ြဒပ်မဲ့သော
နျူကလိယ accumbens အတွက် dopaminoceptive အာရုံခံအပေါ် dendritic ကျောရိုး (NACC) ၏ Psychostimulant-သွေးဆောင်အပြောင်းအလဲတချို့ကြာရှည်စွဲလမ်းအပြုအမူတွေဆက်စပ်ကြောင်းတစ်ခုသပ္ပါယ်အာရုံခံတုံ့ပြန်မှုအဖြစ်တွေးဆခဲ့သည်။ NACC အကြီးအကျယ် dopamine D1 သို့မဟုတ် D2 receptors ဖြစ်စေ၏မြင့်မားဖော်ပြအလတ်စား spiny အာရုံခံနှစ်ခုကွဲပြား subpopulations ဖွဲ့စည်းထားတာဖြစ်တယ်။ ပစ္စုပ္ပန်လေ့လာမှုတှငျကြှနျုပျတို့ကွဲပြား D1 သို့မဟုတ် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော NACC အတွက်အလတ်စား spiny အာရုံခံအတွက်နာတာရှည်ကင်းကုသမှုပြီးနောက် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ။ ဤရွေ့ကားလေ့လာမှုများ D1 သို့မဟုတ် D2 အဲဒီ receptor ကမကထ (Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP) ဖြစ်စေ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် EGFP ထုတ်ဖော်ပြောဆိုကြောင်း Transgene ကြွက်၏အသုံးပြုမှုကိုဖန်ဆင်းတော်မူ၏။ ကိုကင်းကုသမှုနှင့်ဆုတ်ခွာ၏ 28 ကာလ၏ 2 ရက်ပေါင်းပြီးနောက်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆ Drd1-EGFP- နှင့် Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံနှစ်ဦးစလုံးအတွက်တိုးတက်လာခဲ့သည်။ သို့သော်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက်တိုး 1 ရက်ပေါင်းမူးယစ်ဆေးဆုတ်ခွာပြီးနောက်သာ Drd30-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံအတွင်းထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။ အထူးသ, ΔFosBစကားရပ်တွင်မူးယစ်ဆေးဆုတ်ခွာ၏ 1 ရက်အကြာမှာမူးယစ်ဆေးဆုတ်ခွာ၏ 2 ရက်အကြာမှာသာ Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံအတွက် Drd1-EGFP- နှင့် Drd30-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံလေ့လာခဲ့သည်တိုးတက်လာခဲ့သည်။ ဤရလဒ်သည်နာတာရှည်ကင်းကုသမှုပြီးနောက်လေ့လာတွေ့ရှိတိုးမြှင့ကျောရိုးသိပ်သည်းဆသာ D1-receptor ပါဝင်သောအာရုံခံအတွက်တည်ငြိမ်သည်နှင့်ΔFosBစကားရပ်ဖွဲ့စည်းရေးနှင့် / သို့မဟုတ် D1 အတွက် dendritic ကျောရိုး၏ပြုပြင်ထိန်းသိမ်းမှုအဖြစ် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံတွေနဲ့ဆက်စပ်ကြောင်းအကြံပြု NACC ၌တည်၏။
အဆိုပါ mesolimbic dopaminergic လမ်းကြောင်းအနျူကလိယ accumbens innervate ကြောင်း ventral tegmental ဧရိယာ (NACC), olfactory tubercle, prefrontal cortex နှင့် amygdala (မှာရှိတဲ့အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ဖွဲ့စည်းထားသည်1), အ substantia nigra အတွက် nigrostriatal dopaminergic အာရုံခံသော်လည်း (compacta အပိုဒျ) dorsal striatum တစ်ခုတက်လျက်ရှိနေသည်ကို projection ပေး (2) ။ (အာရုံကြောဆိပ်ကမ်းကနေ dopamine လွှတ်ပေးရန်မြှင့်တင်အားဖြင့်, Synaptic ကွဲများနှင့်စိတ်ကြွဆေးထံမှ dopamine လွှာမှပိတ်ဆို့ခြင်းအသုံးပြုပုံကင်း: Psychostimulants NACC အတွက် dopamine ၏ Synaptic ပြင်းအားခြီးမွှော3-5) ။ ဒီဆေးတွေရဲ့စူးရှ stimulatory သက်ရောက်မှုမှတိုးပွားအပြုအမူတုံ့ပြန်မှု (ထိခိုက်လွယ်) (ထဲမှာ psychostimulants ရလဒ်များထပ်ခါတစ်လဲလဲ, ပြတ်တောင်းပြတ်တောင်းအုပ်ချုပ်ရေး6-8) ။ သက်သေအထောက်အထားအများစုဟာလိုင်းများအတွက် ventral tegmental ဧရိယာ-NACC dopaminergic စနစ်သပ္ပါယ်အပြောင်းအလဲများကိုမူးယစ်ဆေး-သွေးဆောင်အပြုအမူအခြေခံသောအတွေ့အကြုံကို-မှီခို plasticity မြားတှငျပွောငျးလဲမှဗဟိုဖြစ်ကြောင်းအကြံပြုအပ်ပါသည်။
dopamine အပြင်, အချိုမှု (psychostimulants တုံ့ပြန်အပြုအမူအကဲဆတ်ခြင်းဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေးအတွက်လိုအပ်9, 10) ။ အလတ်စား spiny အာရုံခံ (MSNs) ventral striatum အတွက် dendritic ကျောရိုး၏ဦးခေါင်းပေါ်သို့ synapse ကြောင်း prefrontal cortex ကနေ excitatory glutamatergic စီမံချက်များလက်ခံရရှိသည်။ MSNs လည်း (ကျောရိုးလည်ပင်းပေါ်ကို synapse ကြောင်း dopaminergic axon များအတွက်အဓိကပစ်မှတ်များမှာ1, 11, 12) ။ ထို့ကြောင့်, MSNs အတွက် dendritic ကျောရိုး dopaminergic နှင့် glutamatergic ဂီယာပိုင်းတွင်ပေါင်းစည်းကြသည်ရှိရာဆယ်လူလာအခန်းကိုကိုယ်စားပြုသည်။
နှစ်ခုကအဓိကအဲဒီ receptor subfamilies အပေါ် Dopamine လုပ်ရပ်များသည် D1 subfamily (D1 နှင့် D5 Subtype) နှင့် D2 subfamily (D2, D3 နှင့် D4 Subtype) (13) ။ dorsal striatum ခုနှစ်, ခန္ဓာဗေဒလေ့လာမှုများ (striatopallidal MSNs အများစုအမြန် D1 receptors (အတူတကွ enkephalin နှင့်အတူ) သော်လည်း, striatonigral MSNs D2 receptors (အတူတကွပစ္စည်းဥစ္စာ P နှင့် dynorphin နှင့်အတူ) ဓာတ်ပါဝင်မှုမြင့်မားကြောင်းပြသကြ14-17) ။ NACC ထံမှစီမံကိန်း shell ကိုနှင့် ventral pallidum ၏ကွဲပြားငျဒသေဖို့နဲ့ ventral tegmental ဧရိယာနှင့် substantia nigra (မှထုတ်လုပ်တဲ့ယင်း NACC ၏အဓိကအစိတ်အပိုင်းများနှင့်အတူ dorsal striatum ထက်ပိုမိုရှုပ်ထွေးနေကြသည်18) ။ D2 receptors နှင့် enkephalin မြင့်မားသည့် ventral pallidum မှစီမံကိန်းများတွင်ထုတ်ဖော်ပြောဆိုနေကြပါတယ်သွားရမည်အကြောင်း, D1 receptors နှင့်ပစ္စည်းဥစ္စာ P ကိုအညီအမျှ ventral pallidum နှင့် ventral tegmental ဧရိယာ (မှစီမံကိန်းများတွင်ဖြန့်ဝေတွေ့ရှိ19) ။ D1 သို့မဟုတ် D2 receptors များအတွက်ရွေးချယ် agonists နှင့်ရန်၏လေ့လာရေး (D1 နှင့် D2 နှစ်ဦးစလုံး receptors psychostimulant-မှီခိုအပြုအမူအပြောင်းအလဲများအတွက်လိုအပ်လျက်ရှိသောပြသ20-25) ။ သို့သော်ဤ receptors တွေရဲ့အခန်းကဏ္ဍကွဲပြားခြားနားဖြစ်ပေါ်လာပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်, D1 receptors ၏ဆွ (D2 receptors ၏ဆွကင်း-သွေးဆောင် reinstatement နိုင်အောင်စီစဉ်ပေးထားတယ်သော်လည်းကင်းစှာရှာကင်း priming ထိုးခြင်းနှင့်ကင်း-related သဘာဝပတ်ဝန်းကျင်တွေကိုအားဖြင့်သွေးဆောင် attenuates26-28).
