PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
ြဒပ်မဲ့သော
မျိုးဗီဇစကားရပ်ထဲမှာကိုကင်း-သွေးဆောင်ပွောငျးလဲကင်းစွဲအခြေခံစေခြင်းငှါအာရုံခံ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်နှင့်အပြုအမူများတွင်အပြောင်းအလဲများဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပါတယ်။ ကျနော်တို့ histone 3 lysine 9 (H3K9) dimethylation များအတွက်မရှိမဖြစ်အခန်းကဏ္ဍဖော်ထုတ်နှင့် lysine ကင်း-သွေးဆောင်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံနှင့်အမူအကျင့် plasticity အတွက် G9a dimethyltransferase ။ ထပ်ခါတစ်လဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေးအတွက်နျူကလိယ accumbens အတွက် H3K9 dimethylation ၏ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာအဆင့်ဆင့်လျှော့ပေါ့ပေးခဲ့ပါတယ်။ T ကhistone methylation ၌သူ၏လျော့ချရေးအတွက်ကင်း-သွေးဆောင်ကူးယူအချက်ΔFosBနေဖြင့်စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်ခံခဲ့ရသောဤဦးနှောက်ဒေသအတွက် G9a များ၏ဖိနှိပ်မှုမှတဆင့်ကမကထပြုခဲ့ခဲ့သည်။ ခြွင်းချက် mutagenesis နှင့်ဗိုင်းရပ်စ်-mediated ဗီဇလွှဲပြောင်းအသုံးပြုခြင်း, ငါတို့ G9a downregulation နျူကလိယ၏ dendritic ကျောရိုး plasticity အားဖြင့်ကင်း၏ရေရှည်လုပ်ရပ်များအတွက် histone methylation များအတွက်အလွန်အရေးပါအခန်းကဏ္ဍတည်ထောင်, ကိုကင်းဘို့အာရုံခံခြင်းနှင့်တိုးမြှင် preference ကို accumbens တိုးပွားလာကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။
နိဒါန္း
ထပ်ခါတစ်လဲလဲကင်းထိတွေ့ခြင်းဟာနျူကလိယ accumbens အတွင်းဗီဇစကားရပ်များနှင့်ပြောင်းလဲအာရုံခံ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်ထဲမှာမြဲအပြောင်းအလဲများကို (NAc), ဦးနှောက်ရဲ့ဆုလာဘ် circuitry ၏အဓိကအစိတ်အပိုင်း (ဖြင့်သွင်ပြင်လက္ခဏာဖြစ်ပါသည်1-2). Chromatin ပြုပြင်ကင်းစွဲ၏ရှုထောင့်အခြေခံစေခြင်းငှါဤအဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ထစ်အငေါ့မှတ်တမ်းအပြောင်းအလဲများအတွက်အရေးပါသည် (3-9) ။ histone acetylation နှင့် phosphorylation ပြောင်းလဲမှုများမှဦးဆောင်သည့် chromatin enzymatic စက်ပစ္စည်းများ၏တိုက်ရိုက်ကင်း-သွေးဆောင်ပြုပြင်မွမ်းမံ, (ရာမှတစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအတွက် NAc ရလဒ်များကိုအတွက် chromatin ဖွဲ့စည်းပုံမှာကိုကင်းစည်းမျဉ်း,4, 7-9); သို့သော် histone methylation ထိန်းချုပ်အင်ဇိုင်းတွေအဘို့အခန်းကဏ္ဍသေးစုံစမ်းစစ်ဆေးကြပြီမဟုတ်။
microarrays မှ coupled chromatin immunoprecipitative (chip-Chip) ဖော်ထုတ်ပြောင်းလဲဖိနှိပ် histone H3 lysine 9 (H3K9) ၏ပုံစံများနှင့်ထပ်ခါတလဲလဲကင်းကုသမှုအပြီးတွင် NAc အတွက်တိကျသောမျိုးရိုးဗီဇမြှင့မှာ 27 (H3K27) methylation (သုံးပြီးတစ်ဦးကမကြာသေးခင်ကမျိုးရိုးဗီဇ-ကျယ်ပြန့်ကမကထခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ6) ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် (H3K9 သို့မဟုတ် H3K27 methylation ထိန်းချုပ်ဖို့လူသိများကြသည်မြောက်မြားစွာ lysine methyltransferases (KMTs) နှင့် demethylases (KDMs) profiledသင်္ဘောသဖန်း။ 1A). နှစ်ဦးစလုံးမျိုးဗီဇ၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးသိသိသာသာ downregulated အခါနှစ်ခုသာအင်ဇိုင်းတွေ, G9a နှင့် GLP, 24 နာရီထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်မှုအပြီးမြဲမှတ်တမ်းစည်းမျဉ်းပြသ. G9a နှင့် GLP အထူးသ H3K9 (H3K9me2) ၏ dimethylation catalyze သောကြောင့်, ကိုကင်းများက၎င်းတို့၏ downregulation နှင့်ကိုက်ညီဖြစ်ပါတယ် euchromatic H3K9me2 ၏ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာအဆင့်ဆင့် (ဒီအချိန်မှာရှုလေ့လာလျော့နည်းသွားသင်္ဘောသဖန်း။ 1B) ။ ဆနျ့ကငျြ, heterochromatic H3K27 methylation ၏ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာအဆင့်ဆင့် (ထပ်ခါတလဲလဲကင်းထိတွေ့မှုအားဖြင့် unaltered ကျန်ရစ်အွန်လိုင်းပစ္စည်းထောက်ပံ့အတွက်သင်္ဘောသဖန်း။ S1) ။ နှစ်ဦးစလုံး catalytic လှုပ်ရှားမှုက၎င်း၏မြင့်မားမှုကြောင့် စသည်တို့အတွက် နှင့် Vivo အတွက် (10), ကျနော်တို့နောက်ထပ် NAc အတွက်အထပ်ထပ်ကိုကင်းထိတွေ့အောက်ပါ G9a ဖိနှိပ်မှု၏အလုပ်လုပ်တဲ့အရေးပါမှုကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်ထွက်ထားကြ၏။ ယင်း၏ mRNA ၏အဆင့်ဆင့်နဲ့တူ G9a ပရိုတိန်း၏အဆင့်ဆင့်, သိသိသာသာ (ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေးပြီးနောက် 24 နာရီသို့လျှော့ချခဲ့သည်သင်္ဘောသဖန်း။ S2) ။ G9a mRNA စကားရပ် NAc အတွက် 35% အထိလျှော့ချခဲ့သော်လည်း, immunohistochemical ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ (ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေးပြီးနောက် H15K9me21 အတွက်စောင့်ကြည့်လေ့လာ 3% လျော့နည်းသွားနှင့်ကိုက်ညီ G9a ပရိုတိန်းအဆင့်ဆင့်အတွက်ပိုပြီးကျိုးနွံ 2% လျှော့ချရေး, ထင်ရှားသင်္ဘောသဖန်း။ 1B) ။ G9a mRNA စကားရပ်လည်းကင်း၏အထပ်ထပ် Self-အုပ်ချုပ်ရေး (အောက်ပါ 20% ဖွငျ့ဤဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ downregulated ခဲ့သည်သင်္ဘောသဖန်း။ S3).
euchromatic H3K9me2 အတွက်ပြောင်းလဲမှု NAc အတွက်မျိုးဗီဇစကားရပ်များတွင်မျိုးရိုးဗီဇ-ကျယ်ပြန့်ပြောင်းလဲအတူပတျသကျရှိမရှိကိုသိရှိနိုင်ဖို့, ငါတို့ microarray (ဖြည့်စွက်ကြည့်ရှုကြိုတင်ကင်းထိတွေ့မှုတစ်ခုသမိုင်းနှင့်အတူသို့မဟုတ်မပါဘဲတိရိစ္ဆာန်များအတွက်ကင်းတဲ့စိန်ခေါ်မှုထိုးခြင်းဖြင့်သွေးဆောင်ဗီဇစကားရပ် profile များကိုဆန်းစစ်ရန်လေ့လာဆန်းစစ်အလုပ် မျိုးဗီဇစာရင်းအတွက် ဇယား S1-S3) ။ ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းကိုလက်ခံရရှိခဲ့ကြောင်းတိရစ္ဆာန်များ (နှိုင်းယှဉ် acute ကုသနိုင်ရန်တိရစ္ဆာန်တွေကိုတစ်ဦးကိုကင်းစိန်ခေါ်မှုပြီးနောက်သိသိသာသာတိုးမြှင့်ဗီဇစကားရပ် 1 နာရီပြသသင်္ဘောသဖန်း။ 1C) ။ ဤသည်တိုးမြှင့်ဗီဇစကားရပ်နေဆဲထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းကနေဆုတ်ခွာ၏ 1 တပတ်အကြာတွင်ပေးထားသောတစ်ဦးကိုကင်းစိန်ခေါ်မှုတုံ့ပြန်ဖြစ်ပွားခဲ့သည်။ ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့်အတူတသမတ်တည်း, မျိုးဗီဇ၏သေးငယ်တဲ့ရာခိုင်နှုန်း (~ 10%) (အထပ်ထပ်ကိုကင်းအုပ်ချုပ်ရေးအောက်ပါ desensitized မှတ်တမ်းတုံ့ပြန်မှုပြသသင်္ဘောသဖန်း။ 1C; မြင် စားပွဲတင် S1()5) ။ တိုက်ရိုက်ထပ်ခါတလဲလဲကင်းပြီးနောက်လေ့လာတွေ့ရှိသည့်တိုးမြှင့်ဗီဇစကားရပ်ထဲမှာ G9a downregulation ၏အခန်းကဏ္ဍကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်, ကြွက် herpes simplex virus ရဲ့အချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ထိုး GFP သို့မဟုတ် G9a ဖြစ်စေဖော်ပြ (HSV) virus သယ်ဆောင်လက်ခံရရှိခြင်းရှိမရှိ G9a overexpression ဆုံးဖြတ်ရန်ဆားသို့မဟုတ်ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းနဲ့ကုသခဲ့ကြသည် မျိုးဗီဇစကားရပ်၏ထပ်ခါတလဲလဲကင်း-သွေးဆောင်တိုးမြှင့်ပိတ်ဆို့ဖို့လုံလောက်ခဲ့ပါတယ်။ ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအောက်ပါစကားရပ်၏မြင့်အဆင့်ဆင့်ပြသ 12 ကျပန်းရွေးချယ်ထားသည့်မျိုးဗီဇအစုတခုကနေကျနော်တို့ (G9a သိသိသာသာသောဤမျိုးဗီဇ၏ 50% ၏တိုးမြှင့်စကားရပ်ကိုလျှော့ချကြောင်းလေ့လာတွေ့ရှိစားပွဲတင် S4).
