ကြွက် (2011) တွင် Sucrose Self-အုပ်ချုပ်မှုနှင့် CNS activation

ဘာသာရပ်များ။

ဘာသာရပ်များ Simonsen (Gilroy, CA) မှအထီး Albino ကြွက် (325-425 ဂရမ်) ရှိကြ၏။ ကြွက်များကို chow ad libitum တွင်ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ၎င်းတို့သည် ၁၂ း ၁၂ နာရီအလင်းရောင်မှောင်မိုက်သံသရာတွင်ထိန်းသိမ်းထားပြီးမနက် ၆ နာရီတွင်မီးများပါရှိပြီး ၇ နာရီနှင့်မွန်းတည့်ချိန်မှစပြီးအလွန်ကောင်းမွန်ပြီး postabsorptive အခြေအနေတွင်ရှိသည်။ ကြွက်များတွင်ပြုလုပ်သောလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများသည်အမျိုးသားကျန်းမာရေးဌာန၏တိရိစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုလမ်းညွှန်ချက်အတိုင်းလိုက်နာခြင်းနှင့် VA Puget Sound Health Care System ရှိသုတေသနနှင့်ဖွံ့ဖြိုးမှုကော်မတီ၏တိရိစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုနှင့်အသုံးပြုမှုဆပ်ကော်မတီမှအတည်ပြုခဲ့သည်။

Sucrose Self-အုပ်ချုပ်မှု။

လုပျထုံးလုပျနညျး (ကျွန်ုပ်တို့၏ထုတ်ဝေနည်းစနစ်အပေါ်မှာအခြေခံခဲ့ကြ15) နှင့်အောင်ကျွေးကြွက်အပေါ်ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့ကြသည်။ အဆိုပါစမ်းသပ်မှုအဆင့်သုံးဆင့်ပါဝင်သည်: ရစ်ချတ်ဆန်နှင့်ရောဘတ်၏ PR စနစ် algorithm ကိုသုံးပြီးလေ့ကျင့်ရေး, FR လေ့ကျင့်ရေးနှင့်တိုးတက်သောအချိုး (PR စနစ်) လေ့ကျင့်ရေးစတင်ရန် autoshaping (38) ။ အဆိုပါ PR စနစ် algorithm ကို (1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999 လိုအပ်ပါတယ် စသည်တို့) က session တစ်ခုအတွင်းမှာဆုလာဘ်ပေးပို့ဆက်ခံဘို့လီဗာပုံနှိပျ (38) ။ ကြွက်အရည်တစ်စက် receptacle သို့အပ် Self-အုပ်ချုပ်ရေးမှူး 5% sucrose (0.5 ml ကိုဆုလာဘ်) ကိုလေ့ကျင့်သင်ကြားပေးခဲ့သည်။ တစ်ဦး Med Associates (ဂျော်ဂျီယာ, VT) စနစ်ကထိန်းချုပ်ထားအော်ပရေတာသေတ္တာများ, နှစ်ခုခရိုနီခဲ့ပေမယ့်တစ်ဦးတည်းသာလီဗာ (တက်ကြွ, ပြန်လည်ရုပ်သိမ်းပေးရန်လီဗာ) ကိုပြုတ်ရည်စုပ်စက် activated ။ အခြားလီဗာ (တခုလှုပျမရှား, စာရေးကိရိယာလီဗာ) ရက်နေ့တွင် Press ကိုလည်းမှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပါသည်။ ကျွန်တော်ယခင်ကလေ့လာတွေ့ရှိခဲ့ကြသကဲ့သို့, မလှုပ်မရှားလီဗာအပေါ်ပုံနှိပျ၏နံပါတ် (10 / session ကိုတိုက်တွန်းထက်နည်း) အလွန်နိမ့်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ sucrose ဖြေရှင်းချက်ပါးစပ်စားသုံးမှု (Med Associates မှ, စိန့် Albans, VT) အတွက်အရည်တစ်စက် receptacle သို့အပ်ခဲ့သည်။ ကနဦးလေ့ကျင့်ရေးတစ်ဦးစဉ်ဆက်မပြတ်အားဖြည့်အချိန်ဇယားကို (တစ်ဦးချင်းစီလီဗာစာနယ်ဇင်းအားဖြည့်ခဲ့ပါတယ် FR1) အရ 1-ဇအစည်းအဝေးများကာလအတွင်းကောက်ယူခဲ့သည်။ တစ်ခုချင်းစီကို session ကိုတက်ကြွစွာလီဗာ၏သွင်းခြင်းနှင့်တစ်ခုလုံးကို session များအတွက်အပေါ်ကျန်ရစ်တဲ့အဖြူရောင်အိမ်သူအိမ်သားအလင်း၏ illumination နှင့်အတူစတင်ခဲ့သည်။ တစ်ဦးက 5-s ကိုသေံ (2900 Hz, နောက်ခံအထက်တွင် 20 dB) နှင့်အလင်း (တက်ကြွစွာလီဗာအထက်တွင် 7.5 W ကအဖြူရောင်အလင်း) discrete ဝင်း cue တစ် 20-s ကိုအချိန်ထဲက sucrose ပေးပို့နှင့်အတူစတင်နှင့်အတူအသီးအသီးဆုလာဘ်ပေးပို့လိုက်ပါသွား။ FR လေ့ကျင့်ရေး 10 နေ့ရက်ကာလအဘို့ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည်; တည်ငြိမ်တုံ့ပြန်ပဉ္စမ session တစ်ခုခြင်းဖြင့်အောင်မြင်သည်။ PR စနစ်လေ့ကျင့်ရေး 3 နေ့ရက်ကာလအဘို့အများဆုံးဖြစ်နိုင်သော 10 ဇ / နေ့အဘို့အထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည်။ PR စနစ်အစည်းအဝေးများအိမ်တော်ကိုအလင်းကိုအလိုအလျောက်ပိတ်ထားခဲ့ပါတယ်နှင့်တက်ကြွလီဗာပြန်ရုပ်သိမ်းခဲ့သည့်အချက်မှာတုံ့ပြန်မျှမတက်ကြွလီဗာစာနယ်ဇင်းများ၏ 30 မိပြီးနောက်အဆုံးသတ်; ကြွက်အခန်းထဲကယူနဲ့သူတို့ရဲ့နေအိမ်လှောင်အိမ်မှပြန်လာသောခဲ့ကြသည်။ အစီရင်ခံ "Stop အချိန်" စားပွဲတင် 2 စနစ်ပိတ်ထားခဲ့သည့်မှာအချိန်ကိုကိုယ်စားပြု; ထို့ကြောင့်, နောက်ဆုံးတက်ကြွလီဗာစာနယ်ဇင်းမတိုင်မီမှတ်တိုင်အချိန် 30 မိဖြစ်ပွားခဲ့သည်ကြလိမ့်မယ်။ အမူအကျင့်ဒေတာ (စားပွဲတင် 2) ၏ပျမ်းမျှကိုယ်စားပြု အစည်းအဝေးများ 6-10 FR လေ့ကျင့်ရေးအဘို့နှင့် အစည်းအဝေးများ 1-9 PR စနစ်လေ့ကျင့်ရေးဘို့။ control-ကိုင်တွယ်ကြွက်ဟာကြွက် Self-စီမံခန့်ခွဲ sucrose များ၏ကိုင်တွယ်နှင့်အခန်းတစ်ခန်းအတွေ့အကြုံများတူအောင်ဖန်တီးသောကြောင့်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအခန်းတစ်ခန်းအတွင်း, 60 မိသည်အိမ်သူအိမ်သားအလင်းနှင့်အတူအိမ်ရာအခန်းတစ်ခန်းထဲကနေယူပြီးသန့်ရှင်းတဲ့အော်ပရေတာအခန်းနေရာချပေးခဲ့သည်။ သူတို့ကအော်ပရေတာ boxes များအနေဖြင့်အစာစားသို့မဟုတ်သောက်ဘာမှပေးထားသောနှင့်ခရိုနီဖို့လက်လှမ်းမပါခဲ့မခံခဲ့ရပါ။

