Endocrinol depan (Lausanne). 2017; 8: 216.
Diterbitkan dalam talian 2017 Ogos 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† and Vincent Paillé1,*†
Abstrak
Penggunaan perinatal makanan makanan padat perinatal meningkatkan risiko obesiti pada kanak-kanak. Ini dikaitkan dengan pengambilan makanan yang lebih lazat yang digunakan untuk harta hedoniknya. Mekanisme yang menghubungkan diet ibu dan anak-anak perinatal keutamaan lemak masih kurang difahami. Dalam kajian ini, kita bertujuan untuk mengkaji pengaruh pemakanan diet tinggi lemak / gula tinggi ibu [diet barat (WD)] semasa kehamilan dan penyusuan pada jalur ganjaran mengawal makan pada anak tikus dari lahir hingga kematangan seksual. Kami melakukan tindak lanjut pembedahan WD dan Kawalan keturunan pada tiga tempoh masa kritikal (kanak-kanak, remaja, dan dewasa) dan menumpukan pada penyiasatan pengaruh pendedahan perinatal terhadap diet sedap pada (i) keutamaan lemak, (ii) profil ekspresi gen , dan (iii) perubahan neuroanatomik / seni bina rangkaian dopaminergik mesolimbi. Kami menunjukkan bahawa pemberian makan WD yang terhad kepada tempoh perinatal mempunyai pengaruh jangka panjang yang jelas terhadap organisasi litar otak homeostatic dan hedonik tetapi bukan pada keinginan lemak. Kami menunjukkan evolusi tempoh tertentu keutamaan lemak yang kita kaitkan dengan tandatangan molekul otak tertentu. Dalam keturunan dari WD diberi makan empangan, kita melihat pada zaman kanak-kanak kewujudan pilihan lemak yang berkaitan dengan ekspresi gen utama yang terlibat dalam sistem dopamin (DA); pada masa remaja, keutamaan lemak tinggi untuk kedua-dua kumpulan, secara berkala dikurangkan semasa ujian hari 3 untuk kumpulan WD dan dikaitkan dengan ekspresi gen gen yang dikurangkan yang terlibat dalam sistem DA bagi kumpulan WD yang boleh mencadangkan mekanisma pampasan untuk melindungi mereka dari pendedahan lemak tinggi lagi; dan akhirnya pada masa dewasa, keutamaan lemak yang sama dengan tikus kawalan tetapi dikaitkan dengan pengubahsuaian yang mendalam dalam gen utama yang terlibat dalam rangkaian asid γ-aminobutyric, reseptor serotonin, dan asid polysialic-NCAM yang bergantung kepada hipotalamus. Secara keseluruhannya, data ini mendedahkan bahawa WD ibu, yang terhad kepada tempoh perinatal, tidak memberi kesan yang berterusan ke homeostasis tenaga dan keinginan gemuk kemudian dalam kehidupan walaupun pembentukan semula semula hipotalamik ganjaran homeostatic dan ganjaran yang terlibat dalam makan tingkah laku berlaku. Eksperimen berfungsi lebih lanjut diperlukan untuk memahami perkaitan pembentukan litar ini.
Pengenalan
Persekitaran hidup dan peristiwa awal kini dikenali dengan baik untuk menyumbang kepada kecenderungan kesihatan dan penyakit di kemudian hari (1-3). Konsep pencetakan metabolik telah dicadangkan untuk menggambarkan bagaimana perubahan dalam persekitaran pemakanan dan hormon semasa tempoh perinatal dapat menimbulkan predisposisi keturunan terhadap obesiti dan patologi yang berkaitan kemudiannya. Isu yang penting mengenai cara hidup kita sesekali adalah makanan berlebihan sebagai akibat dari penggunaan makanan padat tenaga. Sesungguhnya, individu yang terdedah kepada pengambilan makanan jenis makanan ini berisiko tinggi untuk mengembangkan obesiti dan sindrom metabolik (4, 5). Banyak kajian telah menunjukkan bahawa diet tinggi lemak ibu (HFD) melalui kehamilan dan menyusu mempunyai kesan jangka panjang ke metabolisme keturunan (6-8). Sebagai tambahan kepada laluan yang terlibat dalam peraturan metabolik, sistem ganjaran otak juga memainkan peranan penting dalam tingkah laku makan (9, 10). Mesoprak dopamin (DA) neurotransmit, dikaji secara intensif dalam konteks ganjaran dan ketagihan, diubah dalam obesiti yang disebabkan oleh diet pada kedua-dua manusia (11-13) dan haiwan (14-16). Unjuran DA berkembang, untuk sebahagian besar, selepas (17), dan oleh itu, perkembangan mereka mungkin dipengaruhi oleh diet awal. Sejak beberapa tahun kebelakangan, eksperimen mengenai tikus telah membuktikan bahawa pengambilan HFD ibu meningkatkan pemakanan hedonik pada anak (18, 19). Walaupun pemerhatian ini melibatkan beberapa perubahan dalam fungsi sistem DA (20-22), data terhad tersedia mengenai ontogeny dan pembentukan semula laluan ganjaran semasa hidup awal (21). Selain itu sama ada dan bagaimana bahagian isyarat non-DA dari sistem ganjaran seperti sistem GABA (γ-aminobutyric) boleh dipengaruhi oleh tekanan pemakanan perinatal tidak didokumenkan. Sesungguhnya, neuron GABA nampaknya memainkan peranan utama dalam ganjaran dan keengganan. Kawasan tegar ventral (VTA) neuron GABA menerima corak input yang sama dari kawasan otak yang berbeza (23), dan kajian kelakuan berdasarkan optogenetik baru-baru ini menyerlahkan peranan utama VTA GABA di penghindaran tempat yang dikondisikan (24) dan dalam tingkah laku perolehan ganjaran25). Nukleus accumbens (NAc) terutamanya terdiri daripada unjuran neuron berduri sederhana GABAergik dan bertindak sebagai antara muka limbik-motor yang mengintegrasikan isyarat yang timbul daripada sistem limbik dan mengubahnya menjadi tindakan melalui output ke pallidum ventral (VP) dan lain-lain effectors motor (26). Dan akhirnya, hipotalamus yang dibentuk oleh banyak sambungan GABA di LH (27) dan arcuate nucleus, mengintegrasikan isyarat kelaparan dan ketenangan (10).
Kajian ini bertujuan untuk mengenalpasti pengambilan pengambilan diet barat ibu (WD) pada anak tikus dari lahir hingga kematangan seksual (i) keutamaan lemak (ii) pada profil ekspresi gen sistem DA, sistem GABAergik dan kepekaan hipotalamus , dan (iii) mengenai perubahan neuroanatomikal / seni bina rangkaian dopaminergik mesolimbi untuk tempoh yang sama. Oleh itu, kami menilai, dalam kajian membujur (daripada menyapu, P25, kepada kematangan seksual, P45 dan dewasa, P95), kesan WD ibu pada pertumbuhan berat badan dan perkembangan tisu adipose keturunan yang disimpan di bawah kerap biasa selepas menyapih. Sejajar dengan itu, kami melakukan ujian keutamaan lemak diikuti dengan analisis transkrip yang berdedikasi dan analisa komponen utama (PCA) berikutnya bagi pemilihan penanda untuk pengambilan makanan, pilihan dan motivasi sistem pengawalseliaan. Hasil kami dengan ketara memperkaya keputusan terkini yang memberi tumpuan kepada pengaturcaraan pemakanan sistem DA.
