एमएमएनएक्स-एक्सयूएनएक्सच्या एमआयएनएक्स ऍसिडस् विरूद्ध व्युत्पन्न केलेल्या आमच्या स्वत: च्या सब्सिडी-एफओएसबी पॉलीक्लोनल अँटीबॉडीसह झटपट 16 डिग्री सेल्सियसवर राक्षस रोखले गेले. प्राथमिक उष्मायनानंतर, बफर अवरोधित करून 1 मि साठी झिबके चार वेळा धुतले आणि नंतर एक्सएमएक्सएक्स डिग्री सेल्सियसमध्ये ~ एक्सएमटीएक्स एच साठी उकळले गेले आणि बकरीच्या विरोधी-ससा आयजीजीला हॉर्सरायडिश पेरोक्साइझेसशी जोडण्यात आला (10,000 वर वापरला: बफर अवरोधित करण्यात 5, वेक्टरमधून प्रयोगशाळा, बर्लिंगेम, सीए). नंतर बफर ब्लॉकसह 25 मि साठी तीन वेळा झेंबला आणि पीबीएससह 1 मिनिटासाठी एक वेळ झेंडूला. कोडक एमआर फिल्ममध्ये एकूण Δएफओएसबी प्रथिने बँडची कल्पना केली गेली. त्यात केमिलाइमिनेन्स (पिअर्स) आणि / किंवा ईसीएल-प्लस रेगेंट्स (अमेरहॅम बायोसाइसेस) आणि स्टॉर्म फॉस्फर इमेजर वापरुन फ्लोरोसेंसचा शोध करून.

ओव्हरक्सप्रेस आणि किटक पेशींमधून पुनः संयोजक ΔFOSB शुद्धीकरण.

Δएफओएसबी एसएक्सएक्सएनएक्सएक्स कीटक पेशींमध्ये बीएसी टू टू बाकुलोव्हायरस एक्सप्रेशन सिस्टम (Invitrogen) वापरुन एनए टर्मिनस हेक्सा-त्यांचे टॅग केलेल्या प्रोटीन (एन-हे (9) ΔFOSB) मध्ये ओव्हरक्प्रेस केले होते आणि निर्मात्याच्या निर्देशांचे अनुसरण करीत होते. थोडक्यात, Δफॉसबी सीडीएनए (अवशेष 6-2) एफिनिटी एन-टर्मिनल टॅगच्या आधी होते, मिघ्हह्हाग पीएफएएसटीएबीटीएमएक्सएक्सएक्सएक्स वेक्टरमध्ये घसरले होते, ज्याचा उपयोग रीकॉम्बिनेंट बाकुलोव्हायरस तयार करण्यासाठी केला होता. एसएफएक्सएनएक्सएक्स पेशी रीकॉम्बीनंट व्हायरसने संक्रमित झाल्या होत्या आणि एन-हेस (237) ΔFOSB सेल लिटेट्समधून अनेक क्रोमॅटोग्राफिक पायर्यांद्वारे शुद्ध केले गेले होते, त्यात मोनो-क्यू स्तंभ (अमेरशॅम) वापरून निकेल कॉलम (क्विएगेन, व्हेलेन्सिया, सीए), अॅयनियन एक्सचेंजचा वापर करून ऍफिनिटी क्रोमैटोग्राफीचा समावेश आहे. बायोसाइंसेस), आणि जेल-फिल्टरेशन कॉलम (अमेर्सहॅम बायोसाइसेस) वापरून आकार वगळता.

ग्लासमध्ये फॉस्फोरिलेशन अभ्यास.

ग्लासमध्ये वेळोवेळी आणि स्टॉइचोमेट्री विश्लेषणासाठी फॉस्फोरीलायझेशन रीअॅक्शनस एक्सएमएक्स μl च्या खंडात एक्सएमएनएक्स μm (एन-हेस (30) Δएफओएसबी किंवा पॉजिटिव्ह कंट्रोल सबस्ट्रेट असलेल्या व्होल्यूममध्ये करण्यात आले होते, 10 μm एटीपी आणि 6 μCi / μl [γ-³²पी] एटीपी, किनेझ निर्मात्याकडून पुरवलेले बफर आणि खालीलपैकी एक केके: सीकेएक्सएनएक्सएक्स (2 एनजी / μl; अपस्टेट, चार्लोट्सविले, व्हीए), कॅमकी (20 एनजी / μl; अपस्टेट), पीकेसी (10 एनजी / μl; कॅलिबोकेम) किंवा पीएक्सयूएनएक्सएक्सएनएक्सकेके (1.6 एमयू / μl; अपस्टेट). निर्दिष्ट वेळेच्या वेळी प्रतिक्रिया समाधानापासून 70 μl aliquots काढून टाकून टाइम कोर्स अभिक्रिया केली गेली आणि लेमेल्मी प्रोटीन नमुना बफर कमी करून 6 × च्या समान प्रमाणात जोडून. सीकेएक्सएनएक्सएक्स प्रतिक्रियेसाठी मायकेलिस-मेन्टेन कीनेटिक पॅरामीटर्स अनुभवात्मक परिभाषित रेषीय स्थिर-स्थितीच्या स्थितीत निर्धारित करण्यात आली. 2.5 μl च्या खंडात 5 मिनिटांसाठी या प्रतिक्रिया 4 एनजी / μl एंझाइम, 2 μm एटीपी, 15 μCi / μl [γ-³²पी] एटीपी आणि एन-त्याचे (6) Xएफओएसबी सांद्रता 2.5-30 μm पासून. सर्व प्रतिक्रिया 30 डिग्री सेल्सिअस वॉटर बाथमध्ये केली गेली. एसडीएस-पृष्ठानंतर आणि बायो-सेफ कुमास्सी (बायो-रेड) सह जेलचा धुरा केल्यानंतर, जेल सुकविण्यात आले आणि ³²पी-फॉस्फेट निगमाचे फॉस्फोरिमिंग विश्लेषण द्वारे मूल्यांकन केले गेले (खाली पहा, डेटा प्रमाणन, गणना आणि आकडेवारी).

द्वि-आयामी फॉस्फोपेप्टाइड नकाशा आणि फॉस्फोमिनो अॅसिड विश्लेषण.

या दोन्ही विश्लेषणाद्वारे वर्णन केल्याप्रमाणे केले गेले प्लाएग आणि डुन (2000). थोडक्यात, कोरड्या जेल तुकडे असलेले ³²पी लेबल केलेले ΔFOSB (एकतर पासून ग्लासमध्ये प्रतिक्रियांचे किंवा चयापचयाच्या लेबलच्या पेशींचे प्रतिरक्षीकरण), उत्परिवर्तित, पुनर्निर्मित, धुऊन, आणि ट्रायप्टिक पाचन अधीन होते. ट्रायप्टिक पाचन उत्पादनासह असलेल्या उपशामकांना लियोफिलाइज्ड केले गेले आणि लियोफिलेट अनेक वेळा धुतले आणि इलेक्ट्रोफोरोसिस बफरच्या 10 μl मध्ये, पीएच 1.9 मध्ये पुनरुत्थित केले. सेलूलोज पातळ-थर क्रोमॅटोग्राफी (टीएलसी) प्लेट (अॅनलटेक, नेवार्क, डीई) वर नमुना (3 μl) दर्शविला गेला आणि टीएलसी चढून इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि अन्य आयामांद्वारे एक परिमाण मध्ये विभक्त झाला. परिणामी फॉस्फोप्टाइड नकाशे ऑटोरायडिओग्राफी आणि फॉस्फरिमायझिंगद्वारे दृश्यमान होते. फॉस्फोमिनो एसिड विश्लेषणासाठी, ट्रिप्प्टिक डायजेक्ट्सच्या 2 μl ज्याला इलेक्ट्रोफोरेसीस बफरमध्ये पुनरुत्थित केले गेले होते ते एचएलसी हायड्रोलिसिसने 105 ° C वर 25 एम एचसीएल मध्ये 3 एम एचसीएल मध्ये एन एन अंतर्गत₂ वातावरण. या प्रक्रियेला पाण्यात सहावेळा वितळवून थांबवले आणि मिश्रण लियोफिलाइज्ड केले गेले. इलेक्ट्रोफोरेसीस बफरच्या 5 μl मध्ये पीओ 1.9 मध्ये लियोफिलेट पुनरुत्थित करण्यात आले आणि फॉस्फो-सेर, -एचएच, आणि -टेर मानकांसह सेल्यूलोज टीएलसी प्लेटवर पाहिले. इलेक्ट्रोफोरोसिस इलेक्ट्रोफोरेसीस बफर, पीएच 1.9 वापरून टीएलसी प्लेटच्या अर्ध्यापेक्षा जास्त प्रमाणात केले गेले आणि नंतर प्लेट पीएच 3.5 बफरमध्ये स्थानांतरित करण्यात आले आणि इलेक्ट्रोफोरेसीस पूर्ण होण्याकरिता करण्यात आले. एसीटोनमधील 1% (v / v) ninhydrin सोल्यूशनसह टीएलसी प्लेट फवारणी करून फॉस्फोमाइनो अम्ल मानके कल्पना केली गेली आणि ³²पी-लेबल केलेल्या एमिनो अॅसिड नमुने आर्टोडायोग्राफी आणि फॉस्फरिमायझिंग या दोघांनी व्हिज्युअलाइज्ड केले होते.

siRNA-प्रेरित CK2α नॉक-डाउन.

सीकेएक्सएनएक्सच्या पातळीवर निवडकपणे नॉक-डाउन करण्यासाठी आम्ही आरएनए हस्तक्षेप पद्धत वापरली (डि माईरा एट अल., एक्सएमएक्स). पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशी पुढील दिवसात ~ एक्सNUMएक्स-एक्सNUMएक्स% संगम गाठण्यासाठी कोलेजन आय-लेटेड सहा-कुट्यांच्या प्लेट्सवर बीड करण्यात आले होते, जेव्हा ते कॅटलाइटिकच्या एमआरएनएकडे निर्देशित सीआरआरएनए किंवा सीआरआरएनए नॉनटेक्शनलिंग एक्सएनएक्सएक्स एनएम (अंतिम एकाग्रता) चे ट्रान्सफेक्टेड होते तेव्हा दुसऱ्या दिवशी रानटीकेकेएनएमएक्सएक्सचे α सब्यूनिट, ट्रान्झॅक्शन एजंट सीलेंटफॅक्टिन (बायो-रेड) च्या 12 μl वापरून आणि निर्मात्याच्या निर्देशांचे अनुसरण करत आहे. अंदाजे 70 एच नंतर, वर सांगितल्यानुसार, पेशींना transफॉसबी प्लास्मिडसह संक्रमित केले गेले. नंतर सुमारे 80 एच (SiRNA संक्रमणा नंतर ~ xNUMX एच), पेशी एकतर अधीन होते ³²वर वर्णन केल्याप्रमाणे पी चयापचय लेबलिंग किंवा नाडी-पाठलाग विश्लेषण. पुढील चार CK2α siRNAs समान परिणामांसह वापरले गेले: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUUUGUGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAUUCUUGUGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCUUAUUUU3' (धर्मकॉन, लाफायेट, सीओ). नकारात्मक नियंत्रण म्हणून आम्ही वापरले सिलेंसर नकारात्मक नियंत्रण # एंबियन पासून ऑक्सिऑन सीआरआरएनए (ऑस्टिन, टेक्सस). सीएनएक्सएनएक्सएक्स नॉक-डाउनची मर्यादा रात्रीच्या वेळी 3: 2 डिलीशनवर अँटी-सीकेएक्सएनएक्स पॉलीक्लोनल अँटीबॉडी (अपस्टेटकडून कॅटलॉग # 2-06) वापरून इम्यूनोब्लॉटिंगद्वारे नियंत्रित केली गेली. β-Tubulin ला लोडिंग कंट्रोल म्हणून वापरले गेले आणि एका 873: 1 dilution वर रातोंरात एक मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (अपस्टेटकडून कॅटलॉग # 1000-05) आढळून आले.

