proc Natl Acad သိပ္ပံအမေရိကန်အေ 2005 ဖေဖော်ဝါရီလ 1; 102(5): 1737-1742 ။
ြဒပ်မဲ့သော
ကိုကင်း, အလွဲသုံးစားမှုတစ်ဦးမူးယစ်ဆေးဝါး, axon ဆိပ်ကမ်းမှာ dopamine reuptake ပိတ်ဆို့ခြင်းအားဖြင့် striatum အတွက် Synaptic dopamine အဆင့်ဆင့်တိုးပွားစေပါသည်။ Cyclin-မှီခို kinase 5 (Cdk5) နှင့်၎င်း၏ Active p35, postmitotic အာရုံခံအတွက်အလွှာ၏ phosphorylation တွင်ပါဝင်ပတ်သက်ပရိုတိန်း, ကိုကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့ပြီးနောက်တက်-စညျးမဉျြးစညျးကမျးဖြစ်တွေ့ရှိခဲ့ကြသည်။ နောက်ထပ် striatal dopamine အချက်ပြအပေါ် Cdk5 နှင့် p35 သော induction ၏သက်ရောက်မှုဆန်းစစ်ဖို့ကျနော်တို့ Cdk5 သို့မဟုတ် p35 အာရုံခံအတွက်အထူး overexpressed ခဲ့သည့်အတွက်နှစ်ဦးကိုလွတ်လပ်သော Transgene mouse ကိုလိုင်းများ generated ။ ကျနော်တို့ကိုကင်း-mediated dopamine အချက်ပြ၏ကို attenuation စေပါတယ်, p5 ၏ရလဒ်အဖြစ်မဟုတ်ဘဲ Cdk35 overexpression ၏, Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတိုးလာကြောင်းဤနေရာတွင်သတင်းပို့ပါ။ Thr-5 မှာ dopamine နဲ့စခန်း-စညျးမဉျြးစညျးကမျး phosphoprotein, မော်လီကျူးအစုလိုက်အပြုံလိုက် 32 KDA (DARPP-32) ၏တိုးလာ Cdk75-mediated phosphorylation ဖြင့်လိုက်ပါသွားခဲ့ခြင်းဖြစ်သည် Thr-32 မှာ DARPP-34 ၏ phosphorylation လျော့နည်းသွားသည်။ Thr-5 မှာ extracellular signal ကို-စညျးမဉျြးစညျးကမျး kinase kinase 1 ၏တိုးလာ Cdk286-mediated phosphorylation ဖြင့်လိုက်ပါသွားခဲ့သည် extracellular signal ကို-စညျးမဉျြးစညျးကမျး kinase 1 / 2 ၏ activation လျော့နည်းသွားသည်။ ဤရွေ့ကားသက်ရောက်မှုစခန်းတုံ့ပြန်မှုဒြပ်စင်-binding ပရိုတိန်းအဖြစ် striatum အတွက်က c-fos တစ်ပြောင်သော induction ၏ကင်း-သွေးဆောင် phosphorylation ၏ကို attenuation မှလှူဒါန်းခဲ့သည်။ ဤရလဒ်သည် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုနာတာရှည်ကင်းမှထိတွေ့မှုနှင့်ဤအရပ်မှသက်ရောက်မှုကိုကင်းစွဲအခြေခံအာရုံခံ function ကိုအတွက်အချိန်ကြာမြင့်စွာတည်တံ့အပြောင်းအလဲများကိုပြီးနောက်ပြောင်းလဲဗီဇစကားရပ်တွင်ပါဝင်ပတ်သက်ကြောင်းအယူအဆကိုထောက်ခံပါတယ်။
ကိုကင်း (အ striatum အတွက် Synaptic dopamine အဆင့်ဆင့်တိုးပွါးနှင့်နျူကလိယဖို့ dopamine D1 အဲဒီ receptor ကနေကနဦးအချက်ပြပြန့်ပွားကြောင်း intracellular လမ်းကြောင်းကိုသက်ဝင်အားဖြင့် dopaminoceptive အာရုံခံအတွက်မျိုးဗီဇစကားရပ်ပွောငျးလဲ1) ။ ကိုကင်းစွဲအတွက်အာရုံခံအလိုက်သင့်ပြောင်းလဲနေထိုင်အခြေခံမှထင်ကြသည်ဗီဇစကားရပ်ထဲတွင်အချိန်ကြာမြင့်စွာတည်မြဲအပြောင်းအလဲများကို (ထဲမှာရရှိလာတဲ့အများအပြားကူးယူအချက်များ-ထိန်းညှိတက်ကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့မှု2) ။ ထိုကဲ့သို့သောကူးယူအချက်အဖြစ်ဖော်ထုတ်ΔFosB, (3), (ကိုကင်းမှတိရစ္ဆာန်များ၏အမူအကျင့်တုန့်ပြန်မြှင့်တင်ရန်ပြသထားသည်4, 5) ။ ထို့ကြောင့်, ΔFosBသော induction နေဖြင့်စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်ကြသည်ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇ၏မှတ်ပုံတင်ကိုကင်းစွဲအခြေခံမော်လီကျူးယန္တရား၏ကြီးမြတ်သောနားလည်မှုအထောက်အကူပြုလိမ့်မည်ဟုမျှော်လင့်နေသည်။ မကြာသေးမီကကင်းနှင့်အတူတိရစ္ဆာန်များ၏နာတာရှည်ကုသမှုကို up-ထိန်းညှိသည့် cyclin-မှီခို kinase 5 (Cdk5) ၏စကားရပ်နှင့်၎င်း၏ Active p35 ပြထားပြီးအဆိုပါ striatum အတွက်ΔFosB၏ induction မှတဆင့် (6, 7).