psychostimulant စွဲနှင့်အတူသက်ဆိုင်တဲ့အပြုအမူမူမမှန်အလွန်အသက်ရှည်ကြသည်။ ထို့ကြောင့်, (dopamine နဲ့အချိုမှုအားဖြင့်စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်အာရုံခံဆားကစ်အတွက်မော်လီကျူးများနှင့်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံအဆင့်မှာကြာရှည်မူးယစ်ဆေး-သွေးဆောင်အပြောင်းအလဲများကိုဖော်ထုတ်အတွက်စဉ်းစားဆင်ခြင်စရာစိတ်ဝင်စားမှုရှိခဲ့29-32) ။ အထူးသ, ကင်းသို့မဟုတ်စိတ်ကြွဆေးမှရေရှည်ထိတွေ့မှု NACC အတွက် MSNs ၏ dendritic နျဌာနခှဲအချက်များနှင့်ကျောရိုး၏နံပါတ်တိုးမြှင့်ဖို့ရှာတွေ့ခဲ့ပြီး (33-35) ။ ဤရွေ့ကားဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာအပြောင်းအလဲများကို (ပြီးခဲ့သည့်မူးယစ်ဆေးထိတွေ့ပြီးနောက်≈1-3.5 လအထိများအတွက်ဆက်လက်ပြသပြီ30, 35) နှင့် psychostimulant ထိတွေ့မှုနှင့်ဆက်စပ် Synaptic plasticity အတွက်ကြာရှည်ပွောငျးလဲအခြေခံမှအကြံပြုခဲ့ကြသည်။
ပစ္စုပ္ပန်လေ့လာမှု၏ရည်မှန်းချက် D1 သို့မဟုတ် D2 ဖြစ်စေ receptors ဖော်ပြကြောင်း accumbal MSNs ၏ subpopulations အတွက် dendritic ကျောရိုး၏ကင်း-သွေးဆောင်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံကိုပြောင်းလဲဆန်းစစ်ဖို့ဖြစ်တယ်။ ဒီလေ့လာမှုတွေမှာတော့ကျနော်တို့ဘက်တီးရီးယားအတုခရိုမိုဆုန်း (BAC) ကို D1 (Drd1-EGFP) သို့မဟုတ် D2 (Drd2-EGFP) dopamine အဲဒီ receptor ကမကထ (ဖြစ်စေ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် EGFP ဖော်ပြကြောင်း Transgene ကြွက်တွေကိုအသုံးပြုခဲ့ကြ36) ။ ရလဒ်တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆပိုင်းတွင် D1 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs နှင့် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs ထဲတွင်ဖြစ်ပေါ်သော်လည်း, ထိုပြောင်းလဲကျောရိုးသိပ်သည်းဆသာ D1 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံအတွက်တည်ငြိမ်ဖြစ်ပါသည်, ကဖော်ပြသည်။ ထို့အပြင်ကျနော်တို့ΔFosBဖွဲ့စည်းရေးနှင့် / သို့မဟုတ် D1 အတွက် dendritic ကျောရိုး၏ပြုပြင်ထိန်းသိမ်းမှုအဖြစ် NACC အတွက် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံပါဝင်ပတ်သက်စေခြင်းငှါအကြံပြုသည်ကူးယူအချက်ΔFosB၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးအလားတူအပြောင်းအလဲများကိုရှာပါ။
ရလဒ်များ
Drd1-EGFP နှင့် Drd2-EGFP BAC Transgene ကြွက်တွေအတွက် MSNs ၏ analysis ။
Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP BAC Transgene ကြွက်တွေမှာ dorsal နှင့် ventral striatum ထံမှ MSNs ၏စီမံကိန်းပုံစံ GFP ထုတ်ဖော်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှတဆင့်သွင်ပြင်လက္ခဏာခဲ့ပြီး (36) ။ dorsal striatum ၏ MSNs အတွက် GFP ၏ differential ကိုစကားရပ် (အသီးသီး endogenous D1 သို့မဟုတ် D2 receptors ၏ရန်ယေဘုယျအားဖြင့်ကိုက်ညီ36) ။ ကျနော်တို့နောက်ထပ် Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP ကြွက် (ထဲမှာ NACC အတွက် GFP ၏ differential ကိုစကားရပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသဖန်းသီး။ 1a နှင့် b) ။ NACC အတွက်အာရုံခံ၏≈58% (Drd1-EGFP ကြွက်တွေမှာ GFP ထုတ်ဖော်ပြောဆိုပေမယ့်သဖန်းသီး။ 1a), NACC အတွက်အာရုံခံ၏≈48% (ကျေးလက်ဒေသဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေးဦးစီး-2-EGFP ကြွက်တွေမှာ GFP ထုတ်ဖော်ပြောဆိုသဖန်းသီး။ 1b) ။ MSNs (NACC အားလုံးကိုအာရုံခံ၏ 90-95% ကိုယ်စားပြု12, 37) ။ D1 receptors သာ MSNs အတွက်ထုတ်ဖော်ပြောဆိုကြသည်နှင့် D2 receptors MSNs နှင့် striatal အာရုံခံ၏ 1-3% ကိုယ်စားပြုထားတဲ့ cholinergic interneurons, (အတွင်းထုတ်ဖော်ပြောဆိုနေကြပါတယ်37) ။ အကောင့်ထဲသို့ထိုအအချက်များယူခြင်း, ရလဒ်အနည်းဆုံး, NACC အတွက် MSNs ၏≈10-15% နှစ်ဦးစလုံး D1 နှင့် D2 receptors ထုတ်ဖော်ပြောဆိုဖို့များပါတယ်, ထိုအကြံပြုအပ်ပါသည်။
Drd1-EGFP နှင့် Drd2-EGFP ကြွက်တွေအတွက် Dendritic ကျောရိုး၏ analysis ။