साइट निर्देशित mutagenesis.

अॅला किंवा एएसपी वर सेरक्सNUMएक्सची क्विक चेंज साइट-डायरेक्टेड म्यूटेजेनेसिस किट (स्ट्रेटाजेने, ला जोला, सीए) वापरून आणि निर्मात्याच्या निर्देशांचे पालन करून पूर्ण करण्यात आली. माउस ΔFOSB प्रथिनेमध्ये सेर्क्सNUMएक्स उत्परिवर्तन परिचय देण्यासाठी, खालील म्युटेजेनेसिस प्राइमर्स वापरण्यात आले. सेएक्सएक्सएनएक्स टू अला: (रिव्हर्स प्राइमर) 27'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. सेएक्सएक्सएनएक्सएक्स ते एएसपी (पुढे प्राइमर) 27'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATटीसीजीजीटीजीजीसीटीसीटीटीसीजीसीएक्सएनएक्सएक्स '. उत्परिवर्तित ठिपके ठळक आहेत, आणि सेरक्समॅक्स कोडन इटॅलिलाइज्ड आहे.

बायोइनफॉरमॅटिक्स.

Sफॉसबीसाठी संभाव्य फॉस्फरिलायेशन साइट्स आणि केनेसेस प्रोसेसाइट समेत विशेष डेटाबेसमध्ये माऊस प्रोटीन अनुक्रम सबमिट करुन शोधले गेले होते.http://www.expasy.org/prosite/), अंदाजपत्रिका (रोस्ट एट अल., एक्सएमएक्स), आणि नेटफॉस्क (ब्लॉम एट अल., एक्सएमएक्स).

डेटा प्रमाणन, गणना आणि आकडेवारी.

पीव्हीडीएफ किंवा नायट्रोसेलुल्लोस झिल्लीमध्ये उपस्थित प्रथिनांची संख्या स्टॉर्म फॉस्फर इमेजर आणि सोबत इमेजक्वेंट सॉफ्टवेअर (अॅमर्सहॅम बायोसाइसेस / आण्विक डायनॅमिक्स) वापरून मोजली गेली. सेल संस्कृती आणि मेंदूच्या फळामध्ये फॉस्फोरीलायझेशन अभ्यासांमध्ये, मूल्यांकडे मिळणारे मूल्य ³²पी-लेबल केलेल्या प्रोटीन नंतर ΔFosB साठी मिळविलेल्या मूल्यांनी विभागले गेले आणि एक गुणोत्तर म्हणून व्यक्त केले. मध्ये ग्लासमध्ये फॉस्फोरिलेशन अभ्यास, रक्कम ³²ΔFosB (stoichiometry) च्या पी-लेबल केलेल्या ΔFOSB प्रति मोल पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे गणना केली गेली (सहिन इट अल., एक्सएमएक्स). सर्व मोजमाप वापरलेल्या इंस्ट्रुमेंटच्या रेषेच्या श्रेणीमध्ये घेण्यात आले. किनेटिक पॅरामीटर्सची गणना मायकेलिस-मेन्टेन मॉडेलद्वारे केली गेली V = V_कमाल[S] / ([S]+K_M) आणि V_कमाल = k₂[E_एकूण]. अर्ध-जीवन (t_1/2) फॉसबेज आणि फॉस्बी चे पल्स-चेस प्लॉट्स (डेटा पॉईंट्समध्ये सर्वोत्तम फिट असणार्या नॉनलाइनर रीग्रेशनचा वापर करुन) अंदाज लावला गेला आणि उर्वरित प्रोटीनची रक्कम मूळची 50% इतकी असते. सर्व आकडेवारीमध्ये, दर्शविलेले परिणाम किमान दोन ते तीन स्वतंत्र प्रयोगांचे प्रतिनिधी आहेत. सर्व ग्राफांमध्ये, दर्शविलेले डेटा सरासरी ± एसईएम (3 ≤ n ≤16). मतभेदांचे सांख्यिकीय महत्व मूल्यांकन केले गेले नाही t चाचणी, अनेक तुलनांसाठी दुरुस्त केलेले, आणि लघुग्रंथ सूचित करतात p ≤ 0.05.

मागील विभाग पुढील विभाग

परिणाम

Δएफओएसबी एक विलक्षण स्थिर स्थिरलेखन घटक आहे

जरी आम्ही पूर्वी अनुमान केला आहे की Δएफओएसबी तुलनेने स्थिर लिप्यंतरण घटक आहे (नेस्लर एट अल., एक्सएमएक्स), प्रथिनेचे टर्नओव्हर प्रोफाइलचे थेट विश्लेषण केले गेले नाही. या प्रश्नाचे समाधान करण्यासाठी, आम्ही पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींचा वापर करून पल्स-चेस प्रयोग केले, ज्याचा न्यूरॉनसारख्या सेल लाइनचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला गेला आहे, ज्यामध्ये Δएफओएसबीला रीकॉम्बीनंट हर्पीस सिम्प्लेक्स व्हायरस (एचएसव्ही-Δएफओएसबी) सह संक्रमणाने व्यक्त करण्यात आले. नवीन संश्लेषित प्रोटीन चयापचय पद्धतीने लेबल केले होते ³⁵एस-मेट / सीआयएस, आणि घटनेची नमुना ³⁵S-labeled ΔFOSB (³⁵एस-Δफॉसबी) रेडियोलॅबल्ड अमीनो अॅसिड काढून टाकल्यानंतर वेगवेगळ्या वेळी पॉईंट्स प्राप्त केलेल्या सेल लिझेट्समधून त्याचे प्रतिरक्षा करून त्याचे परीक्षण केले गेले. एसडीएस-पृष्ठ आणि ऑटोरियोग्राफीद्वारे इम्यूनोप्रिसीटेट्सचे विश्लेषण केले आहे की पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये Δफॉसबीचे अर्ध-आयुष्य ~ xNUMX एच आहे (चित्र 1). या निष्कर्षांवरून हे दिसून येते की फॉस्बचा अर्ध-जीवन सर्वात अपरिवर्तनीय लिप्यंतरण घटक (चर्चा पहा) पेक्षा जास्त आहे, पूर्ण-लांबीच्या FOSB सह, ज्याचे सेल संस्कृतीत अर्ध-आयुष्य हे ~ xNUMX मिनिट असल्याचे सांगितले गेले आहे (डोब्राझांस्की इट अल., एक्सएमएक्स; कार्ले एट अल. 2004). याव्यतिरिक्त, फॉस्बीचे अवशेष प्रथम-डिग्री घातीय घाटाच्या वक्रेशी जुळत नाहीत याची नोंद घेणे महत्त्वाचे आहे, परंतु हळूहळू कमी होण्याच्या प्रक्रियेसह प्रारंभ होण्याऐवजी हा बिफासिक आहे. हे एकापेक्षा जास्त एफओएसबी प्रजातींचे अस्तित्व आणि / किंवा एकापेक्षा जास्त अपघाती मार्ग असल्याचे सूचित करते.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 1.

Δएफओएसबी एक विलक्षण स्थिर स्थिरलेखन घटक आहे. सेल संस्कृतीत Xफॉसबीचे अर्ध-आयुष्य ~ xNUMX एच आहे. Δएफओएसबी पीसीएक्सयूएनएक्स पेशींमध्ये एचएसव्ही-Δएफओएसबीसह संक्रमण किंवा Δएफओएसबी-युक्त प्लास्मिडसह क्षैतिज संक्रमणाद्वारे व्यक्त करण्यात आले होते आणि सामग्री आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केल्यानुसार सेल नाडी-पाठलाग प्रयोगांच्या अधीन होते. ΔFosB overexpress करण्यासाठी वापरल्या जाणार्या पद्धतीचा विचार केल्याशिवाय समतुल्य परिणाम प्राप्त केले गेले. आकृती एफओएसबी घटनेचा वेळ अभ्यासक्रम (आणि प्रतिनिधी ऑटोरायड्राम) दर्शवितो. कमीतकमी पाच स्वतंत्र प्रयोगांद्वारे मिळविलेले कमीतकमी 10 वैयक्तिक डेटा पॉईंट्सचे सरासरी ± एसईएम प्लॉट केलेले डेटा आहे. तुलना करण्यासाठी, पूर्ण-लांबीच्या FOSB ची सूचित अर्ध-जीवन दर्शविली आहे.

Δफॉस बी मेंदूमध्ये फॉस्फोप्रोटीन आहे

आम्ही कल्पना केली आहे की Δएफओएसबीच्या पोस्ट्रान्सॅन्सलॅशनल सुधारणा त्याच्या स्पष्ट स्थिरतेमध्ये योगदान देऊ शकते. फॉस्फरिअलायझेशन ट्रान्सक्रिप्शन घटकांच्या क्रियाकलापांना बर्याच मार्गांनी सुधारित करण्यासाठी दर्शविले गेले आहे, त्यांच्या स्थिरतेसह (पुनरावलोकनासाठी, पहा डेस्ट्रो एट अल., एक्सएमएक्स; व्हिटमारश आणि डेव्हिस, 2000), आम्ही investigएफओएसबी फॉस्फोप्रोटीन आहे की नाही याचा तपास केला. या अंतरावर, Δएफओएसबी अभिव्यक्ती क्रॉनिक ईसीएसचा वापर करून चूहाच्या मेंदूमध्ये प्रेरित करण्यात आली होती, ज्याचा उपचार Δफॉसबीच्या उच्च पातळीला प्रेरित करण्यासाठी केला जाणारा उपचार, विशेषतया फ्रंटल कॉर्टेक्स (होप इट अल., 1994a). शेवटच्या ईसीएस उपचारानंतर एक दिवस, जेव्हा फॉस्फेटचे स्तर उच्च राहते, पातळ पुढच्या कॉर्टिकल स्लाइस तयार केले जातात आणि चयापचय पद्धतीने लेबल केले जातात. ³²पी-ऑर्थोफॉस्फेट. स्लाइसचे समांतर सेट रेडियोलॅबल्ड केलेले नव्हते आणि हे एकूण ΔFOSB स्तर ओळखण्यासाठी वापरले होते. एसडीएस-पृष्ठ द्वारे विशिष्ट एन्टी-एफओएसबी / Δएफओएसबी एंटीबॉडी आणि इम्यूनोप्रिसीटेटेड प्रोटीन्सचे पृथक्करण केल्यानंतर इम्यूनोप्रेइएर केल्यानंतर, फॉस्फोरीलेटेड ³²पी-लेबल्ड Δएफओएसबी ऑटोरियोग्राफीद्वारे ओळखले गेले होते, तर इमुनोब्लोटिंगद्वारे एकूण ΔFOSB सापडला. या विश्लेषणातून असे दिसून आले की Δएफओएसबी हे मेंदूमध्ये फॉस्फोरीलेटेड असते, जसे एखाद्या विशिष्ट प्रमाणानुसार ³²कालखंडात उपचार केलेल्या मेंदूच्या नमुन्यांमध्ये ~35 केडीएचा पी-लेबल केलेला बँड, परंतु शम-नियंत्रित नियंत्रणामध्ये अक्षरशः ज्ञानीही आहे (चित्र 2A). क्रॉनिक उत्तेजनाच्या अनुपस्थितीत, ΔFOSB ची मूलभूत पातळी फार कमी असल्याचे तथ्याने सुसंगत आहे. इम्यूनोपेरेयरेक्ट रिएक्शनची विशिष्टता नॉनमिम्यून आयजीजी प्रक्षेपण सिग्नलच्या अभावामुळे स्पष्ट होते.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 2.