Cdk5 serine / threonine kinases ၏ Cdk မိသားစုအဖွဲ့ဝင်တစ်ဦးဖြစ်ပါတယ်။ ဆဲလ်-သံသရာတိုးတက်မှု၏အဓိကအားပြိုင်မှုတွေဟာအခြား Cdks မတူဘဲ, Cdk5 postmitotic အာရုံခံအတွက်အလွှာ၏ phosphorylation အတွက်အဓိကအားဖြင့်ပါဝင်ပတ်သက်ဖြစ်ပါသည် (8) ။ Cdk5 လှုပ်ရှားမှု၏အာရုံခံတိကျတဲ့အများစု postmitotic အာရုံခံအတွက်ထုတ်ဖော်ပြောဆိုထားတဲ့ p35 သို့မဟုတ် p39, (ဖြစ်စေ၎င်း၏လှုပ်ရှားမှုများနှင့်အတူအသင်းအဖွဲ့မှတဆင့်အောင်မြင်ခဲ့တာဖြစ်ပါတယ်8) ။ ဦးနှောက်ဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် Cdk5 ၏မရှိမဖြစ်အခန်းကဏ္ဍအပြင် (9, 10), မင်းt ကိုလည်း (postnatal ဦးနှောက်ထဲမှာ dopaminergic ဂီယာ်ပတ်သက်နေထားပြီး11, 12) ။ အဆိုပါ striatum အတွက်တိုးမြှင့် dopamine လွှတ်ပေးရန်အတွက် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုရလဒ်များကို၏တားစီး, dopamine လွှတ်ရာအပျက်သဘောဆောင်သောစည်းကမ်းထိန်းသိမ်းရေးအဖြစ် Cdk5 တစ် presynaptic function ကိုညွှန်ပြ (11) ။ Camp-မှီခို kinase (PKA) ၏တစ်ဦး inhibitor သို့ DARPP-5 ပြောင်းပေးထားတဲ့ Thr-32 မှာထို့အပြင် Cdk32 dopamine- နှင့်စခန်း-စညျးမဉျြးစညျးကမျး phosphoprotein phosphorylating အားဖြင့် postsynaptic dopamine အချက်ပြ၏ထိရောက်မှု modulates, မော်လီကျူးအစုလိုက်အပြုံလိုက် 75 KDA (DARPP-32) (12).
ယင်းတွေ့ရှိချက် Cdk5 နှင့် p35 dopamine ၏ကြာရှည် activation ၏မြစ်အောက်ပိုင်းအားပြိုင်မှုကိုကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့ပြီးနောက်အချက်ပြခြင်းနှင့်ဤအရပ်မှကိုကင်းစွဲအတွက်ဖြစ်ကြောင်းအကြံပြုအပ်ပါသည်။ နောက်ထပ် striatal dopamine အချက်ပြအပေါ် Cdk5 ၏အခန်းကဏ္ဍကိုဖြေရှင်းရန်ကျနော်တို့ Cdk5 သို့မဟုတ် p35 ဖြစ်စေသည့် p35 ကမကထများ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင်အာရုံခံအတွက်အထူး overexpressed ခဲ့သည့်အတွက်နှစ်ဦးကို Transgene mouse ကိုလိုင်းများ generated ။ ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက် Cdk5 လှုပ်ရှားမှု p35 ပရိုတိန်း၏အဆငျ့မှုနှုန်း-ကန့်သတ် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုအတွက်ကြောင်းအကြံပြု, Cdk35 ပရိုတိန်း p5 ပရိုတိန်း၏တိုးချဲ့အဆင့်ဆင့်နှင့်အတူစည်းမျဉ်းသတ်မှတ်-up, ဒါပေမယ့်မဟုတျကွောငျးဖျောပွခဲ့။ ကျနော်တို့ကဒီမှာပေး Vivo အတွက် p5 overexpression ၏ရလဒ်အဖြစ်, Cdk35 လှုပ်ရှားမှုတိုးလာကြောင်းသက်သေအထောက်အထား, အ PKA နှင့် extracellular signal ကို-စညျးမဉျြးစညျးကမျး kinase (ERK) ကက်စကိတ်တစ်ခုတားစီးကနေတဆင့်နျူကလိယမှအချက်ပြကိုကင်း-mediated dopamine ၏ကို attenuation စေပါတယ်။
ကုန်ကြမ်းနှင့်နည်းစနစ်များ
ပဋိ။ Cdk5 (ကို C-8) နှင့် p35 (ကို C-19) မှ Polyclonal ပဋိ Santa Cruz ဇီဝနည်းပညာထံမှဝယ်ယူခဲ့သည်။ ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 နှင့်စခန်း-တုံ့ပြန်မှုဒြပ်စင်-binding ပရိုတိန်း (CREB) မှအဆိုပါ phosphorylation-မှီခိုနှင့် -independent ပဋိဆဲလ် signal နည်းပညာ (Beverly, MA) မှရရှိသောခဲ့ကြသည်။ phospho-Thr-34 DARPP 32 ဖို့ပဋိ (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), စုစုပေါင်း DARPP-32 (12), နှင့်က c-fos (14) ဖော်ပြထားအဖြစ်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ actin တစ်ခု antibody ကို Sigma ထံမှဝယ်ယူခဲ့သည်။
စမ်းသပ်တိရစ္ဆာန်များ။ ကျနော်တို့အစောပိုင်းကမောက် p35 ဗီဇပုံတူမျိုးပွား Cdk5r1, p35 ပရိုတိန်း encodes, နှင့်၎င်း၏ Genomics ဖွဲ့စည်းပုံမှာသွင်ပြင်လက္ခဏာအရာ (15) ။ p35 (Tgp35), အ 6-kb ၏အာရုံခံ overexpression အတူ Transgene mouse ကိုထုတ်လုပ်ဖို့ ပဲ့တင်သံRI-ပဲ့တင်သံ(-) ကို 1.2-kb ကမကထဒေသပါဝင်သော RI ကအပိုင်းအစတစ်ခု pGEM9Z သို့ subcloned ခဲ့သည် plasmid နှင့် SV45 ကနေဆင်းသက်လာတဲ့ 40-BP tag ကိုအဆိုပါသို့ထည့်သွင်းခဲ့သည် Kpnငါ Poly ၏မြစ်အောက်ပိုင်းဆိုဒ် (တစ်ဦး+) signal ကို (သဖန်းသီး။ 1A) ။ အဆိုပါ tag ကိုတစ်ဦးပါရှိသော Speတိရစ္ဆာန်၏ genotype အဘို့ငါ site ကို။ အဆိုပါ 6-kb အပိုင်းအစအဆိုပါ plasmid ထံမှ excised နှင့်စင်ကြယ်အောင် ပြု. , အရ Transgene ကြွက် generate ဖို့ Transgene ၏ pronuclear ဆေးထိုးခြင်းဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ 1.2-kb p35 ကမကထ၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းထိန်းချုပ်မှုအောက်ရှိ Transgene ၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးပရိုဖိုင်းကိုဆနျးစစျဖို့ Vivo အတွက်တစ်ဦးကို double Transgene mouse ကို (Tgp35; p35 - / -) နောက်ထပ် Tgp35 mouse ကိုတစ်ဦး endogenous p35-တရားမဝင်သောနောက်ခံ regenerated ခဲ့သည့်တစ်ဦး Two-ခြေလှမ်းမွေးမြူရေးနည်းဗျူဟာ အသုံးပြု. ထုတ်လုပ်ပြီးခဲ့သည်။ (Cdk35 +/- နှင့် Cdk35 (TgCdk5) ၏အာရုံခံ overexpression အတူ Transgene mouse ကို - / - ဒီလေ့လာမှုအတွက်အသုံးပြုသည်အခြား mouse ကိုမော်ဒယ်များ p5 +/-, p5 ပါဝင်သည်9, 16, 17) ။ ဤအကြွက်၏ genotype အမြီးခန္နေခွဲထုတ် Genomics DNA ကိုပေါ်တောင်ပိုင်းချေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသို့မဟုတ် PCR ဖြစ်စေဖျော်ဖြေကဆုံးဖြတ်ခဲ့ကြသည်။ ကြွက်တစ်ဦး 12-ဇအလင်း / 12-ဇမှောင်မိုက်သံသရာအောက်မှာသျောခဲ့ကြသည်။ အားလုံးစောင့်ရှောက်မှုဓာတ်ခွဲခန်းနှင့်စမ်းသပ်ဆဲတိရိစ္ဆာန်များ၏စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုအပေါ်ကနျြးမာရေးလမ်းညွှန်ချက်များအမျိုးသား Institutes နှင့်အတူလိုက်နာမှု၌ပေးသောခဲ့သည်။
တောင်ပိုင်းချေအားသုံးသပ်ခြင်း။ အမြီးခန္ထံမှထုတ်ယူ Genomics DNA ကိုနှင့်အတူကြေညက်ခဲ့သည် ပဲ့တင်သံRI ကနှင့် Speတစ်ဦး 0.9% agarose ဂျယ်လ်အပေါ် electrophoresed ငါနှင့်နိုင်လွန်အမြှေးပါးပေါ်ကိုလွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။ အဆိုပါအမြှေးပါးကျပန်း-ရစေတယ်နှင့်အတူ hybridized ခဲ့သည် 3242 မှာ, P-label တပ်ထားသောစုံစမ်းစစ်ဆေးနေ့ချင်းညချင်းကို C °။ 485'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-35 'နှင့် 35'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-35': (- - / p5) p3 နောက်ကောက်၏ genotype များအတွက် 5-BP စုံစမ်းစစ်ဆေးခြင်းနှင့် Tgp3 ကြွက်အောက်ပါ primer အသုံးပြု. PCR အားဖြင့်ထုတ်ပေးခဲ့ခြင်းဖြစ်သည်။ အဆိုပါ Hybrid အမြှေးပါး 2 မိဘို့ 0.1 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ% SDS 42 × SSC / 10 နှစ်ခုကြိမ်ဆေးကြောခြင်းနှင့် 0.1 နှစ်ခုကြိမ် 0.1 မိဘို့ 65 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ% SDS SSC / 20 ×နှင့်က x-ray ရုပ်ရှင်နှင့်ထိတွေ့ခဲ့သည်။
မူးယစ်ဆေးကုသမှု။ ကိုကင်း (Sigma) မြုံဆားအတွက်ဖျက်သိမ်းခံခဲ့ရသည်။ တိရစ္ဆာန်များ ip-ထိုးသွင်းကင်း (15 mg / kg) သို့မဟုတ် 3 လအသက်အရွယ်မှာဆားတစ်ဦးတန်းတူအသံအတိုးအကျယ်နှင့်ဆေးထိုးပြီးနောက်ကွဲပြားခြားနားသောအချိန်အချက်များ (15, 30, 60 နှင့် 120 မိနစ်) မှာယင်းသို့ခေါင်းဖြတ်စီရင်သတ်ဖြတ်ခဲ့ကြသည်။ ဦးနှောက်လျှင်မြန်စွာဖယ်ရှားခြင်းနှင့်ရေခဲ-အအေး PBS အတွက် chilled ခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါ striata ပြီးတော့အထဲကခွဲဖြာနှင့်မြောက်ပိုင်းသို့မဟုတ် Western ချေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအကြောင်းမဲ့ခဲ့ကြသည်။ immunohistochemical ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာဘို့, striatal ကဏ္ဍများကိုဆေးထိုးပြီးနောက်ကြွက် 2 ဇထံမှရရှိသောခဲ့ကြသည်။
မြောက်ပိုင်းချေအားသုံးသပ်ခြင်း။ စုစုပေါင်း RNA (TRIzol ဓါတ်ကူပစ္စည်း (Invitrogen ဘဝ Technologies က, Carlsbad,, CA) နှင့်အတူ striata ထံမှထုတ်ယူနဲ့ဖော်ပြထားသကဲ့သို့မြောက်ပိုင်းချေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအကြောင်းမဲ့ခဲ့သည်18) ။ ဖော်ပြထားသကဲ့သို့က c-fos mRNA ၏ထောက်လှမ်းဘို့, mouse ကိုက c-fos cDNA တစ် 189-BP အပိုင်းအစတစ်အာကာသယာဉ်အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့ပါတယ် (19) ။ က c-fos mRNA ၏အဆင့်ဆင့် nih ပုံရိပ်ကိုဆော့ဖ်ဝဲ, ဗားရှင်း 1.62 နှင့်အတူပုံတစ်ပုံကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုစနစ်ကို အသုံးပြု. တိကျသောတီးဝိုင်းများ၏ optical သိပ်သည်းဆကိုတိုင်းတာနေဖြင့် quantified ခဲ့ကြသည်။
အနောက်တိုင်းချေအားသုံးသပ်ခြင်း။ Striatal တစ်ရှူး 1% SDS အတွက် sonicated နှင့် 10 မိဘို့အပြုတ်ခဲ့ကြသည်။ တစ်ခုချင်းစီကိုနမူနာထဲမှာပရိုတိန်းအာရုံစူးစိုက်မှု BCA ပရိုတိန်း assay (ပီယပ်) ကဆုံးဖြတ်ထားခဲ့ပါတယ်။ ပရိုတိန်း၏တန်းတူပမာဏတစ် nitrocellulose အမြှေးပါးပေါ်သို့ပြောင်းရွှေ့မခံရမီ SDS / စာမကျြနှာဖွငျ့ကွဲကွာခဲ့သည်။ အဆိုပါအမြှေးပါး 1 ပိတ်ဆို့ထားခဲ့ကြသည် PBS 5% အကြမ်းဖျဉ်းဖတ်နို့နှင့် 0.05% Tween 20 ်နှင့် 4 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာနေ့ချင်းညချင်းမူလတန်းပဋိနှင့်အတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီး×။ peroxidase-conjugation Anti-မောက်စ်သို့မဟုတ်ယုန် IgG (Sigma) နဲ့ပေါက်ဖွား 60 မိဘို့အခန်းအပူချိန်မှာဖျော်ဖြေခဲ့ပါတယ်။ တစ်ဦးက signal ကိုတိုးမြှင် chemiluminescence (ပီယပ်) ကရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်နှင့်အထက်တွင်ဖော်ပြခဲ့သကဲ့သို့တပ်သားများ၏ optical ထု quantified ခဲ့ကြသည်။