Bahan dan Kaedah
Kenyataan Etika
Semua eksperimen dilakukan mengikut garis panduan jawatankuasa kebajikan haiwan tempatan, EU (arahan 2010 / 63 / EU), Institut Nasional de la Recherche Agronomique (Paris, Perancis), dan Jabatan Veterinar PerancisA44276). Protokol percubaan telah diluluskan oleh jawatankuasa etika institusi dan didaftarkan di bawah rujukan APAFIS 8666. Setiap langkah berjaga-jaga telah diambil untuk mengurangkan tekanan dan bilangan haiwan yang digunakan dalam setiap siri eksperimen.
Haiwan dan Diet
Haiwan dikekalkan dalam kitaran 12 h / 12 h cahaya / gelap dalam 22 ± 2 ° C dengan makanan dan air iklan libitum. Tiga puluh dua tikus Sprague-Dawley wanita (berat badan: 240-290 g) pada hari kehamilan 1 (G1) dibeli secara langsung dari Janvier (Le Genest Saint Isle, Perancis). Mereka ditempatkan secara individu dan diberi makanan kawalan (CD) (5% lemak daging lembu dan 0% sucrose) untuk 16 mereka atau WD (21% daging lembu lemak dan 30% sukrosa) untuk 16 mereka semasa tempoh kehamilan dan penyusuan (lihat Jadual Table1: 1: komposisi diet dalam peratus kcal dari ABdiet Woerden, Belanda). Semasa kelahiran, saiz sampah disesuaikan kepada lapan pups per sampah dengan nisbah 1: 1 kepada perempuan. Kami menyimpan 12 daripada empangan 16 dengan sampah yang terdiri daripada lelaki 4 dan wanita 4 untuk setiap kumpulan. Pada menyapih (P21), anak yang dilahirkan pada CD dan empangan WD disimpan pada chow standard sehingga akhir eksperimen (Angka (Rajah 1A, B) .1A, B). Berat badan pup dicatatkan semasa lahir dan selepas itu setiap hari di 10: 00 am hingga P21 (menyapih). Selepas menyapu dan sehingga akhir eksperimen, tikus telah ditimbang setiap hari 3. Kami membentangkan data mengenai anak lelaki sahaja. Tikus betina digunakan untuk kajian lain (Rajah (Rajah11).
Kelakuan (ujian pilihan dua botol)
Tiga tempoh perkembangan kritikal dikaji (P21 ke P25: remaja, P41 ke P45: remaja dan P91 ke P95: dewasa muda). Anak lelaki 24 (n = 12 setiap kumpulan) dipilih secara rawak dan diletakkan di dalam sangkar individu untuk melakukan ujian percuma pilihan dua botol (Gambar (Rajah 1A, B) 1A, B) (28-30). Ujian ini digunakan khusus untuk mengkaji daya tarikan terhadap rasa lemak dengan memisahkannya dari rasa manis dan sebanyak mungkin dari kesan metabolik pengambilan kalori. Sesungguhnya penggunaan larutan minyak jagung 1% dikaitkan dengan pengambilan 0.09 kcal / ml sahaja. Selepas satu hari kebiasaan dengan kehadiran dua botol, ujian itu dilakukan lebih dari hari 2 pada P25 dan lebih dari 4 hari di P41 dan P91 (Rajah (Rajah1A) .1A). Secara terperinci, semasa menyapih (P21), anak 24 ditempatkan secara berasingan untuk hari-hari 2 (Rajah (Rajah1A): 1A): 1 hari, fasa pembiakan, hari 2, tikus diberi pilihan bebas dua botol antara emulsi minyak jagung 1% dalam 0.3% xanthan gum (Sigma Aldrich, St Quentin Fallavier, Perancis) dan larutan gula xanthan ( 0.3%). Pada P41 dan P91, anak anjing 24 digunakan dan pilihan dua botol percuma dicadangkan selama tiga hari berturut-turut. Penggunaan larutan gusi xanthan dan larutan rasa (minyak jagung 1%) dicatatkan setiap hari di 11: 00 am untuk hari 3 (P45 dan P95). Kedudukan kedua-dua botol itu terbalik setiap hari untuk mencegah kecenderungan keutamaan kedudukan. Skor keutamaan lemak dikira sebagai nisbah "larutan lemak" yang digunakan untuk jumlah keseluruhan yang digunakan dalam 24 h. Semua tikus dikekalkan di bawah diet chow standard sepanjang ujian tingkah laku.
Koleksi Tisu dan Pengambilan Darah
Hari selepas hari terakhir ujian pilihan bebas dua botol, separuh daripada tikus (n = 6 setiap kumpulan) disahkan dengan cepat antara 09:00 dan 12:00 pagi oleh CO2 penyedutan. Darah dikumpulkan dalam tiub dengan EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, Perancis) dan disentrifugasi pada 2,500 g untuk min 15 pada 4 ° C. Plasma dibekukan pada -20 ° C. Organ dan kumpulan depo lemak retroperitoneal dibedah dan ditimbang. Otak itu dikeluarkan dengan cepat dan dimasukkan ke dalam matriks otak (WPI, Sarasota, FL, USA tikus 300-600 g). Mula-mula hypothalamus dibedah [mengikut koordinat atlas Paxinos: -1.0 ke -4.5 mm dari Bregma (31)], bagi setiap tikus, dua keping coronal ketebalan 2 mm pada tahap NAc dan satu lagi pada tahap VTA diperolehi. Sampel kanan dan kiri NAc dan kanan dan kiri VTA (empat sampel dalam jumlah setiap haiwan) telah diperoleh dengan cepat menggunakan dua pukulan biopsi yang berbeza (Stiefel Laboratories, Nanterre, France) (diameter 4 mm untuk NAc dan 3 mm untuk ubat tengah ventral). Sampel tersebut dibengkokkan beku dalam nitrogen cair dan disimpan di -80 ° C untuk penentuan gen ekspresi berikutnya oleh TaqMan array kepadatan rendah (TLDA).
Tikus yang lain (n = 6 setiap kumpulan) dibius secara mendalam dengan pentobarbital (150 mg / kg ip) dan disempurnakan dengan perfusi salin fiskal transkardial diikuti dengan paraformaldehid 4% sejuk dalam penampan fosfat (PB), pH 7.4. Otak dikeluarkan dengan cepat, direndam dalam fiksatif yang sama selama 1 jam pada suhu 4 ° C, dan akhirnya disimpan dalam sukrosa PB 25% selama 24-48 jam. Otak kemudian dibekukan dalam isopentana pada suhu −60 ° C, dan akhirnya disimpan pada suhu −80 ° C sehingga digunakan. NAc, hypothalamus dan VTA dipotong menjadi bahagian koronal bersiri 20 µm dengan cryostat (Microm, Microtech, Francheville, Perancis). Dua atau tiga siri 10 slaid kaca yang mengandungi 4-6 bahagian dilakukan untuk setiap kawasan otak. Untuk setiap slaid kaca, bahagian bersiri berjarak 200 μm (Rajah (Rajah66).