 

စားပွဲတင် 2 ။

FR နှင့် PR စနစ်ကြွက်အဘို့အမူအကျင့်မှာ parameters

နောက်ဆုံးသောနေ့၌ကြွက်များကိုလေ့ကျင့်ရေးနေ့အရအခန်းထဲတွင်ထားရှိပြီးအခန်းထဲတွင်မိနစ် ၉၀ ကြာအောင်ထားခဲ့ပြီးမေ့ဆေး၊ perfusion နှင့် immunohistochemistry တို့အတွက်ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်သည့်ကြွက်များအားလည်းအခန်းတွင်းသို့ခေါ်ဆောင်သွားပြီးလေ့ကျင့်ရေးရက်များအရ ၉၀ မိနစ်ခန့်အကြာတွင်သန့်ရှင်းစေသည့်အခန်းတွင်ထားကာ၎င်းတို့အားမေ့ဆေးပေးသည်။ ထိုနောက်ဆုံးမိနစ် ၉၀ ကြာသည့်နောက်တွင်ချက်ချင်းပင်ကြွက်များကို isoflurane ရှူရှိုက်မိခြင်းဖြင့်မေ့ဆေးပေးပြီး ၀.၉% NaCl ဖြင့်ရောနှောကာအအေး ၄% paraformaldehyde ဖြေရှင်းချက်ဖြင့်လိုက်သည်။ မေ့ဆေးနှင့် euthanasia များအတွက်အချိန်ကိုက်ဖြစ်ရပ်ပြီးနောက်မိနစ် 90-90 မှာ c-Fos ပရိုတိန်း၏အထွတ်အထိပ်စကားရပ်၏လူသိများအချိန်သင်တန်းအပေါ်အခြေခံခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့် c-Fos ဟူသောစကားရပ်သည်တိရိစ္ဆာန်များ၏လုပ်ဆောင်မှုကိုကြုံတွေ့ရခြင်းနှင့် sucrose စားခြင်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းထက်အပြုအမူဆိုင်ရာတာ ၀ န်အစတွင် CNS ၏သက်ဝင်လှုပ်ရှားမှုကိုထင်ဟပ်လိမ့်မည်။ ဦး နှောက်များကိုရက်ပေါင်းများစွာ paraformaldehyde တွင်ဖယ်ရှားပြီးဖယ်ရှားခြင်း၊ ထို့နောက်သူတို့နောက်ပိုင်းတွင်သူတို့ 90% sucrose-PBS ဖြေရှင်းချက်ထဲမှာနေရာချပြီးလျှင်, ထို့နောက် 0.9% sucrose-PBS ထဲတွင်နေရာချခဲ့သည်။ immunohistochemistry အတွက် ဦး နှောက်ကို cryostat (Leica CM 4S cryostat) တွင်ခွဲထားသည်။