အဆိုပါ Drd1-EGFP နှင့် Drd2-EGFP ကြွက်တွေမှာ GFP စကားရပ်တွင် neuron ဆဲလ်အလောင်းတွေကိုရှုတ်ချဖို့အသုံးဝင်ခဲ့သည်။ သို့သော် dendrites နှင့် dendritic ကျောရိုးထဲမှာ GFP signal ကိုဆန့်ကျင် GFP ပဋိနှင့်အတူ immunostaining ပြီးနောက်၎င်းတို့၏ဆန်းစစ်ခွင့်ပြုပါရန်လည်းအားနည်းခဲ့ပါတယ်။ ချောင်းဆိုးဆေးများ၏အမှုန်-mediated ပဲ့ထိန်းတပ်ပေးပို့မကြာသေးမီက (ကလျင်မြန်စွာနှင့်အကျိုးရှိစွာထုံးစံ၌အာရုံခံလူဦးရေတံဆိပ်ကပ်ဖို့အသုံးပြုထားပြီး38) ။ တစျခုလုံးကိုအာရုံခံဒီ technique ကိုသုံးပြီးတံဆိပ်ကပ်ခံရနိုင်ပြီး, ၎င်းနည်းလမ်း Golgi-ကော့အစွန်းအထင်းမှနှိုင်းယှဉ်ဖြစ်ပေါ်လာသည်။ NACC အတွက်အာရုံခံ၏ dendritic shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်, fixed accumbal ချပ်တစ်ဗီဇသေနတ်သုံးပြီးအားဖြင့် lipophilic ချောင်းဆိုးဆေး 1,1'-diotadecyl-3,3,3 '3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) နဲ့တံဆိပ်ကပ်ခဲ့သည်။ တစ်ဦး DiI-စွန်း MSN ကိုတခုရဲ့ဥပမာမှာပြသတာဖြစ်ပါတယ် သဖန်းသီး။ 1c။ အသုံးပြုတဲ့အခြေအနေများအောက်တွင်ကျနော်တို့ယေဘုယျအားဖြင့်အခြားအတံဆိပ်ကပ်အာရုံခံထံမှမဆိုထပ် dendrites မပါဘဲတံဆိပ်ကပ်အာရုံခံလေ့လာသည်။ ပိုမိုမြင့်မားချဲ့မှာ dendritic ကျောရိုးအပါအဝင်အသေးစိတ် dendritic shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်, (လေ့လာတွေ့ရှိနိုင်သဖန်းသီး။ 1d).
ကျနော်တို့ထို့နောက် (တွေ့မြင်တစ်ရှူး permeabilization ဘို့ဆပ်ပြာတစ်ဦးအနိမ့်အာရုံစူးစိုက်မှုကို အသုံးပြု. ဖြစ်နိုင်ခြေကိုဖန်ဆင်းခဲ့သော Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP Transgene ကြွက်ဖြစ်စေများတွင် GFP များအတွက် DiI တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့် immunohistochemistry ပေါင်းစပ်အသုံးပြုခဲ့ နည်းလမ်းများ) ။ MSNs ၏ဆဲလ်အသေကောင်အတွက် DiI အစွန်းအထင်းများနှင့် GFP ထုတ်ဖော်သတိထားနှိုင်းယှဉ်မှတဆင့်ကျနော်တို့ DiI- နှင့် GFP-အပြုသဘောသို့မဟုတ် Drd1-EGFP အတွက် DiI-အပြုသဘောနှင့် GFP-အနုတ်လက္ခဏာအာရုံခံ (identify နိုင်သဖန်းသီး။ 2a) သို့မဟုတ် Drd2-EGFP (သဖန်းသီး။ 2b) ကြွက်။ အောက်ပါလေ့လာမှုများအဘို့, သာ DiI- နှင့် Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP ကြွက်တွေကနေ GFP-အပြုသဘောအာရုံခံအတွက် dendritic shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ။
နာတာရှည်ကင်းကုသမှုဖြစ်စေ Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP ဖော်ပြ. Accumbal MSNs အတွက်တိုးမြှင့်ကျောရိုး Density အတွက်ရလဒ်များ။
Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP ကြွက် (တွေ့မြင်လေးပတ်ဆက်တိုက်အဘို့ကိုကင်း (30 mg / kg) သို့မဟုတ်ဆားနှင့်အတူအကြိမ်ကြိမ်ထိုးသွင်းခဲ့ကြ နည်းလမ်းများ) ။ နှစ်ရက်ကနောက်ဆုံးမူးယစ်ဆေးဝါးကုသမှုပြီးနောက် (2WD) သို့မဟုတ် 30 ရက်ပေါင်း (30WD), အထက်တွင်ဖော်ပြခဲ့သကဲ့သို့ဦးနှောက် DiI တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့် immunohistochemistry များအတွက်လုပ်ငန်းများ၌ခဲ့ကြသည်။ တစ်ဦးကယခင်လေ့လာမှုစိတ်ကြွဆေးနှင့်အတူနာတာရှည်ကုသမှု NACC အတွက် MSNs ၏ distal သော်လည်းမ Proximity dendrites (အပေါ်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆတိုးမြှင့်ကြောင်းအစီရင်ခံ35) ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် terminal ကိုဒေသများတွင်အပါအဝင် distal dendrites (ဆိုလိုသည်မှာ, ဒုတိယသို့မဟုတ်တတိယယူမှုကိုအကိုင်းအခက်နှင့်အတူသူတို့အား), ငါတို့၏ကိုယ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာကန့်သတ်။ 2WD မှာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည့်အခါကျောရိုးသိပ်သည်းဆ Drd1-EGFP-အပြုသဘော MSNs (ဆားအုပ်စု 128%) (ခုနှစ်တွင်တိုးမြှင့်ဖို့ရှာတွေ့ခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 3a နှင့် c) နှင့် Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (ဆားအုပ်စု 115%) (တစ်ဦးပြောင်အတိုင်းအတာအထိသဖန်းသီး။ 3 b နှင့် d) ။ 30WD ပြီးနောက်တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆ (Drd1-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (ဆားထိန်းချုပ်မှု 118%) ထဲမှာထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 3 a နှင့် c) သော်လည်းမ Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံအတွက် (သဖန်းသီး။ 3 b နှင့် d).