G9a စကားရပ်၏ထပ်ခါတလဲလဲကင်း-သွေးဆောင်ဖိနှိပ်မှုဖျန်ဖြေကြောင်းအထက်မှတ်တမ်းဖြစ်ရပ်များကိုသိရှိနိုင်ဖို့, ငါတို့သည်ချက်ချင်းအစောပိုင်းမျိုးဗီဇတစ်ခုမြင့်မားတည်ငြိမ် splice ထုတ်ကုန်ΔFosBတစ်ဖြစ်နိုင်တဲ့အခန်းကဏ္ဍစုံစမ်းစစ်ဆေး fosB။ ΔFosB (ကိုကင်းဖို့ထပ်ခါထပ်ခါထိတွေ့ပြီးနောက် NAc အတွင်းစုဆောင်းပါကတိုးမြှင့်ကင်းဆုလာဘ်ဆက်စပ်လျက်ရှိသည်ဘယ်မှာ11) ။ ΔFosB (ပါဝင်ပတ်သက်ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇအပေါ်မူတည်ပြီးတစ်ဦးမှတ်တမ်း Active သို့မဟုတ် repressor ဖြစ်စေအဖွစျဆောငျရှကျနိုငျသညျ3, 5, 6, 12) ။ bitransgenic NSE- အသုံးပြုခြင်းtTA tetOP-Δ×FosB ΔFosBစကားရပ်အရွယ်ရောက်ပြီးသူတိရိစ္ဆာန်များ၏ NAc နှင့် dorsal striatum အတွက်ရွေးချယ်သွေးဆောင်နိုင်ပါတယ်ကျသောကြွက်, (13), ကျနော်တို့က NAc အတွက် H3K9me2 နှင့် KMTs ၏ကင်းစည်းမျဉ်းအပေါ်ΔFosBစကားရပ်များ၏သက်ရောက်မှုဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ ΔFosB overexpression (နှစ်ဦးစလုံး H3K9me2 ၏အဆင့်ဆင့်လျှော့ချရန်လုံလောက်သောခဲ့သည်သင်္ဘောသဖန်း။ 1D) နှင့် G9a စကားရပ် (သင်္ဘောသဖန်း။ 1E), အားဖြင့်ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းများ၏သက်ရောက်မှုန်းမှာ။ ဆနျ့ကငျြ, ΔFosB (အသီးသီး, ဒီဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ GLP စကားရပ်ကိုလျှော့ချနှင့် SUV39H1 နှင့် EZH2 မသက်ရောက်ခဲ့ကျောင်းအုပ်ကြီး H3K9 နှင့် H3K27 ဘို့အင်ဇိုင်းတွေ trimethylating ဘူးသင်္ဘောသဖန်း။ S4) ။ လွတ်လပ်သောΔFosB overexpression စနစ်အား အသုံးပြု. ဤအ data တွေကိုအတည်ပြုဖို့, wildtype အရွယ်ရောက်ပြီးသူကြွက် GFP သို့မဟုတ်ΔFosBဖြစ်စေဖော်ပြ Adeno-ဆက်စပ်ဗိုင်းရပ် (AAV) virus သယ်ဆောင်၏နှစ်နိုင်ငံအချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ထိုးလက်ခံရရှိခဲ့သည်။ ΔFosB၏ viral-mediated overexpression (ဒီဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ G9a စကားရပ်၏အဆင့်ဆင့်ယုတ်လျော့သင်္ဘောသဖန်း။ 1E).
G9a ၏ထိုကဲ့သို့သောသိသာနှင့်တိကျသောစည်းမျဉ်း NAc အာရုံခံအတွက်အထူး G9a စကားရပ်ပြောင်းလဲကင်းရန်အမူအကျင့်တုံ့ပြန်မှုထိန်းညှိခြင်းရှိမရှိစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်ကျွန်တော်တို့ကိုသတိပေးခံရ။ Wildtype ကြွက် GFP သို့မဟုတ် G9a ဖော်ပြ HSV virus သယ်ဆောင်၏အချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ထိုးလက်ခံရရှိပြီးတော့မူးယစ်ဆေးဝါးဆုလာဘ်တစ်ခုသွယ်ဝိုက်အတိုင်းအတာကိုထောက်ပံ့ပေးသည့်ဘက်မလိုက်ကင်းသောအခြေအနေများအရပျကို preference ကိုပါရာဒိုင်း, သုံးပြီးဆန်းစစ်ခဲ့ကြသည်။ NAc အာရုံခံအတွက် G9a ၏ viral overexpression (အပြုအမူစမ်းသပ်ခြင်းအောက်ပါအတည်ပြုခဲ့သည်ခဲ့သည်သင်္ဘောသဖန်း။ 2A) ။ G9a overexpression သိသိသာသာ (GFP overexpressing တိရိစ္ဆာန်များမှနှိုင်းယှဉ်လျှင်ကင်းဘို့ preference ကိုလျော့နည်းသွားသင်္ဘောသဖန်း။ 2B), နှင့် NAc အတွက် H3K9me2 အဆင့်ဆင့်တိုးမြှင့် (သင်္ဘောသဖန်း။ 2C) ။ G9a တစ် catalytically သေပြီ Mutant (G9aH1093K) ၏ Overexpression (14) (ကိုကင်း preference ကိုမထိခိုက်ခဲ့ပါသင်္ဘောသဖန်း။ 2B) နှင့်မျှမကဤဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ H3K9me2 အဆင့်ဆင့်အပေါ်အကျိုးသက်ရောက်စေခဲ့တယ် (သင်္ဘောသဖန်း။ 2C).
နောက်ထပ်ကိုကင်းများ၏အမူအကျင့်အပေါ်သက်ရောက်မှုများအတွက် G9a ၏အခန်းကဏ္ဍကိုလေ့လာဖို့နှင့်ထို့ထက် ပို. အထူး NAc, အရွယ်ရောက်ပြီးသူ G9a အတွက် G9a စကားရပ်၏ထပ်ခါတလဲလဲကင်း-သွေးဆောင်ဖိနှိပ်မှုတူတဲ့ရန်FL / FL ကြွက် (14က) ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် Cre recombinase သို့မဟုတ် GFP ဖော်ပြ AAV virus သယ်ဆောင်၏အချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ထိုးလက်ခံရရှိခဲ့သည်။ immunohistochemically အတည်ပြုခဲ့သည်ခဲ့သော NAc အတွက် G9a ၏ AAV-Cre knockdown, (သင်္ဘောသဖန်း။ S5), သိသိသာသာ (ရာအရပျအေးစက်စမ်းသပ်ချက်အတွက်ကိုကင်းများ၏သက်ရောက်မှုများတိုးပွားလာခြင်းနှင့် NAc အတွက် H3K9me2 အဆင့်ဆင့်ယုတ်လျော့သင်္ဘောသဖန်း။ 2D, E ကို) ။ G9a နှင့် GLP ၏တစ်ဦးကစီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင် pharmacological inhibitor, BIX01294 (15-16), အင်ဇိုင်းတားစီးအလားတူကင်းရန်အမူအကျင့်တုံ့ပြန်မှုအပေါ်သက်ရောက်မှုရှိမရှိသိရှိနိုင်ရန်ဖို့အသုံးပြုခဲ့ပါတယ်။ အမှန်စင်စစ် G9a နှင့် GLP ၏ pharmacological တားစီးသိသိသာသာ (ကိုကင်းဘို့ preference ကိုတိုးမြှင့်ခြင်းနှင့် NAc အတွက် H3K9me2 လျော့နည်းသွားသင်္ဘောသဖန်း။ 2F, G).