က c-Fos immunohistochemistry နှင့် quantitative ။

ကျနော်တို့ (ဦးနှောက်ကဏ္ဍများအတွက် immunoreactive က c-Fos ပရိုတိန်း quantitate ငါတို့၏ကိုယ်ထူထောင်နည်းစနစ်ကိုအသုံးပြု12) ။ တစ်ခုလုံးကိုဦးနှောက်၏ကနဦးအရည်အသွေးမျက်နှာပြင်က c-Fos စကားရပ်ဘို့ကောက်ယူခဲ့သည်။ တွန်း-တပ်ဆင်ထား 12-μmလုံးဦးနှောက် Coronal ကဏ္ဍများကို PBS (Oxoid, Hampshire ပြည်နယ်, ဗြိတိန်) တွင် 3 ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်။ ကဏ္ဍများထို့နောက် 1% ပုံမှန်ဆိတ်သငယ်သို့မဟုတ်မြည်းသွေးရည်ကြည်များ PBS အတွက်အခန်းအပူချိန်မှာ 5 ဇများအတွက်ပိတ်ဆို့ခဲ့ကြသည်။ ကဏ္ဍများထို့နောက် PBS အတွက်အကြိမ်ပေါင်းများစွာဆေးကြောခြင်းနှင့် PBS ၌ထလုပ်မူလတန်း antibody ကိုဖြေရှင်းချက်ထဲမှာ 4 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှာနေ့ချင်းညချင်းနွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ ကဏ္ဍများ PBS အတွက်သုံးကြိမ်ဆေးကြောပြီးတော့ 1 ဇများအတွက် PBS ၌ထလုပ်အလယ်တန်း antibody ကိုဖြေရှင်းချက်အတွက်အခန်းအပူချိန်မှာမှောင်မိုက်၌နွေးထွေးစွာရှိနေပြီးခဲ့ကြသည်။ ကဏ္ဍများနောက်ပိုင်းတွင် PBS မှာထပ်ဆေးကြောခြင်းနှင့်တပ်ဆင်ထားခြင်းနှင့်ဖုံးအလတ်စား mounting (Vector Laboratories, Burlingame,, CA) Vectashield အတွက်ခက်ခဲ set mounting အလတ်စားချော်ခဲ့သည်။ အပိုင်းဒစ်ဂျစ်တယ်ရုပ်ပုံများကိုတစ်ဦး Optiphot ကင်မရာကိုချိတ်ဆက်ထားပြီးတစ်ဦးက Nikon Eclipse E-800 ချောင်းဏုသုံးပြီးဝယ်ယူခြင်းနှင့် Image ကို Pro ကို Plus အား (မီဒီယာဆက်သွယ်မှုလေ့လာရေး, Silver, နွေဦး, MD) software ကိုသုံးပြီးခဲ့ကြသည်။

နောက်ပိုင်းတွင်ကျနော်တို့ quantitative အဘို့နှင့်အာရုံခံ phenotyping အဘို့, အခြေအနေများအကြားတစ်ဦးသိသာခြားနားချက်ဖေါ်ပြခြင်းဒေသများ၏ကန့်သတ်အရေအတွက်အားအပေါ်သို့အာရုံစူးစိုက်။ အထူးသကျနော်တို့နျူကလိယ accumbens core နဲ့ shell ကို (NAc) အပေါ်သို့အာရုံစူးစိုက်; stria terminalis (aBNST, pBNST) ၏ anterior နှင့် posterior အိပ်ရာနျူကလိယ; medial hypothalamic ဒေသများ [ventromedial နျူကလိယ (VMH), dorsomedial hypothalamus (ဇလဌာန), paraventricular နျူကလိယ (PVN), retrochiasmatic ဧရိယာ (RCh), နှင့် ARC]; dorsal နှင့် ventral ဒေသများနှင့် perifornical (peF) ဧရိယာအပါအဝင်နှစ်ဦးနှစ်ဖက် hypothalamus (LH), VTA; ဦးနှောက်ကို stem [ယုတ်ညံ့သံလွင်, hypoglossal ဆိတ်ညံကျေးရွာအုပ်စု၏ (nXII) နျူကလိယ, နှစ်ဦးနှစ်ဖက် reticular နျူကလိယနှင့် C1 / A1 adrenaline / noradrenaline အရေးပါ] ။ Atlas-လိုက်ဖက် 12-μmအပိုင်း (Paxinos နှင့် Watson ရဲ့ Atlas အပေါ်မှာအခြေခံ, လိုက်ဖက်ကဏ္ဍများနှင့်တိုင်းဒေသကြီးများအတွက်က c-Fos စကားရပ်နှင့် quantitative များအတွက်အကဲဖြတ်ခဲ့ကြသည်34) ။ ကြည့်ပါ ကျေးဇူးပြု. စားပွဲတင် 1 တိကျတဲ့ stereotaxic သြဒီနိတ်သည်။ အဆိုပါ assay ၏အဓိကအာရုံက၎င်း၏သက်ဆိုင်ရာထိန်းချုပ်မှု (; FRC vs. FR PRC vs. PR စနစ်) ဖြင့်အသီးအသီးအမူအကျင့်အလုပ်တခုကိုခိုင်းနှိုင်းဖို့ဖြစ်တယ်။ ထိန်းချုပ်မှုအခြေအနေများ vs. အပြုအမူအပေါ်အခြေခံပြီးဖြစ်နိုင်ခြေကွဲပြားခြားနားမှုပိုကောင်းအောင်လုပ်ဖို့, PR စနစ်နှင့် FR အုပ်စုများထံမှအထွတ်အထိပ်အဆိုတော်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာအတွက်ရွေးချယ်ခဲ့ကြသည်။ ထို့ကြောင့် 4 / 12 PR စနစ်နှင့် 3 / 12 FR ကြွက်ဆန်းစစ်ခဲ့ကြသည်: အဲဒီကြွက်ကသူတို့ရဲ့သက်ဆိုင်ရာအမူအကျင့်အုပ်စုယုတ်အထက်တွင် သာ. ကြီးတစ်ခုထက်စံသွေဖည်ခဲ့ကြောင်းတက်ကြွလီဗာစာနယ်ဇင်းနံပါတ် (မူလတန်းအမူအကျင့်အဆုံးမှတ်) ရှိခဲ့ပါတယ်။ (ထို FR သို့မဟုတ် PR စနစ်ကြွက်အဖြစ်တစ်ချိန်တည်းမှာလုပ်ထုံးလုပ်နည်းခန်း၌ပစ္စုပ္ပန် 5 PRC နှင့် 3 FRC ကြွက်,) ထိန်းချုပ်မှုကြွက်များ၏တစ်ဦးက subcohort ကိုလည်းသုံးသပ်ခဲ့ပါတယ်။ ရှိမရှိအကဲဖြတ်ဖို့ (PR စနစ်ကြွက် FR ပြီးတော့ PR စနစ်မှတစ်ဆင့်ယူနေကြသည်အဖြစ်, 20 ရက်ပေါင်းစုစုပေါင်းအဘို့, ဆိုလိုသည်မှာ) သုံးကြွက်တစ်ဦးအပိုဆောင်းအုပ်စုက PR စနစ်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ၏ဆက်ပြောသည်ကြာချိန်တူတဲ့ဖို့ FR လုပ်ထုံးလုပ်နည်း ( "FRext") မှတဆင့်ခေါ်ဆောင်သွားခဲ့သည် FR နှင့် PR စနစ်အကြားကွဲပြားခြားနားမှုကြောင့်အမူအကျင့်တာဝန်ဒါမှမဟုတ်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ၏ကြာချိန်ရကြ၏။ အဆိုပါ FRext ဦးနှောက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနှင့်စနစ်တကျပြသပေမယ့်ရလဒ်တွေကိုအတွက်အထူးညွှန်ပြအဖြစ်အကျိုးစီးပွားသတ်သတ်မှတ်မှတ်ဒေသများ, နှိုင်းယှဉ် quantitative ခွင့်ပြုပါရန်, အခြားလေးအုပ်စုများနှင့်အတူ assayed ခဲ့ကြသည်မခံခဲ့ရပါ။