dendritic ကျောရိုး၏ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်သူတို့၏အရှည်နှင့်ကျောရိုးဦးခေါင်းရဲ့ width ၏စည်းကမ်းချက်များ၌ variable ကိုဖြစ်ပါတယ်။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် (Data ပြမပါ) ကိုကင်းကနေ 2WD မှာလေးကျောရိုးအတန်း (ပေးသော Stubby, မှို, ပါးလွှာနှင့် filopodia) သို့ dendritic protrusions ခွဲခြား။ မှို-type အမျိုးအစားများ၏သိပ်သည်းဆ (119.7 ± 4.0%, P <0.01) နှင့်ပါးလွှာသောကျောရိုး (120.0 ± 3.4%, P <0.01) Stubby ၏သိပ်သည်းဆ (1 ± 182.4%, သော်လည်း, Drd21.6-EGFP- အပြုသဘော MSNs အတွက်ကိုကင်းကုသမှုအားဖြင့်တိုးမြှင့်ခဲ့သည်, P <0.05) နှင့်မှိုကျောရိုး (122.5 ± 5.0%, P <0.01) Drd2-EGFP- အပြုသဘော MSNs အတွက်တိုးမြှင့်ခဲ့သည်။ Drd1-EGFP- အပြုသဘောအာရုံခံသို့မဟုတ် Drd2-EGFP- အပြုသဘောအာရုံခံအတွက်ပါးလွှာကျောရိုး၏ stubby ကျောရိုးမရှိသိသိသာသာတိုးရှိခဲ့သည်။
Drd1-EGFP- သို့မဟုတ် NACC အတွက် Drd2-EGFP-အပြုသဘောဆောင်သော MSNs အတွက်နာတာရှည်ကင်းသွေးဆောင်ΔFosB Expression ။
ΔFosBကူးယူအချက်များ၏ Fos မိသားစုအဖွဲ့ဝင်တစ်ဦးဖြစ်ပါတယ်။ ကိုကင်း၏စူးရှသောအုပ်ချုပ်ရေး NACC အတွက်အများအပြား Fos isoforms တစ်ဦးလျှင်မြန်ခြင်းနှင့်ယာယီသော induction induces သွားရမည်အကြောင်း, ကင်းဖို့ထပ်ခါထပ်ခါထိတွေ့ခြင်းΔFosBများ၏အဆင့်ကိုတိုးပွားစေပါသည်။ ထိုမှတပါး, ΔFosBစကားရပ်ထဲမှာတိုးမူးယစ်ဆေးထိတွေ့မှု၏ပြတ်တောက်ပြီးနောက်လပတ် NACC အတွက်ဆက်ရှိနေသေးနှင့် (မူးယစ်ဆေးဆည်းပူးနေတာတွေရပ်စဲပင်ပြီးနောက်, မျိုးဗီဇထုတ်ဖော်ကြာရှည်စည်းမျဉ်းများတွင်ပါဝင်ပတ်သက်ခံရဖို့အကြံပြုထားသည်29, 39, 40).
ကိုကင်းကုသမှုအောက်ပါ Drd1-EGFP သို့မဟုတ် Drd2-EGFP ကြွက်တွေကနေ NACC အတွက်ΔFosB၏ induction ဆနျးစစျဖို့, ကျနော်တို့ (နှစ်ဆတံဆိပ်ကပ်ခြင်းအားဖြင့် FosB နှင့် GFP စကားရပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသဖန်းသီး။ 4 နှင့် စားပွဲတင် 1က) Anti-FosB antibody ကို FosB ၏ပုံစံအားလုံးကိုအသိအမှတ်ပြုပေမယ့်ကျနော်တို့ကတိုးမြှင့် immunostain ΔFosB (တွေ့မြင်ကိုယ်စားပြုယူဆ နည်းလမ်းများ ) နောက်ထပ်ဆွေးနွေးမှုသည်။ ဆား-ကုသကြွက်များတွင် Drd16-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 1% နှင့် Drd15-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 2% (အတော်လေးအားနည်းနေပြင်းထန်မှုနှင့်အတူ FosB immunoreactivity ထုတ်ဖော်ပြောဆိုသဖန်းသီး။ 4 a နှင့် b နှင့် စားပွဲတင် 1) ။ 2WD အားဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်ထပ်ခါတစ်လဲလဲကင်းကုသမှုΔFosB coexpressed ကြောင်း Drd1-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (GFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 55%) (များ၏အရေအတွက်သိသိသာသာတိုးမှုသဖန်းသီး။ 4c နှင့် စားပွဲတင် 1) ။ ΔFosBစကားရပ်များတွင်တစ်ဦးကသေးငယ်ပေမယ့်နေဆဲသိသိသာသာတိုး Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (GFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 25%) (၌တွေ့သဖန်းသီး။ 4d နှင့် စားပွဲတင် 1) ။ ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက်အပြောင်းအလဲများနှင့်အတူအမျှΔFosB၏တိုးလာစကားရပ်သော်လည်းမ Drd1-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (GFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 46%) နောက်မှာ Drd2-EGFP-အပြုသဘောအာရုံခံ (GFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏ 15%) ထဲမှာထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည် 30WD (သဖန်းသီး။ 4 e နှင့် f နှင့် စားပွဲတင် 1) ။ တိုးမြှင့ΔFosBစကားရပ်များတွင်ကြည့်ရှုလေ့လာသတိပြုပါ သဖန်းသီး။ 4f Drd2-EGFP-အနုတ်လက္ခဏာအာရုံခံအတွက်လက်ဆောင်ဖြစ်ပါတယ်။
ဆွေးနွေးမှု
dopaminergic neurotransmission အတွက်ကြာရှည်အလိုက်သင့်ပြောင်းလဲနေထိုင် psychostimulant မူးယစ်ဆေးဝါးများနှင့်အတူဆက်နွယ်စွဲလမ်းအပြုအမူတွေကိုအခြေခံယုံကြည်နေကြသည်။ အထူးသဖြင့်, NACC အတွက် MSNs ၏ dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက် psychostimulant-သွေးဆောင်တိုး (Synaptic ဆက်သွယ်မှု၏ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းဆက်စပ်ခံရဖို့တွေးဆခဲ့ကြ30) ။ အဆိုပါ NACC အကြီးအကျယ် D1 သို့မဟုတ် D2 ဖြစ်စေ dopamine receptors ၏မြင့်မားဖော်ပြ MSNs နှစ်ခုကွဲပြား subpopulations ဖွဲ့စည်းထားတာဖြစ်တယ်။ ပစ္စုပ္ပန်လေ့လာမှုတှငျကြှနျုပျတို့နာတာရှည်ကင်းကုသမှုပြီးနောက် NACC အတွက်ကွဲပြား D1 သို့မဟုတ် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs အတွက်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါပြီ။ ရလဒ်တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆပိုင်းတွင် D1 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs နှင့် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs ထဲတွင်ဖြစ်ပေါ်ပေမယ့်အကြောင်း, ပြပွဲရရှိသော, ပြောင်းလဲကျောရိုးသိပ်သည်းဆသာ D1-receptor ပါဝင်သောအာရုံခံအတွက်တည်ငြိမ်ဖြစ်ပါတယ်။ ထို့အပြင်ကျနော်တို့ D1 အတွက်ကူးယူအချက်ΔFosB၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးပြောင်းလဲမှုများနှင့် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs ၏အလားတူပုံစံကိုရှာပါ။
ဤရွေ့ကားလေ့လာမှုများ D1 သို့မဟုတ် D2 အဲဒီ receptor ကမကထဖြစ်စေ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် MSNs ၏တိကျသော subpopulations အတွက် GFP ဖော်ပြကြောင်း BAC Transgene ကြွက်၏အသုံးပြုမှုကိုဖန်ဆင်းတော်မူ၏။ ထို့အပြင်ကျနော်တို့ DiI သုံးပြီးအာရုံခံ၏ပဲ့ထိန်းတပ်တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့်အတူ GFP များအတွက် immunohistochemistry ပေါင်းစပ်တဲ့ကို double-တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနည်းလမ်းကိုတီထွင်ထုတ်လုပ်နိုင်ခဲ့သည်။ ယခင်လေ့လာမှုများ (ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအပေါ် psychostimulants ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာဖို့ Golgi-ကော့နည်းလမ်းကိုအသုံးပြုခဲ့ကြပါပြီ34), ဒီမှာအသုံးပြုသော DiI နည်းလမ်း quantitative နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ရလဒ်များကိုအပ်ပေးတော်မူ၏။ Golgi အစွန်းအထင်း immunohistochemistry နှင့်သဟဇာတမဖြစ်ဘာဖြစ်လို့လဲဆိုတော့ကျနော်တို့ကို double-တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနည်းလမ်းကိုတီထွင်ထုတ်လုပ်နိုင်ခဲ့သည်။ Immunostaining များသောအားဖြင့်, ဆပ်ပြာနှင့်အတူပုံမှန်အား (ထိုအမြှေးပါးကနေ lipophilic ဆိုးဆေးများ၏ solubilization မှဦးဆောင်မယ့်လုပ်ငန်းစဉ်သည်တစ်သျှူး permeabilization လိုအပ်ပါတယ်38) ။ သို့သော်ကျွန်ုပ်တို့၏လက်ရှိလေ့လာမှုများအတွက် GFP immunostaining တစ်ရှူး permeabilization ဘို့ဆပ်ပြာ၏မြင့်မားသောအာရုံစူးစိုက်မှုမလိုအပ်ခဲ့ပါဘူးနှင့်အရှင် lipophilic ဆိုးဆေးတံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့် တွဲဖက်. အသုံးပြုနိုင်မည်ဖြစ်သည်။ GFP cortex အတွက်အာရုံခံ၏တိကျသောလူဦးရေအတွက်ထုတ်ဖော်ပြောဆိုသည်အဘယ်မှာရှိ BAC Transgene ကြွက်လိုင်းများခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတွက်အသုံးပြုသည့်အခါကျွန်ုပ်တို့၏ကို double-တံဆိပ်ကပ်နည်းလမ်း (ဥပမာ, dendritic ကျောရိုးအတွက်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာအပြောင်းအလဲများလေ့လာမှုများအဘို့ယေဘုယျအားဖြင့်အသုံးဝင်သောဖြစ်သင့်36).