Cdk5 Kinase assay ။ Striatal lysates သော pH 50 / 7.4 MM NaCl / 50 MM EDTA / 5% ထရီ X-1 / 100mMDTT / 1 MM phenylmethylsulfonyl ဖလိုရိုဒ်ဓာတ် / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / 1 MM Tris ပါဝင်သည်ဟုတစ် lysis ကြားခံ· HCl နှင့်အတူကိုပြင်ဆင်ခဲ့ကြသည် ml ကို leupeptin / phosphatase inhibitors (phosphatase inhibitor အရောအနှောငါနှင့် II ကို, Sigma) ။ အဆိုပါ lysates Anti-Cdk5 (ကို C-8) သို့မဟုတ် Anti-p35 (ကို C-19) ပဋိဖြစ်စေနှင့်အတူ immunoprecipitated ခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါ Cdk5 immunoprecipitative ပရိုတိန်း A-agarose ပုတီး၏μl 300 နှင့်အတူထပ်မံပေါက်ဖွား (300 အားဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက်နေ့ချင်းညချင်း 5 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ Anti-Cdk3 antibody ကို (4 μg) နဲ့ (ပရိုတိန်း၏μg 25 မှသက်ဆိုင်ရာ) က lysate ၏ 50 μl၏ပေါက်ဖွားကပြင်ဆင်ခဲ့ကြသည် အဆိုပါ lysis ကြားခံအတွက်% slurry; Santa Cruz ဇီဝနည်းပညာ) 3 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာ 4 ဇသည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသကဲ့သို့ p35 immunoprecipitative ၏ပြင်ဆင်မှုအဘို့, (ပရိုတိန်း၏မီလီဂရမ် 500 မှသက်ဆိုင်ရာ) က lysate ၏ 1 μl Anti-p35 antibody ကို (3 μg) နဲ့နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့သည်။ အဆိုပါ immunoprecipitative HCl, သော pH 50 / 7.4 MM MgCl · 5 MM Tris ပါဝင်သည်ဟုတစ် kinase ကြားခံနှင့်နှစ်ကြိမ် lysis ကြားခံနှင့်နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်2အဆိုပါ kinase ကြားခံ၏ 1 μlအတွက် resuspended / 1 MM EDTA / 1 MM EGTA / 60 MM DTT ။ Kinase လှုပ်ရှားမှု (အလွှာအဖြစ် histone H1 အသုံးပြု. တိုင်းတာခဲ့သည်18).
Immunohistochemistry ။ ကြွက် avertin (250 မီလီဂရမ် / ကီလိုဂရမ်, Fluka) ၏ ip ထိုးခြင်းဖြင့် anesthetized နှင့် Streck တစ်ရှူး Fixative (Streck Laboratories, la Vista က, NE), non-crosslinking fixative အားဖြင့်နောက်တော်သို့လိုက် 0.1 M ကဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ကြားခံ, သော pH 7.4 အတူ transcardially perfused ခဲ့ကြသည်။ ခှဲစိတျဦးနှောက်ကနောက်ထပ် 37 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာအတူတူပင် fixative နေ့ချင်းညချင်းအတွက် fixed ခဲ့ကြသည်။ ထို့နောက်ဦးနှောက် 5-μm-ထူ Coronal ကဏ္ဍများသို့ဖြတ်ကာအလွှာအဖြစ် diaminobenzidine နှင့်အတူ avidin-ဓါတ်-peroxidase ရှုပ်ထွေး technique ကို (Vector Laboratories) ကို အသုံးပြု. immunohistochemistry အကြောင်းမဲ့, paraffin အတွက် embedded ခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါကဏ္ဍများ 4 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာက c-fos နေ့ချင်းညချင်းဆန့်ကျင်ကာဆှဖှေဲ့-ကိုစင်ကြယ်စေ polyclonal antibody ကိုအတူနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါအစွန်းအထင်းတိကျတဲ့မူလတန်း antibody ကို၏ပျက်ကွက်ခြင်းဖြင့်အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။
ရလဒ်များ
p35 ၏အာရုံခံ Overexpression နှင့်အတူ Transgene ကြွက်တွေ၏မျိုးဆက်။ p35 ၏တိုးချဲ့အာရုံခံစကားရပ်အောင်မြင်ရန်အသုံးပြုသော Transgene အဆိုပါ 6-kb ကမကထင်သည့်ပုံတူမျိုးပွားကြွက် p35 ဗီဇနှင့် p1.2 ၏တစ်ခုလုံးကို coding sequence ကို (များ၏ 35-kb အပိုင်းအစဖွဲ့စည်းသဖန်းသီး။ 1 A) ။ / - - ကြွက်များ၏ genotype တစ် p35 ခွဲခြားရန်ဒီဇိုင်းရေးဆွဲခဲ့စုံစမ်းစစ်ဆေး အသုံးပြု. တောင်ပိုင်းချေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာကဆုံးဖြတ်ခဲ့ကြသည်ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်မှ Tgp35 ကြွက် (သဖန်းသီး။ 1 A နှင့် B)။ p1.2 စကားရပ် Transgene မှသာမောင်းနှင်ခဲ့သည့်အတွက်, ယင်း 35-kb p35 ကမကထ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်ရှိ Transgene စကားရပ်ဆနျးစစျဖို့ကျနော်တို့ကို double Transgene ကြွက် (- - / p35 Tgp35) ထုတ်လုပ်ပြီး။ Tgp35 အတွက် p35 စကားရပ်; p35 - / - ကြွက် (သာဦးနှောက်ထဲမှာလေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 1C), အ Spatial စကားရပ်ပုံစံ (ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်၏ဆင်တူရှိရာသဖန်းသီး။ 1D) ။ p35 မရှိခြင်း (ကြွက်၏ဦးနှောက် cortex နဲ့ hippocampus အတွက်ပုံမှန်မဟုတ်တဲ့အလွှာဖွဲ့စည်းပုံမှာမှုပြခဲ့ပြီး10) ။ သို့သော် Tgp35; p35 - / - (ဦးနှောက် phenotype - / - ကြွက်ဟာ p35 တစ်ဦးပြည့်စုံကယ်ဆယ်ရေးပြသသဖန်းသီး။ 1E) ။ ဤရွေ့ကားအချက်အလက်များကို 1.2-kb p35 ကမကထအဆိုပါ endogenous p35 ဗီဇကနေ p35 ၏တစ်အလားတူစကားရပ်ပရိုဖိုင်းကိုအတူ Transgene ၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးထိန်းချုပ်ထားကြောင်းညွှန်ပြ။