 

စားပွဲတင် 1 ။

Stereotaxic က c-Fos quantitative အဘို့ကိုသြဒိနိတ်

(ချဲ့× 40 မှာ) quantitative အဘို့, Atlas-လိုက်ဖက်ဒေသများကိုရှေးခယျြခဲ့သညျ။ ImagePro Plus အားဆော့ဖျဝဲ (မီဒီယာဆက်သွယ်မှုလေ့လာရေး) ကိုတပ်မက်လိုချင်သောအဧရိယာ၏ပုံရိပ်တစ်ခုဖမ်းဆီးဖို့အသုံးပြုသွားမည်ခဲ့သည်။ ဧရိယာရေတွက်များအတွက် delineated ခဲ့ပါတယ်နှင့်အပြုသဘောဆောင်သည့်ဆဲလ်အရေအတွက်များအတွက်တံခါးခုံကိုတည်ထောင်ခဲ့ပါသည်။ အဆိုပါတူညီဧရိယာနှင့်နောက်ခံ (ခုံ) ကိုသက်ဆိုင်ရာစမ်းသပ်အုပ်စုများထံမှအပိုင်းများအတွက်အသုံးပြုသွားမည် ဖြစ်. , အပြုသဘောဆဲလ် (quantitative) ၏ဆော့ဖ်ဝဲကိုရေတွက်နောက်ခံ setting ကိုအတွက်အကြား-session တစ်ခုအပြောင်းအလဲများကိုကာကွယ်တားဆီးဖို့, ရှိသမျှစမ်းသပ်အဖွဲ့များအတွက်တူညီသော session တစ်ခုထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာများအတွက်ရေတွက်မှာသတ်မှတ်ထားတဲ့အဖြစ် (တစ်ဦးချင်းစီဧရိယာကတဆင့်သာသက်ဆိုင်တဲ့သို့မဟုတ်ပြည့်စုံကဏ္ဍများလျှင်တစ်ဦးချင်းကြွက်ကနေခေါ်ဆောင်သွားခဲ့သည် စားပွဲတင် 1) ရရှိနိုင်ကြ၏ အဲဒီဒေသမှာအဘို့မပြည့်စုံနှစ်နိုင်ငံကိုယ်စားပြုမှုရှိကြ၏လျှင်တိကျသောဧရိယာအတွက်ဒေတာတစ်ဦးကြွက်ကနေယူမခံခဲ့ရပါ။

အရည်အသွေးကို double-တံဆိပ်ကပ်နဲ့ Immunofluorescence ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ။