ကိုကင်းများထပ်ခါတစ်လဲလဲအုပ်ချုပ်ရေး (NAc အလတ်စား spiny အာရုံခံအပေါ် dendritic ကျောရိုး၏သိပ်သည်းဆကိုတိုးပွားစေ17ဤအအာရုံခံပေါ်သို့ excitatory glutamatergic synapses မှာအလုပ်လုပ်တဲ့အပြောင်းအလဲများနှင့်ဆက်စပ်), လုပ်ငန်းစဉ် (18-19) နှင့်မူးယစ်ဆေးဝါးမှထိခိုက်အပြုအမူတုံ့ပြန်မှု (17, 20). ကျနော်တို့အရှင်ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းအားဖြင့် NAc အတွက် G9a လှုပ်ရှားမှု downregulation NAc အာရုံခံ၏ dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကိုထိန်းညှိဖို့ကိုကင်းရဲ့စွမ်းရည်ကိုဖျန်ဖြေစေခြင်းငှါ, တွေးဆ။ Anti-G9a antibody ကိုအတူ chromatin immunoprecipitative (chip) ကိုသုံးပြီးကျနော်တို့ (ယခင်ကကင်း-သွေးဆောင် dendritic plasticity ်ပတ်သက်နေထားပြီးတစ်ဦးချင်းစီ၏ NAc အတွက်အများအပြား putative G9a ဗီဇပစ်မှတ်များကိုတွေ့ရှိသင်္ဘောသဖန်း။ 3A()20-26) ။ ကျနော်တို့ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေးသိသိသာသာ binding G9a လျော့နည်းသွားကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့အဖြစ်ဤအမျိုးဗီဇမြှင့ (အနည်းဆုံး H3K9me2 ၏အဆင့်ဆင့်,သင်္ဘောသဖန်း။ 3B) ။ ဆနျ့ကငျြစူးရှသောကိုကင်းအုပ်ချုပ်ရေးလျှင်မြန်စွာကင်း၏စူးရှသောဆေးထိုးပြီးနောက် NAc 9 နာရီအတွင်းလေ့လာတွေ့ရှိတိုးလာ G9a စကားရပ်နှင့်ကိုက်ညီဤတူညီသောမျိုးဗီဇမြှင့အချို့မှ G1a စုဆောင်း (သင်္ဘောသဖန်း။ S6) ။ G9a သတ်သတ်မှတ်မှတ်မျိုးဗီဇမြှင့မှာ binding က၎င်း၏စကားရပ်ပြောင်းလဲမှုများနှင့်အတူဆက်နွယ်နေပါသည်သော်လည်းထိုကဲ့သို့သောဖြစ်ရပ်များနှင့် / သို့မဟုတ်စူးရှသောအောက်ပါ G9a စုဆောင်းမှုအတွက်ကွဲပြားမှုအားဖြင့် NAc အတွက် G9a ၏ပြောင်းလဲကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာအဆင့်ဆင့်ကကမကထပြုခဲ့ကြသည်ရှိမရှိအဖြစ်မသိရသေးဖြစ်နေဆဲ vs. ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်မှု။
အဆိုပါ NAc အတွက်မြောက်မြားစွာ plasticity-related မျိုးဗီဇ၏ G9a ရဲ့စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းအပေါ်အခြေခံပြီးကျနော်တို့အထပ်ထပ်ကိုကင်းကုသမှုအောက်ပါဒီဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌ G9a ထုတ်ဖော်ပြုပြင်ထိန်းသိမ်းမှုကိုကင်း-သွေးဆောင် dendritic ကျောရိုးဖွဲ့စည်းရေးပိတ်ဆို့ဖို့လုံလောက်ခဲ့ပါတယ်ရှိမရှိတိုက်ရိုက်ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ NAc အတွက် dendritic ကျောရိုးသော induction မြှင့်တင်ရန်ယခင်ကသရုပ်ပြတစ်ဦးကိုကင်းကုသမှု protocol ကိုအသုံးပြုခြင်း (20), ကျနော်တို့ HSV-GFP သို့မဟုတ် HSV-G9a ဖြစ်စေနဲ့အတူထိုးသွင်းတိရိစ္ဆာန်များအတွက်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ ယခင်တွေ့ရှိချက်များနှင့်အတူသဘောတူညီချက်မှာတော့ကျနော်တို့ (ကိုကင်းကုသမှုအောက်ပါ G9a overexpression နေဖြင့်လုံးဝပိတ်ဆို့ခဲ့ကာအကျိုးသက်ရောက်မှု NAc အတွက် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအတွက်သိသိသာသာတိုးလေ့လာတွေ့ရှိသင်္ဘောသဖန်း။ 3C) ။ တစ်ဦးတည်း G9a overexpression ကိုကင်းများ၏မရှိခြင်းအတွက် NAc dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကိုလျော့ချဖို့လုံလောက်သောမဟုတ်ခဲ့ပေ။ , G9a သည်ဤဒေတာဖြည့်စွတ်ရန်FL / FL ကြွက် HSV-Cre နှင့်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆများထိုး quantified နှင့်ကိုကင်းများ၏မရှိခြင်းအတွက် HSV-GFP လက်ခံရရှိတိရိစ္ဆာန်များမှနှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်အချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ကိုလက်ခံရရှိခဲ့သည်။ G9a ထုတ်ဖော် Knockdown သိသိသာသာ (NAc အလတ်စား spiny အာရုံခံအပေါ်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆတိုးမြှင့်သင်္ဘောသဖန်း။ 3C).
ထပ်ခါတလဲလဲကင်းပြီးနောက် NAc အတွက် G9a downregulation ΔFosBကကမကထပြုခဲ့ကြောင်းအထောက်အထားပေးထားကျနော်တို့လာမယ့်ဒီကူးယူအချက် NAc dendritic ကျောရိုး၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းအတွက်ထိုနည်းတူပါဝင်ပတ်သက်ရှိမရှိဆန်းစစ်. ΔFosBယခင်က Cdk5 နှင့်NFκB subunits အပါအဝင်ယင်း၏ပစ်မှတ်အတော်ကြာထိုကဲ့သို့သော dendritic plasticity, ရန်ကြောင်းကျိုးဆက်စပ်ဆက်နွယ်နေရသေးပေမယ့်ဒါပတ်သက်သည်ဟုယူဆရပြီ (20-23), နှင့် NAc အာရုံခံအတွက်ΔFosBရဲ့ဇွဲစကားရပ်ထပ်ခါတလဲလဲကင်းကုသမှုပြီးနောက်တိုးမြှင့် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆနှင့်ဆက်နွယ်နေပါသည် (27) ။ ပထမဦးစွာကျနော်တို့ (G9a နှင့် H3K9me2 စကားရပ် downregulated သောကိုကင်းများ၏မရှိခြင်းအတွက် bitransgenic ကြွက်တွေမှာΔFosB၏ induction တွေ့ရှိခဲ့သင်္ဘောသဖန်း။ 1D, E ကို), G9a မြောက်မြားစွာ plasticity-related ဗီဇမှ binding လျော့နည်းသွား, အရာအတော်များများလည်း (ΔFosBကိုယ်တိုင်ကတိုက်ရိုက်ပစ်မှတ်ဖြစ်ပြခဲ့ကြသင်္ဘောသဖန်း။ 3D()3, 6). ကျနော်တို့လာမယ့်, အ NAc အတွက်ΔFosB၏ဗိုင်းရပ်စ် overexpression သိသိသာသာ Basal အခြေအနေများအောက်တွင် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆတိုးမြှင့်ကြောင်းပြသ ကြောင်းအလားတူ (အထပ်ထပ်ကိုကင်းအုပ်ချုပ်ရေးအောက်ပါလေ့လာတွေ့ရှိသင်္ဘောသဖန်း။ 3E). ပြောင်းပြန်ΔJunD၏ NAc, ΔFosBမှတ်တမ်းလှုပ်ရှားမှု antagonizes တစ်ဦးကြီးစိုးကအနုတ် Mutant ပရိုတိန်းအတွက် overexpression, အ NAc အတွက် dendritic ကျောရိုးဖွဲ့စည်းရေးတိုးမြှင့်ဖို့ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းများ၏စွမ်းရည်ကိုပိတ်ဆို့ (သင်္ဘောသဖန်း။ 3C).
ΔFosBအဆိုပါ NAc အတွက် G9a စကားရပ်ကိုထိန်းညှိနှင့်ΔFosBနှင့် G9a တူညီသောပစ်မှတ်မျိုးဗီဇအချို့ကိုထိန်းညှိကြောင်းကိုကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာရေး, ΔFosBနှင့် G9a အကြားကတခြား interaction ကဆနျးစစျဖို့ကျွန်တော်တို့ကိုဦးဆောင်ခဲ့သည်။ G9a အဆင့်ဆင့်ပုဖို့ G9a ၏စညျး, တိုးပွားလာသောအခါစူးရှသောကိုကင်း, ပြီးနောက် fosB G9a စကားရပ်နှိမ်နင်းခံခဲ့ရသည့်အခါမျိုးဗီဇ G9a ယင်းမှ binding, ပြီးနောက်ထပ်ခါတလဲလဲကင်းစဉ်တိုးပွားလာခဲ့သည် fosB မျိုးဗီဇ (လျော့နည်းသွားခဲ့သည်သင်္ဘောသဖန်း။ 3A) ။ ထပ်ခါတလဲလဲကင်းဘို့စောင့်ကြည့်လေ့လာမခံခဲ့ရပြီးနောက်ထိုကဲ့သို့သော binding G9a လျော့နည်းသွား က c-fos, G9a binding ထပ်ခါတလဲလဲကင်းတိုးပွားလာသည်အဘယ်မှာရှိ (သင်္ဘောသဖန်း။ S7) ။ ဤသည်နှင့်မတူဘဲဆိုတဲ့အချက်ကိုအတူတသမတ်တည်းဖြစ်တယ် fosB, က c-fos (နာတာရှည် psychostimulant ထိတွေ့အသုံးပြုပုံသွေးဆောင်ဘဲ, ဖိနှိပ်နေသည်5) ။ bitransgenic ကြွက်တွေမှာΔFosB overexpression သိသိသာသာမှ binding G9a လျော့ချဖို့လုံလောက်ခဲ့တယ် fosb မျိုးဗီဇ (သင်္ဘောသဖန်း။ 3D) ။ ထို့အပွငျ G9a overexpression (အထပ်ထပ်ကိုကင်းအုပ်ချုပ်ရေးအောက်ပါတိုးလာΔFosBစကားရပ်လျှော့ချရန်လုံလောက်သောခဲ့သည်စားပွဲတင် S4). ဤရွေ့ကားဒေတာ G9a ပိုင်းတွင်စူးရှသောကိုကင်းအုပ်ချုပ်မှုအားဖြင့်ΔFosB၏ induction ကန့်သတ်ခွထားတဲ့ autoregulatory ကွင်းဆက်အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ΔFosBအထပ်ထပ်မူးယစ်ဆေးထိတွေ့မှုနှင့်အတူစုဆောင်းအဖြစ်သို့သော်ကြောင့် G9a represses နှင့်အားဖြင့်၎င်း၏ကိုယ်ပိုင်နောက်ထပ်သော induction potentiates ။