အဆိုပါ p35 ပရိုတိန်းအဆင့်နှုန်း-ကန့်သတ် Cdk5 လှုပ်ရှားမှု၏ Up ကို-Regulation အဘို့ဖြစ်ပါတယ်။ / - - ကျနော်တို့ p35 ထံမှ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူအတွက်ပရိုတိန်းစကားရပ်အပေါ် p5 နှင့် Cdk35 ကုဒ်သွင်းသည့်မျိုးဗီဇ၏မျိုးဗီဇ-သောက်သုံးသောသက်ရောက်မှုဆန်းစစ်, p35 +/-, ရိုင်း-type အမျိုးအစား, Tgp35, Cdk5 +/- နှင့် TgCdk5 ကြွက် 3 လနှစ်အရွယ်တွင်။ p35 နှင့် Cdk5 ပရိုတိန်း၏အဆင့်ဆင့် (အသီးသီးတို့သည်ဗီဇဆေးညွှန်းနှင့်အတူကောင်းစွာဆက်နွယ်နေကြောင်းသဖန်းသီး။ 2 A နှင့် B) ။ Cdk35 ပရိုတိန်းပါဝင်မှုနှုန်း p1.6 ပရိုတိန်း၏ကွဲပြားခြားနားသောအဆင့်ဆင့်အားဖြင့်ထိခိုက်ခဲ့ကြသော်လည်း Tgp35 ကြွက်, ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်နှင့်အတူနှိုင်းယှဉ်ပါက p5 ပရိုတိန်းအဆင့်တစ်ခု≈35-ခြံတိုးပြသခဲ့သည်။ p5 ပရိုတိန်းပါဝင်မှုနှုန်း Cdk1.9 ပရိုတိန်း၏ကွဲပြားခြားနားသောအဆင့်ဆင့်အားဖြင့်ထိခိုက်ခဲ့ကြသော်လည်း TgCdk5 ကြွက်, ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်နှင့်အတူနှိုင်းယှဉ်ပါက Cdk35 ပရိုတိန်းအဆင့်တစ်ခု≈5-ခြံတိုးပြသခဲ့သည်။ Cdk35 လှုပ်ရှားမှုအပေါ် p5 ပရိုတိန်း၏ကွဲပြားခြားနားသောပမာဏ၏သက်ရောက်မှုဆန်းစစ်ရန်, Cdk5 Anti-Cdk5 antibody ကိုနှင့် kinase လှုပ်ရှားမှုနှင့်အတူ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူထံမှ immunoprecipitated ခဲ့သည်ကိုတိုင်းတာခဲ့ပါတယ်။ အလားတူပင် kinase လှုပ်ရှားမှုအပေါ် Cdk5 ပရိုတိန်း၏ကွဲပြားခြားနားသောပမာဏ၏သက်ရောက်မှုဆန်းစစ်ရန်, p35 Anti-p35 antibody ကိုအတူ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူထံမှ immunoprecipitated ခဲ့ပါတယ်နှင့် kinase လှုပ်ရှားမှုတိုင်းတာခဲ့သည်။ Cdk5 လှုပ်ရှားမှု p35 ပရိုတိန်း၏အဆင့်နှင့်အတူကောင်းစွာဆက်နွယ်နေကြောင်းသော်လည်းမ Cdk5 ပရိုတိန်း၏အဆင့် (နှင့်အတူသဖန်းသီး။ 2 C နှင့် D) ။ ဤရလဒ်သည် p35 ပရိုတိန်းပမာဏကို Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတစ်မှုနှုန်း-ကန့်သတ်အချက်ကြောင်းညွှန်ပြ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် striatal dopamine အချက်ပြအပေါ်တိုးမြှင့် Cdk35 လှုပ်ရှားမှုများ၏သက်ရောက်မှုကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်မှ Tgp5 ကြွက်တွေကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။
Thr-32 မှာ DARPP-34 ၏ကင်း-သွေးဆောင် Phosphorylation Tgp35 ကြွက်တွေအတွက် Attenuated သည်။ DARPP-32 ရဲ့လုပ်ဆောင်ချက် (မျိုးစုံကိုက်ဘ်ဆိုက်များမှာယင်း၏ phosphorylation ပြည်နယ်ပေါ်တွင်မူတည်သည်20) ။ Cdk32 Thr-34 မှာ DARPP-5 phosphorylates သော်လည်း PKA, Thr-32 မှာ DARPP-75 phosphorylates ။ ထို့ကြောင့်ကျွန်တော်ရိုင်း-type နှင့် Tgp32 ကြွက်တွေကနေ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူအတွက် DARPP-35 ၏ phosphorylation ပြည်နယ်ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ phospho-Thr-75 DARPP-32 များ၏အဆင့် (Tgp35 ကြွက်တွေမှာပိုမိုမြင့်မားခဲ့သဖန်းသီး။ 3A; 1.6) ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်၏တန်ဖိုးအထက် 0.2-ခြံ±။ ကျနော်တို့လာမယ့် striatal dopamine အချက်ပြအပေါ်တိုးမြှင့် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုများ၏သက်ရောက်မှုအကဲဖြတ်။ ကျနော်တို့ Thr-35 မှာ DARPP-32 ၏ phosphorylation ပြည်နယ်ခွဲခြားစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် Tgp34 ကြွက်တွေထဲမှာကိုကင်း-သွေးဆောင် PKA activation ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ phospho-Thr-34 DARPP-32 များ၏အဆင့်ကို (ကိုကင်းဆေးထိုးပြီးနောက်ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက် 15 မိတိုးမြှင့်ခဲ့ပါတယ်သဖန်းသီး။ 3B; 1.8) ကို Basal မျက်နှာပြင်အထက် 0.2-ခြံ±။ သို့သော် DARPP-34 ၏ Thr-32 phosphorylation အပေါ်ကိုကင်းများ၏အကျိုးသက်ရောက်မှု Tgp35 ကြွက် (1.2-ခြံဟာ Basal မျက်နှာပြင်အထက် 0.3 ±) တွင် attenuated ခဲ့သည်။ ဤရလဒ်သည် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတစ်ခုတိုးဖြစ်ကောင်း Thr-32 (မှာ DARPP-75 phosphorylation မှတဆင့်ကင်း-သွေးဆောင် PKA activation attenuated ကြောင်းညွှန်ပြ6, 12) ။ ဒါဟာ presynaptic Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတစ်ခုတိုး dopamine လွှတ်ပေးရန်လျော့နည်းသွားစေပါတယ်ကြောင့်လည်းဖြစ်နိုင်သည်, ဤကိုကင်းများ၏လျှော့အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုအထောက်အကူပြုရန်ဖြစ်သည်။ အထူးသ, ကင်း၏တစ်ခုတည်းသောဆေးထိုး (p35 နှင့် Cdk5 ပရိုတိန်း၏အဆင့်ဆင့်အဖြစ် kinase လှုပ်ရှားမှုမထိခိုက်ခဲ့ပါသဖန်းသီး။ 3 C နှင့် D) ။ ဤသည်ကို up-ထိန်းညှိကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့မှုပြသခဲ့ပြီးသည့်အတွက်ယခင်လေ့လာမှုမှမတူဘဲ p35 နှင့် Cdk5 (၏ဟူသောအသုံးအနှုနျးဖြစ်ပါသည်6).