ဦး နှောက်ကဏ္sectionsများကို c-Fos တွက်ချက်ထားသည့်ကြွက်များမှထုတ်ယူပြီး immunohistochemistry ကိုနှစ်ခါတပ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည်တိရိစ္ဆာန်များ၏အမူအကျင့်ဆိုင်ရာစွမ်းဆောင်ရည်ကိုအနှောင့်အယှက်မပေးလိုသောကြောင့်၎င်းတို့သည် peptide neurotransmitters ၏မြင်ကွင်းကိုပိုမိုကောင်းမွန်စေရန်အတွက် colchicine နှင့်မကုသရသေးပါ။ ထို့ကြောင့် Self- အုပ်ချုပ်ရေးတာဝန်နှင့်အတူအသင်းအဖွဲ့အတွက် activated အာရုံခံ phenotypes ၏ visualization ကန့်သတ်ခဲ့သည်။ သို့သော် CNS နေရာအတော်များများတွင် activated neuron များ၏ phenotypes များကိုစတင်အကဲဖြတ်ရန်၊ ဒစ်ဂျစ်တယ်ပုံရိပ်များ (အပေါ်ကအပိုင်းတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်းဝယ်ယူ) သည် 20 ×, 40 × (သို့) 60 × (ပုံဒဏ္inာရီတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) ကိုချဲ့ခြင်းဖြစ်သည်။ ။ glutamate decarboxylase (GAD)၊ tyrosine hydroxylase (TH), CRF, neuropeptide Y (NPY), Agouti-related peptide (AgRP) နှင့် tryptophan hydroxylase တို့အတွက် dual-staining procedure သည် c-Fos-immunoreactivity ရဲ့ assay နဲ့နှိုင်းယှဉ်ထားပါတယ်။ c-Fos-Ab နှင့်အခြားအဓိကပantibိပစ္စည်းများကိုအရောအနှောကို ၄ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင်ညအိပ်ဖောက်ခြင်းအတွက်အသုံးပြုသည်မှအပကိုယ်ပိုင်; အလားတူပင်အလယ်တန်းပantibိပစ္စည်းနှစ်ခုလုံးသည်တူညီသောအဖြေနှင့်အခန်းအပူချိန်တွင်မှောင်မိုက်သောအချိန်၌ ၁ နာရီနွေးထွေးစွာရှိနေသည်။ ပိတ်ဆို့ခြင်းအဆင့်မတိုင်မီမိနစ် ၂၀ မိနစ် ၅၀% အီသနောဆေးကို orexin assay အတွက်အသုံးပြုသည်။ အဓိကပantibိပစ္စည်းများကိုသင့်လျော်စွာအရည်ပျော်အောင်ဆုံးဖြတ်ရန်ကန ဦး optimization assay များကိုပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အသုံးပြုသောမူလပantibိပစ္စည်းများမှာယုန်ဆန့်ကျင် -fos (၁ း ၅၀၀) (sc-4) နှင့် mouse anti-c-fos (၁: ၈၀၀) (Santa Cruz ဇီဝနည်းပညာ၊ Santa Cruz, CA မှ)၊ mouse ကို anti-GAD (၁: ၁၀၀၀)၊ mouse ကို anti-tyrosine hydroxylase (၁: ၅၀၀) နှင့်သိုး anti-tryptophan hydroxylase (အားလုံး Chemicon, Temecula, CA မှ); ယုန်ဆန့်ကျင် CRF (၁ း ၅၀၀) (Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA မှလက်ဆောင်); ယုန်ဆန့်ကျင်သော NPY (၁: ၁၀၀၀)၊ ယုန်ဆန့်ကျင်သော AGRP (၁: ၁၀၀၀) နှင့်ဆိတ်ဆန့်ကျင်သော orexin A (၁: ၅၀၀၀) သည် Phoenix ဆေးဝါး (စိန့်ဂျိုးဇက်၊ MO) မှဖြစ်သည်။ အသုံးပြုသောဒုတိယပantibိပစ္စည်းများသည် Cy1-conjugated ဆိတ်၊ ယုန်ဆန့်ကျင်ခြင်းသို့မဟုတ် anti-mouse (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 20 ဆိတ်ဆန့်ကျင်သောကြွက်သို့မဟုတ်ယုန်ဆန့်ကျင်သို့မဟုတ်မြည်းဆန့်သိုး IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; အားလုံးအလယ်တန်းပodိ 50 မှာရောခဲ့ကြသည်: 1 ။ က c-Fos / MCH dual immunostaining Serial assayed ခဲ့သည်; ပထမ - MCH (၁: ၂၅၀၀ မူလပodyိပစ္စည်း, Millipore) အတွက် Alexa-500-go ဆိတ်ဆန့်ကျင်ယုန် (52: 1) အလယ်တန်းပodyိနှင့်အတူ။ ဆလိုက်များသည် ၅% ပုံမှန်ဆိတ်သွေးရည်ကြည်နှင့်ပြန်လည်တွန်းလှန်ပြီး Anti-c-Fos (800: 1) နှင့် cy1,000-goat ယုန်ဆန့်ကျင်သောယုန်များအတွက်ဒုတိယပantibိပစ္စည်းအဖြစ်ဆေးကြောခဲ့သည်။ MCH assay အတွက်ပိတ်မိခြင်းမတိုင်မီမိနစ် ၂၀ မိနစ် ၅၀% အီသနောကိုဆေးကြောသည်။

စာရင်းအင်းဆန်းစစ်ခြင်းများပြုလုပ်ထားခြင်း။

Group မှဒေတာများ±အရှေ့တောင်စာသား, စားပွဲနှင့်ကိန်းဂဏန်းများအတွက်ဆိုလိုတယ်အဖြစ်ပေးအပ်ကြသည်။ အရေးပါမှုအဖြစ်သတ်မှတ်တာဖြစ်ပါတယ် P ≤ 0.05 ။ စာရင်းအင်းဆိုင်ရာနှိုင်းယှဉ်မှုများအားစမ်းသပ်မှုအုပ်စုများ (FR vs. PR) အကြားသို့မဟုတ်စမ်းသပ်သည့်အဖွဲ့များနှင့်သက်ဆိုင်ရာထိန်းချုပ်မှုများ (PR နှင့် PRC; FR နှင့် FRC) အကြားမညီသောကျောင်းသား၏အသုံးပြုမှုကိုပြုလုပ်သည်။ t- စမ်းသပ်မှု ကွဲပြားခြားနားသော ဦး နှောက်ဒေသများရှိတက်ကြွသောလီဗာများနှင့် c-Fos စကားရပ်များအကြား Pearson ဆက်စပ်မှုကိန်းများအပြင်တူညီသောစမ်းသပ်အခြေအနေများအောက်ရှိ ဦး နှောက်ဒေသများအကြား c-Fos ဖော်ပြမှုဆက်စပ်မှုကို StatPlus: mac LE အတွက်စာရင်းအင်းဆိုင်ရာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအစီအစဉ်ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်သည်။ AnalystSoft အားဖြင့် 2009 ခုနှစ်။ ကျနော်တို့ linear ဆက်စပ်မှု (Pearson ရဲ့။ ) အတွက်စမ်းသပ်စစ်ဆေးပါတယ် R ကွဲပြားခြားနားသော CNS ဒေသများတွင်က c-Fos စကားရပ်များအကြားစာရင်းဇယား) ။ ငါတို့သည်လည်းကွဲပြားခြားနားသော activated CNS ဒေသများနှင့်အပြုအမူများတွင်က c-Fos စကားရပ်များအကြားဆက်စပ်မှုဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ က c-Fos quantitative ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည့်အဘို့ကြွက်မှ FR နှင့် PR စနစ်ဒေတာကိုအဲဒီဆက်စပ်မှုတို့အတွက်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။