နေဆဲအတန်ငယ်အငြင်းပွားဖွယ်သော်လည်း D1 နှင့် D2 receptors တိုက်ရိုက် (striatonigral) နှင့်အသီးသီးသွယ်ဝိုက် (striatopallidal) striatal projection အာရုံခံ, (ရန်အကြီးအကျယ်ခန္ဓာဗေဒအသားအရောင်ခွဲခြားဖြစ်ကြောင်းယုံကြည်17, 41) ။ အဆိုပါ Drd1-EGFP နှင့် Drd2-EGFP ကြွက်တွေမှာ GFP များ၏ဒေသခံများ၏ကနဦးစရိုက်လက္ခဏာတွေ (ဒီနိဂုံးချုပ်နှင့်ကိုက်ညီခဲ့သည်36) ။ ထို့အပြင် Drd1-EGFP ထံမှ NACC အတွက် GFP-အပြုသဘောအာရုံခံ၏နံပါတ်နှင့် Drd2-EGFP ကြွက်ကျွန်တော်တို့ရဲ့ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ≈50-1% သာ D35 receptors ဖော်ပြကြောင်း, MSNs ၏≈40% သာ D2 receptors ဖော်ပြကြောင်းနိဂုံးတွေနဲ့ကိုက်ညီဖြစ်ပါသည်, နှင့်≈10-15% coexpress D1 နှင့် D2 နှစ်ဦးစလုံး receptors သော။ coexpression ဒီတန်ဖိုး (mRNAs ခွဲထုတ်နှင့်များကိုချဲ့ထွင်ရန် RT ကို-PCR နည်းစနစ်နှင့်အတူတစ်ခုတည်းသော striatal အာရုံခံ၏ patch ကို-ညှပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပေါင်းစပ်ကြောင်း dorsal striatum (enkephalin နှင့်ပစ္စည်းဥစ္စာ P ကို၏≈17% coexpression) ၏လေ့လာမှုများအားဖြင့်ဆိုလိုကြောင်းဆင်တူသည်42) ။ ဒါဟာကျွန်တော်တို့ရဲ့လက်ရှိလေ့လာမှုများ D3, D4 နှင့် D5 receptors ၏စကားရပ်၏မေးခွန်းကိုဖြေရှင်းကြဘူး, မသူတို့ D1 receptors သို့မဟုတ်အပြန်အလှန်၏မြင့်မားဖော်ပြ MSNs အတွက် D2 receptors ၏စကားရပ်၏အနိမ့်အဆင့်ဆင့်၏ပြဿနာဖြေရှင်းမသတိပြုသင့်ပါတယ်။
အများအပြားကယခင်လေ့လာမှုများ psychostimulant-သွေးဆောင် Fos စကားရပ်နှင့် D1 နှင့် D2 receptors (၏အခန်းကဏ္ဍကို၏အာရုံခံမူပြောင်းခြင်းလေ့လာခဲ့ကြ43-45) ။ သူများသည်လေ့လာမှုများ Fos နှင့်ΔFosBသော induction D1 receptors ၏ activation ကကမကထပြုခဲ့သောကောက်ချက်ထောက်ခံခဲ့ကြသည်။ သို့သော် Fos စကားရပ်၏ဆယ်လူလာမူပြောင်းခြင်း (psychostimulant မူးယစ်ဆေးဝါးများအုပ်ချုပ်ထားတဲ့အတွက်သဘာဝပတ်ဝန်းကျင်အခြေအနေတွင်လွှမ်းမိုးမှုဖြစ်ပါတယ်46, 47) ။ ဥပမာအားဖြင့်, အိမ်လှောင်အိမ်ထဲမှာပေးထားတဲ့စိတ်ကြွဆေးသို့မဟုတ်ကင်း D1 receptors coexpress ကြောင့်ပစ္စည်းဥစ္စာ, P-အပြုသဘောဆဲလ်တွေအတွက်ဦးစား (Fos အပါအဝင်) ချက်ချင်းအစောပိုင်းမျိုးဗီဇဖြစ်ပေါ်သည်။ တစ်ဝတ္ထုပတ်ဝန်းကျင်တွင်အုပ်ချုပ်ခွင့်ရသောအခါမတူဘဲဤမူးယစ်ဆေးဝါးများကိုနှစ်ဦးစလုံး D1 နှင့် D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs အတွက် Fos စကားရပ်သွေးဆောင်နိုင်ပါတယ်။ ကျွန်တော်တို့ရဲ့လက်ရှိလေ့လာမှုများအတွက်အသုံးပြုတဲ့ protocol ကိုတစ်ဝတ္ထုပတ်ဝန်းကျင်နှင့်ထိတွေ့နှင့်အတူမူးယစ်ဆေးဝါးဆေးထိုးချိတ်တွဲမပါဝင်ခဲ့ချေ။ သို့သျောကြှနျုပျတို့ D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သော MSNs အတွက်ΔFosBစကားရပ်များအတွက်တာဝန်ရှိကြောင်းစကားစပ်-မှီခိုစိတ်ဖိစီးမှုအချို့ကိုမျိုးထွက်မအုပ်စိုးလို့မရပါဘူး။
ပစ္စုပ္ပန်ရလဒ်တစ်ဦးကမှတ်သားလောက်အင်္ဂါရပ်တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆနှင့်ΔFosBစကားရပ်၏အပြိုင်ပုံစံဖြစ်ခဲ့သည်။ တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆနှင့်ΔFosBစကားရပ်ပိုင်းတွင် Drd1-EGFP နှင့် Drd2-EGFP ဖော်ပြ MSNs အတွက်ဖြစ်ပွားခဲ့သည်။ သို့သော်ဤအပြောင်းအလဲများသာ D1 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံအတွက်တည်ငြိမ်ခဲ့ကြသည်။ ကျောရိုးသိပ်သည်းဆနှင့်ΔFosBစကားရပ်တိုးပွားလာသောလေ့လာရေးအဘို့တစ်ခုမှာဖြစ်နိုင်သောရှင်းပြချက်ယာယီ D2 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံ၌တွေ့ဒီ D1 နှင့် D2 နှစ်ဦးစလုံး dopamine receptors coexpress ကြောင်း MSNs ၏သေးငယ်တဲ့အစိတ်အပိုင်းအတွက်ဖြစ်ပွားခဲ့သည်သောကွောငျ့ဖွစျသညျ။ ထို့ကြောင့်ဤတိုး၏ယာယီသဘာဝ (D2-မှီခိုအချက်ပြလမ်းကြောင်းအပေါ် D1 အဲဒီ receptor activation ၏ရန်သက်ရောက်မှုနှင့်အတူဆက်နွယ်စေခြင်းငှါ48) ။ ဒါဟာΔFosB၏တည်ငြိမ်မှုကိုသြဇာလွှမ်းမိုးဖို့ D2 အဲဒီ receptor-မှီခိုအချက်ပြလမ်းကြောင်းများ၏စွမ်းရည်ကိုထင်ဟပ်စေခြင်းငှါအရာ, ကျောရိုးသိပ်သည်းဆနှင့်ΔFosBစကားရပ်အတွက်အပြောင်းအလဲများကို Reversible လုပ်ခဲ့အကျိုးစီးပွားဖြစ်ပါတယ်။