up-Regulation Cdk5 လှုပ်ရှားမှု၏ ERK1 / 2 ၏ကင်း-သွေးဆောင် Activation Attenuates ။ မကြာသေးမီကအထောက်အထားများအ striatum အတွက် dopamine အဲဒီ receptor ကို Activation လည်း ERK လမ်းကြောင်းအပါအဝင်အခြားအချက်ပြကက်စကိတ်, (မြှင့်လုပ်ဆောင်ကွောငျးဖျောပွသ21, 22), ကိုကင်းဖို့အမူအကျင့်တုံ့ပြန်မှု (အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍရှိပါတယ်ရာ23) ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုဟာ ERK လမ်းကြောင်း၏ကင်း-သွေးဆောင် activation ကိုထိခိုက်စေခြင်းငှါ, ရှိမရှိဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ ERK လမ်းကြောင်း၏ activation SER-1 နှင့် SER-2 (ထို Basal မျက်နှာပြင်အထက် 217 ± 221-ခြံ) မှာ ERK1.5 ၏ MEK0.2 / 1 ၏တိုးလာ phosphorylation အားဖြင့်အဖြစ်ထင်ရှား, ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်တွေကနေ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူအတွက်ကိုကင်းဆေးထိုးပြီးနောက်လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည် (Thr-2 နှင့် Tyr-202 (204 အဆိုပါ Basal မျက်နှာပြင်အထက် 2-ခြံ± ERK1.5 phosphorylation) မှာ / 0.2သဖန်းသီး။ 4 A နှင့် B) ။ သို့သျောလညျးကို (Basal မျက်နှာပြင်အထက် 1 ± 2-ခွံ) MEK1.2 / 0.2 ၏, ထိုကင်း-သွေးဆောင် activation နှင့် ERK1 / 2 (ERK2 phosphorylation: 1.2 အဆိုပါ Basal မျက်နှာပြင်အထက် 0.2-ခြံ±) ၏ (Tgp35 ကြွက်တွေမှာ attenuated ခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 4 A နှင့် B) ။ ဒီလမ်းကြောင်းသစ်ကစာရင်းအင်းသိသိသာသာမဟုတ်ခဲ့သော်လည်းထိုမှတပါး, phospho-ERK1 / 2 ၏ Basal အဆင့်ဆင့်, (35 0.8-ခြံရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်၏တန်ဖိုးကိုအောက်တွင်±) Tgp0.2 ကြွက်တွေမှာအနိမ့်ခဲ့ကြသည်။ ဒါကအဆုံးစွန်သောရလဒ် catalytic လှုပ်ရှားမှု (တစ်ကျဆင်းခြင်းအတွက်ရရှိလာတဲ့, Thr-5 မှာ MEK1 ၏ Cdk286-မှီခို phosphorylation မှစွပ်စွဲစေခြင်းငှါ24) ။ ဒီဖြစ်နိုင်ချေအကဲဖြတ်ရန်, ငါတို့ Thr-1 မှာ MEK286 ၏ phosphorylation ပြည်နယ်ဆန်းစစ်နှင့် phospho-Thr-286 MEK1 ၏အဆင့်မြင့် Tgp35 ကြွက် (ထံမှ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူအတွက်ပစ္စုပ္ပန်ကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့ရသည်သဖန်းသီး။ 4C; 1.3) ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်၏တန်ဖိုးအထက် 0.1-ခြံ±။ ထို့အပွငျ Thr-1 မှာ MEK286 ၏ phosphorylation ပြည်နယ် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုကုသမှုကြောင့်ထိခိုက်မခံခဲ့ရသောတွေ့ရှိချက် (နဲ့အတူတသမတ်တည်း, ကင်း၏တစ်ခုတည်းသောဆေးထိုးခြင်းဖြင့်ပြောင်းလဲမခံခဲ့ရသဖန်းသီး။ 3D).
ယင်းနျူကလိယမှ Dopamine signal ၏ဝါဒဖြန့်တိုးမြှင့် Cdk5 လုပ်ဆောင်ချက်အားဖြင့် Attenuated သည်။ PKA နှင့် ERK ပါဝင်သောမျိုးစုံအချက်ပြကက်စကိတ်၏ကင်း-သွေးဆောင် activation SER-133 (မှာယင်း၏ phosphorylation မှတဆင့်နျူကလိယထဲတွင်ကူးယူအချက် CREB ၏နောက်ဆက်တွဲ activation မှဦးဆောင်22, 25) ။ PKA နှင့် ERK အပေါ် Cdk5-mediated inhibitory သက်ရောက်မှု activation ကက်စကိတ်နျူကလီးယပ်အတွက် CREB phosphorylation အပေါ်ဆုံစေခြင်းငှါရှိမရှိစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်, ငါတို့ရိုင်း-type နှင့် Tgp133 ကြွက်တွေကနေ striatal ကောက်နုတ်ချက်များထုတ်ယူအတွက် SER-35 မှာ CREB ၏ phosphorylation ပြည်နယ်ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ phospho-CREB ၏ Basal အဆင့် (Tgp35 ကြွက် (ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်၏တန်ဖိုး၏ 0.7 ± 0.1-ခွံ) တွင်အနိမ့်ခဲ့သဖန်းသီး။ 5) ။ 1.5 ± 0.1- (ကိုကင်း၏ဆေးထိုးဖို့တုန့်ပြန်မှာတော့ phospho-CREB ၏အဆင့် (35 1.2-ခြံဟာ Basal မျက်နှာပြင်အထက်±) ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်များ၏ striatum တိုးမြှင့်ခဲ့ပါတယ်, ဒါပေမယ့်ကင်းရန်ဤတုံ့ပြန်မှု Tgp0.1 ကြွက်တွေမှာ attenuated ခဲ့သည် ) ကို Basal မျက်နှာပြင်အထက်ခေါက် (သဖန်းသီး။ 5).