နိဂုံးချုပ်မှာတော့ကျနော်တို့ NAc အတွက် histone lysine methylation ကင်းတုံ့ပြန်အာရုံခံဗီဇစကားရပ်ကိုထိန်းညှိအတွက်ပြင်းထန်စွာပါဝင်ပတ်သက်ကြောင်းသရုပ်ပြပါပြီ။ ထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေးအောက်ပါ G9a နှင့် H3K9me2 ၏ဖိနှိပ်မှု dendritic plasticity ၏ထစ်အငေါ့ပုံစံများကိုထိန်းညှိဖို့လူသိများမြောက်မြားစွာမျိုးဗီဇ၏မှတ်တမ်း activation မှတဆင့်အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုအတွက်ကိုကင်း preference ကိုအားပေးအားမြှောက်။ ထိုကဲ့သို့သောယန္တရားများမှတဆင့်စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်ခံရသည့်မျိုးဗီဇ၏ပိုကောင်းတဲ့နားလည်မှုရရှိမှုမူးယစ်ဆေးစွဲ၏ရှုပ်ထွေးသောဇီဝအခြေခံကျွန်တော်တို့ရဲ့အသိပညာတိုးတက်စေမည်စွဲလမ်းမမှန်ပိုမိုထိရောက်သောကုသမှု၏ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက်ကူညီနိုင်ဘူး။
ကုန်ကြမ်းနှင့်နည်းစနစ်များ
တိရစ္ဆာန်များနှင့်ကုသ
အတူအဆက်မပြတ်အပူချိန် (ကို C ° 12) မှာမဟုတ်ရင်ဖော်ပြထား, ကြွက် (7 pm တွင်: 00 မှ 7 AM 00 ကနေအပေါ်ထွန်း) တစ်ဦး 23 နာရီအလင်း / မှောင်မိုက်သံသရာအတူကိုလိုနီအတွက်လှောင်အိမ်နှုန်းမှငါးလေးသျောခဲ့ကြသည်မဟုတ်လျှင် ကြော်ငြာ libitum ရေနှင့်အစားအစာမှဝင်ရောက်ခွင့်။ အားလုံးတိရိစ္ဆာန် protocols များ UT အနောက်တောင်ပိုင်း Medical Center မှာနဲ့ဆေးပညာသိနာတောင်ပေါ်ကျောင်းနှစ်ဦးစလုံးမှာ IACUC ကအတည်ပြုပေးခဲ့သည်။
ကိုကင်းစမ်းသပ်ချက် [immunohistochemitry အနောက်ပိုင်းချေ, အရေအတွက် PCR (qPCR), microarray ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနှင့် chromatin immunoprecipitative (chip)] အဘို့, 8-ရက်သတ္တပတ်အရွယ်အထီး C10BL / 57J ကြွက်မှ 6- အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ တိရိစ္ဆာန်များ '' ဆား '(7 ကုသဆား, ip),' 'စူးရှသော' 'ကိုကင်း (6 ကုသဆား + တဦးတည်းကုသမှု 20 / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip mg) သို့မဟုတ်' 'ထပ်ခါတလဲလဲ' 'ကိုကင်း (7 ကုသ 20 မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်ဖြစ်စေ၏နေ့စဉ်ဆေးထိုးလက်ခံရရှိ ကိုကင်း-HCl, ip) ။ ကြွက်နောက်ဆုံးကုသမှုအောက်ပါ 1 နာရီသို့မဟုတ် 24 နာရီဖြစ်စေမှာယဇျပူဇျောခဲ့သညျ။ microarray လေ့လာမှုများအဘို့, တိရိစ္ဆာန်များ '' ဆား '(15 ကုသဆား, ip) တစ်ခုခုကိုနှင့်အတူနေ့စဉ်ကုသခံခဲ့ရသည်,' စူးရှသော '' ကိုကင်း ( 'စူးရှ + ထပ်ခါတလဲလဲ' 'ကိုကင်း, (14 ကုသဆား + 1 ကုသမှု 20 / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip mg) 7 / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip) သို့မဟုတ် '' ထပ်ခါတလဲလဲဆုတ်ခွာ + စူးရှသော '' ကိုကင်း mG 8 ကုသဆား + 20 ကုသမှု (7 ကုသ 20 ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl + 7 ကုသဆား + 1 စိန်ခေါ်မှုကုသမှု 20 / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl mg / mG ip) နှင့်နောက်ဆုံးကုသမှုပြီးနောက် 1 နာရီယဇ်ပူဇော်ကြ၏ခဲ့ကြသည်။ အမူအကျင့်စမ်းသပ်ချက်များတွင်ကြွက် singly Post-ခွဲစိတ်သျောခဲ့ကြသည်နှင့်အ 10 နဲ့ကုသခံခဲ့ရသည်အောက်တွင်ဖော်ပြထားသကဲ့သို့ / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip MG ။ HSV-GFP နှင့် HSV-G9a-GFP ရောဂါကူးစက်အောက်ပါ dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနှင့် microarray validation ကိုအဘို့, ကြွက် '' ဆား '(5 ကုသဆား, ip) သို့မဟုတ်' 'ထပ်ခါတလဲလဲကင်း' (5 ကုသ 20 မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip နဲ့ကုသခဲ့ကြသည် ) ဒီဆေးထိုး protocol ကိုယခင်ကနျူကလိယ accumbens အပေါ်ကျောရိုးသိပ်သည်းဆတိုးမြှင့်ဖို့သရုပ်ပြခဲ့ပြီးသည်အတိုင်း, 3 ကာလ၏သင်တန်းကျော် (NAc) herpes simplex virus ကို၏အချိန်အပိုင်းအခြားအတွင်းအာရုံခံ (HSV) Transgene စကားရပ် (ဖြည့်စွက် ref S1) ။ dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတှကျအသုံးပွုကြွက်ကနောက်ဆုံးကုသမှုအောက်ပါ 4 နာရီယဇ်ပူဇော်ကြ၏ခဲ့ကြသည်။
NAc အာရုံခံမှကန့်သတ်သည့် G9a မှတ်တမ်း၏ဒေသခံဖျက်မှုကိုသွေးဆောင်ခြင်းငှါ, ကျနော်တို့တခြားနေရာအသေးစိတ်ဖော်ပြထားခဲ့ကြသည့် floxed G9a allele (များအတွက် homozygous Mutant ကြွက်တွေကိုအသုံးပြုS2) ။ Cre-သွေးဆောင် recombination အဆိုပါ mutated မှတ်တမ်း၏ဒဏ်ဍာရီ-mediated ယိုယွင်းမှဦးဆောင် 22 Out-of-frame ကို splicing မှ exon 25 ထုတ်လုပ်သည်။ ကျနော်တို့ G9a အပြည့်အဝ C57BL / 6J ကြွက်မှ backcrossed ခဲ့ကြွက် floxed ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ကြွက် 2 နှင့် 7 ရက်သတ္တပတ်၏အသက်အရွယ်အကြား GFP သို့မဟုတ် Cre-GFP ဖော်ပြ Adeno-ဆက်စပ်ဗိုင်းရပ် (AAV) virus သယ်ဆောင် (serotype 10) နှင့်အတူ NAc သို့ sterotaxically-ထိုးသွင်းခဲ့ကြသည်။ Immunohistochemical ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ (တွေ့မြင် Cre-mediated recombination ၏ထိရောက်မှုကိုအတည်ပြုရန်အသုံးပြုခဲ့သည် ဖြည့်စွက်ပုံ။ S5) ။ G21a အတွက် recombination ကြွက် floxed ဘာဖြစ်လို့လဲဆိုတော့ကျနော်တို့ (ပုံနှိပ်ထုတ်ဝေသည့်အစီရင်ခံစာများနှင့်အတူတသမတ်တည်း, ဒီအချိန်မှာတည်ငြိမ်ပြီးလုပျသငျခဲ့ AAV 9 ရက်ပေါင်း Post-ခွဲစိတ်တိရိစ္ဆာန်များထိုးသွင်းအသုံးပြုသောS3-S4) ။ G9a နှင့်ΔJunD overexpression စမ်းသပ်ချက်အလားတူ GFP, wildtype G9a-GFP, catalytically သေပြီ G9aH1093K-GFP သို့မဟုတ်ΔJunD-GFP (တွေ့မြင်ဖြစ်စေဖော်ပြ HSV ဗိုင်းရပ်စ် virus သယ်ဆောင်သုံးပြီးကောက်ယူခဲ့သည် S2 G9a ဆောက်လုပ်ရေးဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေးကိုရည်မှတ်အသေးစိတ်ကို) ။ immunohistochemistry ကနေတဆင့်ကြည့်ရှုလေ့လာအဖြစ် overexpression, ဒီအချိန်မှာလုပျသငျခဲ့ကတည်းက HSV overexpressing ကြွက် Post-ခွဲစိတ် 3 ရက်ပေါင်းအသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ AAV virus သယ်ဆောင် Transgene ထုတ်ဖော်တိုးချဲ့ကာလလိုအပ်စမ်းသပ်ချက်တွင်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်သော်လည်းကြောင့် HSV စကားရပ်၏ယာယီသဘောသဘာဝနှင့် AAV စကားရပ်၏သိသိသာသာပိုမိုတည်ငြိမ်သဘောသဘာဝရန်, HSV virus သယ်ဆောင်မြန်ဆန်, ရေတိုရေရှည် Transgene စကားရပ်လိုအပ်စမ်းသပ်ချက်တွင်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ နှစ်ဦးစလုံး virus သယ်ဆောင် afferent သို့မဟုတ် efferent အာရုံခံမဆိုရောဂါကူးစက်မှုမရှိဘဲ, ထိုးသွင်းဦးနှောက်ဧရိယာအတွင်းသာအာရုံခံဆဲလ်အသေကောင်ကူးစက်ရန်, ကျယ်ပြန့်ကြိုတင်လေ့လာမှုများအတွက်ပြသခဲ့ကြသည်။