Analisis Plasma Biokimia
Plasma EDTA yang dikumpulkan pada tikus P25, P45, dan P95 digunakan untuk mengukur glukosa plasma, NEFA (asid lemak tanpa ester), insulin, dan leptin. Glukosa dan NEFA diukur menggunakan tindak balas enzimatik kolum dengan kit spesifik (kit glukosa dan NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Perancis). Hormon telah diuji dengan kit ELISA tertentu mengikut arahan pengeluar untuk insulin dan leptin (kit ELISA tikus / tetikus, kit leptin ELISA, Linco Research, St. Charles, MO, Amerika Syarikat).
Imunohistokimia
Slaid kaca yang mengandungi seksyen VTA dan NAc bersiri pertama disekat untuk 3-4 h dan kemudian diinkubasi semalaman di 4 ° C dengan campuran antibodi yang berikut: anti-NeuN tetikus (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, Amerika Syarikat) dan kelinci anti-TH (1: 1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, Amerika Syarikat). Selepas inkubasi dengan antibodi utama dan pencucian berikutnya dengan PB, bahagian diinkubasi dalam campuran antibodi sekunder: Alexa 488 konjugasi keldai anti-tikus IgM dan Alexa 568-conjugated keldai anti-arnab IgG (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, Amerika Syarikat) untuk 2 h. Seksyen dipasang di superfrost ditambah slaid emas (Scientific ThermoFisher, Waltham, MA, Amerika Syarikat), dikeringkan udara, dan dibalut dengan reagen anting-anting ProLong ™ Gold (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat).
TH Neurons Count in VTA
Untuk setiap tikus, sel-sel TH-positif dikira seperti yang dinyatakan sebelumnya (32) pada tiga tahap rostrocaudal yang berbeza dari VTA: pada tahap keluar dari saraf ketiga (jarak berbanding dengan Bregma: -5.3 mm), 200 μm rostral dan 200 μm caudal ke tahap ini (Rajah (Rajah 6A) .6A). Di sebelah kiri dan kanan, gambar digital yang terdiri daripada seluruh VTA dari saluran terminal aksesori ke tepi sempadan mesencephalon diperoleh menggunakan pembesaran x 40 pengimbas slaid NanoZoomer-XR Digital C102 (Hamamatsu, Jepun). Satu garisan ditarik di sekitar perimeter VTA bagi setiap bahagian. Batasan dipilih dengan memeriksa bentuk sel dan merujuk kepada atlas Paxinos dan Watson. Suatu dopaminergik neuron ditakrifkan sebagai NeuN (+) / TH (+) sel badan immunoreaktif dengan nukleus yang jelas kelihatan. Menggunakan perisian NIH Image J (plugin kaunter sel), sel NeuN (+) / TH (+) dikira oleh dua orang yang berbeza tanpa pengetahuan kumpulan haiwan. Kesalahan mengira sel-sel telah diperbetulkan menggunakan formula Abercrombie (32), di mana N = n[t/(t + d)] (N = jumlah sel; n = bilangan sel yang dikira; t = ketebalan bahagian; dan d = diameter sel), dan faktor pembetulan ini adalah 0.65. Data dinyatakan sebagai min [NeuN (+) / TH (+) di kiri dan kanan VTA] ± SEM.
Ketumpatan Fiber TH di NAc
Kandungan protein TH di terminal saraf dopaminergik NAC dianggarkan oleh analisis densitometrik anatomis bahagian immunolabel TH. Ketumpatan serat TH dihitung pada tiga tahap sewenang-wenang di sepanjang paksi rostrocaudal NAc (Bregma 2.20, 1.70, dan 1.20 mm) (Rajah (Rajah6B) .6B). Secara ringkas, gambar digital yang terdiri daripada striatum dan NAc yang diperolehi menggunakan pembesaran × 40 pengimbas slaid NanoZoomer-XR Digital C102 (Hamamatsu, Jepun) diperolehi. Bagi NAc yang diberikan, garisan ditarik ke seluruh nukleus untuk menentukan ukuran kepadatan optik (OD) pengukuran (Rajah (Rajah6B) .6B). Nilai yang diperolehi dinormalisasikan dengan nilai OD yang diukur dari zon pekeliling yang ditarik pada callosum corpus (rantau yang tidak bernoda untuk immunochemistry TH) bahagian yang sama menggunakan perisian NIH Image J. Data dinyatakan sebagai purata nisbah OD (nilai OD dalam nilai NAc / OD dalam callospore corpus dari tiga bahagian) ± SEM.
Ekspresi Gen oleh TLDA dan TaqMan
RNA diasingkan daripada NAc yang beku, sampel diperkayakan VTA, dan hipotalamus, menggunakan kit RNA / protein NucleoSpin (Macherey-Nagel, Hoerdt, Perancis). Jumlah RNA diserahkan kepada pencernaan DNase berikutan arahan pengeluar, kuantiti tersebut dianggarkan oleh penyerapan UV 260 / 280 nm, dan kualiti dinilai menggunakan Sistem Agilent 2100 Bioanalyzer, nombor integriti RNA (RIN) kemudian dikira. Sampel dengan RIN di bawah 8 dibuang. Satu mikrogram daripada jumlah RNA adalah sebaliknya ditranskripsikan ke dalam cDNA menggunakan kit RT Kapasiti Tinggi (Applied Biosystems, Foster City, CA, Amerika Syarikat) dalam jumlah keseluruhan 10 μl.
Seperti yang dinyatakan sebelumnya (33), TLDA adalah kad mikro-fluidik 384 yang mana PCR masa serentak 384 boleh dilakukan (Applied Biosystems, Foster City, CA, Amerika Syarikat). Kami menggunakan TLDA yang direka khusus untuk melindungi keluarga gen yang berlainan yang berkaitan dengan keplastikan dan peraturan pengambilan makanan. Setiap kad adat dikonfigurasikan sebagai garisan muatan 2 × 4 yang mengandungi ruang tindak balas 2 × 48 (rujukan: 96a). Set gen 92 (Jadual S1 dalam Bahan Tambahan) dan empat gen pengemasan (18S, Gapdh, Polr2a, dan Ppia) telah dikaji. PCR masa nyata dijalankan menggunakan reagen Life Technologies TaqMan dan dijalankan pada sistem pengesanan urutan ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, Amerika Syarikat). Data pendarfluor mentah dikumpulkan melalui PCR menggunakan perisian SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), yang seterusnya menghasilkan kitaran ambang Ct dengan penentuan automatik kedua-dua garis dasar dan ambang. Selepas penapisan menggunakan Apl awan ThermoFisher (ThermoFisher, USA) untuk mendiskriminasi PCR yang menyimpang, ujian setiap sampel adalah n = 6 (n = 5 untuk kumpulan WD pada P25). Data kemudian dianalisis dengan ThermoFisher Cloud App (ThermoFisher, USA) untuk kuantitatif relatif. Kuantiti relatif ekspresi gen (RQ) berdasarkan kaedah perbandingan Ct menggunakan persamaan RQ = 2-ΔΔCt, di mana ΔΔCt untuk satu sasaran gen adalah variasi Ct sendiri yang ditolak dari sampel calibrator dan dinormalisasi dengan kawalan endogen. Tepatnya, kami menentukan gen rumahtangga yang paling stabil menggunakan algoritma geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, USA). Di antara empat gen pengemasan, Gapdh ditakrifkan sebagai kawalan endogen untuk NAc dan hypothalamus, dan Ppia untuk VTA dan ini adalah benar untuk semua sampel dari tiga masa yang dianalisis. Perwakilan graf ekspresi gen secara manual direka bentuk untuk memberikan satu warna untuk peningkatan 10% ekspresi gen berbanding dengan kumpulan CD. Variasi yang ketara, menggunakan ujian pangkat yang tidak berparameter untuk Wilcoxon ditandakan dengan asterisk.