က c-Fos quantitative ။

ကျွန်တော်ယခင်ကလေ့လာတွေ့ရှိသည်အတိုင်းတက်ကြွလီဗာပုံနှိပျ၏နံပါတ် (FR စွမ်းဆောင်ရည် vs. PR စနစ်အဘို့သိသိသာသာကြီးစားပွဲတင် 2), နှင့် sucrose ဆုလာဘ်များ၏အရေအတွက် FR စွမ်းဆောင်ရည်စဉ်အတွင်း သာ. ကြီးမြတ်ဖြစ်ခဲ့သည်။ အဆိုပါ PR စနစ်ကြွက်များအတွက်တွေ့ဆုံဆွေးနွေးပွဲအရှည် 90 မိ (- 30 ရပ်တန့်အချိန်) အကြောင်းကိုဖြစ်ခဲ့သည်။ စားပွဲတင် 3 quantitative ထွက်သယ်ဆောင်ခဲ့သည်ရှိရာအားလုံး CNS ဒေသများတွင်စာရင်းက c-Fos immunoreactive ဆဲလ်အရေအတွက်။ အဆိုပါ FR နှင့် PR စနစ်ကြွက်ဘို့က c-Fos စကားရပ်၏ပုံစံအတွက်အကျဉ်းချုပ်ဖြစ်ပါသည် သဖန်းသီး။ 1။ အဆိုပါ medial hypothalamus (MH ၏သိသာထင်ရှားသော activation ရှိခဲ့သည်_TOT, PR စနစ် sucrose အဘို့အနှိပ်လီဗာ, ဒါပေမယ့်သက်ဆိုင်ရာထိန်းချုပ်မှုတွေနဲ့နှိုင်းယှဉ် sucrose အဘို့အနှိပ် FR လီဗာအတွက်စေ့စပ်ကြွက်မခြုံငုံ activation အတွက်စေ့စပ်ကြွက်၏ ARC, PVN, RCh, ဇလဌာနနှင့် VMH တစ်ဦးပေါင်းစပ်) ။ PR စနစ်ကြွက်များ၏ medial hypothalamus အတွင်းမှာပဲ, ဒီတက်ကြွစွာ PVN ARC, နှင့် VMH (ခုနှစ်တွင်ဖြစ်ပွားခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 2) ။ FR လီဗာ PR စနစ်လီဗာကိုနှိပ်နှိပ်ပေမယ့်မရ, (ထို perifornical ဧရိယာအတွင်း activation အပေါ်အများစုအခြေစိုက်) က LH အတွင်းသိသိသာသာ activation နှင့်ဆက်စပ်ခဲ့သည်။ တက်ကြွလီဗာပုံနှိပျနှင့် hypothalamic က c-Fos စကားရပ်နှစ်ဦးစလုံးဟာ FRext နှင့် FR အုပ်စုများအကြားနှိုင်းယှဉ်ခဲ့ကြသည် (MH_TOT, 946 26 နှင့် 911 ± 118 ±; ARC, 176 ± 18 နှင့် 186 ± 10; LH_TOT, 468 79 နှင့် 378 ± 34 ±; FR နှင့် PR စနစ်အုပ်စုများအကြားစကားရပ်ပုံစံအတွက်ခြားနားချက်ဘဲလေ့ကျင့်ရေး / အတှေ့အကွုံကြာချိန်ဖို့ပေမယ့်ဆာလုပ်ငန်းတာဝန်၏သဘောသဘာဝနှင့်ဆက်စပ်ကြောင်းအကြံပြု LHpeF အသီးသီး 200 ± 31 နှင့် 173 ± 15) ။ အဆိုပါ FR အုပ်စု, aBNST နှင့် pBNST နှစ်ဦးစလုံးအတွက်လေ့လာတွေ့ရှိသည့် BNST အတွက်က c-Fos စကားရပ်များတွင်သိသိသာသာတိုးရှိ၏။ နှစ်ဦးစလုံး FR နှင့် PR စနစ်လီဗာကိုနှိပ်အဆိုပါ NAc shell ကိုတိုးက c-Fos-immunopositive အာရုံခံတွေနဲ့ဆက်နွယ်ကြသည် ဟူ. ၎င်း, က c-Fos အရေအတွက်သိသိသာသာကိုနှိပ် PR စနစ်လီဗာအတွက်စေ့စပ်ကြွက်များတွင်တိုးမြှင့်က c-Fos စကားရပ်ဆီသို့တစ်ဦး nonsignificant လမ်းကြောင်းသစ်အတူနှိပ် FR လီဗာအတွက်စေ့စပ်ကြွက်များကနေ NAc core ကိုတိုးခံခဲ့ရသည်။ တစ်ခုတိုးဆီသို့တစ်ဦး nonsignificant လမ်းကြောင်းသစ်အတွက် FR တာဝန်နှင့်အတူကြည့်ရှုလေ့လာခဲ့သည်ပေမယ့်က c-Fos, ထို PR စနစ်လုပ်ငန်းတာဝန်နှင့်အတူ VTA အတွက်တိုးမြှင့်မခံခဲ့ရပါဘူး။ နောက်ဆုံးအနေနဲ့က c-Fos သိသိသာသာ PR စနစ်အဘို့ဖြစ်သည်မဟုတ် FR များအတွက်လေ့ကျင့်သင်ကြားကြွက်၏ဦးနှောက်ကို stem အတွက် hypoglossal (cranial အာရုံကြော XII) နျူကလိယတိုးမြှင့်ခဲ့ပါတယ်။