အဆိုပါ pharmacological G9a / GLP inhibitor ကိုအသုံးပြုပြီးအမူအကျင့်စမ်းသပ်ချက်အဘို့, BIX01294 (25 ng / μl), ကြွက် sterotaxically အဆိုပါ NAc သို့နှစ်ခုအရေပြားအောက်ဆုံး Mini-ပန့်များအဖြစ်နှစ်နိုင်ငံလမ်းညွှန် cannulae နှင့်အတူကိုထညျ့သှငျးခဲ့သညျ။ mini-ပန့်များအပြုအမူအကဲဖြတ်ဖျော်ဖြေခဲ့ပြီးသောအချိန်ကာလအတွင်း 12 ရက်များအတွက်မော်တော်ယာဉ် (0.25 hydroxypropyl β-cyclodextrin) သို့မဟုတ်မူးယစ်ဆေးဝါးတစ်ခုခုများစဉ်ဆက်မပြတ်ဖြန့်ဝေ (5 μl / နာရီ) စတင်ကြိုတင် implantation မှ 14 နာရီ activated ခဲ့ကြသည်။
ΔFosB overexpression စမ်းသပ်ချက် [အနောက်ပိုင်းချေ, qPCR နှင့် chip] အထီး bitransgenic NSE- များအတွက်tTA tetOP ×-ΔFosB အဆိုပါ tetracycline ဆင်းသက်လာ doxycycline (doxycycline ချွတ် 10 ရက်သတ္တပတ်) ၏မရှိခြင်းအတွက်, အိမ်မွေးတိရစ္ဆာန် (ΔFosB၏ကြံ့ခိုင် striatal ကန့်သတ်ဖွဲ့စည်းပုံအခြေခံဥပဒေစကားရပ်ပြသခွကြွက်, (8 ရက်သတ္တပတ်-ဟောင်း) အသုံးပြုခဲ့ကြသည်S5) ။ ဤအကြွက်တွေမှာΔFosB overexpression qPCR မှတဆင့်အတည်ပြုနိုင်ခဲ့ခဲ့သည်။ NSE- သုံးပြီးတွေ့ရှိချက်ကိုအတည်ပြုဖို့tTA tetOP ×-ΔFosB ကြွက်, wildtype 8-ရက်သတ္တပတ်အရွယ် C57BL / 6J အထီးကြွက် AAV virus သယ်ဆောင် GFP သို့မဟုတ်ΔFosB-GFP ဖြစ်စေဖော်ပြနှင့်အတူ sterotaxically-ထိုးသွင်းအချင်းချင်းအပြန်အလှန် NAc ခဲ့ကြသည်။ AAV virus သယ်ဆောင်ကြွက် overexpressing ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်နှင့် bitransgenic ΔFosBအကြားတိုက်ရိုက်နှိုင်းယှဉ်ဘို့အခွင့် 8 ရက်သတ္တပတ် Post-ခွဲစိတ်မှာအကျယ်ချဲ့ΔFosBစကားရပ်သေချာစေရန်, ဤကိစ္စတွင်အတွက်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ ဗိုင်းရပ်စ် overexpression Post-ခွဲစိတ်ကုသ (8-gauge NAc လာကြတယ်ထိုး site ကိုအောက်တွင်ခွဲဖြာခဲ့ကြသည်) 15 ရက်သတ္တပတ်မှာ qPCR သုံးပြီးအတည်ပြုခဲ့သည်ခဲ့သည်။ qPCR များအတွက်အသုံးမခဲ့ AAV-GFP နှင့် AAV-ΔFosB-GFP overexpressing ကြွက်ဆား (14 ကုသဆား, ip) သို့မဟုတ်ထပ်ခါတလဲလဲကိုကင်းနဲ့ကုသခံခဲ့ရသည် 14 ရက်သတ္တပတ်ပြီးဆုံးပြီးနောက်အကဲဖြတ်မှာစတင် (30 ကုသ 6 / ကီလိုဂရမ်ကိုကင်း-HCl, ip mg) ခွဲစိတ်။ နောက်ဆုံးကုသမှုအောက်ပါ 4 ရက်, ဦးနှောက်တစ် vibratome အပေါ် sectioned နှင့် dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတှကျအသုံးပွု, 4% paraformaldehyde နှင့်အတူ fixed ခဲ့ကြသည်။
အနောက်တိုင်းချေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
14-gauge NAc လာကြတယ် 1 မီလီမီတာ Coronal အပိုင်းကနေခေါ်ဆောင်သွားတဲ့သံမဏိ mouse ကိုဦးနှောက် matrix ကိုသုံးပြီးရယူ protease နှင့် phosphatase inhibitors ် 1 M က HEPES lysis ကြားခံ (1% SDS) တွင် sonicated ခဲ့ကြသည်။ 10-စုစုပေါင်းပရိုတိန်း၏ 30 μgနမူနာ 18% SDS gels အပေါ် electrophoresed ခဲ့ကြသည်။ ပရိုတိန်း PVDF အမြှေးပါးမှလွှဲပြောင်းနဲ့ anti-H3K9me2 (mouse ကို monoclonal, 1: 500) တစ်ခုခုကိုနှင့်အတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်, Anti-β-tubulin (mouse ကို monoclonal, 1: 60,000), Anti-စုစုပေါင်း histone H3 (ယုန် polyclonal, 1: 5,000), Anti-GFP (လက်သီးဖြင့်ထိုးနှက်တစ်ရှူးအတွက်တန်းတူဗိုင်းရပ်စ်စကားရပ်၏စိစစ်အတည်ပြုအတှကျအသုံးပွု) (ယုန် polyclonal, 1: 1000), Anti-H3K27me3 (ယုန် polyclonal, 1: 500) သို့မဟုတ် Anti-actin ပဋိ (mouse ကို monoclonal, 1: 60,000) နေ့ချင်းညချင်းမှာ ကို C ° 4 (အားလုံးအမြှေးပါး 5% နို့သို့မဟုတ် 5% bovine သွေးရည်ကြည် albumin ပိတ်ဆို့ထားခဲ့ကြသည်။ ) 1: အမြှေးပါးထို့နောက် peroxidase-တံဆိပ်ကပ်အလယ်တန်းပဋိ (15,000 နှင့်အတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်-1: 60,000 အသုံးပြုတဲ့မူလတန်းကျောင်း antibody ကိုပေါ် မူတည်. ) နှင့်ခညျြအနှော SuperSignal အနောက်အီရတ်တွင်အလွှာကို အသုံးပြု. မြင်ခဲ့ကြသည်။ ခညျြအနှောညျြအနှော actin သို့မဟုတ်β-tubulin ဖြစ်စေရန်နှင့်တန်းတူတင်ဘို့ကိုထိန်းချုပ်ရန်စုစုပေါင်း histone H3 မှပုံမှန်ခဲ့ကြသည် NIH Image ကို J ကို Software များနှင့် H9K2me3 နှင့်အတူ quantified ခဲ့ကြသည်။ ထပ်ခါတစ်လဲလဲကိုကင်း (actin ၏အဆင့်ဆင့်အပေါ်အဘယ်သူမျှမသက်ရောက်ခဲ့သင်္ဘောသဖန်း။ S8) သို့မဟုတ်စုစုပေါင်း histone 3 (သင်္ဘောသဖန်း။ S1) ကို NAc ၌တည်၏။ ထို့အပွငျ HSV-G9a-GFP နှင့် HSV-G9aH1093K-GFP ရောဂါကူးစက်မှုကို (NAc အတွက်β-tubulin စုစုပေါင်းအဆင့်ဆင့်အပေါ်အဘယ်သူမျှမသက်ရောက်ခဲ့သင်္ဘောသဖန်း။ S8).
Immunohistochemistry
ကြွက် (chloral ဓါတ်ကိုပြန်လည်တစ်ဦးသေစေလောက်ထိုးနှင့်အတူ sedated နှင့်ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့တစ်ခုတည်းသို့မဟုတ်နှစ်ဆ immunohistochemistry အားဖြင့်သုံးသပ်မခံရမီ 4% paraformaldehyde နှင့်အတူ perfused ခဲ့ကြသည်S6) ။ အတိုချုပ်, Post-fixed ဦးနှောက် 30 μm (dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတှကျအသုံးပွုဦးနှောက် 35% sucrose ၏မရှိခြင်းအတွက် 100 μmကဏ္ဍများမှာ vibratome အပေါ် sectioned ခဲ့ကြသည်) မှာ sectioned မခံရမီ 30% sucrose အတွက်နေ့ချင်းညချင်းအခန်းအပူချိန်မှာနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ အခမဲ့-floating NAc ကဏ္ဍများ, 1X PBS နှင့်အတူဆေးကြော (3% ပုံမှန်မြည်းသွေးရည်ကြည်, 0.1% tritonX, 1X PBS) ပိတ်ဆို့နောက်ပိုင်းတွင် Anti-GFP (ကြက်သား polyclonal, 1: 8000) နဲ့နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်နှင့် / သို့မဟုတ် Anti-G9a (ယုန် polyclonal , 1: ဖြေရှင်းချက်ပိတ်ဆို့ခြင်းအတွက် 500) ပဋိ။ dendritic ကျောရိုးများအတွက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာကဏ္ဍများ 1 မှာယုန် polyclonal Anti-GFP antibody ကိုအတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်: 200 ။ နေ့ချင်းညချင်းပေါက်ဖွားပြီးနောက် NAc ကဏ္ဍများ 3 နာရီဖြေရှင်းချက်ပိတ်ဆို့ခြင်း 10X PBS အတွက် Cy1 နှင့် / သို့မဟုတ် Cy2 ချောင်း-coupled အလယ်တန်းပဋိနှင့်အတူပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်, 3X PBS နှင့်အတူ 1 မိနစ် 2 ကြိမ်နှင့်ဆေးခဲ့သည်။ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်လေ့လာမှုများအတွက်အသုံးပြုကဏ္ဍများအခန်းအပူချိန်မှာနေ့ချင်းညချင်းအလယ်တန်း antibody ကိုနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ 1 မိနစ်: နျူကလီးယား Co-အစွန်းအထင်း DAPI (1 50,000) ပါဝင်တဲ့ 10X PBS အတွက်ကဏ္ဍများ incubating ခြင်းဖြင့်အောင်မြင်ခဲ့ပါသည်။ ကဏ္ဍများတစ်ဖန်ပြန်လည်ဆေးကြောအီသနောရေဓါတ်ခန်းခြောက်ခြင်းဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်နှင့် DPX နှင့်အတူ mounting ခဲ့ကြသည်။ အားလုံးကဏ္ဍများ confocal microscopy သုံးပြီး imaged ခဲ့ကြသည်။
RNA အထီးကျန်မှုတွေနဲ့ qPCR