Analisis Statistik
Keputusan dinyatakan sebagai min ± SEM dalam jadual dan angka. Ujian bukan parametrik Mann-Whitney digunakan untuk analisis berat badan pada titik masa yang berlainan, keutamaan Lemak, dan nisbah OD yang diperolehi daripada imunohistokimia.
Untuk menilai kepentingan keutamaan lemak hari 3, kami melakukan analisis statistik lajur untuk setiap hari. Bagi setiap kumpulan, penggunaan larutan lemak dan larutan kawalan diuji dengan menggunakan ujian berpangkalan yang tidak berparameter, Wilcoxon. Kami membandingkan nilai minima keutamaan dengan nilai hipotesis 50% (garis merah putus-putus). Variasi yang ketara telah diambil perhatian dengan asterisk merah. Kami menggunakan ujian yang sama untuk analisis nilai RQ qPCR; kami membandingkan nilai min RQ dengan nilai hipotesis 1. Variasi yang ketara telah diperhatikan dengan asterisk (Rajah (Rajah44).
Untuk analisis sampel plasma, kami melakukan ujian Mann dan Whitney yang tidak parametrik. Bilangan sel TH-positif dianalisis dengan ANOVA dua hala dan p nilai dikira. Kerana kepelbagaian ujian yang dilaksanakan, Bonferroni post hoc pembetulan telah digunakan hanya selepas ujian ini. Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Amerika Syarikat).
PCA yang tidak dikawal pertama kali dilakukan pada parameter 130 (TLDA, tingkah laku, dan data plasma) pada titik waktu yang berbeza untuk setiap pukulan biopsi otak (VTA, NAc, dan hypothalamus) untuk menggambarkan struktur umum set data (iaitu, tiga PCA global setiap masa). PCA dapat didefinisikan sebagai unjuran ortogonal data ke ruang linear dimensi yang lebih rendah, sehingga varians data yang diproyeksikan dimaksimalkan di subspace. Kami mula menapis gen yang tidak dinyatakan atau sedikit dinyatakan (Rajah (Rajah5) .5). Nilai untuk anak dari CD diberi makan empangan dan dari WD diberi makan empangan muncul dalam warna yang berbeza dalam plot PCA individu untuk memvisualisasikan jika kedua-dua kumpulan percubaan ini dipisahkan dengan baik oleh komponen PCA yang tidak dikendalikan. Analisis ini mengasingkan kumpulan-kumpulan gen yang berbeza-beza di antara kedua-dua kumpulan keturunan. Selanjutnya, PCA yang ditumpukan dilakukan pada kelompok penanda mRNA yang berbeza: plastisitas (lekatan sel, sitoskeleton, faktor neurotropik, synaptogenesis, dan pengawalan transkripsi), jalur DA, laluan GABAergik, modulator epigenetik (deastetylase histon dan asetil asetil transferase). PCA terfokus ini membolehkan seseorang untuk menggambarkan secara serentak hubungan antara diet ibu dan beberapa penanda dan korelasi antara gen keluarga tertentu. Skala kualitatif digunakan untuk analisis PCA dan berfokus PCA: +++: pemisahan yang sangat baik; ++: pemisahan yang baik dengan satu tikus di sebelah yang salah pemisahan PCA; +: pemisahan yang agak baik dengan dua tikus (salah satu daripada setiap kumpulan) di sisi yang salah, -: tidak ada pemisahan yang jelas.
Hasil
Berat Badan dan Pertumbuhan
Pengambilan WD ibu semasa kehamilan (dari G1 hingga G21) tidak menjejaskan berat badan anak semasa lahir (Rajah (Rajah2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (Angka (Rajah 2A, B) .2A, B). Kelebihan berat badan dari kelahiran hingga menyapih adalah lebih tinggi 21% pada anak yang dilahirkan dari empangan WD daripada keturunan dari empangan CD dengan berat badan yang jauh lebih tinggi untuk menyapih pada anak yang dilahirkan dari empangan WD (36.19 ± 0.90 g vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (Rajah (Rajah2C) .2C). Dari penyusutan hingga akhir eksperimen (P95), tikus diberi makan dengan standard chow diet dan berat badan tetap lebih tinggi untuk anak-anak dari empangan WD daripada dari empangan CD wadah. Secara terperinci: semasa remaja (P39) (Angka (Rajah 2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 dan pada P93 (dewasa muda) (Angka (Rajah 2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g vs WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Penanda Hormon dan Metabolik pada Tempoh Masa yang Berbeza
Plasma leptin, insulin, glukosa, dan kepekatan NEFA diukur pada P25, P45, dan P95. Di semua peringkat umur, kadar glukosa plasma, NEFA dan leptin dari keturunan WD tidak berbeza secara statistik daripada keturunan CD (Jadual (Table2,2, n = 6 setiap kumpulan). Kami memerhatikan peningkatan ketara dalam pemendapan lemak (nisbah jisim lemak retroperitoneal) pada keturunan dari empangan yang diberi makan WD pada P25 sahaja (p = 0.0327, ujian Mann dan Whitney).
Kesan WD Perinatal pada Keutamaan Lemak dari Penyusutan hingga Dewasa
Untuk meneroka kesan WD pada pilihan lemak, kami menggunakan paradigma pilihan dua botol pada tiga titik masa yang berbeza semasa pertumbuhan. Ujian ini digunakan untuk mengkaji secara khusus keutamaan lemak dengan mengelakkan kesan metabolik pengambilannya. Kami menunjukkan bahawa perbezaan dalam pengambilan kalori "tambahan" dari botol (di P25, P45, dan P95) tidak signifikan secara statistik antara kumpulan (Rajah S1A-C dalam Bahan Tambahan). Selain itu, perbezaan dalam penggunaan larutan minyak jagung 1% menghasilkan peningkatan kalori oleh 1% untuk tikus WD di P25 (WD: 4.9% vs CD: 3.9% kalori yang ditelan) dan 0.5% untuk tikus CD di P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% kalori yang ditanam) (Angka S1D-F dalam Bahan Tambahan). Di P25, pups dari empangan CD tidak mempunyai keutamaan untuk lemak (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); pada tikus WD yang bertentangan menunjukkan pilihan untuk lemak (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 mengikuti ujian peringkat ditandatangani Wilcoxon, tanda bintang merah). Lebih-lebih lagi terdapat perbezaan statistik antara dua kumpulan dengan p = 0.0347 (Ujian Mann dan Whitney, tag hash hitam) (Rajah (Rajah33A).
Pada P45 dan P95, kedua-dua kumpulan mempunyai keutamaan yang ketara untuk lemak, iaitu berbeza dengan nilai teoretikal 50% (di P45, CD: 80.68 ± 2.2% p = 0.0005 dan WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; pada P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 dan WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 mengikuti ujian peringkat bertanda Wilcoxon, asterisk merah) (Rajah (Rajah3A) .3A). Nilai-nilai untuk kedua-dua kumpulan itu tidak dapat dibezakan selepas satu hari pembentangan rasa (di P45 p = 0.7857 dan pada P95 p = 0.9171 Ujian Mann – Whitney) (Rajah (Rajah33A).