 

စားပွဲတင် 3 ။

အဆိုပါ CNS အတွက် cFos Expression

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 1 ။

ထိန်းချုပ်မှုကိုင်တွယ်ရန်ဆွေမျိုးကြွက် -performing နှင့်တိုးတက်သောအချိုး (PR စနစ်) - ဗဟိုအာရုံကြောစနစ်အတွင်းက c-Fos immunopositive-ဆဲလ်အရေအတွက် fixed အချိုး (FR) ၏ (CNS) ဒေသများ။ FR-ထိန်းချုပ်မှု (FRC) နှင့် PR-ထိန်းချုပ်မှု (PRC) အတွက် cell အရေအတွက်% 100 ဟုသတ်မှတ်ခဲ့ကြသည်။ မြင် စားပွဲတင် 2 ...

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 2 ။

PR စနစ်-ထိန်းချုပ်မှု (မှဆွေမျိုး PR စနစ်-performing ကြွက်၏ hypothalamic ဒေသများတွင်က c-Fos immunopositive-ဆဲလ်အရေအတွက် *P <0.05) ။ PR-control အတွက်ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ၁၀၀% သတ်မှတ်ထားသည်။ ကြည့်ပါ စားပွဲတင် 2 ကုန်ကြမ်းဒေတာအတွက်။ ±အရှေ့တောင်ဆိုလိုတယ်အဖြစ် data ကိုထုတ်ဖော်ပြောဆိုနေကြပါတယ်။

က c-Fos စကားရပ် amygdala နှင့်ဦးနှောက် cortex အပါအဝင်အခြား CNS ဒေသများ, (အတွင်းကြည့်ရှုလေ့လာခဲ့သည်သဖန်းသီး။ 3) ။ သို့သော်စကားရပ် (ကိုင်တွယ်ခြင်း, လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအခနျးသို့လှုပ်ရှားမှုကို) ဒီ activation မှုရှိသည်ဟုစေခြင်းငှါ, လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ၏ nonspecific ရှုထောင့်ကြောင်းအကြံပြု, နှစ်ဦးစလုံးကိုထိန်းချုပ်သောအခြေအနေများရှိသကဲ့သို့ကောင်းစွာအဖြစ် PR စနစ်နှင့် FR တာဝန်များကိုနှင့်အတူအသင်းအဖွဲ့အတွက်လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤအဒေသများတွင် quantitative ထွက်သယ်ဆောင်မခံခဲ့ရပါဘူး။ အလားတူပင် nXII ထက်အခြားဦးနှောက်ကို stem ဒေသများအတွင်း activation လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်, ဒါပေမယ့်လည်း nonspecific arousal သို့မဟုတ်အပြုအမူကို Activation အတွက်အခန်းကဏ္ဍအကြံပြုခြင်း, ထိန်းချုပ်မှုများနှင့်တာဝန်-related အခြေအနေများနှစ်ဦးစလုံးနှင့်အတူအသင်းအဖွဲ့အတွက်ဖြစ်ပွားခဲ့သည်။

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 3 ။

Piriform cortex (bregma ကနေ AP, -0.26) တွင်က c-Fos immunostaining ။ Immunostaining အားလုံးလေးယောက်စမ်းသပ်အုပ်စုများ (FR, PR စနစ်, FRC နှင့် PRC) တွင်ကြည့်ရှုလေ့လာခဲ့သည်။ ချဲ့× 20 ။

ကျနော်တို့ကွဲပြားခြားနားသော CNS ဒေသများရှိ c-Fos စကားရပ်အကြားဆက်စပ်မှုများအတွက်စမ်းသပ်စစ်ဆေးပါတယ်။ လီဗာ - ဖိအားပေးအုပ်စုများမှအချက်အလက်များကိုပေါင်းစပ်ပြီးကျွန်ုပ်တို့သည် LH နှင့် VMH ရှိ c-Fos အသုံးအနှုန်းနှင့်အပြန်အလှန်ဆက်စပ်မှုကိုတွေ့ရှိခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့် VMH ၏ activation သည် LH (Pearson's) ၏ခြုံငုံသော activation လျော့နည်းခြင်းနှင့်ဆက်စပ်နေသည် R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056) ။ ထို့အပြင်ကျွန်ုပ်တို့သည် LH ၏ perifornical ဒေသနှင့် VTA (Pearson's) တွင်သိသာသောအပြုသဘောဆက်နွယ်မှုကိုတွေ့ရှိခဲ့သည်။ R, 0.7772; t = 3.493; P = နှစ်ခုဒေသများအကြားလူသိများ monosynaptic ဆက်သွယ်မှုနှင့်အတူတသမတ်တည်း 0.0082), (Refs အတွက်ဆွေးနွေးမှုကိုကြည့်ပါ။ 2 နှင့် 13) ။ FR စွမ်းဆောင်ရည်အတွက်သီးခြားစမ်းသပ်ခြင်းရှိမရှိ VTA တွင် c-Fos ဖော်ပြမှုနှင့် VTA ရှိသိသိသာသာအနုတ်လက္ခဏာဆက်နွယ်မှုကိုတွေ့ရှိခဲ့သည်။ R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) သို့မဟုတ် PR စနစ်စွမ်းဆောင်ရည် (Pearson ရဲ့။ ) R, -0.9897; t = -9.7624; P = ပု substantia nigra မှ striatal ဒေသများအကြားလူသိများအပြန်အလှန်သွင်းအားစုနှင့်အတူတသမတ်တည်း 0.0103), နှင့် VTA (2, 13) ။ ကွဲပြားသော CNS ဒေသများရှိ c-Fos အသုံးအနှုန်းနှင့်အပြုအမူများအကြားဆက်စပ်မှုရှိမရှိကိုလည်းကျွန်ုပ်တို့စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ လီဗာ - ဖိအားပေးအုပ်စုများမှအချက်အလက်များပေါင်းစပ်ခြင်းအားဖြင့်ကျွန်ုပ်တို့သည် ARC ရှိ c-Fos နှင့်တက်ကြွသောလီဗာပုံနှိပ်ခြင်း (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067) ။

sucrose များအတွက် sucrose စားသုံးမှုနှင့်လှုံ့ဆျောမှုနှင့်အတူ activated အာရုံခံ၏ identification ။