Δफॉस बी मेंदूमध्ये फॉस्फोप्रोटीन आहे. A, Δ FosB हे मेंदूमध्ये फॉस्फोरीलेटेड असते. एंडोजेनस ΔFOSB मटेरियल आणि पद्धतींमध्ये वर्णित क्रॉनिक ईसीएस उपचाराने चूहाच्या मेंदूमध्ये प्रेरित होते. फ्रंटल कॉर्टिकल स्लाइस चयापचयाने लेबल केले होते ³²पीएच₃PO₄ अनेक तासांसाठी. स्लाइसचे होमोजेनाइझेशन केल्यानंतर, Δएफओएसबी इम्यूनोप्रिसेप्टिटेड होते आणि फॉस्फोरिलेटेड Δफॉसबी (³²पी-Δफॉसबी) ऑटोरायडिओग्राफी (शीर्ष पॅनेल) द्वारे ओळखले गेले. इम्यूनोब्लोटिंग (तळाशी पॅनेल) द्वारे नॉनरायडॉऑक्टिव्ह इम्युनोप्रेसिटिट्समध्ये एकूण Δएफओएसबी आढळली. नकारात्मक नियंत्रणे म्हणून, शम-उपचारित प्राणी आणि नॉनमिम्यून आयजीजीची प्रतिकारशक्ती दर्शविली जाते. B, उमेदवाराच्या फॉस्फोरीलायझेशन साइट्स आणि केनेसिस माऊससाठी संबंधित अंदाज गुणांसह Δएफओएसबी प्रथिने अनुक्रम बायोइन्फोर्मेटिक विश्लेषण द्वारे प्राप्त केले गेले. उच्च अंदाज गुणांसह उमेदवार साइट प्रथिने अनुक्रमात हायलाइट केल्या आहेत आणि सारणीमध्ये सूचीबद्ध आहेत. डीएनए-बाईंडिंग (मूलभूत) डोमेन आणि ल्युसीन जिपर प्रथिने क्रमाने बोल्डमध्ये आहेत. C, D, Δएफओएसबी फॉस्फोरेलायनेशन सीएआर / थ्रॉम फॉस्फेटेस इनहिबिटर ओए द्वारे वाढविण्यात येते. C, ³²अनुपस्थितिमध्ये (सीटीआर) किंवा 100 एनजी / एमएल ओए (ग्राफ आणि टॉप पॅनेल) ची उपस्थिति ऑटोरॅडीओग्राफीने लेबल केलेल्या फ्रंटल कॉर्टिकल स्लाइसमधून immunoprecipitates मध्ये P-ΔFOSB स्तर आढळले. तळाशी पॅनेल दर्शविते की ΔFosB प्रतिरक्षित स्लाइसेसपासून इम्यूनोब्लॉटिंगद्वारे इम्यूनोप्रिसीटिटमध्ये आढळतो. D, पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशी एचएसव्ही-एफओएसबी किंवा एचएसव्ही-लेकझेड (वेक्टर) आणि चयापचयाशी लेबल केलेल्या आहेत. ³²पीएच₃PO₄ अनुपस्थितीत (सीटीआर) किंवा 100 एनजी / एमएल ओए उपस्थिती. ³²ऑयूनोप्रेसीपिटेट्समध्ये पी-Δएफओएसबी स्तर ऑटोरियोग्राफी (आलेख, शीर्ष पॅनेल) द्वारे शोधले गेले. तळाच्या पॅनेलमध्ये इमुनोब्लॉटिंगद्वारे सेल लिसेट्समध्ये आढळलेल्या एकूण ΔFOSB दर्शविल्या जातात.

Δएफओएसबी फॉस्फोरीलायझेशनमध्ये कोणत्या किनना (ओं) आणि साइट (ओं) मध्ये अंतर्भूत आहेत हे दर्शविण्याच्या दिशेने पहिले पाऊल म्हणून, आम्ही त्याच्या बायोगॅनिमॅटिक विश्लेषणासाठी अमिनो अॅसिड अनुक्रमांचे अधीन केले. यावरून असे दिसून आले की, ΔFOSB मध्ये टायर फॉस्फोरलायझेशन अभिप्राय साइट नसली तरी त्यात तीन सीएमकेआयआयआय साइट्स, तीन सीकेएक्सएनएक्स साइट्स आणि दोन पीकेसी साइट्स आहेत ज्यात उच्च फॉस्फोरिलेशन अंदाज गुणांसह अनेक सर्क / थ्रिस किनास सर्वसाधारण साइट्स आहेत.चित्र 2B). बायोइनफॉरमॅटिक्सद्वारे अंदाजानुसार, ΔFOSB केवळ सेर किंवा थ्रर अवशेषांवर फॉस्फोरिलेट केले असल्यास, त्याचे फॉस्फोरलायझेशन Ser / Thr phosphatases च्या क्रियाकलापाने लक्षणीय स्वरुपात नियंत्रित केले पाहिजे. या परिकल्पनाची चाचणी घेण्यासाठी आम्ही समोरच्या कॉर्टिकल स्लाइससह लेबल केले ³²पी-ऑर्थोफॉस्फेट ओएच्या उपस्थिती किंवा अनुपस्थितीत, एक सेर / थ्रर प्रोटीन फॉस्फेटेस इनहिबिटर. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 2C, ओएमुळे मोठा (~ xNUMX-fold) वाढला ³²पी-Δफॉसबी. हे Δएफओएसबीच्या पातळीमध्ये थोडी वाढ झाली आहे, जी ओएसच्या कर्करोगासंबंधी प्रभावाशी जोडलेली मागील अहवालाशी संबंधित आहे ज्यामध्ये फॉस प्रोटीन्ससह अनेक तत्काल लवकर जीन्स तयार करण्याची क्षमता आहे.मिलर एट अल., एक्सएमएक्स; Choe et al., 2004). फॉस्फोरिलेट केलेल्या ΔFOSB स्तरांमध्ये निव्वळ नफ्याचे लक्षणीय वाढ (~60%) आहे.

आम्ही नंतर तपास केला की, पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये, जे प्रयोगात्मक हाताळणीसाठी अधिक सक्षम आहेत, ΔFOSB ने मेंदूमध्ये दिसल्याप्रमाणे फॉस्फोरिलेशन नमुना दर्शविला. आम्ही एचएसव्ही-Δएफओएसबीच्या संक्रमणाद्वारे पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये ΔFOSB व्यक्त केले आणि चयापचयाने सेल्स लेबल केले. ³²पी-ऑर्थोफॉस्फेट ओएच्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत. HSV-ΔFOSB- संक्रमित पेशींमधून प्रथिनांचे यशस्वी अभिव्यक्ती आणि प्रतिकारक इम्यूनोब्लॉटमध्ये उपस्थित असल्याद्वारे दर्शविले जाते.चित्र 2D, तळ पॅनेल) आणि ~ एक्सएमएक्स केडीए बँडचे ऑटोरियोग्राफ (शीर्ष पॅनेल), वेक्टर-संक्रमित पेशींमध्ये अनुपस्थित आहे. मेंदूच्या मते, ओए ने एकूण Δएफओएसबी पातळीमध्ये थोडासा वाढ झाल्यामुळे पण जास्त (अंदाजे दुप्पट) वाढ ³²पी-Δफॉसबी, परिणामी Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शनमध्ये लक्षणीय (~ xNUMX%) शुद्ध वाढ. शिवाय, बायोइनॉफॉर्मेटिक अंदाजानुसार, टियर फॉस्फेटेस इनहिबिटरसह पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींचा उपचार केल्याने लक्षणीय बदल होत नाहीत. ³²पी-Δफॉसबी स्तर (डेटा दर्शविला जात नाही). एकत्रितपणे, या निष्कर्षांवरून हे दिसून आले की Δएफओएसबी हे मेंदू आणि पीसीएक्सएनएक्सच्या पेशींमध्ये सेर आणि / किंवा थ्रस अवशेषांवर फॉस्फोरीलाइट केले आहे आणि नंतर एक चांगली सेल संस्कृती प्रणाली असल्याचे निश्चित केले आहे ज्यामध्ये Δफॉसबीच्या फॉस्फोरिलेशन आणि डीग्रेडेशन प्रोफाइलचे आणखी अभ्यास करावे.

सीकेएक्सएनएक्सएक्स परंतु पीकेसी किंवा केएमकेआयआय फॉस्फोरीलाइट्स Δएफओएसबी नाही ग्लासमध्ये

वर वर्णन केल्याप्रमाणे, Δफॉसबी एमिनो अॅसिड अनुक्रमांचे विश्लेषण CK2, PKC, आणि CaMKII फॉस्फरिलायझेशन साइट्ससाठी उच्च अंदाज स्कूल्स प्रकट केले. यापैकी कोणत्या केनास फॉस्फोरलेट फॉरफॉस्फेट होऊ शकते हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही एक मालिका आयोजित केली ग्लासमध्ये फॉस्फोरिलायझेशन प्रतिक्रिया शुद्ध शुद्धीकरण आणि शुद्ध रीमॉम्बिनेंट Δफॉसबी वापरुन. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 3A, तीन उमेदवारांच्या केनासेसपैकी, केवळ सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोरिलेटेड Δएफओएसबी लक्षणीय पद्धतीने. याव्यतिरिक्त, इतर बर्याच किनांचे परीक्षण केले गेले (उदा., जीएसकेएक्सएनएक्सएक्स आणि पीएक्सएनएक्सएसएक्सएनएक्सकेके) परंतु लक्षणीय फॉस्फोरिलेट Δफॉसबी (डेटा दर्शविला जात नाही) मध्ये अयशस्वी झाले. वेळोवेळी विश्लेषणाद्वारे सीकेएक्सएनएक्सएक्सच्या प्रतिक्रियाचे अतिरिक्त वैशिष्ट्य असे दिसून आले की हे केनेस फेफफेट प्रति मोसमाच्या Xएफओएसबीच्या तळाच्या ~ xNUMX एमओएलच्या स्थापनेला उत्प्रेरित करू शकते (चित्र 3B). CK2 ΔFOSB फॉस्फोरीलाइट करू शकते हे तथ्य ग्लासमध्ये लक्षणीय stoichiometry (~50%) पर्यंत शारीरिकदृष्ट्या संबंधित प्रतिक्रिया सूचित करणारे आहे. त्यानंतर आम्ही सीएफएक्सएनएक्सच्या शुद्धिकरण Δएफओएसबीच्या प्रमाणामध्ये उपस्थित करून या प्रतिक्रियेच्या गतिविषयक अभ्यासांचा अभ्यास केला आणि आम्ही निश्चित केले की सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोरिलेटस Δफॉसबीला ए V_कमाल 5.8 PMOL च्या मि^-1 · Μg^-1 एनजाइम, ए K_M 18.4 μm, आणि अ k_{मांजर} च्या 0.2 / एस (चित्र 3C). या गतिशील मापदंडासाठी प्राप्त केलेले मूल्य या प्रतिक्रियांच्या शारीरिक प्रासंगिकतेस पुढे समर्थन देतात. उदाहरणार्थ, अगोदर निर्देश केलेल्या बाबीसंबंधी बोलताना K_M DARPP2 साठी CK32, त्याच्या सर्वोत्तम ज्ञात सबस्ट्रेट्सपैकी एक, 3.4 μm आहे आणि k_{मांजर} ~ xNUMX / एस आहे (Girault et al., 1989); द K_M एटीपी श्रेणीसाठी ~ xNUMX-10 μm (कोकेट एट अल., एक्सएमएक्स; सिल्वा-नेटो इट अल., एक्सएमएक्स), आणि केसिनच्या श्रेणीसाठी ~ xNUMX-10 μm (मेगीओ एट अल., एक्सएमएक्स; पेयरिन एट अल., एक्सएमएक्स). एकत्रितपणे, हा डेटा सूचित करतो की Δएफओएसबी सीकेएक्सएनएक्सएक्ससाठी एक सखोल सब्सट्रेट आहे ग्लासमध्ये.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 3.