Untuk mengetahui bagaimana tikus mengawal penggunaan lemak mereka dari masa ke masa, kami mengulangi persembahan lemak selama tiga hari berturut-turut di P45 dan P95 (Angka (Rajah 3B, C) .3B, C). Menariknya di P45, hanya lelaki dari empangan WD secara berperingkat kehilangan keutamaan penyelesaian lemak (Rajah (Rajah3B) 3B) (hari ketiga: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 mengikuti ujian peringkat ditandatangani Wilcoxon). Walau bagaimanapun, pada usia P95 (usia dewasa) semua haiwan lebih suka lemak tanpa evolusi selama ujian 3 hari (Gambar (Rajah33C).
Ringkasnya, dalam model ini, kita melihat, pada peringkat awal (zaman kanak-kanak), keutamaan lemak dalam tikus yang diberi oleh empangan WD dengan ketidakpuasan yang progresif dari semasa ke semasa semasa remaja. Kami melihat tidak ada perbezaan antara kedua-dua kumpulan tikus pada dewasa.
Tandatangan Molekul Kepekaan Otak dan Pembentukan Litar GABA dalam Laluan Hypothalamus dan Ganjaran
Untuk menentukan sama ada pengambilan WD ibu semasa kehamilan dan penyusuan mempunyai kesan terhadap hipotalamus dan jalur ganjaran anak, kami mengukur ungkapan relatif beberapa faktor utama kepekaan otak, pemodelan otak, dan penanda litar neuron yang terlibat dalam pengambilan makanan dan epigenetik pengawal selia. Kami menggunakan TLDA untuk menganalisis kelimpahannya di kawasan otak yang berbeza (iaitu, hypothalamus, VTA, dan NAc) (Jadual S1 dalam Bahan Tambahan) pada tempoh tiga kali. Pemeriksaan dilakukan selepas ujian pilihan dua botol di P25, P45, dan P95 (Rajah (Rajah1) 1) ke atas enam lelaki yang dilahirkan dari WD diberi makan bendungan dan enam orang lelaki yang dilahirkan dari CD diberi makan empangan.
Di P25 dalam hypothalamus, lima gen dari tiga belas kategori berbeza menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang jauh lebih rendah terutamanya dalam penanda plastik dan penanda GABA antara -20% (Gfap) dan -40% (Gabra5) dalam pups dari WD diberi makan empangan berbanding dengan tikus CD memberi makan empangan. Dalam biopsi jalur ganjaran (VTA dan NAc), dua gen menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi statistik (D2R dan Gabra1), iaitu, isyarat GH dan reseptor GABA dan satu gen ungkapan yang lebih rendah (Hcrtr2) (iaitu, reseptor orexin 2) , manakala empat gen menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi (Map2, Gabara1, Hcrtr1, dan Hcrtr2) (iaitu, penanda plastik, reseptor GABA dan reseptor serotoninergik) dalam VTA (Rajah (Rajah44).
Di P45 dalam hypothalamus, lima gen dari tiga belas kategori berbeza memperlihatkan tahap ekspresi mRNA yang lebih rendah antara -20% (Fos) dan -50% (FosB) dalam pups dari WD diberi makan empangan berbanding dengan tikus dari empangan diberi makan CD. Pada P45 dalam biopsi jalur ganjaran, empat gen menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi (Gfap, Dat, Cck2r, dan Kat5) dan dua gen ekspresi yang lebih rendah (Fos dan FosB) di NAc manakala tiga gen menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih rendah (Arc, FosB, dan Th) dan satu gen tahap yang lebih tinggi (Gabrg2) dalam VTA.
Di P95 dalam hipotalamus, gen 20 dari tiga belas kategori berbeza menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi antara + 20 dan + 40% (Syt4 hingga Gjd2) dan gen 3 menunjukkan ekspresi mRNA yang lebih rendah (FosB, D1r, dan Gabarb1) empangan yang diberi makan berbanding tikus dari empangan diberi makan CD. Pada P95 dalam biopsi jalur ganjaran, gen 12 menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi antara + 20 dan + 40% (Syn1 hingga Hcrt1) dan gen 1 ungkapan yang lebih rendah (Th) dalam NAc, gen 6 menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi (Ncam1 , Gra1, Gjd2, Gabra5, Htr1a, dan Htr1b), dan gen 6 memaparkan tahap ekspresi mRNA yang lebih rendah (Cntf, Igf1, Fos, Socs3, Gabrb2, dan Hdac3) dalam VTA.
Kami kemudian melakukan tiga PCA tanpa pengawasan yang sepadan dengan tiga biopsi otak menggunakan semua parameter kuantitatif (iaitu, dos plasma, data perilaku dan variasi ungkapan mRNA). Pemisahan jelas kedua-dua kumpulan itu diperolehi hanya di P95 untuk NAc dan VTA (Jadual (Table33).
Menurut bulatan korelasi PCA dan data TLDA (mewakili majoriti pembolehubah termasuk dalam PCA ini), kita menentukan keluarga gen yang boleh bertanggungjawab untuk pemisahan dan melakukan PCA yang fokus (Rajah (Rajah 5A, B, 5A, B, contohnya). PCA terfokus mendedahkan bahawa pada penanda P25 DA penanda NAc dan plastisitas dalam hipotalamus dapat memisahkan dua kumpulan keturunan (Jadual (Table33 untuk ringkasan). Tiada diskriminasi sedemikian kemudiannya diperolehi di P45. Walau bagaimanapun, analisis yang sama di P95 menunjukkan bahawa penanda berbeza sistem GABA dalam NAc dan hypothalamus, ditambah penanda plastik (dalam hypothalamus, NAc dan VTA) dan pengawal selia epigenetik (hanya di NAc) menyumbang untuk memisahkan kedua-dua kumpulan haiwan ( Rajah (Rajah5; 5; Jadual Table33).
Analisis ini mendedahkan pengaruh jangka panjang diet perinatal pada penanda GABAergic serta plastisitas dan penanda epigenetik dalam kedua-dua homeostatic dan laluan ganjaran yang terlibat dalam tingkah laku makan.
Immunohistochemistry of TH Cells Confirmed Transcript Analysis
Kerana kita melihat beberapa variasi dalam mRNA TH dalam NAc dan VTA pada pelbagai tempoh perkembangan, kami berhasrat untuk mengaitkan hasil ini dengan TH immunostaining. Bilangan sel positif TH / NeuN dianalisis dalam VTA di mana badan sel dopaminergik berada dan OD of immunolabel TH dihitung dalam ujung saraf yang terletak di NAc. Sel TH (+) kurang banyak di VTA WD berbanding tikus CD di P45 sahaja (Angka (Rajah 6A, C, E; 6A, C, E; Rajah S2A dalam Bahan Tambahan). Tiada interaksi yang signifikan di antara paras bahagian dan kuantum TH / NeuN pada tiga tempoh (P25 p = 0.9991, P45 p = 0.9026, dan P95 p = 0.9170). Pada P45 sahaja, perbezaan statistik diperoleh antara dua kumpulan keturunan (p = 0.0002) (Rajah (Rajah6E) .6E). Di samping itu, kami mendapati tiada perbezaan dalam OD TH di immunostaining di NAc di P25 dan P45 antara kedua-dua kumpulan (nilai nisbah OD di P25: 1.314 ± 0.022 dalam CD vs 1.351 ± 0.026 di WD, p = 0.2681; Nilai nisbah OD pada P45: 1.589 ± 0.033 dalam CD vs 1.651 ± 0.027 di WD, p = 0.1542). Walau bagaimanapun, penurunan ketara ujung saraf TH OD didapati di NAc dari kumpulan WD pada P95 (nilai nisbah OD pada p95: 1.752 ± 0.041 dalam CD vs 1.550 ± 0.046 di WD, p = 0.0037) (Angka (Rajah 6B, D, F; 6B, D, F; Rajah S2B dalam Bahan Tambahan).