SER-133 မှာ CREB ၏ Phosphorylation (အက c-fos ဗီဇအပါအဝင်အချို့မျိုးဗီဇ၏ကမကထဒေသတွင်း၌တစ်စခန်းတုံ့ပြန်မှုဒြပ်စင်မှတဆင့်၎င်း၏မှတ်တမ်းလှုပ်ရှားမှုကြီးထွားများပြားစေ26) ။ ထိုကြောင့်ငါတို့သည်ကင်းဆေးထိုးပြီးနောက်ရိုင်း-type နှင့် Tgp35 ကြွက်များ၏ striatum အတွက်က c-fos ၏ induction ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ (ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်များတွင်က c-fos mRNA ၏အဆင့်ကိုကင်း၏ဆေးထိုးပြီးနောက် (1.8 ± 0.2-ခြံဟာ Basal မျက်နှာပြင်အထက်) မှာအထွတ်အထိပ်တန်ဖိုး 30 မိတိုးတက်ခဲ့ပြီးနောက်ပိုင်းတွင်ဆေးထိုးပြီးနောက် 120 မိအားဖြင့် Basal အဆင့်အထိပြန်ရောက်သဖန်းသီး။ 6 A နှင့် B) ။ သို့သော်က c-fos mRNA ၏အဆင့်ဆင့် (ထိုဆေးထိုးပြီးနောက် 30 မိသည်အထိရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်တွေမှာထက် Tgp35 ကြွက်တွေမှာ≈30% နိမ့်ခဲ့ကြသဖန်းသီး။ 6 A နှင့် B) ။ Tgp35 ကြွက်တွေမှာက c-fos များ၏အပြောင်သော induction နောက်ထပ် (immunohistochemistry အားဖြင့် corroborated ခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 6 C-F) ။ ကိုကင်းအုပ်ချုပ်ရေးရိုင်း-type နှင့် Tgp35 ကြွက်နှစ်ဦးစလုံးအတွက်ပြင်းထန်စွာ striatum ရဲ့ dorsomedial-dorsocentral အစိတ်အပိုင်းများအတွက်ကိုအားနည်းစွာဟာနှစ်ဦးနှစ်ဖက်အစိတ်အပိုင်းများအတွက်က c-fos immunoreactivity တိုးတက်လာခဲ့သည်။ သို့သော်က c-fos-immunopositive ဆဲလ်အရေအတွက်ထဲမှာကိုကင်း-သွေးဆောင်တိုးအထူးသ (Tgp35 ကြွက်များ၏ striatum အတွက် attenuated ခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 6G) ။ အတူတကွဤရလဒ်များနျူကလိယမှအချက်ပြ striatal dopamine ၏ကင်း-mediated တိုးမြှင့်, Tgp35 ကြွက်တွေမှာတိုးလာ Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတစ်ခုဖြစ်နိုင်ဖွယ်ရလဒ်ဘယျလိုမှခဲ့ကြောင်းညွှန်ပြ။
ဆွေးနွေးမှု
Cdk5 နှင့်ကိုကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့ up-စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်ကြသည်ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇအဖြစ်ဖော်ထုတ်ခဲ့ကြ p35 က၎င်း၏လှုပ်ရှားမှုများ (6). ကျနော်တို့ကဒီမှာ striatal အာရုံခံအတွက်အချက်ပြကိုကင်း-mediated dopamine ၏ကို attenuation စေပါတယ်, ထ-စည်းမျဉ်းမဟုတ်ဘဲ Cdk5 ထက်တက်-စည်းမျဉ်း p35 ၏ရလဒ်အဖြစ်, Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတိုးလာကြောင်းသက်သေအထောက်အထားသတင်းပို့ပါ။ striatal dopamine အချက်ပြအပေါ် Cdk5 သို့မဟုတ် p35 ဖြစ်စေ၏တက်-စညျးမဉျြးစညျးကမျးစကားရပ်၏အကျိုးဆက်များကိုဆနျးစစျဖို့, နှစ် Transgene mouse ကိုလိုင်းများ, TgCdk5 နှင့် Tgp35 ကြွက်, ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ကြသည်။ ကျနော်တို့ Cdk5 လှုပ်ရှားမှု p35 ပရိုတိန်းတစ်ခုတိုးလာအဆင့်အထိအချိုးအစားကျ၌ထ-စည်းမျဉ်းသတ်မှတ်ခဲ့ကြောင်းတွေ့ရှိရပေမယ့် Cdk5 ပရိုတိန်းတစ်ခုတိုးလာအဆငျ့ဖွငျ့မထိခိုက်ခဲ့ပါတယ်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်အစီရင်ခံစာလှုပ်ရှားမှု Cdk5 immunoprecipitative ( အသုံးပြု. တိုင်းတာသောအခါ TgCdk5 mouse ကိုဦးနှောက်အတွက် Cdk5 လှုပ်ရှားမှုရိုင်း-type အမျိုးအစား mouse ကိုဦးနှောက်အတွက်ထက်နိမ့်ခဲ့ကြောင်းကိုလည်းသရုပ်ပြထားပါတယ်17), p5 အဆင့်ကိုတိုးမြှင့်မပေးလျှင် monomeric Cdk5 တစ်ခုတိုးလာအဆင့်အတွက် Cdk35 overexpression ရလဒ်များကိုအကြံပြုခြင်း။ ဤရလဒ်သည် p35 ပရိုတိန်း၏အဆငျ့ Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတစ်မှုနှုန်း-ကန့်သတ်အချက်ကြောင်းညွှန်ပြ။
Tgp35 ကြွက်တွေကိုကင်းဖို့ striatal တုံ့ပြန်မှုတိုးလာ Cdk5 လှုပ်ရှားမှုအားဖြင့် inhibited ခဲ့အကြံပြုခြင်း, ကင်း၏စူးရှသောဆေးထိုးပြီးနောက် striatum အတွက် CREB phosphorylation နှင့်က c-fos နှစ်ဦးစလုံး၏အငယျဆုံးသောသော induction ပြ။ Tgp35 ကြွက်တွေမှာကင်း-mediated dopamine အချက်ပြ၏ကို attenuation ဖွယ်ရှိ DARPP-5, PKA နှင့် ERK ပါဝင်သောမျိုးစုံအချက်ပြကက်စကိတ်၏ Cdk32-mediated တားစီးမှတဆင့်အောင်မြင်ခဲ့သည်။ ဒီတုန့်ပြန် Tgp32 ကြွက်တွေမှာ attenuated ခံခဲ့ရသော်လည်းကင်းအုပ်ချုပ်ရေး, ရိုင်း-type အမျိုးအစားကြွက်တွေမှာ Thr-34 မှာ DARPP-35 ၏ PKA phosphorylation တိုးတက်လာခဲ့သည်။ Thr-32 မှာ DARPP-34 ၏ PKA phosphorylation CREB ၏ SER-1 (များ၏ dephosphorylation များအတွက်အင်ဇိုင်းတာဝန်ရှိသည်, ပရိုတိန်း phosphatase 1 (PP133) ၏လှုပ်ရှားမှုတားစီးပြခဲ့ပြီး27) ။ ထို့ကြောင့် PP1 လှုပ်ရှားမှု Tgp32 ကြွက်များတွင် DARPP-1 / PP35 လမ်းကြောင်းကနေတဆင့် antagonized လိမ့်မည်မဟုတ်ပေ။