सीकेएक्सएनएक्सएक्स परंतु पीकेसी किंवा केएमकेआयआय फॉस्फोरीलाइट्स Δएफओएसबी नाही ग्लासमध्ये. ऑटोरियोग्राफ (शीर्ष पॅनेल) फॉस्फरिलेटेड उत्पाद दर्शविते आणि क्युमासी-दागदार जेल (तळ पॅनेल) प्रतिसादात एकूण Δएफओएसबी दर्शविते. A, शुद्ध रीकॉम्बीनंट ΔFOSB अधीन होते ग्लासमध्ये वेगवेगळ्या उमेदवारांद्वारे फॉस्फोरीयलेशन (ज्यापैकी तीन दर्शविल्या जातात). B, टाइम कोर्स आणि स्टॉइचोमेट्रिक विश्लेषणे सूचित करतात की CK2 फॉस्फोरलेट फॉरफॉस ग्लासमध्ये ~50% च्या स्टॉइचिमेट्रीसह. C, सीकेएक्सएनएक्सएक्सच्या प्रतिक्रियाच्या कायनेटिक विश्लेषणातून असे दिसून आले आहे की Δएफओएसबी एक निपुण आहे ग्लासमध्ये सबस्ट्रेट प्रतिक्रियेचे रेखांकन करणे दुहेरी-पारस्परिक (प्लॉट) तळाशी (खाली) दर्शविले जाते, परंतु किनेटिक मापदंड मायकेलिस-मेन्तेन वक्र (शीर्ष) पासून तयार केले गेले.

CK2 अखंड पेशींमध्ये ΔFosB चे फॉस्फोर्लायलेशन आणि स्थिरता सुधारित करते

Δफॉसबीच्या सीकेएक्सएनएक्सएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरीलायझेशनच्या शारीरिक प्रासंगिकतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी आम्ही तुलनात्मक फॉस्फोप्टाइड मॅपिंगचा वापर करून तुलनात्मक संचालन केले. ग्लासमध्ये फॉस्फोरीलेटेड आणि पीसीएक्सएनएक्सएक्स-सेल-फॉस्फोरीलाटेड Δफॉसबी. एसडीएस-पृष्ठ आणि जेल उद्भवल्यानंतर ³²पी-Δफॉसबी (पासून ग्लासमध्ये प्रतिक्रिया किंवा immunoprecipitate पासून ³²पी-लेबल असलेली पेशी), प्रथिनेसह प्रथिने पचविण्यात आली आणि परिणामी फॉस्फोप्टाइड्सचे द्वि-आयामी पृथक्करण केले गेले. या विश्लेषणातून असे दिसून आले की सीकेएक्सएनएक्सएक्सच्या प्रतिक्रियेतील मुख्य फॉस्फोप्टाइड पीसीओएनएनएक्सएक्स पेशींमध्ये Δएफओएसबी फॉस्फोरीलाइट केलेल्या दोन प्रमुख फॉस्फोपेप्टाइड्ससह एकत्रित झाला (चित्र 4A), तर पीकेसी किंवा केएमकेआयआय (डेटा दर्शविला जात नाही) च्या परिणामी फॉस्फोपेप्टाइड्सची प्रतिक्रिया नव्हती. पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल्समधील नकाशामध्ये दुसरा Δएफओएसबी फॉस्फोप्टाइड उपस्थित होता, परंतु कोणत्याही किनांच्या अक्षमतेमुळे आम्ही समान फॉस्फोप्टाइड तयार करण्यासाठी चाचणी केली ग्लासमध्ये, आम्हाला हे माहित नाही की या द्वितीय फॉस्फोप्टाइडमध्ये फॉस्फोरायलेटेशन साइट इतर फॉस्फोप्पेटाइडपेक्षा वेगळी आहे किंवा ते एक विशिष्ट फॉस्फोरिलेशन साइट असलेले एक विशिष्ट ट्रिपेटिक पेप्टाइड दर्शवते की नाही.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 4.

CK2 अखंड पेशींमध्ये ΔFosB चे फॉस्फोर्लायलेशन आणि स्थिरता सुधारित करते. A, सीकेएक्सएनएक्सएक्स परंतु पीकेसी पेशींमध्ये फॉस्फोरिलेट फॉस्फिलेटला दिसत नाही. सीएफएक्सएनएक्सएक्स किंवा पीकेसी द्वारा फॉस्फोरिलेट केलेल्या फॉस्फॉप्टाइड नकाशे ΔFOSB ग्लासमध्ये किंवा अखंड PC12 सेल्सद्वारे. बाण सीकेएक्सएनएक्सएक्स-फॉस्फोरीलेटेड पेप्टाइडचे स्थलांतर दर्शवितो परंतु पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमधून मिळणार्या Δएफओएसबी फॉस्फोपेप्टाइड्सपैकी एक असलेल्या पीकेसी-फॉस्फोरीलाइटेड नसतात. B, पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये फॉस्बी फॉस्फोरलायझेशन सशक्त सीकेएक्सएनएक्सएक्स एक्टिव्हेटर शुक्राणू (एसपी) सह सेल्सचे उपचार करुन आणि सीकेएक्सएनएक्स एक्सहिबिटर डीआरबीच्या उपचाराने कमी झाल्यामुळे वाढते. याच्या व्यतिरीक्त, पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींमध्ये Δएफओएसबी फॉस्फोरीलायशन पीकेसी एक्टिव्हेटर (पीएमए) किंवा पीकेसी-विशिष्ट अवरोधक कॅल्फोस्टिन-सी (कॅल्फ) यांच्या उपचाराने प्रभावित झाले नाही. एक प्रतिनिधी ऑटोरियोग्राम (टॉप पॅनेल) आणि इम्यूनोब्लॉट (तळाचा पॅनेल) दर्शविला जातो. सी-एफΔFOSB स्थिरता वर CK2 क्रियाकलापांचा प्रभाव. आकृत्या एफओएसबी घटनेचा वेळ अभ्यासक्रम (आणि प्रतिनिधी ऑटोरायड्रोग्राम) दर्शवतात. पीसीओएनएक्सएक्स सेल्सने संसर्गपूर्वक ΔFOSB व्यक्त करताना सीकेएक्सएनएक्सएक्स अवरोधक डीआरबीच्या अनुपस्थितीत किंवा उपस्थितीत केलेल्या नाडी-पाठलाग प्रयोगांच्या अधीन होते.C), सीकेएक्सएनएक्सएक्स एक्टिव्हेटर स्पर्मिन (D), किंवा ब्रॉड-स्पेक्ट्रम किनेस इनहिबिटर एच-एक्सNUMएक्स (E), जी डीआरबीच्या असंख्य प्रभावांवर नियंत्रण ठेवण्यासाठी वापरली गेली. FΔएफओएसबी स्थिरता वर CK2 च्या उत्प्रेरक उपनगरास नकारण्याचा प्रभाव. पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल एकतर नॉन-लक्ष्मण करणारे सीआरआरएनए (सीआरआर) किंवा सीआरआरएनए लक्ष्यीकरण चूहा CK12α आणि 2 एच नंतर एक Δफॉसबी प्लास्मिडसह संक्रमित केले गेले. शीर्ष पॅनेलमध्ये संपूर्ण-सेल लियेट्सचे इम्यूनोब्लॉट्स दर्शविले आहेत जे सीकेएक्सएनएक्सएक्स आणि Δफॉसबी प्रोटीन स्तरावर CK24 siRNA चे प्रभाव दर्शवित आहेत. Β-tubulin ची संबंधित इम्यूनोब्लोट लोडिंग कंट्रोल म्हणून दर्शविली जाते.

Kएफओएसबी किनेस म्हणून CK2 चे शारीरिक प्रासंगिकता संबोधित करण्यासाठी आम्ही Δएफओएसबी-एक्सपीसींग पीसीएक्सएनएक्स सेल्सचा वापर दोन सीकेसह केला ज्याने सीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप सुधारित केली. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 4B, सेल-पारगम्य CK12 अवरोधक डीआरबीसह पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींच्या उपचाराने Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शन कमी झाले.मेगीओ एट अल., एक्सएमएक्स; झिझ्झा इट अल., एक्सएमएक्स), आणि पॉलीमाइन शुक्राणूंच्या उपचाराने वाढ झाली आहे, एक प्रभावी CK2 एक्टिव्हेटर म्हणून ओळखली जाते (कोकेट आणि चंबॅझ, 1983; मेगीओ एट अल., एक्सएमएक्स). याच्या व्यतिरीक्त, पीकेसीएनएक्स सेल्सचे उपचार पीकेसी इनहिबिटर कॅल्फोस्टिन-सी (कोबायशी एट अल., एक्सएमएक्स; तामाकी et al., 1990) किंवा पीकेसी ऍक्टिव्हिटी पीएमए (श्मिट आणि हेकर, 1975; बेह एट अल., एक्सएमएक्स) Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शनमध्ये महत्त्वपूर्ण बदल होत नाहीत. पीएमएच्या बाबतीत, किंचित (आणि महत्त्वपूर्ण) वाढ होत नाही ³²पी-Δएफओएसबी या औषधामुळे होणार्या एकूण Δएफओएसबी पातळीमध्ये वाढ झाल्याचे मानले जाऊ शकते; प्रत्यक्षात, असे म्हटले गेले आहे की फोर्बोल एस्टर अनेक फॉस कौटुंबिक प्रथिने अभिव्यक्त करतात ज्यामध्ये एफओएसबी (योझा एट अल., एक्सएमएक्स; सुह एट अल., एक्सएमएक्स). शिवाय, विशिष्ट सेल-पारगम्य कॅमकेआय अवरोधक असलेल्या पेशींचा उपचार एम-एआयपी (इशिदा आणि फुजीसावा, 1995; स्टीव्हन्स इट अल., एक्सएमएक्स) Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शन (डेटा दर्शविला जात नाही) कमी झाला नाही. एकत्रितपणे, हे परिणाम आमच्याशी सुसंगत आहेत ग्लासमध्ये निष्कर्ष आणि सूचित करतात की अखंड पेशींमध्ये ΔFOSB संभाव्यपणे सीकेएक्सएनएक्सएक्स द्वारे फॉस्फोरीलाइट केले जाते परंतु पीकेसी किंवा केएमकेआयआय नाही. सीकेएक्सएनएक्सएक्स प्रतिबंध एचओएसबी फॉस्फोरायलेक्शन पूर्णपणे रोखत नाही हे खरे आहे की प्रोटीनमध्ये अतिरिक्त फॉस्फोरीलायझेशन साइट्सचे अस्तित्व दर्शवितात.