နှစ် ဦး နှစ်ဖက် 14-gauge NAc လာကြတယ်တွေဟာ Trizol မှာတစ်သားတည်းဖြစ်အောင်လုပ်ပြီးထုတ်လုပ်သူရဲ့ညွှန်ကြားချက်အရလုပ်ဆောင်ပါတယ်။ RNA ကို RNAesy Micro ကော်လံဖြင့်သန့်စင်ပေးခဲ့ပြီး Spectroscopy သည် RNA 260/280 နှင့် 260/230 ခွဲတမ်းများသည် ၁.၈ ဖြစ်ကြောင်းအတည်ပြုခဲ့သည်။ ထို့နောက် RNA သည် Bio-Rad iScript Kit ကို အသုံးပြု၍ ကူးရေးသည်။ cDNA ကို SYBR အစိမ်းရောင် သုံး၍ qPCR ဖြင့်တွက်ချက်သည်။ တုန့်ပြန်မှုတစ်ခုချင်းစီကိုပုံတူပွားခြင်း (သို့) သုံးမျိုးဖြင့်ပြုလုပ်ခဲ့ပြီးယခင်က glyceraldehyde-1.8-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ကိုပုံမှန်ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ်အသုံးပြုပြီးဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်းΔΔCtနည်းလမ်းဖြင့်လေ့လာခဲ့သည်။S7) ။ မြင် ဖြည့်စွက်ဇယား S5 mRNA primer ပာသည်။
DNA ကို microarray ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
လေးအုပ်စုများ (အုပ်စုတစ်စုနှုန်း 3 လွတ်လပ်သောဇီဝပွား) 12 microarrays စုစုပေါင်းသည် microarray လေ့လာမှုအဘို့အအသုံးပြုသွားမည်ခဲ့ကြသည်။ ပြီးခဲ့သည့်ကိုကင်းဆေးထိုးအောက်ပါ 1 နာရီ, တိရိစ္ဆာန်များလျှင်မြန်စွာခေါင်းဖြတ်အသတ်ခံခဲ့ကြခြင်းနှင့်ဦးနှောက်ကိုဖယ်ရှားခဲ့ကြသည်များနှင့်ရေခဲပေါ်တင်လိုက်တယ်။ NAc ၏ခှဲစိတျတစ် 15-gauge အပ်လာကြတယ်သုံးပြီးခေါ်ဆောင်သွားခဲ့သည်နှင့် RNA ဖြည်ချသည်အထိလျင်မြန်စွာခြောက်သွေ့တဲ့ရေခဲပေါ်အေးခဲခဲ့ကြသည်။ နှစ်နိုင်ငံလာကြတယ်အုပ်စုတစ်စုနှုန်း 12 ကြွက်စုစုပေါင်းပွားနှုန်းလေးတိရိစ္ဆာန်များကနေထို့နောက်ပါတီအသီးသီးမှခဲ့ကြသည်။ RNA အထီးကျန်မှုတွေ, microarray အပြောင်းအလဲနဲ့နှင့်ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ (ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ဖျော်ဖြေခဲ့ကြS8) ။ အတိုချုပ်အားဖြင့်အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း RNA ကိုသီးခြားသန့်စင်ပြီး Agilent's Bioanalyzer ကို အသုံးပြု၍ အရည်အသွေးစစ်ဆေးသည်။ Illumina MouseWG-6 v2.0 arrays များသို့ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၊ ချဲ့ခြင်း၊ တံဆိပ်ကပ်ခြင်းနှင့်ပေါင်းစပ်ခြင်းအား UT Southwestern ၏ microarray core မှစံလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ Raw data များသည် Beadstudio software ကို အသုံးပြု၍ နောက်ခံနုတ်ယူပြီး quantile စံပြုခဲ့သည်။ ပုံမှန်ဒေတာ GeneSpring software ကိုသုံးပြီးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ကြသည်နှင့် genelists p <1.3 ၏ non- တင်းကြပ် p- တန်ဖိုးကို cutoff နှင့်အတူဒွန်တွဲတဲ့ 0.05 ခြံပြောင်းလဲမှု cutoff ၏အရေးပါမှုကိုစံသုံးပြီးထုတ်ပေးခဲ့ကြသည်။
ကျနော်တို့တော်တော်များများအကြောင်းပြချက်ဤဒေတာအတွက်ယုံကြည်စိတ်ချမှုတစ်ခုမြင့်မားတဲ့ဒီဂရီကိုထိန်းသိမ်းရန်။ ပထမဦးစွာအားလုံးတိရိစ္ဆာန်များတူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင်, တစ်ချိန်တည်းမှာ, ကိုင်တွယ်ကုသနဲ့ဦးသေဆုံးခဲ့သည်။ အဖြစ်ကောင်းစွာအပေါင်းတို့, RNA နှင့်စစ်ခင်းကျင်းအပြောင်းအလဲနဲ့တစ်ချိန်တည်းမှာဖျော်ဖြေခဲ့ပါတယ်။ ဒုတိယအချက်မှာကျနော်တို့ (အားဖြင့်တစ်ဦးချင်းစီအမျိုးမျိုးပြောင်းလဲမှုကြောင့်ကွဲပြားမှုအသေးအဖွဲများနှင့်စာရင်းအင်းပါဝါတိုးမြှင့်, triplicate Array ကိုဖျော်ဖြေခြင်းနှင့်စစ်ခင်းကျင်းနမူနာနှုန်းမျိုးစုံတိရိစ္ဆာန်များထို့နောက်ပါတီအသီးသီးမှS9) ။ ဤအစံ intersite reproducibility နှင့်မြတ်နှင့် intraplatform reproducibility ၏မြင့်မားသောဘွဲ့များကိုအတည်ပြုပြီအဖြစ်တတိယကျွန်တော်တို့ရဲ့လေ့လာမှုများအတွက်အသုံးပြုသော data တွေကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာစံ (ပု MicroArray အရည်အသွေးထိန်းချုပ်ရေးစီမံကိန်းကြောင့်အကြံပြုကြသည်S10-S11).
ဗိုင်းရပ်စ် virus သယ်ဆောင်ဆောက်လုပ်ခြင်း
ကြောင့်ဗိုင်းရပ်စ်အားနည်းချက်ကိုသွင်းအရွယ်အစားကန့်သတ်ခြင်း, wildtype G9a (G9a) သို့မဟုတ် catalytically သေပြီ G9a (G9aH1093K) ဖြစ်စေဘို့ coding ပာလူ့ချက်ချင်းအစောပိုင်း cytomegalovirus ကမကထ (CMV) (ပု G1005a များ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် GFP ဖော်ပြသည့် bicistronic p9 + HSV plasmid သို့ subcloned ခဲ့ကြသည် ဒါဆို insertion အရွယ်အစား AAV-3.96 virus သယ်ဆောင်များအတွက်အများဆုံးသွင်းအရွယ်အစားထက်ကျော်လွန်အရာ ~ 2 kb) ဖြစ်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ IE4 / 5 ကမကထ G9a စကားရပ်မောင်း။ Klenow နှင့်အတူတုံးအဆုံး ligations PmeI နှင့် EcoRI (pcDNA1005 ထံမှ) G9a ကြေညက်ခြင်းနှင့် CIP EcoRI အစာခြေအောက်ပါ p3.1 + ကုသကုသမှတဆင့်အပိုင်းအစများကိုအဆိုပါ bicistronic p1005 + HSV plasmid သို့ subcloned ခဲ့ကြသည်။ HSV-ΔJunD-GFP ထုတ်လုပ်မှုများအတွက် EcoRI ကန့်သတ်က်ဘ်ဆိုက်များအားဖြင့် flanked ΔJunD၏နိုင်တဲ့ coding sequence ကိုပု EcoRI site ကိုပါဝင်တဲ့ primer oligonucleotides သုံးပြီး PCR အားဖြင့်ထုတ်ပေးခဲ့ခြင်းဖြစ်သည်။ အဆိုပါ PCR ထုတ်ကုန်ထို့နောက် p1005 + အားနည်းချက်ကို၏ EcoRI site ကိုသို့ ligated ခဲ့သည်။ ဖော်ပြထားသကဲ့သို့ NAc အာရုံခံအတွက် Cre recombinase ၏ဒေသခံစကားရပ် (တစ်ဦး AAV အားနည်းချက်ကိုသုံးပြီးဗိုင်းရပ်စ်-mediated ဗီဇပေးပို့နေဖြင့်အောင်မြင်ခဲ့ပါသည်S12) ။ Cre မှ GFP သို့မဟုတ် GFP တစ်ဦး N-terminal ကိုပေါင်းစပ်တဲ့ splice အလှူရှင်လက်ခံ sequence ကိုနှင့် polyadenylation signal ကိုအတူ CMV ကမကထင်တစ်ဦး recombinant AAV-2 အားနည်းချက်ကိုသို့ subcloned ခဲ့သည်။ အားလုံးအားနည်းချက်ကို INSERT dideoxy-အစီအစဉ်ကအတည်ပြုပေးခဲ့သည်။ ဗိုင်းရပ်စ် virus သယ်ဆောင် (ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့တစ်ဦးသုံးဆ-transfection, အထောက်အ-အခမဲ့နည်းလမ်းကို အသုံးပြု. ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်S13) ။ သန့်ဗိုင်းရပ်စ် -80 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာသိမ်းဆည်းထားခဲ့ပါတယ်။ ဗိုင်းရပ်စ်ရဲ့အရည်အသွေး HEK293 ဆဲလ်တွေအတွက်အကဲဖြတ်ကူးစက် titer အားဖြင့်အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ AAV-ΔFosB-GFP ဗိုင်းရပ်စ်အလားတူပြင်ဆင်ထားခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါ IE4 / 5 ကမကထဆန့်ကျင်အဖြစ် HSV-Cre အဘို့, Cre စကားရပ် (တွေ့မြင် Cre စကားရပ် minimize နှင့်အာရုံခံအဆိပ်တားဆီးနိုင်ရန်အတွက်, တစ်ခု IRES ကမကထမောင်းနှင်ခဲ့သည် S14 ) ဗိုင်းရပ်စ်ဆောက်လုပ်ရေးသည်။ အားလုံးကိစ္စများတွင်ဗိုင်းရပ်စ် overexpression နှစ်ဦးစလုံး, အတည်ပြုခဲ့သည် စသည်တို့အတွက် နှင့် Vivo အတွက်, qPCR မှတဆင့်များနှင့်ဗိုင်းရပ်စ် immunohistochemically ခွဲစိတ်အောက်ပါ NAc-ကန့်သတ်စကားရပ်ဖော်ပြရန်အတည်ပြုခဲ့သည်ခဲ့ကြသည်။
Stereotaxic ခွဲစိတ်ကုသ