ERK1 / 2 ၏ကင်း-သွေးဆောင် activation လည်း Tgp35 ကြွက်တွေမှာ attenuated ခဲ့သည်။ Cdk5 ERK1 / 2 ၏ကင်း-သွေးဆောင် activation တားစီးနိုင်သည့်အားဖြင့်အများအပြားကွဲပြားယန္တရားများရှိပါတယ်။ ပထမဦးစွာ Thr-5 မှာ DARPP-32 ၏ Cdk75-မှီခို phosphorylation ERK1 / 2 activation လိုအပ်ကြောင်းဆို PKA-mediated MEK1 / 2 activation ၏နောက်ဆက်တွဲတားစီးဖို့ဦးဆောင် PKA တားစီးနိုင်ပါတယ်။ မကြာသေးမီကလေ့လာမှုလည်း, MEK ကို Activation ၏သွယ်ဝိုက်စည်းမျဉ်းပါဝင်သောအဖြစ် striatal-ကြွယ်ဝပြည့်စုံ phosphatase ၏စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းနဲ့ပတ်သက်တဲ့ Thr-32 မှာ DARPP-34 ၏ phosphorylation မျိုးစုံလမ်းကြောင်းအားဖြင့် ERK1 / 2 ၏ကင်း-mediated activation များအတွက်လိုအပ်သော tyrosine တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ် ERK1 / 2 အပေါ်တိုက်ရိုက်ပြုမူကြောင်း phosphatase (28) ။ ဒီဖြစ်နိုင်ခြေများအတွက်ပံ့ပိုးမှု SER-1 နှင့် SER-2 မှာ MEK217 / 221 ၏ကင်း-သွေးဆောင် phosphorylation Tgp35 ကြွက်တွေအတွက်ဖျက်သိမ်းခံခဲ့ရသောတွေ့ရှိချက်များကအကြံပြုထားသည်။ နောက်ထပ်ဖွယ်ရှိလမ်းကြောင်း (၎င်း၏ catalytic လှုပ်ရှားမှုတစ်ခုလျော့ကျမှုနှင့် ERK5 / 1 လှုပ်ရှားမှု၏တားစီးဖို့ဦးဆောင်လမ်းပြလို့ Thr-286 မှာ MEK1 ၏ Cdk2-မှီခို phosphorylation မှတဆင့်ဖြစ်ပါတယ်24).
အဆိုပါ striatum အတွက် Cdk5 လှုပ်ရှားမှု၏တားစီး (တိရိစ္ဆာန်များအတွက်နာတာရှည်ကင်းကုသမှုအပြုအမူသက်ရောက်မှု potentiate ပြထားပြီး6) ။ Cdk5 လှုပ်ရှားမှုတက်-စည်းမျဉ်းထပ်ခါတလဲလဲကင်းအုပ်ချုပ်ရေး၏သက်ရောက်မှု counteracting များအတွက်အာရုံခံလိုက်လျောညီထွေအထောက်အကူပြုစေခြင်းငှါ၎င်းအယူအဆနှင့်ကိုက်ညီ (6), ကျနော်တို့ DARPP-5 နှင့် MEK32 ၏ Cdk1-mediated phosphorylation အဆိုပါ striatum အတွက် CREB phosphorylation နှင့်က c-fos များ၏အပြောင်သော induction အတွက်ရရှိလာတဲ့, ERK1 / 2 ၏ကင်း-သွေးဆောင် activation ၏ကို attenuation မှလှူဒါန်းခဲ့ကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက်ကိုကင်းမှနာတာရှည်ထိတွေ့ပြီးနောက် striatum အတွက်မျိုးဗီဇစကားရပ်ပြောင်းလဲပစ်စေခြင်းငှါ, တက်-စည်းမျဉ်း p5 ၏ရလဒ်အဖြစ်, Cdk35 လှုပ်ရှားမှုတိုးလာသောစိတ်ကူးထောက်ခံပါတယ်။ ဤသည်ထိုကဲ့သို့သော CREB နဲ့ c ကို-fos အဖြစ်ကူးယူအချက်များများ၏လှုပ်ရှားမှုများတွင်အပြောင်းအလဲများမှတဆင့်ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ ထို့ကြောင့် Cdk5 Active p35, Cdk5 လှုပ်ရှားမှုအပေါ်မှုနှုန်း-ကန့်သတ်သက်ရောက်မှု၏သီလအသုံးပြုပုံကိုကင်းစွဲအခြေခံအာရုံခံ function ကိုအတွက်ကြာရှည်ပြောင်းလဲမှုများကိုအထောက်အကူပြုစေခြင်းငှါ.
ကျေးဇူးတင်လွှာ
ကျနော်တို့ DRs ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။ မာရိက Jo Danton, ဖိလိပ္ပု Grant ကများနှင့် Sashi Kesavapany လက်ရေးမူများမှာတွေ့နိုင်ပါတယ်ဝေဖန်စာဖတ်ခြင်းသည်။ ဤလုပ်ငန်းကိုအမေရိကန်ပြည်သူ့ကျန်းမာရေးဝန်ဆောင်မှု Grant က DA01, (ABK ရန်) ကနျြးမာရေး Grant က Z00664DE05-10044 အမျိုးသား Institutes ကထောက်ခံလျက်, Simons ဖောင်ဒေးရှင်းက, အပတေရုသဂျေ Sharp ကဖောင်ဒေးရှင်းနှင့် (PG မှ) အ Picower ဖောင်ဒေးရှင်းမှထောက်ပံ့ငွေခဲ့သည်။
မှတ်စုများ
အတိုကောက်: Cdk5, cyclin-မှီခို kinase 5; ERK, extracellular signal ကို-စညျးမဉျြးစညျးကမျး kinase; DARPP-32, dopamine နဲ့စခန်း-စညျးမဉျြးစညျးကမျး phosphoprotein, မော်လီကျူးအစုလိုက်အပြုံလိုက် 32 KDA; PKA, Camp-မှီခို kinase; MEK, ERK kinase; CREB, Camp-တုံ့ပြန်မှုဒြပ်စင်-binding ပရိုတိန်း။
ကိုးကား
;