အပြိုင်ΔFosB၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးပြောင်းလဲမှုများနှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆရှိပါတယ်အဆိုပါလေ့လာရေးΔFosBကနဦးဖွဲ့စည်းရေးနှင့် NACC အတွက် D1 အဲဒီ receptor ပါဝင်သောအာရုံခံအတွက် dendritic ကျောရိုး၏နောက်ဆက်တွဲပြုပြင်ထိန်းသိမ်းမှုအတွက်ပါဝင်ပတ်သက်ကြောင်းစိတ်ကူးနှင့်ကိုက်ညီသည်။ ΔFosB၏ expression (MSNs အတွက် D1 / DARPP-32 / PP1-မှီခိုအချက်ပြလမ်းကြောင်းကထိန်းချုပ်ထားတာဖြစ်ပါတယ်49) ။ အများအပြားကလေ့လာမှုများ (ΔFosB psychostimulants ၏အကြိုးနှင့် locomotor-ကိုသက်ဝင်လုပ်ရပ်များအတွက်အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍကြောင်းပြသကြ39), neurotransmitter receptors ပါဝင်သည်ကြောင်းမျိုးစုံမျိုးဗီဇ၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးလွှမ်းမိုးပရိုတိန်းအချက်ပြများနှင့်အာရုံခံ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းများတွင်ပါဝင်ပတ်သက်ပရိုတိန်းများကဖွယ်ရှိ (50) ။ သို့သော်နာတာရှည်ကင်း-သွေးဆောင်ကျောရိုးဖွဲ့စည်းရေးတွင်ပါဝင်ပတ်သက်သည့်တိကျသောမော်လီကျူးယန္တရားများသည်လက်ရှိတွင်လူသိများကြသည်မဟုတ်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုများကို (Cdk5 inhibitor ၏ intraaccumbal ပြုတ်ရည်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက် attenuated ကင်း-သွေးဆောင်တိုး roscovitine ကြောင်းပြသကြ51) ။ ထိုမှတပါး, Cdk5 ΔFosBတစ်မြစ်အောက်ပိုင်းပစ်မှတ်မျိုးဗီဇဖြစ်ပါတယ်နှင့် (နာတာရှည်ကင်းကုသမှုနှင့်ဆက်စပ်အစားထိုးသပ္ပါယ်အပြောင်းအလဲများအတွက်ပတ်သက်သည်ဟုယူဆရထားပြီး52) ။ ထို့ကြောင့်, Cdk5-မှီခို phosphorylation အတွက်အပြောင်းအလဲတချို့ကင်း-သွေးဆောင်ကျောရိုးဖွဲ့စည်းရေးနှင့် / သို့မဟုတ်ကျောရိုးတည်ငြိမ်ရေးကိုအခြေခံတဲ့ယုတ္တိတန်သည်ဟုဆိုရမည်ယန္တရားဖြစ်ပါတယ်။ PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), နှင့် spinophilin (56) (Cdk5 များအတွက်အလွှာဖြစ်ကြပြီးအားလုံးကျောရိုး morphogenesis ၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းများတွင်ပါဝင်ပတ်သက်နေကြသည်57-60) ။ ကျောရိုးတွင်ဤနှင့်အခြား Cdk5 အလွှာ၏နောက်ထပ်စရိုက်လက္ခဏာတွေမျှော်လင့် psychostimulants အားဖြင့်ကျောရိုးဖွဲ့စည်းခြင်းစည်းမျဉ်းများတွင်ပါဝင်ပတ်သက်သည့်ယန္တရားများအပေါ်အလင်းကိုသွန်းပါလိမ့်မယ်။
နည်းလမ်းများ
တိရိစ္ဆာန်များ။
ဖြစ်စေအဆိုပါ D1 သို့မဟုတ် D2 dopamine receptors များ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင်တစ်ဦး EGFP Transgene တင်ဆောင်လာသောကြွက် (အ Gensat BAC Transgene စီမံကိန်းကြောင့်ထုတ်လုပ်ပြီးခဲ့ကြသည်36) ။ ဒီလေ့လာမှုမှာအသုံးပြုတဲ့ Transgene ကြွက်ဟောင်း 4-5 ရက်သတ္တပတ်ခဲ့ကြသည်နှင့်ဆွစ်ဇာလန်-Webster နောက်ခံပေါ်တွင်ရှိကြ၏။ 12-ဇအလင်း / မှောင်မိုက်သံသရာနှင့်အစားအစာနှင့်အမရရှိနိုင်ပါရေကြော်ငြာ libitum နှင့်အတူ 12-2 အုပ်စုများ၌ကျိန်းဝပ်: ကြွက်တစ်ဦး 5 အတွက်ထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။ အားလုံးတိရိစ္ဆာန် protocols များဓာတ်ခွဲခန်းတိရစ္ဆာန်များ၏စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုများအတွက်ကျန်းမာရေးလမ်းညွှန်အမျိုးသား Institutes နှင့်အညီရှိကြ၏နှင့် Rockefeller တက္ကသိုလ် Institutional တိရိစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုကော်မတီကအတည်ပြုပေးခဲ့သည်။
မူးယစ်ဆေးကုသမှု။
သာအတွက်နာတာရှည်ကင်းကုသမှု (30 နေ့စဉ် / ကီလိုဂရမ် mg) (15 / ကီလိုဂရမ် mg) ကြွက်အနေဖြင့် NACC ၏ core နဲ့ shell ကိုနှစ်ဦးစလုံးအတွက် MSNs ၏ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက်ခိုင်မာတဲ့တိုး, ဒါပေမယ့်နိမ့်ထိုးထုတ်လုပ်ရန်အစီရင်ခံခဲ့သည်တိုးမြှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆ shell ကို (61) ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် NACC နှစ်ခုစလုံးအစိတ်အပိုင်းများအတွက်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာပြုပြင်မွမ်းမံသွေးဆောင်ဖို့ကိုကင်းများ၏ပိုမိုမြင့်မားထိုးကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ကြွက် 30 ဆေးထိုး-အခမဲ့ရက်ပေါင်းအားဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်, 5 ရက်ဆက်တိုက်နေ့တိုင်း 2 မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl (သို့မဟုတ်ဆား) ၏တဦးတည်းထိုး (ip) ကိုလက်ခံရရှိ, ဤလုပ်ထုံးလုပ်နည်း 4 ဆက်တိုက်ပတ်ထပ်ခါတလဲလဲခဲ့သည်။ ထိုးအိမ်လှောင်အိမ်ထဲမှာထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့ကြသည်။ 2WD သို့မဟုတ် 30WD, mouse ကိုဦးနှောက် DiI တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့် / သို့မဟုတ် immunohistochemistry များအတွက်လုပ်ငန်းများ၌ခဲ့ကြသည်။