आम्ही पुढील वेळी पाहिले की CK2 ने Δएफओएसबीच्या टर्नओव्हरमध्ये आणि त्याच्या स्थिरतेमध्ये भूमिका बजावली आहे का. याप्रकारे, आम्ही Δएफओएसबी-एक्सपीसींग पीसीएक्सएनएक्स सेलचा वापर करून पॅक-चेसेस प्रयोग केले ज्यामध्ये सीकेएक्सएनएक्स एक्सहिबिटर किंवा फॉस्फोरिलेशन अभ्यासात वापरल्या गेलेल्या CK12 एक्टिव्हिटरसह उपचार केले गेले. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 4C, सीकेएक्सएनएक्स एक्सहिबिटर डीआरबी असलेल्या पेशींचा उपचार डीओबीच्या टर्नओव्हर रेटवर एक मोठा प्रभाव पडला आहे, त्याच्या घटनेच्या वक्रच्या आकारात बदल, बायफॅसिकपासून ते एक घातांकीय क्षयच्या जवळपास एक वळण असल्याचे दर्शविलेले आहे. उलटपक्षी, सीकेएक्सएनएक्सएक्स एक्टिव्हेटर शुक्राणुंच्या अस्तित्वामुळे Δफॉसबीच्या अवनति दरात लक्षणीय घट झाली आणि त्यामुळे पाठलाग होण्याच्या पहिल्या तासात प्रोटीनचा संचय झाला.चित्र 4D).

बर्याच किनेज ऍक्टिव्हिटीज आणि इनहिबिटरसह केस आहे म्हणून, शुक्राणू आणि डीआरबीमध्ये सीकेएक्सएनएक्सएक्स क्रियाकलापाच्या मॉड्यूलेशनच्या बाहेर चयापचय प्रभाव असू शकतात. खरं तर, डीआरबीने ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर IIH (TFIIH) -सॉसिटेड केनेजला प्रतिबंध करण्यास दर्शविले आहे (यांकुलोव इट अल., एक्सएमएक्स), ज्यामुळे आरएनए पोलिमेरेझ II-mediated transcription मध्ये प्रतिबंध होतो. कारण हा प्रभाव Δफॉसबीच्या स्थिरतेवर गांभीर्याने प्रभाव टाकू शकतो, आम्ही ब्रॉड स्पेक्ट्रम किनेस इनहिबिटर एच-एक्सNUMएक्सच्या प्रभावाचे विश्लेषण केले (हिदाका आणि कोबायाशी, 1992) टीएफआयआयएच-संबंधित किनास प्रतिबंधित करण्यासाठी ज्ञात एकाग्रता (200 μm) वर Δएफओएसबी टर्नओवरवर परंतु CK2 (यांकुलोव इट अल., एक्सएमएक्स). दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 4Eएच-एक्सएमएक्सएक्सच्या उपचाराने Δफॉसबीच्या टर्नओव्हर रेटला प्रभावित केले नाही. एच-एक्सएनएक्सएक्स, एक अन्य ब्रॉड स्पेक्ट्रम किनेस इहिबिटरसह तत्सम परिणाम प्राप्त केले गेले होते, जे टीएफआयआयएच-संबंधित किनास प्रतिबंधित करते परंतु सीकेएक्सएनएक्स (डेटा दर्शविला जात नाही) प्रतिबंधित करते. डीआरबीमुळे होणा-या Δफॉस्बी स्थिरतेतील घट कमी झाल्यास या डेटाने या व्याख्येचे आणखी समर्थन केले आहे, हे बहुतेकदा CK8 च्या प्रतिबंधनास पात्र ठरते.

एफओएसबी टर्नओव्हरमध्ये सीकेएक्सएनएक्सची भूमिका पुढे चालू ठेवण्यासाठी आम्ही सीआरएएनएनए द्वारे सीकेएक्सएनएक्स डाऊनलोड करण्याच्या परिणामाची तपासणी केली. आम्ही हे प्रयोग पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल्सद्वारे केले ज्यास प्रथम सीएनआरएनए (सीएनआरएनए) किंवा सीआरआरएनए (जीएनबीएनएनएक्सईएक्स) च्या उत्प्रेरक उपनिरीक्षकांचे एमआरएनए लक्ष्यित करते आणि नंतर Δएफओएसबीने संक्रमित केलेल्या 2 एच चे लक्ष्य ठेवणार्या (सीएनआरएनए) नियंत्रणासह हस्तांतरित केले गेले. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 4F, CK2α siRNA सह संक्रमणास प्रभावीपणे आणि विशेषतः KFOSB स्तर (शीर्ष पॅनेल) प्रभावित केल्याशिवाय CK2α प्रोटीन स्तर कमी करतात. पल्स-चेस विश्लेषणाने स्पष्ट केले की सीकेएक्सएनएक्सएक्सने खाली उतरल्यामुळे प्रथिनांचे वेगवान प्रमाण कमी झाल्यामुळे एफओएसबी टर्नओवर रेटमध्ये लक्षणीय वाढ झाली. सीकेएक्सएनएक्सएक्स क्रियाकलाप (डीआरबी उपचार किंवा सीआरआरएनएद्वारे) जरी बाधित असेल तर ipफॉसबीचे टर्नओव्हर वाढते आणि बिफासिक व्हर्व्हच्या धीमे-रेट घटकाची गायब होण्याची शक्यता असते, तर सीकेएक्सएनएक्सएक्स सक्रियतेमुळे वक्रचा धीमा टप्पा वाढतो, यासाठी मजबूत समर्थन प्रदान करते Δएफओएसबी स्थिरता नियंत्रित करण्यासाठी CK2 भूमिका निभावते अशी कल्पना.

सीएक्सएक्सएनएक्स फॉस्फोरीलाइट्स Δफॉसबी सेरक्सNUMएक्सवर

सीकेएक्सएनएक्स द्वारा Δफॉसबी फॉस्फोरिलेटवर साइट (ओं) ओळखणे प्रारंभ करण्यासाठी, आम्ही CK2 द्वारे फॉम्फो-एमिनो अॅसिड विश्लेषण पुनः संयोजक ΔFOSB फॉस्फोरीलाइट केले ग्लासमध्ये आणि पीसीओएनएक्सएक्स पेशींमध्ये फॉस्फोरेटेड Δफॉसबी. या प्रयोगांवरून असे दिसून आले की, दोन्ही बाबतीत केवळ फॉस्फो-एमिनो एसिड आढळला जो फॉस्फो-सेर होता (चित्र 5A). सीकेएक्सएनएक्सएक्ससाठी प्राप्त होणारे स्टॉइचिमेट्रीसह हे शोध ग्लासमध्ये फॉस्फोरिलेक्शन प्रतिक्रिया (~50%) (चित्र 3B) आणि सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोप्पेटाइड नकाशावर फक्त एक महत्त्वपूर्ण स्थान आहे.चित्र 4A), असे सूचित करते की Δफॉसबीचे सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोर्लायलेशन कदाचित एका सिरीन अवशेषापर्यंत मर्यादित आहे. हे निष्कर्ष फॉस्फरिलायझेशन सर्वसमावेशक साइट विश्लेषणांशी सुसंगत आहे (चित्र 2B), जे सीकेएक्सएनएक्सएक्ससाठी केवळ एक उमेदवार सीरीन अर्थात सेरक्सNUMएक्सची भविष्यवाणी करते. Taxonomic विश्लेषण उघड केले की FOS कुटुंबातील सदस्यांमध्ये उत्क्रांती माध्यमातून Ser27 अत्यंत संरक्षित आहे (चित्र 5B), ते एक महत्वपूर्ण शारीरिक कार्य सहन करू शकते असे सुचवितो.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 5.

सीएक्सएक्सएनएक्स फॉस्फोरीलाइट्स ΔFOSB वर Ser2. A, सीकेएक्सएनएक्सएक्स-फॉस्फोरीलेटेड (फॉस्फॉमिनो) अॅसिड विश्लेषणग्लासमध्ये) आणि पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल-फॉस्फोरिलेटेड Δफॉसबी दर्शविते की, दोन्ही बाबतीत, मुख्य अवशेष फॉस्फोरिलेटेड हे सेरिन आहे. B, एफओएसबी / Δएफओएसबी एमिनो अॅसिड अनुक्रमांच्या क्रॉस-प्रजाती विश्लेषणाने फ्रॉस कुटुंबातील सदस्यांना सेझ झिब्राफिश (गडद हायलाइट) मधील सेरक्सNUMएक्सचे उच्च संवर्धन केले. तथापि, Cx27 सर्वसमावेशक साइटसाठी आवश्यक असलेल्या + 3 स्थितीवरील अम्लीय अवशेष संरक्षित (प्रकाश हायलाइट) संरक्षित नाही. C, हेला पेशींना वाइल्ड-प्रकार Δ फॉस्बी (डब्ल्यूटी) किंवा Δफॉसबीमध्ये संक्रमित केले गेले होते ज्यामध्ये अला (एसएक्सएनएक्सएए) सह सेर्क्सNUMएक्सची जागा घेण्याकरिता बिंदू बदलणे समाविष्ट होते. पेशी चयापचयपणे लेबल केली गेली ³²पीएच₃PO₄ आणि सीकेएक्सएमएक्स सक्रिय करण्यासाठी वाहन किंवा शुक्राणु (एसपी) सह उपचार केले. प्राप्त एफओएसबी इम्युनोप्रेसीपेटीट्सच्या प्रतिनिधींच्या ऑटोोरियोग्राम (टॉप पॅनेल) आणि इम्यूनोब्लॉट (तळ पॅनेल) दर्शविल्या जातात. मॉक-ट्रांस्फेक्टेड सेल्स (वेक्टर) च्या immunoprecipitate दर्शविले आहे.

ΔFOSB मध्ये सेरॉक्सNUMएक्स फॉस्फोरीलाइट आहे हे निर्धारीत करण्यासाठी, आम्ही हा अवशेष आलामध्ये बदलला आणि प्रोटीनच्या फॉस्फोरीलायझेशन स्थितीवरील परीणामांचे विश्लेषण केले. याप्रकारे, आम्ही डब्ल्यूटी किंवा एसएक्सएनएक्सए म्यूटेंट Δफॉसबी व्यक्त करण्यासाठी हेल सेल (ज्याला उच्च कार्यक्षमतेसह संक्रमित केले जाऊ शकते) वापरले. संक्रमणा नंतर सुमारे 27 एच, पेशी चयापचय पद्धतीने लेबल केली गेली ³²पी-ऑर्थोफॉस्फेट आणि संपूर्ण-सेल लिझेट तयार केले होते. इम्यूनोपेरिएरा आणि एसडीएस-पृष्ठ खालील, ³²पी-Δएफओएसबी ऑटोरियोग्राफी आणि इमुनोब्लोटिंगद्वारे Δएफओएसबी द्वारे ओळखले गेले. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 5C (तळाशी पॅनेल), Δएफओएसबी वेक्टर-ट्रांस्फेक्टेड सेल्समध्ये आढळली नाही, तर डब्ल्यूटी किंवा एसएक्सएनएक्सए उत्परिवर्तित सेल्सने संक्रमित सेल Δफॉसबीने यशस्वीरित्या प्रथिने व्यक्त केली. आम्हाला आढळले की S27A उत्परिवर्तनात लक्षणीय (~ xNUMX%) घट झाली ³²पी -फॉसबी स्तर (चित्र 5C, शीर्ष पॅनेल आणि आलेख), जे जिवंत सेलमध्ये दर्शवितात, ΔFOSB हे Ser27 वर फॉस्फोरीलाइट केलेले असते. सीएक्सएक्सएनएक्स द्वारा सेलसएक्सएनएक्समध्ये खरोखर फॉस्फोरीलाइट केलेले आहे की नाही हे सिद्ध करण्यासाठी, आम्ही सीकेएक्सएनएक्सएक्स एक्टिव्हेटर शुक्राणुंच्या क्षमतेची तुलना WT आणि S27A ΔFosB चे फॉस्फोर्लायलेशन सुधारण्यासाठी केली. आम्ही पूर्वी पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल्समध्ये पाहिले होते (चित्र 4B), शुक्राणुने युक्त हेला पेशींच्या उपचाराने डब्ल्यूटीटी प्रथिनेचे फॉस्फोरिलेशन लक्षणीय वाढविले. S27A उत्परिवर्तनाने हा प्रभाव लक्षणीयपणे कमी केला आहे हे तथ्यचित्र 5C) ΔFosB मधील सेरॉक्सNUMएक्स CK27 साठी एक फिजियोलॉजिकल सबस्ट्रेट आहे याचे स्पष्टीकरण समर्थित करते.