Perbincangan
Dalam kajian ini, kami menegaskan bahawa makanan berlebihan perinatal ibu akan mempengaruhi program pembangunan jalur ganjaran yang terlibat dalam homeostasis tenaga, pilihan makanan, dan pengambilan makanan kepada anak-anak. Kami secara meluas memeriksa kesan pengambilan WD ibu dari kelahiran untuk menyapih pada GABA, serotonin, dan laluan DA bidang otak tertentu (VTA, NAc, dan hypothalamus) pada keturunan, dari zaman kanak-kanak hingga dewasa. Keputusan kami menunjukkan bahawa penggunaan diet, kaya dengan lemak dan manis, terhad kepada tempoh perinatal mempunyai kesan ke atas kecenderungan awal awal (kanak-kanak) dalam anak-anak yang dikaitkan dengan perubahan dalam profil ekspresi gen dan perubahan neuroanatomikal / seni bina mesolimbic rangkaian dopaminergik. Walau bagaimanapun, apabila anak-anak diletakkan di bawah diet chow, kita melihat pada tikus WD yang diberi makan remaja kehilangan kehilangan daya tarikan terhadap lemak yang dikaitkan dengan pengurangan gen gen sistem dan pengurangan sedikit neuron TH-positif dalam VTA . Kemudian dalam keutamaan lemak kehidupan tidak berbeza antara kumpulan walaupun keplastikan penting rangkaian GABAergic dan rangkaian homeostasis tenaga hipotalamus telah dikenalpasti dalam tikus dari WD diberi makan empangan (Rajah (Rajah77).
Kesan pertama pengambilan perinatal-WD yang kami perhatikan dalam kajian ini adalah peningkatan berat badan anak pada penyembuhan tetapi tidak ada perbezaan pada kelahiran. Sesungguhnya, haiwan kumpulan WD memperoleh 21 lebih banyak berat daripada CD pada akhir tempoh penyedutan. Kajian terdahulu telah memberikan hasil yang bercanggah mengenai perubahan berat lahir untuk anak-anak dari WD diberi makan empangan: berat badan yang lebih tinggi19, 34), berat badan yang lebih rendah (18, 21, 35) atau tiada perbezaan (6, 22). Data kami selaras dengan analisis meta-regresi baru-baru ini (36) yang dijalankan pada penerbitan percubaan 171 yang membuat kesimpulan bahawa pendedahan HFD ibu tidak mempengaruhi berat badan lahir anak tetapi menyebabkan peningkatan berat badan pada akhir tempoh laktasi. Berat badan yang lebih tinggi dari keturunan WD mungkin mencerminkan perubahan komposisi susu dan / atau pengeluaran susu yang digambarkan dalam penerbitan terdahulu37, 38). Selaras dengan berat badan mereka yang lebih tinggi, nisbah lemak retroperitoneal dari keturunan WD jauh lebih tinggi daripada keturunan CD pada akhir tempoh penyusuan (P25, Jadual Table2), 2), yang juga konsisten dengan kajian terdahulu (18, 21). Walau bagaimanapun, adipositi yang lebih tinggi tidak berterusan di P45 dan P95, dan parameter metabolik lain seperti plasma insulin, NEFA, dan glukosa tidak berbeza di antara kumpulan. Keputusan kami menunjukkan bahawa tanpa obesiti ibu yang jelas semasa kehamilan dan penyusuan, diet dengan sendirinya tidak mencukupi untuk mendorong kesan metabolik yang berkekalan dalam keturunan (22, 39, 40).
Telah dilaporkan bahawa pengambilan HFD perinatal berkait rapat dengan keutamaan anak-anak untuk makanan yang enak (41). Dalam kajian kami, kami melakukan kajian membujur yang bertujuan untuk menguji keutamaan lemak pada anak-anak yang disapu pada chow biasa.
Kesan WD Perinatal pada Kanak-Kanak (selepas penyusuan)
Rodents pups makan makanan padat 19-20 hari selepas kelahiran (42) apabila jalur ganjaran serebrum mereka belum matang (17). Oleh itu, sangat menarik untuk mengkaji keutamaan mereka pada awal lemak dan menghubungkan keutamaan awal dengan analisis transkrip otak. Hanya selepas menyapih, kami mengamati keutamaan untuk lemak dalam keturunan WD yang tidak dibuktikan dalam tikus CD. Ini adalah selaras dengan laporan lain yang menunjukkan hubungan antara kekurangan zat makanan perinatal dan keutamaan makanan yang enak dan keutamaan yang rendah untuk lemak pada usia awal untuk tikus kawalan (43).
PCA global tidak membenarkan membezakan kumpulan pups berkenaan dengan diet ibu pada usia itu. Walau bagaimanapun, apabila PCA yang disasarkan, terhad kepada penanda DA, dilakukan, kami memperoleh pengasingan yang baik dari kumpulan-kumpulan tersebut. Sesungguhnya, terdapat peningkatan ketara dalam ekspresi mRNA reseptor D2 di NAc dalam pakan WD. Dexnaptic overexpression postsynaptic ini di NAc boleh sebahagiannya terlibat dalam motivasi yang lebih tinggi untuk lemak (44). Beberapa transkrip yang lain diubahsuai dalam pupus WD berbanding dengan CD, seperti peningkatan subunit 1 GABAA alpha dalam NAc dan VTA dan pengurangan subunit 5 GABAA alpha dalam hipotalamus yang menunjukkan penyusunan semula reseptor GABAA dalam nukleus ini.
Kesan WD Perinatal pada Masa Remaja
Di P45, kami mengamati keutamaan lemak tinggi yang sama untuk kedua-dua kumpulan pada hari pertama persembahan tetapi, menariknya, tikus WD secara progresif kehilangan minat mereka untuk lemak selepas pembentangan berulang. Masa remaja adalah tempoh kritikal penyusunan semula neurobehavioral yang diperlukan untuk pemprosesan kognitif sepanjang hayat (45), dan pelbagai kajian menunjukkan kelemahan yang ketara untuk kesan kognitif yang memudaratkan diet lemak (46-48). Hasilnya adalah percanggahan dengan kerja-kerja sebelumnya kumpulan Muhlhausler (21, 35) di mana tikus juvana (6 minggu) menunjukkan pilihan yang jelas untuk makanan ringan. Walau bagaimanapun, dalam penerbitan mereka paradigma eksperimen adalah berbeza kerana tikus mempunyai akses percuma ke kedua-dua standard chow dan makanan ringan daripada menyapih korban (6 minggu).