ketamine အောက် (100 / ကီလိုဂရမ် mg) / xylazine (10 မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်) မေ့ဆေး, ကြွက်ငယ်လေးတစ်-တိရိစ္ဆာန် stereotaxic တူရိယာထဲမှာနေရာယူထားခဲ့ကြသည်, ထို cranial မျက်နှာပြင်ထိတွေ့ခဲ့သည်။ ပြွတ်တစ်ခါသုံးဆေးထိုးအပ်မြန်မာနိုင်ငံသထောင့်ဒီဂရီတစ် 0.5 မှာ NAc သို့ဗိုင်းရပ်စ်ပိုး၏μl 10 မသွားအောင်ရန်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်သုံးဆယ်သုံးရက် gauge (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) μl / မိနစ် 0.1 တစ်မှုနှုန်းမှာ။ AAV virus သယ်ဆောင်လက်ခံရရှိအပြုအမူစမ်းသပ်ခြင်းအတွက်အသုံးပြုကြွက်အေးစက်နေရာချထားခံရမီ 2 နေ့ရက်ကာလအဘို့ကိုပြန်လည်ဖေါ်ထုတ်ရန်ခွင့်ပြုခဲ့သည်စဉ် HSV ထိုးလက်ခံရရှိတိရစ္ဆာန်များ, ခွဲစိတ်အောက်ပါ 20 နေ့ရက်ကာလအဘို့ကိုပြန်လည်ဖေါ်ထုတ်ရန်ခွင့်ပြုခဲ့သည်။ ဤရွေ့ကားကြိမ်နှစ်ခု virus သယ်ဆောင်ဘို့လုပျသငျဗိုင်းရပ်စ်-mediated Transgene စကားရပ်၏ကာလနှင့်ကိုက်ညီဖြစ်ကြသည်။ BIX01294 တာဟာအဘို့နှစ်ခု Mini-ပန့်များတစ်ခုချင်းစီမောက်ရဲ့ကျောဘက်မှာအရေပြားအောက်ဆုံး positioned ခဲ့ကြသည်။ Cannulae နေရာချထားမှုကိုအဆိုပါ NAc အထက်တွင်ငယ်နှစ် cranial တွင်းတူးအသုံးပြုပုံနှင့် bregma ထံမှ cannula များ၏ပို့ဆောင်မှုအားဖြင့် (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) အောင်မြင်ခဲ့ကြသည်။ ကြွက်အောက်တွင်ဖော်ပြထားသကဲ့သို့ကင်းဖို့ရာအရပျအေးစက်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအစမပြုမီ 4 ရက် 5 များအတွက်ခွဲစိတ်ရာမှပြန်လည်နာလန်ထူရန်ခွင့်ပြုခဲ့သည်။
အေးစက်သောအရပ် preference ကို
ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ထိုအရပ်ကိုအေးစက်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအောက်ပါပြုပြင်မွမ်းမံ (အတူကောက်ယူခဲ့သည်S7) ။ အတိုချုပ်အားဖြင့် HSV-G3a-GFP၊ HSV-G9aH9K-GFP သို့မဟုတ် HSV-GFP ၏အပြန်အလှန် NAc ထိုးသွင်းမှုသုံးခုပြီးနောက်ကြွက်များကိုပတ် ၀ န်းကျင်သုံးခုပါ ၀ င်သောအေးစက်ခန်းများထဲသို့ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အေးစက်နေသောအခန်းနှစ်ခုအနက်မှသိသိသာသာကြိုက်နှစ်သက်သောကြွက်များအားလေ့လာမှုမှ (တိရိစ္ဆာန်များအားလုံး၏ <၁၀%) မှဖယ်ထုတ်ထားသည်။ ဆက်လက်တည်ရှိနေနိုင်သည့်မည်သည့်အခန်းလိုက်ဘက်လိုက်မှုအတွက်ညှိရန်အုပ်စုများကိုမျှမျှတတညှိနှိုင်းခဲ့သည်။ နောက်ရက်များ၌တိရိစ္ဆာန်များကိုဆားဖြင့်ထိုးသွင်းပြီးနေ့လည်ပိုင်းတွင်မိနစ် ၃၀ ခန့်အခန်းတစ်ခန်းထဲထည့်သွင်းကာကိုကင်း (၁၀ မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်၊ ip) ဖြင့်ထိုးသွင်းခဲ့ပြီးညနေပိုင်း၌အခြားအခန်းသို့မိနစ် ၃၀ ကြာည (၂) ရက်ခန့်ချုပ်ထားသည်။ ဆားနှစ်ခုကိုကင်းတွဲဖက်မှု) ။ စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်သည့်နေ့တွင်ကြွက်များကိုကုသမှုမပေးဘဲမိနစ် ၂၀ အတွင်းပြန်လည်ထားရှိခဲ့ပြီးမည်သည့်အပိုင်းကိုပိုမိုနှစ်သက်ကြောင်းစစ်ဆေးရန်စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ မူးယစ်ဆေးဝါးကုထုံး၏ထိရောက်မှုကိုသေချာစေရန်ကိုကင်းနှင့်သက်ဆိုင်သည့်အခန်းများအတွင်းရှိရောင်ခြည်ဖြာထွက်ခြင်းများမှတစ်ဆင့်ကိုကင်း၏ Locomotor တုံ့ပြန်မှုများကိုအကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ AAV နှင့် BIX1093 CPP စမ်းသပ်ချက်များအတွက်အနည်းငယ်ပြုပြင်ထားသော protocol ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ တိရိစ္ဆာန်များကိုနောက်တဖန်ဆား (သို့) ကိုကင်း (၁၀ မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်၊ ip) ဖြင့်ထပ်မံထိုးသွင်းခဲ့ပြီးမိနစ် ၃၀ အတွင်းတိကျတဲ့အခန်းများသို့ပြန်လည်အပ်နှံခဲ့သည်။ သို့သော် ၄ ရက်တစ်ရက်လျှင်တစ်ကြိမ်သာပြုလုပ်ပြီးနောက် ၅ ရက်တွင်စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ည ဦး ယံ၌နှင့်အေးစက်ကုသမှု alternated ခဲ့ကြသည်။ အုပ်စုအားလုံးအတွက်၊ အခြေခံအားဖြင့်ရွေ့လျားသောရွေ့လျားမှုကိုဆားကိုတုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့်ရွေ့လျားမှုကိုဗိုင်းရပ်စ် (သို့) inhibitor ကုသမှုမှမထိခိုက်စေရန်သေချာစေသည်။
သွေးကြောသွင်းကင်း Self-အုပ်ချုပ်ရေး
အထီးဆယ်ကျော်သက်ကလေးကို Long-အီဗန်ကြွက်, ထိုစမ်းသပ်မှုရဲ့အစမှာ 230-250 ဂရမ်အလေးချိန်ရယူခဲ့ကြသည်။ အတူ: သူတို့ (12 နံနက် 9 မှာချွတ်ထွန်း) / တစ်ပြောင်းပြန် 00 နာရီအလင်းအပေါ်တစ်ဦး humidity- နှင့်အပူချိန်-controlled ပတ်ဝန်းကျင်လည်းမှောင်မိုက်သံသရာသျောခဲ့ကြသည် ကြော်ငြာ libitum အစားအစာနှင့်ရေရရှိမှု။ ကြွက်ကသူတို့အသစ်သောပတ်ဝန်းကျင်တွင် acclimate ခွင့်ပြုခဲ့သည်များနှင့်စမ်းသပ်မှုများမစတင်မှီ 1 တစ်ပတ်နေ့စဉ်ကိုင်တွယ်ခဲ့သည်။ အားလုံးလုပျထုံးလုပျနညျးဓာတ်ခွဲခန်းတိရစ္ဆာန်များ၏စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုများအတွက်ကျန်းမာရေးလမ်းညွှန်အမျိုးသားအင်စတီကျုနှင့်အညီကောက်ယူခဲ့ကြခြင်းနှင့်သိနာတောင်ပေါ်ရဲ့တိရိစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုကော်မတီကအတည်ပြုပေးခဲ့သည်။ အဆိုပါ Self-အုပ်ချုပ်ရေးပစ္စည်းကိရိယာများ locomotor အပြုအမူတိုင်းတာရန်နီအောက်ရောင်ခြည်ထုပ်နှင့်အတူတပ်ဆင်ခဲ့သည်။ self-အုပ်ချုပ်ရေးယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည် (S15-S16) isoflurane (2.4-2.7%) မေ့ဆေးအောက်မှာလက်ျာ jugular သွေးကြောထဲသို့ implants ပြွန်နှင့်အတူ။ ပြွန်များကို 0.1 U heparin နှင့် ampicillin (10 mg / kg) ပါ ၀ င်သောဆားအရည်၏ ၀.၁ ml ဖြင့်သုတ်လိမ်းခဲ့သည်။ တစ်ပတ်ခွဲစိတ်ကုသမှုမှပြန်လည်နာလန်ထူပြီးနောက်ကိုယ်ပိုင်အုပ်ချုပ်ရေးသင်တန်းသည်အလင်း / အမှောင်သံသရာ၏အမှောင်ထုအဆင့်တွင်စတင်ခဲ့သည်။ တိကျသောအချိုးအစား -၁၁ (FR50) အားဖြည့်သည့်အစီအစဉ်အရတိရိစ္ဆာန်များအားကိုကင်း (၀.၇၅ မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ် / ပြုတ်ရည်) ကိုနေ့စဉ် ၃ နာရီအသုံးပြုခွင့်ပေးခဲ့သည်။ (၆) ရက်အကြာတွင်ကြွက်များသည်ကိုကင်းပမာဏကိုတည်ငြိမ်စေသည် (၃ ရက်ဆက်တိုက်တုန့်ပြန်မှုနှုန်း ၁၅% ကွဲပြားပြီးအနည်းဆုံး ၇၅% ကလီဗာကိုအားဖြည့်ပေးသည်) ။ ကိုယ်ပိုင်အုပ်ချုပ်ခွင့်ရသည့်အပြီးတွင် ၂၄ နာရီအကြာတွင်ကြွက်များကိုအလျင်အမြန်ခေါင်းဖြတ်သတ်ဖြတ်ခြင်း၊ ဦး နှောက်ကိုလျင်မြန်စွာဖယ်ထုတ်ခြင်းနှင့် RNA သီးခြားခွဲခြားခြင်းနှင့် qPCR အတွက်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
Chromatin immunoprecipitative (chip)
လတ်ဆတ်တဲ့ NAc လာကြတယ် (ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ chip များအတွက် Cross-နှင့်ဆက်စပ်ခြင်းနှင့်ကိုပြင်ဆင် Formaldehyde ခဲ့ကြသည်S17-S18) အသေးစားပြုပြင်မွမ်းမံအတူ။ အတိုချုပ်, တိရစ္ဆာန်နှုန်း 4 14-gauge NAc လာကြတယ် (နမူနာနှုန်းထို့နောက်ပါတီအသီးသီးမှ 5 တိရိစ္ဆာန်များ) -1 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာအေးခဲနေသောမတိုင်မီ 2% Formaldehyde နှင့်အတူလက်ဝါးကပ်တိုင်နှင့်ချိတ်ဆက်ထားသော, စုဆောင်း 80 M က glycine နှင့်အတူမီးမငြိမ်းခဲ့ကြသည်။ 1 နေ့ကသံလိုက်ပုတီး Anti-G9a (ယုန် polyclonal chip တန်း) သို့မဟုတ် Anti-H3K9me2 (mouse ကို monoclonal chip တန်း) တစ်ခုခုကိုနှင့်အတူသင့်လျော်သောသံလိုက်ပုတီး incubating ကပြင်ဆင်ခဲ့ကြသည် IgG (မိုးရွာသွန်းမှု antibody ကိုပေါ် မူတည်. ) Sonic, သိုး Anti-ယုန် / mouse ကိုအမြည်းမှကြိုတင် နေ့ချင်းညချင်း 4 မှာပဋိပိတ်ပင်တားဆီးမှုဖြေရှင်းချက်အတွက်စဉ်ဆက်မပြတ်လည်ပတ်အောက်မှာကို C °။ တစ်ရှူး Sonic နှင့် chromatin မှေးကိုယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့ကြ (S17) ။ Sonic ပြီးနောက် chromatin ၏တန်းတူပြင်းအားသစ်ကိုပြွန်လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်များနှင့်နောက်ဆုံးထုတ်ကုန်များ၏ ~ 5% '' input ကို '' ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ်အစေခံသိမ်းဆည်းခံခဲ့ရသည်။ အဆိုပါ conjugation ပုတီး / antibody ကိုအရောနှောများစေ့စေ့စပ်စပ်အဝတ်လျှော်ခြင်းနှင့် resuspension ပြီးနောက် antibody ကို / ပုတီးအရောနှောများတန်းတူ volumes ကို (~ 7.5 μg antibody ကို / နမူနာ) တစ်ဦးချင်းစီ chromatin နမူနာထည့်သွင်းခဲ့ကြခြင်းနှင့် 16 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာစဉ်ဆက်မပြတ်လည်ပတ်အောက်မှာ ~ 4 နာရီနွေးထွေးစွာရှိနေပြီး။ နမူနာတစ်ခု PCR သန့်စင်ကိရိယာအစုံသုံးပြီးညအိပ် DNA ကိုသန့်စင်မတိုင်မီထပ်မံဆေးကြောခဲ့ကြခြင်းနှင့် 65 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ Cross-နှင့်ဆက်စပ် reverse ။ DNA ကိုသန့်စင်ပြီးနောက်နမူနာ qPCR အကြောင်းမဲ့နှင့်၎င်းတို့၏သင့်လျော်သော '' input ကို 'ရန်ပုံမှန်ကြ၏ (ယခင်ကဖော်ပြထားသကဲ့သို့ထိန်းချုပ်S17) ။ မောက် polyclonal Anti-IgG antibody ကိုသုံးပြီးပုံမှန် mouse ကို IgG immunoprecipitative လည်း signal ကိုချဲ့ထွင်၏သင့်လျော်သောသန့်စင်ဘို့ထိန်းချုပ်ဖို့ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့ကြသည်။ အက်ဒနင်း phosphoribosyltransferase (APRT) ကိုကင်းနှင့်အΔFosB overexpression စမ်းသပ်ချက်တစ်ခုအနှုတ်လက္ခဏာကိုထိန်းချုပ်အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည်။ မြင် ဖြည့်စွက်ဇယား S5 ကမကထ primer ပာသည်။
Dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
Vivo အတွက်အာရုံခံ shape သုက်ပိုးပုံသဏ္ဌာန်၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းအတွက် G9a ၏အခန်းကဏ္ဍကိုလေ့လာဖို့, ကျွန်တော်အရင်ကအောက်ပါပြုပြင်မွမ်းမံ (နဲ့အတူဖော်ပြထားနည်းလမ်းများအသုံးပြုခဲ့S1) ။ သုံးရက် G9a များတွင်အသုံးပြု HSV-GFP, HSV-G57a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (အားလုံးဗိုင်းရပ်စ် wildtype C6Bl / 9J ကြွက်များတွင်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်), သို့မဟုတ် HSV-Cre-GFP (၏ဆေးထိုးပြီးနောက်FL / FL ဗိုင်းရပ်စ်စကားရပ်အကျယ်ချဲ့စဉ်အခါ, ကြွက် perfused ခဲ့ကြသည်ကြွက်), ဦးနှောက် cryoprotected နောက်ပိုင်းတွင်တစ်ဦး vibratome အပေါ် 100 μmမှာ sectioned ခဲ့ကြသည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသကဲ့သို့ကဏ္ဍများထို့နောက် (Immunohistochemistry ကိုကြည့်ပါ) GFP ဆန့်ကျင်ကာ antibody ကို အသုံးပြု. immunostained ခဲ့ကြသည်။ ကျောရိုးနံပါတ်များပေါ်တွင် G9a overexpression နှင့်နောက်ကောက်၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများအကဲဖြတ်ရန်အဖြစ်ΔJunD overexpression ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုမှကျနော်တို့ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့်အာရုံခံဆဲလျနှုန်း 1-2 neurites GFP-ဖော်ပြ NAc အလတ်စားကနေအလယ်တန်း dendrites အနည်းဆုံး 299 μmတန်းတူအပေါ်ကျောရိုး၏နံပါတ်တိုင်းတာ spiny အာရုံခံ (MSNs) ။ MSNs HSV အဓိကအားဒီဦးနှောက်ဒေသတွင်း၌အာရုံခံဖော်ပြ DARPP-32 (ကူးစက်ကြောင်းညွှန်ပြသည့် NAc အခြားအာရုံခံလူဦးရေအဖြစ်ယခင်အစီရင်ခံစာများအနေဖြင့် morphologically ကွဲပြားဖြစ်ကြောင်းပေးထားS19), ကျနော်တို့ MSNs သီးသန့်ဒီလေ့လာမှုတွေအတွက်အကဲဖြတ်ခဲ့ကြသည်ယုံကြည်ကြသည်။ တစ်ခုချင်းစီကိုတိရိစ္ဆာန်, ကြှနျုပျတို့ပျမ်းမျှတန်ဖိုးအားစာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာများအတွက်တစ်ဦးချင်းစီတိရိစ္ဆာန်အဘို့အရယူခဲ့သောပြီးနောက်အုပ်စုတစ်စုနှုန်း 6-8 တိရိစ္ဆာန်များ (3 အုပ်စုများ), အတွက် ~ 4-7 အာရုံခံဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ NAc ကျောရိုးသိပ်သည်းဆအပေါ်ΔFosB overexpression ၏သက်ရောက်မှုဆန်းစစ်ဖို့ဒီဇိုင်းစမ်းသပ်ချက် AAV virus သယ်ဆောင်အချိန်တိုးချဲ့ကာလ (8 ရက်သတ္တပတ်) အတွက် GFP သို့မဟုတ်ΔFosB-GFP ထုတ်ဖော်ပြောဆိုဖို့အသုံးပြုခဲ့ကြသည်သောချွင်းချက်အတူအထက်တွင်ဖော်ပြထားကြောင်းမှအလားတူသယ်ဆောင်ခဲ့ကြသည်။ အားလုံး HSV ပုံရိပ်တွေ (AAV ပုံရိပ်တွေဟာ 100X ရေနံ-နှစ်မြှုပ်ခြင်းရည်ရွယ်ချက်နှင့်အတူဖမ်းဆီးရမိခဲ့သည်) တစ်ဦး 63X ရေနံ-နှစ်မြှုပ်ခြင်းရည်ရွယ်ချက်နှင့်အတူတစ်ဦး confocal ဏုသုံးပြီးသိမ်းပိုက်ခဲ့ကြသည်။ ပုံရိပ်တွေ 1 မတရားယူနစ်မှာပေါက်ကိုဖောက်ပေးထားတယ်အစုံနှင့် 1024 × 1024 ဘောင်အရွယ်အစားနှင့်အတူဝယ်ယူခဲ့ကြသည်။ Dendritic အရှည် NIH Image ကို J ကို software ကိုသုံးပြီးတိုင်းတာခဲ့သည်နှင့်ဆလိုက်ကြိုတင်စမ်းသပ်စကင်ဖတ်စစ်ဆေးဖို့မှ coded ခဲ့ကြသည်အဖြစ်ကျောရိုးနံပါတ်များ, မူလတန်းစမ်းသပ်နေဖြင့်မျက်စိကန်းရေတွက်ခဲ့သည်။ dendrite ၏ 10 μmနှုန်းကျောရိုး၏ပျမ်းမျှအရေအတွက်ကတွက်ချက်ခဲ့သည်။
စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
One- နှင့် Two-လမ်း ANOVAs conditional ရာအရပျ preference ကိုနှင့်ပိုမိုထက်အုပ်စုနှစ်စုနှင့်အတူ dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာဘို့အဓိပ်ပာယျသတျမှတျဖျော်ဖြေခဲ့ကြသည်။ ကျောင်းသားရဲ့အ t ကိုစမ်းသပ်မှု qPCR အနောက်ပိုင်းချေ, G9a အတွက် HSV-Cre မှ HSV-GFP နှိုင်းယှဉ် dendritic ကျောရိုးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအပါအဝင်အခြားနှိုင်းယှဉ်မှုအတွက်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်FL / FL ကြွက်တွေ, microarray ဆန်းစစ်ခြင်းများပြုလုပ်ထားခြင်း (အထက်တွင်ကြည့်ပါ) နှင့် chromatin immunoprecipitation စမ်းသပ်ချက်။ မူးယစ်ဆေးဝါးကုသမှုနှင့်ဗိုင်းရပ်စ်၏အဓိကသက်ရောက်မှုများအတည်ပြုချက်နှင့်အတူ osFosB အလွန်အကျွံဖိအားပေးပြီးနောက် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကို ANOVA ၏နှစ်ဖက်သဘောထားဆန်းစစ်မှုအပြီးတွင်စီစဉ်ထားသောကျောင်းသား၏စစ်ဆေးမှုများကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ပုံ၏ဒဏ္inာရီတွင်ပါ ၀ င်သည့်တန်ဖိုးအားလုံးသည်±± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001) ကိုကိုယ်စားပြုသည်။ အသေးစိတ်စာရင်းအင်းဆန်းစစ်ခြင်းများပြုလုပ်ထားခြင်း သင်္ဘောသဖန်းသီး။ 1-3 အသေးစိတ်ပုံ Legends အပါအဝငျစာရင်းအင်းများ: main စာသားထဲမှာအတွက်ပေးအပ်ထားတယ်။
အောက်ခြေမှတ်ချက်များ
ငါပစ္စည်းများအဘယ်သူအားမျှခံစားပိုင်ခွင့်ရှိသည်လက်ရေးမူများမှာတွေ့နိုင်ပါတယ်အတွင်းထည့်သွင်းကြောင်းအတည်ပြု ကင်း-သွေးဆောင်ပလပ်စတစ်ထဲမှာ Histone Methyltransferase G9a ၏မရှိမဖြစ်လိုအပ်သောအခန်းက္ပ ယခင်ကထုတ်ဝေခြင်းသို့မဟုတ်အင်တာနက်ပေါ်ရှိအပါအဝင်အခြားနေရာများတွင်ထည့်သွင်းစဉ်းစားအောက်မှာရှိပါတယ်ပါပြီ။
တိရိစ္ဆာန်များ၏အသုံးပြုမှုနဲ့ပတ်သက်တဲ့အားလုံးအလုပ်တက္ကသိုလ်တက္ကဆက်ပြည်နယ်၏အနောက်တောင်ပိုင်း Medical Center မှာနဲ့ဆေးပညာသိနာတောင်ပေါ်ကျောင်းနှစ်ဦးစလုံးမှာအဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာနှင့် IACUC လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီကောက်ယူခဲ့သည်။
ကိုးကားနှင့်မှတ်စုများ
;