सेरॉक्सNUMX चे फॉस्फोरलायझेशन Δफॉसबीची स्थिरता नियंत्रित करते

CK2 सक्रिय होते तेव्हा CK2 प्रतिबंधित आणि वर्धित होते तेव्हा ΔFOSB ची स्थिरता कमी होते हे स्थापित केले गेले (चित्र 4), आणि ते CX2 फॉस्फोरीलाइट्स ΔFOSB वर Ser27 (चित्र 5), आम्ही अशी भविष्यवाणी केली की या साइटच्या फॉस्फोरिलायझेशनला प्रोटीन अस्थिर करणे आवश्यक आहे. व्हीटी किंवा एसएक्सएनएएनएए उत्परिवर्तक व्यक्त करणारे हेला पेशींनी केलेल्या पल्स-चेस प्रयोगांमुळे तात्पुरते एकतर डब्ल्यूटी किंवा एसएक्सएनएएनएए म्यूटेंट Δफॉसबी व्यक्त करण्यात आले आहे. अंदाजानुसार, एसएक्सएनएएनएक्सए उत्परिवर्तनामुळे Δएफओएसबीच्या घटनेच्या प्रमाणात लक्षणीय वाढ झाली आहे आणि प्रथिनेच्या अर्ध्या जीवनात संयोगाने घट झाली आहे. (चित्र 6A). आम्ही नंतर तपास केला की हे नियामक यंत्रणा अधिक न्यूरॉन-सारखे पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल लाइनमध्ये देखील येते. या प्रयोगांवरून हे दिसून आले की, आम्ही हेला पेशींमध्ये पाहिल्याप्रमाणे, एसएक्सएनएएनएक्सए पॉईंट म्यूटेशनमुळे पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल्समधील Δफॉसबीच्या अर्ध्या जीवनात नाट्यमय घट झाली आहे (~ xNUMX पासून ~12 एच पर्यंत) (चित्र 6B). हे अस्थिरता सीकेएक्सएनएक्सएक्स अवरोध किंवा नॉक-डाउनमुळे झाल्यासारखेच आहे.चित्र 4) सेक्सक्सNUMX चे CK2-mediated फॉस्फोरलायझेशन ΔFOSB ची स्थिरता नियंत्रित करते या कल्पनेसाठी आणखी समर्थन प्रदान करते. Δफॉसबी प्रोटीन टर्नओवरवरील सेरएक्सनेएक्स फॉस्फोरीलायझेशनच्या नियामक भूमिकेसाठी अतिरिक्त पुरावे फॉस्फोमिमिटिक सेरक्सNUMX वापरून एसएपीएनएक्सडी (एसएक्सNUMएक्सडी) वरुन प्राप्त झाले. S27D उत्परिवर्तन फॉस्फोमाइमेटिक मानले जाते कारण ते एमिनो ऍसिड 27 वर मोठ्या प्रमाणात नकारार्थी (कार्बोक्सिल) गट ठेवते आणि म्हणून अंशतः सेर्क्सNUMX चे फॉस्फोरायलेशन नकल करते. दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 6Cएसएक्सएनएक्सएक्सच्या उत्परिवर्तनाने एसएक्सएनएक्सएए उत्परिवर्तन च्या उलट परिणाम घडवून आणला आणि परिणामी डब्ल्यूटीटी प्रथिनापेक्षा प्रोटीन अधिक स्थिर होते. त्याचप्रमाणे सीकेएक्सएनएक्सएक्स सक्रियतेनंतर प्राप्त झालेल्या प्रभावासाठी (चित्र 4D), S27D उत्परिवर्तनामुळे संचय झाला आणि त्यामुळे पाठलागच्या पहिल्या तासांमध्ये Δएफओएसबी पातळी वाढली.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 6.

सेरॉक्सNUMX चे फॉस्फोर्लायझेशन Δफॉसबीची स्थिरता नियंत्रित करते. A, C, पल्स-चेस विश्लेषण Serफॉसबीच्या टर्नओव्हर रेटवर सेर्क्सNUMएक्स फॉस्फोरायलेक्शनचा प्रभाव दर्शवित आहे. वन्य-प्रकार Δएफओएसबी (डब्ल्यूटी), सीएक्सएक्सNUMएक्स ते अला म्यूटेंट (एसएक्सएनएएनएक्सए) आणि फॉस्फोमेटेटिक सेरक्समॅक्स ते एस्प म्यूटेंट (एसएक्सएनएक्सडीडी) दर्शविल्या जाणार्या डीग्रेडेशन प्रोफाइलचे अनुमानित अर्ध-जीवन. त्याच निष्कर्ष हेला पेशींमध्ये प्राप्त झाले (A) आणि पीसीएक्सएनएक्सएक्स सेल्स (B, C).

सेरॅक्सनेएक्स फॉस्फोरीलायझेशन proteफॉसबीला प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन रोखून स्थिर करते.

सेक्सक्सNUMX चे फॉस्फोर्लायझेशन ΔFOSB स्थिर करणारी यंत्रणा स्पष्ट करण्यास प्रारंभ करण्यासाठी आम्ही प्रोटीसोम इनहिबिटर एमजीएक्सएनएक्सएक्स (पॅलोम्बेला इट अल., 1994; तुबुकी इट अल., एक्सएमएक्स) आणि इपोक्सोमिसीन (हनादा इट अल., एक्सएमएक्स; किम एट अल., एक्सएमएक्स) WT आणि S27A उत्परिवर्ती ΔFosB च्या अवक्रमण दर सुधारित करण्यासाठी. पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींचा वापर करून पल्स-चेसेस प्रयोग केले गेले आहेत ज्यामध्ये एकतर पुन्हा डब्लूटी किंवा एसएक्सएनएक्सएएफ़ फॉस्फॉम्ब व्यक्त करणारे एचसीव्ही किंवा संसर्गित डीएमएसओ किंवा दोन प्रोटीओसम इनहिबिटरपैकी एक उपचार आहे. या प्रयोगांनी उघड केले की जरी डब्ल्यूटीटी प्रथिनांचे अवक्रमण दर दोन प्रोटीओम इनहिबिटरपैकी एकाच्या अस्तित्वाच्या तुलनेत असंवेदनशील आहे.चित्र 7A), एसएक्सएनएक्सएए उत्परिवर्तनाची ही औषधे संवेदनशील आहेत (चित्र 7B). हे सूचित करते की, डब्ल्यूटी प्रोटीनच्या विपरीत, एसएक्सएनएएनएक्सए उत्परिवर्तक प्रोटीसोमल डिग्रेडेशनचा एक उद्देश आहे. खरंच, एमजीएक्सएनएक्सएक्स किंवा एपॉक्सोमिसीनसह सेल्सचा उपचार पूर्णपणे एसएफएनएनएक्सए उत्परिवर्तन प्रभावाचा परिणाम Δफॉसबीच्या घटनेच्या प्रभावावर उलट करतो, एसएक्सएनएक्सएए उत्परिवर्तीच्या अर्ध-जीवनात एमजीएक्सएनएक्सएक्सच्या ~ xNUMX पासून ~ xNUMX एच पर्यंत वाढण्यास आणि ~ इपॉक्सोमिसिनसाठी 27 एच (चित्र 7B). एकत्रितपणे, हे निष्कर्ष सूचित करतात की सेरक्सNUMएक्सवरील Δफॉसबीचे फॉस्फोरलायझेशन प्रोटीनोमनल डिग्रेडेशनपासून प्रथिनेचे संरक्षण करते आणि त्यामुळे त्याच्या असामान्य स्थिरतेसाठी आवश्यक आहे.

मोठी आवृत्ती पहाः

पॉवरपॉईंट स्लाइड म्हणून डाउनलोड करा

आकृती 7.

सेरॉक्सNUMX चे फॉस्फोर्लायझेशन proteफॉसबीला त्याचे प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन रोखून स्थिर करते. A, B, एचएसव्ही-संक्रमित पीसीएक्सएनएक्सएक्स पेशींसह पल्स-चेस विश्लेषण डीग्रेडेशन प्रोफाइल आणि जंगली-प्रकारचे अनुमानित अर्ध-जीवन दर्शविणारे ΔFOSB (A) किंवा एसएक्सएनएक्सएएक्सफॉसबी (B) अनुपस्थिति किंवा दोन प्रोटीओसम इनहिबिटरपैकी [एमजीएक्सएनएक्सएक्स आणि एपॉक्सोमिसिन (एपोक्सो)] उपस्थित. वन्य-प्रकार Δएफओएसबीच्या टर्नओव्हरवर औषधांचा महत्त्वपूर्ण प्रभाव नसल्याचे लक्षात घ्या, तर प्रोटीसॉमी अवरोधक असलेल्या पेशींच्या उपचारांमुळे S132A ΔFOSB ची स्थिरीकरण झाले. C, दीर्घकालीन मेंदूच्या प्लास्टीसिटीमध्ये मध्यस्थी करण्यासाठी ΔFOSB च्या क्षमतेमध्ये सेरॉक्सनेएक्स फॉस्फोरायलेक्शनची भूमिका करण्यासाठी एक मॉडेल. एकदा प्रेरित होऊन, SxNUMX च्या सीकेएक्सएनएक्सएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरायलेक्शनद्वारे मेंदूचा एक भाग मेंदूमध्ये स्थिर केला जातो. याचा परिणाम तिच्या संचयात होतो, परिणामी जीन अभिव्यक्तीमध्ये दीर्घकालीन बदल होतात. जीन अभिव्यक्तीमध्ये हे स्थिर बदल स्थिर वर्तनात्मक अनुकूलनांमध्ये योगदान देतात. उलटपक्षी, सेर / थ्रॉस फॉस्फेट्स व्हीपीएक्सएनएक्सएक्स आणि / किंवा पीपीएक्सएनएक्सएए द्वारा एसएक्सएनएक्सएक्सचे डिफॉस्फोरलायझेशन प्रोटीनची अस्थिरता आणि प्रोटीसोमल मशीनरीद्वारे प्रक्रियेत परिणाम होतो.