Sejajar dengan itu, kita mengukur kenaikan mRNA Dat dalam NAc dan pengurangan Th mRNA dalam VTA yang telah disahkan oleh imunohistokimia yang menunjukkan bilangan sel TH (+) dikurangkan dalam VTA tikus WD. Selepas aktiviti transkriptik yang tinggi untuk sistem DA pada penyapu, aktiviti berkurang di P45 mungkin menjelaskan minat yang rendah untuk makanan yang dimakan yang dilihat dalam tikus WD kami. Perlu juga diperhatikan bahawa penurunan sistematis ekspresi mRNA Fos dan FosB dalam pelbagai nukleus yang kami dianalisis dapat menjadi tanda aktiviti serebral yang dikurangkan selepas pendedahan WD ibu.
WD tikus remaja menunjukkan kecacatan yang lebih pantas untuk lemak yang bertentangan dengan tingkah laku mereka yang terdahulu. Penggunaan diet "biasa" pada masa kanak-kanak seolah-olah "melindungi" mereka terhadap keinginan lemak yang terlalu banyak pada masa remaja. Sebaliknya apabila tikus mempunyai akses percuma ke makanan ringan selepas menyapu, seperti dalam Ref. (21, 35), mereka menunjukkan pada masa remaja keutamaan lemak yang tinggi. Hasilnya menunjukkan bahawa diet 3 minggu selepas menyapih boleh memprogramkan litar dan membuat anak remaja kurang sensitif terhadap cabaran lemak akut.
Kesan WD Perinatal pada Dewasa
Tikus dewasa tidak lagi memaparkan perbezaan keutamaan untuk lemak, walaupun selepas pembentangan lemak berulang seperti yang telah dijelaskan (22, 35). Sejajar dengan itu, kami melihat penurunan mRNA dan protein TH di NAc, dan kecenderungan untuk pengekspresian dikurangkan mRNA Dat dalam VTA. Naef dan rakan sekerja (20) telah melaporkan aktiviti rendah sistem DA pada tikus dewasa yang diberi makan dalam tempoh perinatal dengan HFD, dengan tindak balas DA yang tumpul kepada amphetamine diukur dengan microdialysis dan peningkatan motivasi untuk ganjaran lemak (lihat jadual yang diringkaskan data qPCR terkini mengenai model ini, Jadual S2 dalam Bahan Tambahan). Satu pengehadan kuantifikasi TH (mRNA dan imunohistokimia) dalam NAc berasal dari fakta bahawa sel NAc juga dapat mengekspresikan mRNA dan protein Th dan kemudian boleh menafikan kuantifikasi serabut DA (49, 50). Walau bagaimanapun, penggunaan TH immunostaining di NAc terutamanya mendedahkan terminal akson padat yang datang dari neuron DA midrib (VTA dan SNc). Biasanya, TH yang menyatakan neuron di striatum dan NAc dapat dilihat hanya di haiwan DA yang sangat lesi (51) dan oleh itu tidak dapat dikesan dalam seksyen immuno kami. Dalam kajian ini, kita juga melihat peningkatan yang kuat dalam reseptor mu opioid di NAc apabila kumpulan-kumpulan lain, dengan model yang berbeza, menunjukkan penurunan ekspresi pada striatum mulut tikus yang terdedah kepada HFD (semasa penyusuan dan gestasi)19, 21) atau tiada perubahan (35). Pengubahsuaian ini, yang diukur hanya pada tahap mRNA, boleh mencerminkan aktiviti hypo sedikit dari litar DA yang berkaitan dengan sensitiviti opioid yang lebih tinggi52) yang mungkin tidak mencukupi untuk memberi kesan terhadap ujian tingkah laku yang kami lakukan. Anggapan ini perlu disahkan menggunakan pendekatan berfungsi. Dalam kertas kerja baru-baru ini, dengan model yang sama, Romani-Perez et al., Tidak dapat melihat peningkatan motivasi yang ketara dalam kotak penyaman pengendali untuk anak HFD tetapi memerhatikan kependaman yang lebih pendek untuk mencapai kotak sasaran dalam paradigma ujian landasan (22). Walaupun tiada keinginan lemak yang tahan lama dalam keadaan percubaan kami, kami mendapati bahawa pengambilan WD ibu perinatal mempunyai kesan jangka panjang ke atas rangkaian cerebral lain yang kebanyakannya diselesaikan oleh pembentukan semula GABA di NAc dan Hypothalamus. NAc dianggap sebagai "sentinel sensori" untuk tingkah laku perampasan (52). Kajian terbaru menunjukkan bahawa pengambilan makanan ditindas oleh perencatan neuron LH yang melepaskan GABA (53). O'Connor et al. menunjukkan bahawa neuron NAc D1R (neuron projecting GABAergic) secara selektif menghalang neuron LH VGAT untuk menghentikan pengambilan makanan (54). Eksperimen ini memperkenalkan litar GABA (NAc / Hypothalamus) yang mungkin bertanggungjawab untuk mengawal respon tingkah laku. Sistem striatum-hypothalamic ventral ini melengkapkan litar lain yang melibatkan nukleus stria terminalis GABA-melepaskan VGAT memproyeksikan neuron kepada glutamat yang melepaskan neuron Vglut LH dan perencatan langsung LH vglut2 memakan makanan (55). Satu lagi komponen penting litar pengawalseliaan selera yang melibatkan shell NAc ialah unjuran melepaskan GABA kepada VP (56). Data-data ini menyerlahkan peranan penting GABA isyarat dalam interaksi antara hypothalamus dan NAc untuk menggalakkan pemakanan. Dalam kajian kami, kami tidak dapat mendiskriminasi populasi neuron yang terlibat dalam pembentukan semula GABA dan bagaimana pengubahsuaian ini dapat mengubah rangkaian. Walau bagaimanapun, peranan pusat litar GABA layak mendapat lebih banyak minat. Khususnya, ia akan menjadi sangat menarik untuk melakukan eksperimen fungsional lanjutan dari litar GABA ini dengan menggunakan pendekatan elektrofisiologi (57). Kami juga memerhatikan penyelarasan transkrip mRNA global untuk reseptor 5HT1a dan 5HT1b dalam tiga teras nuklear yang dikaji. Majoriti serat serat yang diproyeksikan berasal dari inti dorsal raphe (DRN) dan nukleus rape (MRN). Data terkini dari dalam vivo rakaman dan kajian pencitraan menunjukkan peranan positif 5HT dalam ganjaran (58). Serat 5HT dari DRN terlibat dalam kawalan impulsif (59). Meningkatkan 5HT1a dalam VTA dan NAc boleh menjadi mekanisma pampasan yang boleh mengawal impulsif. Dalam hipotalamus, kajian farmakologi menunjukkan bahawa subtip reseptor 5HT1a dapat menindas tingkah laku makan yang disebabkan oleh rangsangan serotonin (60, 61). Peningkatan 5HT1a dan b reseptor dalam hipotalamus dapat memotivasi tindakan serakonin makan-suppressive dan oleh itu boleh membentuk mekanisme pampasan. Andaian ini perlu disahkan dengan menjalankan percubaan fungsian yang betul.