ဦးနှောက်ကို stem မှာတော့က c-Fos-အပြုသဘောအာရုံခံ TH, epinephrine နှင့် norepinephrine (နှင့် dopamine) အတွက်နှုန်း-ကန့်သတ်အင်ဇိုင်းများအတွက်အပြုသဘောဆောင် immunostaining မပြဘဲ, အရှင်ဤ catecholaminergic အာရုံခံအဆိုပါ FR သို့မဟုတ် PR စနစ်တာဝန်များကိုအားဖြင့် activated ခံရဖို့ပေါ်လာခဲ့ပါဘူး။ သို့သော်အချို့က c-Fos-အပြုသဘောအာရုံခံ serotonin အာရုံခံ၏လူဦးရေ activated ခဲ့ကွောငျးကိုညွှန်း, tryptophan hydroxylase များအတွက်အပြုသဘောဆောင် immunostaining ပြသခဲ့သည်။ မှာပြထားတဲ့အတိုင်း သဖန်းသီး။ 4အဆိုပါ ARC အတွက်က c-Fos-အပြုသဘောဆဲလ်အသေကောင် AGRP-စွန်းအမျှင်များကဝိုင်းရံခဲ့ကြနှင့် NPY ဖိုင်ဘာများအတွက်အလားတူပုံစံ / က c-Fos immunostaining (ပြမပါ) လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ အဆိုပါ PVN မှာတော့က c-Fos-အပြုသဘောအာရုံခံ CRF-အပြုသဘောအာရုံခံဝန်းရံအားထင်ရှားပေမယ့်မျှမ colocalization (Data ပြမပါ) လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ သဖန်းသီး။ 5 အဆိုပါ LH အတွက် orexin နှင့် MCH နှစ်ဦးစလုံးအတှကျအ immunostaining ပြပွဲ။ Orexin အာရုံခံအဆိုပါ dLH နှင့် peLH နှစ်ဦးစလုံးအတွက်တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ကျနော်တို့က peLH အတွက် MCH-အပြုသဘောအာရုံခံလေ့လာတွေ့ရှိသော်လည်း, LH ၏ဒေသတွင်း၌က c-Fos နှင့်အတူအဘယ်သူမျှမ colocalization မရှိမဖြစ်လိုအပ်တဲ့ရှိ၏။ သို့သော်ကျွန်တော်တို့ (peLH အတွင်း orexin-အပြုသဘောအာရုံခံအတွက်က c-Fos colocalization လေ့လာတွေ့ရှိသဖန်းသီး။ 6, ထိပ်တန်း), နှင့် vLH အတွက် MCH နှင့်အတူအလွန်ကန့်သတ်က c-Fos colocalization (သဖန်းသီး။ 6, အောကျခွေ) ။ ဒါဟာကြွက် colchicine နှင့်အတူ pretreated မဟုတ်ကြောင့်နှစ်ဦးစလုံးဒေသခံမြားနှငျ့က c-Fos နှင့်အတူ colocalization, ထိုကဲ့သို့သော CRH အဖြစ် peptide neurotransmitters အဘို့အလျှော့တွက်စေခြင်းငှါ reemphasized ရပါမည်။ နောက်ဆုံးအနေနဲ့နျူကလီးယပ်အတွင်း (core နဲ့ shell ကို accumbensသဖန်းသီး။ 7), ထွေအုပ်နှင့်အတူ coimmunostaining က c-Fos, အ neurotransmitter ဂါဘမြို့သားများအတွက်ဒြပ်အင်ဇိုင်း, FR နှင့် PR စနစ်ကြွက်နှစ်ဦးစလုံးသည်, ကြည့်ရှုလေ့လာခဲ့သည်။ အဆိုပါ VTA အတွင်း TH များအတွက်ကြံ့ခိုင်အစွန်းအထင်းရှိ၏ သို့သော်က c-Fos-အပြုသဘောအာရုံခံခဲလေ့လာတွေ့ရှိခဲ့ကြသည်များနှင့်သီးသန့် TH နှင့်အတူ colocalize မှပေါ်လာခဲ့ပါဘူး။

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 4 ။

AGRP (အစိမ်းရောင်) အတွက် Immunostaining နှင့် PR-ကြွက်များ၏ ARC အတွက်က c-Fos (အနီ) (AP -2.8) ။ ချဲ့× 20 ။

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 5 ။

အဆိုပါ LH အတွက် orexin နှင့် MCH ၏ Immunostaining ။ ချဲ့× 20 ။

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 6 ။

အဆိုပါ perifornical LH (AP -3.3) တွင် orexin နှင့်အတူတစ်ဦး FR ကြွက်များတွင်က c-Fos colocalization (ထိပ်တန်း) နှင့် vLH အတွက် MCH (-AP-3.0) နဲ့ (အောကျခွေ) ။ 40 ချဲ့×။

 

သင်္ဘောသဖန်း။ 7 ။

နျူကလီးယပ်အတွက်ထွေအုပ် (အစိမ်းရောင်) နှင့်က c-Fos (အနီ) အတွက် immunostaining ၏ Colocalization (core ကို accumbensထိပ်တန်း) နှင့် shell ကို (အောကျခွေ).