मागील विभाग पुढील विभाग

चर्चा

सध्याच्या अभ्यासात, आम्ही दर्शवितो की cellफॉसबीला सेल संस्कृतीत ~ xNUMX एच अर्धा आयुष्य आहे, जे पूर्ण-लांबीच्या फॉस्बी आणि स्थिरतेच्या इतर लिप्यंतरण घटकांच्या तुलनेत स्थिर बनवते, ज्याचे सेल संस्कृतीत अर्ध-आयुष्य लहान असू शकते काही मिनिटे आणि क्वचितच 10 एच पेक्षा जास्त (हॅन आणि एझेनमन, 1984; डोब्राझांस्की इट अल., एक्सएमएक्स; रॉबर्ट्स आणि व्हिटेलो, 1999; फेरारा एट अल., एक्सएमएक्स; हिरता एट अल., एक्सएमएक्स). याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळते की ΔFosB हे मेंदूमध्ये फॉस्फोरीलाइट केलेले असते आणि त्याचे फॉस्फोरलायझेशन PP1 / PP2A अवरोधक ओकेडाइक ऍसिडशी संवेदनशील असते. आमचे सेल कल्चर स्टडीज दर्शविते की Δएफओएसबीची स्थिरता सीकेएक्सएनएक्स द्वारे नियंत्रित केली जाते, प्रोटीन स्थिर करण्यासाठी उच्च CK2 क्रियाकलाप आहे. शेवटी, आमच्या निष्कर्षांवरून असे सूचित होते की सीकेएक्सएनएक्स फॉस्फोरिलेटस फॉस्फोरिलेट्सस अत्यंत संरक्षित एन टर्मिनस सेरिन (एसएक्सएनएएनएक्स) वर करते आणि एसएक्सएनएक्सएक्सच्या फॉस्फोरलायझेशनमुळे प्रोओसोसमल डिग्रेडेशनपासून ΔFOSB चे संरक्षण करते. म्हणून आम्ही एक मॉडेल प्रस्तावित करतो ज्यामुळे सीकेएक्सएनएक्स द्वारा एसएक्सएनएक्सएक्सवरील Δफॉसबीचे फॉस्फोरलायझेशन ΔFOSB च्या टर्नओव्हरचे एक गंभीर नियामक यंत्रणा आहे (चित्र 7C). Δफॉसबीचे अशा फॉस्फोरलायझेशन-मध्यस्थीचे स्थिरीकरण कार्यक्षमतेने महत्त्वपूर्ण आहे कारण विशिष्ट मेंदूच्या क्षेत्रातील Δफॉसबीचे वाढलेले स्तर प्रत्यक्षपणे असंख्य न्यूरोनल जीन्स नियंत्रित करतात. जीवनात आणि बर्याच न्यूरोपॅचिकॅक्टिक डिसऑर्डर (परिचय पहा) च्या प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये प्रभावी वागणूक प्रभाव पाडणे.

फॉस्फोरीलायझेशन म्हणजे सीआरबी (सीएएमपी प्रतिसाद घटक बाध्यकारी प्रथिने) सारख्या काही प्रतिलेखन घटकांचे ट्रान्सक्रिप्शन क्रियाकलाप नियंत्रित करण्याचा वेगवान आणि उलट करण्यायोग्य मार्ग आहे.बोहमान, 1990), लिप्यंतरण घटकांच्या अवनतीमध्ये सुधारणा करणे हे नियमांचे आणखी सामर्थ्यवान (कमी सहजतेने बदलणारे) स्वरूप प्रदान करते (डेस्ट्रो एट अल., एक्सएमएक्स). ट्रान्सक्रिप्शन घटक ज्यांच्या कार्यात्मक क्रियाकलाप त्यांच्या अवनतीच्या पातळीवर नियमन केले जातात त्यात NFκB (डेस्ट्रो एट अल., एक्सएमएक्स), सी-मायक (सीअर्स इट अल., एक्सएमएक्स), आणि सी-फॉस (फेरारा एट अल., एक्सएमएक्स), इतर. बर्याच वेळा, फॉस्फोरिलेशन हे ट्रान्सक्रिप्शन घटकांच्या स्थिरतेचे मुख्य नियामक आहे, सी-फॉससाठी दर्शविल्याप्रमाणे (ओकाझकी आणि सगाता, 1995; Tsurumi et al., 1995), फॉस-संबंधित अँटीजन-एक्सNUMएक्स (फ्रॅ-एक्सNUMएक्स) (व्हियाल आणि मार्शल, 2003), फ्रा-एक्सNUMएक्स (मानेब एट अल., एक्सएमएक्स), सी-जून (फ्चस एट अल., एक्सएमएक्स), जुनब (फ्चस एट अल., एक्सएमएक्स), एटीएफएक्सएनएक्स (फ्चस एट अल., एक्सएमएक्स), आणि पीएक्सएनएक्सएक्स (Buschmann et al., 2001). अशाप्रकारे आमच्या अभ्यासामध्ये Δफॉसबीला लिप्यंतरण घटकांच्या सूचीमध्ये जोडते ज्याची कार्यशील क्रिया तिच्या फॉस्फोरिलेट-आधारित स्थिरतेद्वारे नियंत्रित केली जाते.

सीके 2 हा सर्वव्यापी आणि रचनात्मक सक्रिय सेर / थ्री किनास आहे जो आतापर्यंत ओळखला जाणारा 300 हेतूपूर्ण थर असून सेल मृत्यू आणि जगण्याच्या समावेशासह एकाधिक जैविक प्रक्रियेत अडकलेला आहे.लिचफील्ड, 2003; Unger et al., 2004), सेल्युलर तणाव प्रतिसाद (यानागावा इट अल., एक्सएमएक्स; कॅटो एट अल., एक्सएमएक्स), आणि डीएनए दुरुस्ती आणि क्रोमॅटिन रीमोडलिंग (बरझ इट अल., एक्सएमएक्स; क्रॉन एट अल., एक्सएमएक्स). सीकेएक्सएनएक्सच्या पोटिव्ह सबस्ट्रेट्सपैकी एक तृतीयांशपेक्षा जास्त जीन अभिव्यक्तीच्या नियमनमध्ये प्रथिने असतात.मेगीओ आणि पिना, 2003). खरं तर, सीकेएक्सएनएक्स एक प्रमुख परमाणु किनासे म्हणून दर्शविले गेले आहे (क्रेक इट अल., एक्सएमएक्स) (पुनरावलोकनासाठी, पहा यू इट अल., एक्सएमएक्स) आणि अनेक ट्रांस्क्रिप्शन घटकांच्या BZIP डोमेनशी संवाद साधण्यासाठी (यामागुची et al., 1998). सीकेएक्सएनएक्सएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरेलायझेशन देखील आयटीबी (आयकेबी) समेत अनेक प्रथिनेंचे विकृती (एकतर वाढविणे किंवा कमी करणे) सुधारित करणे दर्शविले गेले आहे.श्वार्झ इट अल., एक्सएमएक्स), पीटीएन (टॉरेस आणि पुलिडो, 2001), लेन्स कनेक्सिन (यिन इट अल., एक्सएमएक्स), क्रोमॅटिन-संबंधित प्रोटीन एचएमजीएक्सएनएक्स (विस्निविस्की et al., 1999), आणि एचएमजीबी सारख्या अनेक प्रतिलेखन घटक (स्टेममेर एट अल., एक्सएमएक्स), मायफ-एक्सNUMएक्स (हिवाळी इट अल., एक्सएमएक्स), आणि सी-मायक (चन्नावजला आणि सेल्डेन, 2002). मेंदूमध्ये सर्वात जास्त प्रचलित असलेले सीकेएक्सएनएक्सअल्काझर एट अल., एक्सएमएक्स; Girault et al., 1990), आणि त्याची क्रिया मस्तिष्क कार्याच्या अनेक पैलूंमध्ये निगडीत आहे, न्यूरॉनल जगण्याची (सहित)बोहेनिंग इट अल., एक्सएमएक्स), भेदभाव (नुथल एट अल., एक्सएमएक्स), आयन चॅनेल फंक्शन (जोन्स आणि याकेल, 2003; बिल्डल इट अल., एक्सएमएक्स), आणि दीर्घकालीन सामर्थ्य आणि न्यूरॉनल प्लास्टीनिटी (डायझ-निडो इट अल., एक्सएमएक्स; लिबरमॅन आणि मोदी, 1999; रेखर्ड एट अल., एक्सएमएक्स).

न्यूरोनल फंक्शनच्या नियमनमध्ये सीकेएक्सएनएक्सच्या भूमिकेसाठी या वाढत्या पुराव्या असूनही, त्याच्या क्रियाकलापांवर नियंत्रण ठेवण्याबद्दल थोडी माहिती आहे. सीकेएक्सएनएक्स निश्चितपणे सक्रिय असल्याचे मानले जाते, फॉस्फोरीलाइट विशिष्ट सबस्ट्रेट्सच्या त्याच्या क्षमतेचे नियमन त्याच्या इंट्रासेल्युलर लोकॅलायझेशन (उदा. साइटोसोल बनाम न्यूक्लियस) मधील बदलांवर अवलंबून असते. (अहमद आणि तावफी, 1994; यू इट अल., एक्सएमएक्स). क्रॉनिक उत्तेजनानंतर मेंदूमध्ये Δएफओएसबी संचयनास उत्तेजन देण्यासाठी कोणते सिग्नल आवश्यक आहेत यासंबंधी ही माहिती एक महत्त्वपूर्ण प्रश्न उठवते.चित्र 7C). एक आवश्यकता पुनरावृत्ती पुनरावृत्ती आहे एफओएसबी जीन आणि Δएफओएसबी एमआरएनएचा समावेश (चेन एट अल., एक्सएमएक्स). आमचा डेटा सूचित करतो की ΔFOSB चे CK2 फॉस्फोर्लायझेशन त्याच्या स्थिरतेसाठी महत्त्वपूर्ण आहे, असे सूचित करते की जीन अभिव्यक्तीवर ΔFosB च्या दीर्घकालीन प्रभावांसाठी दुसरा सिग्नल आवश्यक असू शकतो, म्हणजे सिग्नल जे सीकेएक्सएनएक्सएक्सद्वारे प्रोटीनच्या फॉस्फोरिलायशनस उत्तेजित करते. यात काही अज्ञात तंत्रज्ञानाद्वारे किंवा न्यूक्लियसमध्ये त्याचे स्थानांतरन करून CK2 चे सक्रियकरण समाविष्ट असू शकते. वैकल्पिकरित्या, Δफॉसबीचे सीकेएक्सएनएक्स फॉस्फोर्लायलेशन गठित केले जाऊ शकते, जसे की प्रत्येक उत्तेजनाच्या प्रतिसादात Δफॉसबी प्रोटीनचे भाषांतर केले जाते, त्यातील काही भाग फॉस्फोरीलेटेड होते आणि त्याद्वारे स्थिर होते, जेणेकरून पुनरावृत्ती उत्तेजनासह ते प्रभावित न्यूरॉन्समध्ये उच्च पातळीवर एकत्र होते.

आमचे निष्कर्ष दर्शवितात की सीकेएक्सएनएक्सएक्स आणि एसएक्सएनएक्सएक्स हे एकमेव किनास आणि साइट नसतात जे Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शनसाठी जबाबदार आहेत, कारण सीकेएक्सएनएक्सएक्सचा प्रतिबंध किंवा एसएक्सएनएक्सए उत्परिवर्तन Δएफओएसबी फॉस्फोरायलेक्शन पूर्णपणे रोखण्यात सक्षम नव्हते. समान टोकनद्वारे, एसएसएनटीएनएक्सए उत्परिवर्तन, फॉस्फो-Δफॉसबी मध्ये 2% घट झाल्याचे परिणाम सांगते की एसएक्सएनएक्सएक्स ही प्रोटीनवरील एक प्रमुख फॉस्फरिलेशन साइट आहे. आम्ही, तथापि, putफॉसबीवरील इतर पोटिव्ह केनेसेस आणि फॉस्फोरलेक्शन साइट्स तपासत आहोत. शेवटी, हे मेंदूतील SFNUMX चे फॉस्फोर्लायझेशन आणि फॉस्फोरिलेशन साइट्समधील फॉस्फोरेशन साइटचे विश्लेषण करणे देखील महत्त्वाचे आहे जीवनात बर्याच प्रकारचे क्रॉनिक उत्तेजनानंतर, उदाहरणार्थ, द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री किंवा फास्फॉस्पिफिक एंटीबॉडीजच्या वापराद्वारे.