Perubahan rangkaian ini dikaitkan dengan pengubahsuaian penanda plastis seperti Ncam mRNA. Dalam hypothalamus tikus dewasa, kami melihat peningkatan dalam transkrip Ncam1 dan St8sia4 yang mencadangkan dan menambah isyarat polysialic (PSA). PSA adalah glycan permukaan sel yang memodulasi interaksi sel ke sel. Polysialilasi protein melekat sel terlibat dalam pelbagai proses yang bergantung kepada kepekaan sinaptik dalam sistem saraf pusat dan telah dilaporkan diperlukan untuk penyesuaian plastik penyinaran sinaptik semasa keseimbangan tenaga positif akut (33, 62). Di samping itu pengawal selia lain interaksi sel dan synaptogenesis mungkin terlibat dalam plastisitas hipotalam ini.
Kesimpulannya (Rajah (Rajah7), 7), pengambilan WD ibu mempunyai pengaruh jangka panjang ke atas organisasi litar homeostatik dan hedonik yang mengatur tingkah laku makan pada anak. Dengan analisis tiga tempoh masa kritikal, kami dapat menunjukkan evolusi yang jelas untuk keutamaan lemak yang dikaitkan dengan tandatangan molekul otak tertentu. Semasa zaman kanak-kanak, keutamaan lemak mungkin dikaitkan dengan aktiviti DA yang lebih tinggi. Masa remaja, yang dicirikan oleh penyongsangan keutamaan lemak, dikaitkan dengan ungkapan bawah penanda sistem DA yang menunjukkan mekanisme pampasan. Satu perkara yang sangat menarik untuk diberitahu ialah, dalam model ini, diet yang seimbang selepas menyapu boleh melindungi tikus remaja dari tabiat pemakanan yang merugikan dengan mengurangkan keinginan mereka untuk lemak. Walaupun pada masa dewasa kedua-dua kumpulan mempunyai keutamaan tinggi yang sama untuk lemak, tikus dari WD diberi makan empangan menunjukkan pembentukan semula yang mendalam bagi litar GABA. Apakah akibat dari kelelahan yang berpanjangan ini? Adakah pengambilan diet obesogenik yang dibesar-besarkan semasa remaja mengaktifkan semula sistem ganjaran yang tumpul ini? Persoalan-persoalan semacam itu mungkin relevan dalam tindak lanjut pemakanan yang baru lahir dan anak-anak yang meningkat di negara-negara barat.
Kenyataan Etika
Semua eksperimen dilakukan mengikut garis panduan jawatankuasa kebajikan haiwan tempatan, EU (arahan 2010 / 63 / EU), Institut Nasional de la Recherche Agronomique (Paris, Perancis), dan Jabatan Veterinar PerancisA44276). Protokol percubaan telah diluluskan oleh jawatankuasa etika institusi dan didaftarkan di bawah rujukan APAFIS 8666. Setiap langkah berjaga-jaga telah diambil untuk mengurangkan tekanan dan bilangan haiwan yang digunakan dalam setiap siri eksperimen.
Sumbangan Pengarang
JP dan PB melakukan eksperimen dan mengambil bahagian dalam perbincangan dan penulisan. TM melakukan PCA dan mengambil bahagian dalam perbincangan dan menulis. SN menyumbang kepada reka bentuk percubaan dan mengambil bahagian dalam perbincangan. PP menyumbang kepada reka bentuk eksperimen, mengambil bahagian dalam perbincangan, dan menulis manuskrip. VP direka dan melakukan eksperimen, dianalisis data, dan menulis manuskrip.
Penyata Percanggahan Kepentingan
Penulis mengisytiharkan bahawa penyelidikan itu dijalankan tanpa adanya sebarang hubungan komersial atau kewangan yang boleh ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan.
Penghargaan
Penulis ingin mengiktiraf Guillaume Poupeau dan Blandine Castellano untuk menjaga haiwan sepanjang kajian, Anthony Pagniez atas bantuannya dalam pengekstrakan mRNA dan TLDA, Isabelle Grit atas bantuannya dalam analisis sampel plasma, dan Alexandre Benani dan Marie-Chantal Canivenc untuk perbincangan yang berguna dan reka bentuk TLDA.
Nota kaki
Pembiayaan. Penyelidikan ini disokong oleh geran des pays de la Loire PARIMAD (VP), geran yayasan LCL (VP dan PP), Yayasan SanteDige (VP) dan INRA Metaprogram DIDIT (SN, VP, PP).
Bahan Tambahan
Bahan Tambahan untuk artikel ini boleh didapati di talian di http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Rajah S1
Jumlah pengambilan tenaga daripada minyak jagung mengandungi botol. (A) Pengambilan kalori dari botol minyak jagung untuk 24 h pada P25 dalam pups dari diet Barat (WD) yang diberi makan empangan dan pups dari makanan kawalan (CD) empangan yang diberi makan. (B) Pengambilan kalori dari botol minyak jagung untuk 24 h pada P45 (hari ketiga ujian botol). (C) Pengambilan kalori dari botol minyak jagung untuk 24 h pada P95 (hari ketiga ujian botol). Untuk panel (A-C), data dinyatakan sebagai min ± SEM, tiada perbezaan statistik (p > 0.05) diperhatikan, berikutan ujian non-parametrik Mann dan Whitney, pada semua peringkat umur. (D) Peratusan pengambilan kalori dari botol minyak jagung berbanding dengan jumlah pengambilan kalori (botol minyak jagung + diet chow standard) untuk 24 h pada P25 dalam pai WD dan pups CD. (E) Peratusan pengambilan kalori dari botol minyak jagung berbanding dengan jumlah pengambilan kalori (botol minyak jagung + diet piawai standard) untuk 24 h pada P45 (hari ketiga ujian botol) di WD pups dan CD pups. (F) Peratusan pengambilan kalori dari botol minyak jagung berbanding dengan jumlah pengambilan kalori (botol minyak jagung + diet piawai standard) untuk 24 h pada P95 (hari ketiga ujian botol) di WD pups dan anak anjing CD. Untuk panel (D, E), data dinyatakan dalam peratus jumlah pengambilan kalori tiada perbezaan statistik (p > 0.05) diperhatikan, mengikuti chi-square dengan pembetulan Yates, pada semua peringkat umur.
Rajah S2
Photomicrograph wakil TH dalam immunostaining dalam nukleus accumbens (NAc) dan kawasan tegar ventral (VTA) di tiga titik waktu yang berbeza. (A) Photomicrograph TH / NeuN immunostaining pada tahap VTA, -5.30 mm dari Bregma. Pelabelan merah adalah untuk NeuN, dan satu hijau untuk TH. Anak panah putih menunjukkan keluar dari saraf ketiga. (B) Photomicrograph daripada TH mengimunkan pada tahap NAc, + 1.70 mm dari Bregma. Pelabelan hijau adalah untuk TH. Anak panah putih menunjukkan commissure anterior.
Jadual S1
TaqMan senarai gen array berkepadatan rendah dengan teknologi inventori yang bersesuaian.
Jadual S2
Ringkasan data yang diterbitkan mengenai ekspresi transkrip laluan dopamin. Watak-watak merah sepadan dengan zaman kanak-kanak, yang berwarna biru hingga remaja, dan orang dewasa menjadi dewasa. =: sesuai dengan ungkapan transkrip yang sama antara kumpulan, +: bersamaan dengan ungkapan transkrip yang lebih tinggi dalam pups dari diet kalori tinggi [makanan ringan, diet barat (WD) atau diet tinggi lemak (HFD)], dan - sesuai dengan ungkapan transkrip yang lebih rendah dalam pups dari makanan berkalori tinggi (makanan ringan, WD atau HFD) empangan yang diberi makan.
Rujukan