အဆိုပါအလင်းပြန်မှုဆိုးဆေး DiI နှင့်အတူ ballistic တံဆိပ်ကပ်ခြင်း။
80 / ကီလိုဂရမ်ဆိုဒီယမ် pentobarbital mg နှင့် PBS ၏ 5 ml နှင့်အတူ transcardially perfused, PBS အတွက် 40% paraformaldehyde (4 ml / မိနစ်) ၏ 20 ml နှင့်အတူလျင်မြန်စွာ perfusion အားဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်နဲ့အတူကြွက် anesthetized ခဲ့ကြသည်။ ဦးနှောက်ကိုလျင်မြန်စွာဦးခေါင်းခွံကနေဖယ်ရှားခြင်းနှင့် 4 မိဘို့ 10% paraformaldehyde အတွက် postfixed ခဲ့ကြသည်။ ref ထဲမှာဖော်ပြထားတဲ့အတိုင်းဦးနှောက်အချပ် (100 μm) ချောင်းဆိုးဆေး DiI (Molecular စုံစမ်းစစ်ဆေး) ၏ပဲ့ထိန်းတပ်ပေးပို့နေဖြင့်တံဆိပ်ကပ်ခဲ့သည်။ 38။ တစ်ဦးကပေါင်းစပ် DiI တံဆိပ်ကပ်-immunohistochemistry နည်းလမ်းဆပ်ပြာတစ်ဦးအနိမ့်အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့်အတူဖွံ့ဖြိုးခဲ့သည်။ DiI-label တပ်ထားသောကဏ္ဍများ 0.01 မိဘို့ PBS အတွက် 100% ထရီ X-15 နှင့်အတူ permeabilized ပြီးတော့ 0.01 ဇ nonspecific တံဆိပ်ကပ် minimize ရန်အဘို့အ PBS အတွက် 100% ထရီ X-10 နှင့် 1% ပုံမှန်ဆိတ်သငယ်ကိုသွေးရည်ကြည်နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ တစ်သျှူးအပိုင်းထို့နောက်အခန်းအပူချိန်မှာ 1 ဇများအတွက် 0.01% ပုံမှန်ဆိတ်သငယ်ကိုသွေးရည်ကြည် / 100% ထရီ X-2 နဲ့ anti-GFP antibody ကို (Abcam, ကင်းဘရစ်, MA) နဲ့နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးဆေးကြောပြီး 1 နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်: FITC- ၏ 1,000 dilution conjugation အလယ်တန်း antibody ကို (Molecular စုံစမ်းစစ်ဆေး) ။ ကဏ္ဍများဏုဆလိုက်ပေါ်မှာနေရာချစကာနှင့် mounting အလတ်စားနှင့်အတူ coverslipped ခဲ့ကြသည်။ (အဆိုပါပဲ့ထိန်းတံဆိပ်ကပ်ခြင်းနည်းလမ်း dendritic ကျောရိုးဖွဲ့စည်းပုံ၏အသေးစိတ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခွင့်ပြုခဲ့နှင့်ရရှိသောရလဒ်များသည်ကြွက်ဦးနှောက်အချပ်အတွက် Golgi-ကော့ impregnation နည်းလမ်းကိုသုံးပြီးသှေးနှင့် quantitative ယခင်လေ့လာမှုများနှင့်အတူနှိုင်းယှဉ်ခဲ့ကြသည်34) ။ သို့သော်ယခင်လေ့လာမှုများမှမတူဘဲ, ငါတို့ခဲ DiI-စွန်းအာရုံခံနှစ်ခုခေါင်းနှစ်လုံးကျောရိုးလေ့လာသည်။ ဤသည်ခြားနားချက်ကြွက်တစ်ရှူးနှိုင်းယှဉ်အစွန်းအထင်းနည်းလမ်းများသို့မဟုတ် mouse ကို (ဒီလေ့လာမှု) ၏အမျိုးမျိုးပြောင်းလဲများ၏ sensitivity ကိုကြောင့်ဖြစ်ရတဲ့စေခြင်းငှါ (34).
Immunohistochemistry ။
အထက်တွင်ဖော်ပြထားသကဲ့သို့တိရစ္ဆာန်များ anesthetized နှင့် perfused ခဲ့ကြသည်။ ဦးနှောက်ကိုဖယ်ရှားခြင်းနှင့် 4 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ 4% paraformaldehyde အတွက်နေ့ချင်းညချင်းသိမ်းဆည်းထားခဲ့ကြသည်။ ဦးနှောက် cryoprotection များအတွက် PBS ဖြေရှင်းချက်ထဲမှာ% sucrose 30 ပြောင်းရွှေ့ခံခဲ့ရသည်။ မှု Coronal အပိုင်း (12 μm) တစ်ခဲ microtome (Leica) အပေါ်ဖြတ်ပြီးတော့ immunohistochemistry များအတွက်လုပ်ငန်းများ၌ခဲ့ကြသည်။ ဦးနှောက်အပိုင်းထို့နောက် 0.3 မိဘို့ PBS အတွက် 100% ထရီ X-15 အတွက် permeabilized နှင့် PBS အတွက်နှစ်ကြိမ်နှင့်ဆေးခဲ့သည်။ အဆိုပါကဏ္ဍများ, 10 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ 1 ဇများအတွက် PBS အတွက် 37% ပုံမှန်ဆိတ်သငယ်ကိုသွေးရည်ကြည်အတွက် preincubated 1 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာနေ့ချင်းညချင်း (PBS အတွက် 4% ပုံမှန်ဆိတ်သငယ်ကိုသွေးရည်ကြည်ထဲမှာရောလျက်) မူလတန်းပဋိထိတွေ့, ပြီးတော့ PBS နှင့်ဆေးနှင့်အလယ်တန်းနှင့်အတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည် 1 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ 37 ဇဘို့ပဋိ။ အောက်ပါပဋိအသုံးပြုခဲ့ကြသည်: ယုန် Anti-ဒယ်အိုး-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz ဇီဝနည်းပညာ), mouse ကိုဆန့်ကျင် NeuN (Chemicon), ယုန် Anti-GFP, FITC-conjugation Anti-ယုန် IgG နှင့် rhodamine- conjugation Anti-mouse ကို IgG (Molecular စုံစမ်းစစ်ဆေး) ။ သုံးဆတံဆိပ်ကပ်ခြင်း (ΔFosB, NeuN နှင့် GFP) အတွက်, ဦးနှောက်အပိုင်းပထမဦးဆုံးဆန့်ကျင်ဒယ်အိုး FosB antibody ကိုနဲ့ anti-NeuN antibody ကိုအတူ immunostained ခဲ့ကြသည်ပြီးတော့အလယ်တန်းပဋိ (rhodamine-conjugation Anti-ယုန် IgG နှင့်စိမ်းပြာရောင်-conjugation Anti-mouse ကို IgG နှင့်အတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီး ) ။ double-စွန်းဦးနှောက်အပိုင်းနောက်ထပ် GFP တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနည်းပညာ (Zenon Alexa fluor 488, Molecular စုံစမ်းစစ်ဆေး) Zenon သုံးပြီး immunostaining များအတွက်လုပ်ငန်းများ၌ခဲ့ကြသည်။ Anti-ဒယ်အိုး-FosB antibody ကို FosB များ၏ N ကို terminus မှထမြောက်တော်မူခြင်းနှင့်ΔFosBနှင့် Full-အရှည် FosB (အသိအမှတ်ပြုခဲ့သည်62) ။ ΔFosBပေမယ် FosB သို့မဟုတ်အခြား Fos-related antigen stably နာတာရှည်ကင်းကုသမှုအပြီးတွင်ထုတ်ဖော်ပြောသည်ကိုမပြယခင်လေ့လာမှုများအပေါ်အခြေခံပြီးကျနော်တို့ immunoreactivity အတွက်အချိန်ကြာမြင့်စွာတည်မြဲတိုးΔFosB၏တည်ငြိမ်စကားရပ်ကိုကိုယ်စားပြုတယ်လို့ထင်မြင်ယူဆပါတယ်။ သို့သော်ဆား-ကုသကြွက်များတွင်လေ့လာတွေ့ရှိသည့် immunoreactive FosB signal ကို၏ဝိသေသလက္ခဏာမသိနိုင်ပါဘူး။ အတွက်စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ စားပွဲတင် 1 ကျောင်းသားရဲ့အကိုအသုံးပြု t စမ်းသပ်။
Dendritic ကျောရိုးအားသုံးသပ်ခြင်း။
အဆိုပါ NACC အတွက်တစ်ဦးချင်း MSNs အများအပြားစံပေါ်တွင်အခြေခံကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာဘို့ရွေးကောက်ခံခဲ့ရသည်။ (i) ကွဲပြားခြားနားသောဆဲလ်ကနေဖြစ်စဉ်များရောထွေးမရမယ်လို့သေချာစေရန်နဲ့အခြားတံဆိပ်ကပ်ဆဲလ်တွေနှင့်အတူအနည်းငယ်မျှသာသို့မဟုတ်လုံးဝမထပ်ရှိခဲ့သည်။ (ii) အနည်းဆုံးသုံးမူလတန်း dendrites ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတွက်အသုံးပြုခံရဖို့ဆဲလ်များအတွက်မြင်နိုင်ဖို့လိုအပ်ခဲ့ပါတယ်။ (iii) Distal dendrites (terminal dendrites သို့မဟုတ် terminal dendrite နှင့်နီးစပ်သော) ကိုစစ်ဆေးခဲ့သည်။ NAcc ၏အဓိကနှင့် shell အတွင်းရှိ MSN နှစ်မျိုးလုံးမှ Dendrites များကိုဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ ကျဉ်းမြောင်းသော spined MSNs (spiny type II) ကိုကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ရသော်လည်းကျွန်ုပ်တို့သည် spines အလွန်ကျောရိုး MSNs (spiny type I) ကိုသာဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကိုတွက်ချက်ရန် dendrite (> 20 μm length) အရှည်ကို confocal microscope (Zeiss LSM 510) ကိုဆီနှစ်မြှုပ်ခြင်းမှန်ဘီလူး (× 40) ဖြင့်အသုံးပြုသည်။ dendrites အားလုံးပုံရိပ်တွေကွဲပြားခြားနားမှာယူခဲ့ပါတယ် z အဆင့်ဆင့် (0.5-1 μmနက်ရှိုင်းကြားကာလ) dendritic ကျောရိုး၏ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်ဆန်းစစ်ရန်။ အားလုံးတိုင်းတာအသွင်ပြောင်း image ကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ software ကို (Universal Imaging, Downingtown, PA) နဲ့လုပ်ခဲ့ကြသည်။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည့် Kolmogorov-Smirnov စမ်းသပ်အသုံးပြုခဲ့ပါတယ်။
refs ထဲမှာဖော်ပြထားတဲ့အတိုင်း dendrites ထံမှ Protrusions သူတို့၏အရှည်ပေါ်အခြေခံပြီးလေးအမျိုးအစားများသို့ခွဲခြားခဲ့ကြသည်။ 63 နှင့် 64။ Stubby protuberances ဟုလည်းခေါ်သောအတန်း ၁ မှထွက်သောအတန်းများသည်အရှည် <1 μm ရှိ၍ ကျောရိုးခေါင်းကြီးလဲမ ရှိ၍ လည်ပင်းလည်းရှိသည်။ အတန်းအစား (၂) သို့မဟုတ်မှိုပုံစံကျောရိုးများသည် ၀.၅ မှ ၁.၂၅ မီလီမီတာအကြားရှိပြီးလည်ပင်းတိုနှင့်ကျောရိုးကြီးမားသောခေါင်းအားဖြင့်သွင်ပြင်လက္ခဏာရှိသည်။ Class 0.5 (သို့) ပါးလွှာသောကျောရိုးများသည် ၁.၂၅ မှ ၃.၀ မီလီမီတာကြားရှိပြီးကျောရိုးလည်ပင်းရှည်များကို ဦး ခေါင်းငယ်များနှင့်အတူ; class 2, ဒါမှမဟုတ် filopodial extension များ, တစ် ဦး ပိုင်းခြားသိမြင်ကျောရိုးခေါင်းကိုကင်းမဲ့ကြောင်းရှည်လျားသောနန်းကြိုးအမျှင်လေးများပေါ်ထွက်လာခဲ့ကြသည်။
ကျေးဇူးတင်လွှာ
ဤလုပ်ငန်းကို (PG နှင့် ACN မှ) အမေရိကန်ပြည်ထောင်စုပြည်သူ့ကျန်းမာရေးဝန်ဆောင်မှု Grant က DA10044 ဖွငျ့နှင့် The Simons ဖောင်ဒေးရှင်းက, အပတေရုသဂျေ Sharp ကဖောင်ဒေးရှင်းက, အ Picower ဖောင်ဒေးရှင်းနှင့် FM ရေ Kirby Foundation ကထောက်ခံခဲ့သည်။
အတိုကောက်
- NACC
- နျူကလိယ accumbens
- MSN ကို
- အလတ်စား spiny အာရုံခံဆဲလျ
- BAC
- ဘက်တီးရီးယားအတုခရိုမိုဆုန်း
- Drd1
- dopamine အဲဒီ receptor D1 ကမကထ-မောင်းနှင်
- Drd2
- dopamine အဲဒီ receptor D2 ကမကထ-မောင်းနှင်
- DiI
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 '3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
- 2WD
- 2 ရက်ပေါင်းနောက်ဆုံးမူးယစ်ဆေးဝါးကုသမှုပြီးနောက်
- 30WD
- ရက်ပေါင်းနောက်ဆုံးမူးယစ်ဆေးဝါးကုသမှုပြီးနောက် 30 ။
ကိုးကား