वर उल्लेख केल्याप्रमाणे, Δफॉसबीमधील S27 संपूर्ण उत्क्रांती आणि इतर फॉस कौटुंबिक प्रथिनेंमध्ये संरक्षित आहे. तथापि, CK2 साठी सर्वसाधारण साइट नाही: दर्शविल्याप्रमाणे आकृती 5B, फक्त फॉस्बी / Δफॉसबी (आणि झेब्राफिश झिऑनोलॉजिक), परंतु सी-फॉस किंवा फ्र-एक्सएनएक्सएक्स नसतात, + 2 वर अम्लीय अवशेष असतात, सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोरीलायझेशनचे प्रमुख निर्णायक (मरिन एट अल., एक्सएमएक्स; मेगीओ एट अल., एक्सएमएक्स). अशाप्रकारे, एसएक्सNUMएक्सवरील सीकेएक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोरिलेशनची कमतरता इतर फॉस कौटुंबिक प्रथिने ΔFosB सारखे स्थिर नसल्याचे स्पष्ट करतात. तथापि, फुल-लांबी FOSB, ज्याची समान CK2 सर्वसाधारण साइट ΔFOSB म्हणून आहे ती स्पष्ट करत नाही, ती समान स्थिर नसते. आम्हाला माहित नाही की या संरक्षित अवशेषांवर CK27 द्वारे पूर्ण-लांबीचे FOSB फॉस्फोरिलेट केले आहे किंवा नाही. FosB च्या फक्त अहवाल (स्किनर एट अल., एक्सएमएक्स) आणि सी-फॉस (ओकाझकी आणि सगाता, 1995; चेन एट अल., एक्सएमएक्स) फॉस्फोरीलायझेशन या प्रोटीनच्या सी-टर्मिनल प्रदेशात साइट्सचे वर्णन करते, जे Δफॉसबीमध्ये अनुपस्थित आहे. सीकेएक्सएनएक्सएक्सने पूर्ण-लांबीच्या फॉस्बी आणि इतर फॉस कौटुंबिक प्रोटीन्सचे संभाव्य फॉस्फोरलेक्शन प्रत्यक्ष तपासणी आवश्यक आहे. तथापि, ते फॉस्फोरीलेटेड असल्यासही, इतर फॉस कौटुंबिक प्रथिने त्यांच्या सी टर्मिनीमध्ये आकृतिबंध ठेवतात ज्यामुळे जलद गतीने पडणार्या प्रथिने (प्रथिने)पापवसिलीऊ इट अल., 1992; जरील-एनकॉन्ट्रे इट अल., एक्सएमएक्स; एक्क्वविवा इट अल., एक्सएमएक्स). उदाहरणार्थ, असे दिसून आले आहे की सर्व फॉस फॅमिली प्रोटीन्सच्या सी टर्मिनसमध्ये उपस्थित असलेल्या एक्सएमएक्स अवशेषांचा विस्तार, परंतु Δफॉसबीमध्ये अनुपस्थित, सी-फॉससाठी एक अस्थिर डोमेन म्हणून कार्य करतो (एक्क्वविवा इट अल., एक्सएमएक्स). आम्हाला आढळले की हे अनुक्रम समान प्रकारे पूर्ण-लांबीच्या FOSB (कार्ले एट अल., एक्सएमएक्स), ΔFOSB मधील या डोमेनची अनुपस्थिती पूर्णपणे स्थिरीकरणासाठी जबाबदार नाही. उलट, या सी टर्मिनस डोमेन आणि सेरॅक्सनेएक्स फॉस्फोरायलेक्शनच्या अनुपस्थितीचा संयोजन Δएफओएसबी आणि फॉसबी यांच्यातील स्थिरतेमध्ये अंदाजे पाचपट फरकाने पूर्णपणे असल्याचे दिसते.

फॉस कौटुंबिक प्रथिने कमी होणे जटिल असून पूर्णपणे समजले नसले तरी, प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन हा मुख्य मार्ग असल्याचे दिसून येते (साल्वाट इट अल., एक्सएमएक्स; एक्क्वविवा इट अल., एक्सएमएक्स; फेरारा एट अल., एक्सएमएक्स). येथे सादर केलेला डेटा, ज्यामध्ये प्रोटीसोमल इनहिबिटरस फॉस्फि डीग्रेडेशनच्या दराने लक्षणीय बदल करत नाहीत, असा दावा करतात की, इतर फॉस कौटुंबिक प्रोटीन्सच्या विपरीत, Δएफओएसबी 26S प्रोटीओसमधून बाहेर पडते आणि हे स्थिरीकरण मध्ये मुख्य भूमिका बजावते. म्हणून आम्ही अशी योजना प्रस्तावित करतो ज्यामुळे Δफॉसबीची वाढीव स्थिरता दोन मुख्य घटकांच्या संयोजनसाठी (1) सी-टर्मिनल अस्थिरता डोमेनची अनुपस्थिती आणि (2) सीकेएक्सएनएक्सएक्स द्वारा एसएक्सएनएक्सएक्सच्या फॉस्फोरलायझेशनसाठी श्रेयस्कर आहे.

थोडक्यात, सध्याचे अभ्यासा mechanFOSB, तत्काल लवकर जीनचे उत्पादन का आहे याबद्दल यांत्रिक अंतर्दृष्टी प्रदान करते एफओएसबी, हे इतर सर्व पारिवारिक सदस्यांसारखे नाही, तुलनेने दीर्घकालीन प्रथिने आहे. इतर फॉस कौटुंबिक प्रथिने जलद गतिशील परंतु क्षणिक उत्तेजना-लिप्यंतरण जोडणी (मध्यस्थी)मॉर्गन आणि कुरान, 1995), ΔFosB ची सापेक्ष स्थिरता दीर्घकालीन उत्तेजनामुळे प्रेरित दीर्घकालीन ट्रांस्क्रिप्शनल बदलांमध्ये मध्यस्थ करण्याची क्षमता प्रदान करते. हे दृश्यास समर्थन देते की Δएफओएसबी मेंदूमध्ये निरंतर आण्विक स्विच म्हणून कार्य करते, हळू हळूहळू तीव्र प्रतिसादांना जुन्या अनुकूलनात रूपांतरित करते. ΔFOSB च्या स्थिरतेसाठी केंद्रीय तंत्र म्हणून सेरक्सNUMएक्स फॉस्फोर्लायझेशनची ओळख ΔFOSB च्या कार्याचे नियमन करण्यासाठी नवीन मार्ग उघडते आणि त्याद्वारे न्यूरल आणि वर्तनशील प्लास्टीसीटीवरील दीर्घकालीन प्रभाव सुधारते.

मागील विभाग पुढील विभाग

तळटीप

नोव्हेंबर 21, 2005 प्राप्त झाले.
पुनरावृत्ती फेब्रुवारी 21, 2006 प्राप्त झाली.
एप्रिल 2, 2006 स्वीकारले.

पीजीईला नॅशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग अॅब्युज (एनआयडीए) नॅशनल रिसर्च सर्व्हिस अवॉर्ड, पीजीईला नॅशनल अलायन्स फॉर रिसर्च ऑन स्किझोफ्रेनिया आणि डिप्रेशन यंग इन्व्हेस्टिगेटर पुरस्काराने समर्थन देण्यात आले होते आणि नॅशनल इंस्टिट्यूट ऑफ मॅनल्थ हेल्थ आणि एनआयडीए कडून ईजेएन आम्ही सह त्याच्या मदतीसाठी डॉ. जेम्स बिब धन्यवाद ग्लासमध्ये फॉस्फरिअलायझेशन assays, मिंग-हुन हान, मस्तिष्क स्लाइस तयार करण्यासाठी मदत करण्यासाठी चयापचय लेबलिंग आणि डॉ. राचाेल नेव्ह यांना रीकॉम्बीनंट एचएसव्हीच्या पॅकेजिंगच्या सहाय्याने मदतीसाठी मदत केली.
जी. रुडेन्कोचा सध्याचा पत्ताः लाइफ सायन्सेस इन्स्टिट्यूट आणि फार्माकोलॉजी विभाग, मिशिगन युनिव्हर्सिटी, 210 वॉश्टनॅ अव्हेन्यू # 3163 ए, एन आर्बर, एमआय 48109-2216.
पत्रव्यवहार एरिक जे. नेस्लर, एक्सएमएक्सएक्स हॅरी हेन्स बाउलवर्ड, डल्लास, TX 5323-75390 यांना संबोधित करणे आवश्यक आहे. ईमेलः [ईमेल संरक्षित]

मागील विभाग

संदर्भ

â μ

Acquaviva सी, ब्रॉकली एफ, फेरारा पी, बॉसिस जी, साल्वाट सी, जरील-एनकॉन्टेर I, पायचॅझिक एम (2001) सी-टर्मिनल ट्रायपेप्टाइड मॅटिफची ओळख जी (0) -पासून-एस अवस्थेतील संक्रमण दरम्यान सी-फॉस प्रोटो-ऑन्कोप्रोटीनच्या वेगवान प्रोटीओसोमल डिग्रेडेशनच्या नियंत्रणात समाविष्ट आहे. oncogene 20:7563-7572.

सार

परिचय

सामुग्री आणि पद्धती

स्तनधारी सेल रेषा आणि डीएनए रचना.

पल्स-पाठलाग प्रयोग.

जनावरे आणि क्रॉनिक इलेक्ट्रोकोनव्हलसिव्ह जप्ती उपचार.

32 पी चयापचय लेबलिंग.

रसायने आणि सेल संस्कृती उपचार.

Δएफओएसबी इम्यूनोपेरेयरे, इम्यूनोब्लोटिंग, आणि ऑटोरियोग्राफी.

ओव्हरक्सप्रेस आणि किटक पेशींमधून पुनः संयोजक ΔFOSB शुद्धीकरण.

ग्लासमध्ये फॉस्फोरिलेशन अभ्यास.

द्वि-आयामी फॉस्फोपेप्टाइड नकाशा आणि फॉस्फोमिनो अॅसिड विश्लेषण.

siRNA-प्रेरित CK2α नॉक-डाउन.

साइट निर्देशित mutagenesis.

बायोइनफॉरमॅटिक्स.

डेटा प्रमाणन, गणना आणि आकडेवारी.

परिणाम

Δएफओएसबी एक विलक्षण स्थिर स्थिरलेखन घटक आहे

Δफॉस बी मेंदूमध्ये फॉस्फोप्रोटीन आहे

सीकेएक्सएनएक्सएक्स परंतु पीकेसी किंवा केएमकेआयआय फॉस्फोरीलाइट्स Δएफओएसबी नाही ग्लासमध्ये

CK2 अखंड पेशींमध्ये ΔFosB चे फॉस्फोर्लायलेशन आणि स्थिरता सुधारित करते

सीएक्सएक्सएनएक्स फॉस्फोरीलाइट्स Δफॉसबी सेरक्सNUMएक्सवर

सेरॉक्सNUMX चे फॉस्फोरलायझेशन Δफॉसबीची स्थिरता नियंत्रित करते

सेरॅक्सनेएक्स फॉस्फोरीलायझेशन proteफॉसबीला प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन रोखून स्थिर करते.

चर्चा

तळटीप

संदर्भ

हा लेख उद्धृत लेख

जलद दुवे

³² पी चयापचय लेबलिंग.