DeltaFosB reguleert indirect Cck-promotoractiviteit (2010)

Brain Res. 2010 mei 6; 1329: 10-20.

Gepubliceerd online 2010 maart 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ en Colleen A. McClung^{2, *}

Auteursinformatie ► Informatie over auteursrecht en licentie ►

De definitieve bewerkte versie van dit artikel is beschikbaar op Brain Res

Zie andere artikelen in PMC dat citeren het gepubliceerde artikel.

Abstract

Sommige van de belangrijke biochemische, structurele en gedragsveranderingen geïnduceerd door chronische blootstelling aan drugs van misbruik lijken te worden gemedieerd door de zeer stabiele transcriptiefactor AFosB. Eerder werk heeft aangetoond dat ΔFosB-overexpressie bij muizen gedurende 2-weken leidt tot een toename van de expressie van talrijke genen in striatum, waarvan de meeste later worden gedownreguleerd na 8-weken van ΔFosB-expressie. Interessant genoeg was een groot aantal van deze genen ook opgereguleerd in muizen die de transcriptiefactor CREB tot overexpressie brachten. Het was echter onduidelijk in deze studie of ΔFosB op korte termijn deze genen via CREB reguleert. Hier vinden we dat 2-weken van ΔFosB-overexpressie de CREB-expressie in striatum verhogen, een effect dat met 8 weken verdwijnt. De vroege inductie is geassocieerd met verhoogde CREB-binding aan bepaalde doelgenpromoters in dit hersengebied. Verrassend genoeg was één gen dat een verdacht CREB-doelwit was op basis van eerdere rapporten, cholecystokinin (Cck), werd niet gecontroleerd door CREB in striatum. Om de regulering van cck Na ΔFosB-overexpressie bevestigden we dat kortdurende ΔFosB-overexpressie beide verhoogt cck promotoractiviteit en genexpressie. Het verhoogt ook de bindingsactiviteit bij een vermeende CREB-bindingsplaats (CRE) in de cck promotor. Hoewel de CRE-site noodzakelijk is voor normale basale expressie van cck, het is niet vereist voor ΔFosB-inductie van cck. Alles bij elkaar genomen, suggereren deze resultaten dat hoewel kortdurende ΔFosB-inductie de CREB-expressie en -activiteit verhoogt bij bepaalde genpromoters, dit niet het enige mechanisme is waarmee genen onder deze omstandigheden worden opgereguleerd.

sleutelwoorden: nucleus accumbens, transcriptie, verslaving

INLEIDING

Chronische blootstelling aan misbruik drugs veroorzaakt biochemische en structurele veranderingen in verschillende hersenregio's. Aangenomen wordt dat deze veranderingen betrekking hebben op veranderingen in genexpressieprofielen in het mesolimbische systeem. Dit systeem is samengesteld uit dopaminerge neuronen die uit het ventrale tegmentale gebied (VTA) in de middenhersenen tot middelgrote stekelige neuronen in de nucleus accumbens (NAc) (ventrale striatum) en een aantal andere hersenregio's uitsteken. Veranderingen in de activiteit van twee transcriptiefactoren, cAMP-responselement-bindend eiwit (CREB) en ΔFosB (een Fos-familie-eiwit), is voorgesteld om veel van de biochemische, structurele en gedragsveranderingen te mediëren die worden gezien bij chronische blootstelling aan drugs van misbruik ( beoordeeld door Nestler, 2005).

CREB is een alomtegenwoordig tot expressie gebrachte transcriptiefactor die lid is van de CREB / ATF-familie. CREB-homodimeren binden aan variaties van een CRE-sequentie (consensus: TGACGTCA) die wordt aangetroffen in de promoters van veel genen. Fosforylatie van CREB (voornamelijk bij serine 133, hoewel andere locaties zijn geïdentificeerd) kan worden gestimuleerd door verschillende signaalcascades, waaronder die stroomafwaarts van dopaminereceptoren (Cole et al., 1995). Na fosforylatie bij serine 133, werft CREB het co-activator CREB-bindende eiwit (CBP) of verwante eiwitten aan, leidend tot verhoogde genexpressie (beoordeeld door Johannessen et al., 2004). Chronische blootstelling aan misbruik door opiaat of psychostimulantia veroorzaakt voorbijgaande toenamen in CREB-activiteit in de nucleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), een aanpassing waarvan wordt gedacht dat deze de lonende eigenschappen van deze medicijnen verlaagt en bijdraagt aan de negatieve emotionele toestand van het stoppen van het gebruik van drugs (Nestler, 2005).

LEr wordt gedacht dat langdurige aanpassingen aan drugs van misbruik gedeeltelijk worden gemedieerd door ΔFosB, een zeer stabiele splitsingsvariant van FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos-familieleden dimeriseren met leden van de Jun-familie om een activator-eiwit 1 (AP-1) -complex te vormen. AP-1-transcriptiecomplexen binden aan variaties van het AP-1-responselement (consensus: TGACTCA) om transcriptie te reguleren (herzien door Chinenov en Kerppola, 2001). Hoewel acute blootstelling aan misbruikt drugs leidt tot de kortstondige inductie (uren) van Fos-familieleden (evenals verhoogde CREB-activiteit), leidt herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen tot de accumulatie van de zeer stabiele ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), waarvan de uitdrukking nog wekenlang aanhoudt.

Bi-transgene muizen die induceerbaar hetzij FosB of CREB in het volwassen striatum tot overexpressie brengen, vertonen veel van de biochemische en gedragsfenotypen die worden waargenomen bij dieren die herhaaldelijk worden blootgesteld aan psychostimulantia of andere drugs van misbruik. EENanalyse van genexpressieveranderingen in deze transgene dieren identificeerde talrijke genen opgereguleerd door korte-termijn (2 weken) overexpressie van AFosB, veranderingen geassocieerd met een gelijktijdige afname van geneesmiddelbeloning. De veranderingen in genexpressie en gedragsrespons met kortetermijn-ΔFosB waren opmerkelijk vergelijkbaar met die waargenomen bij dieren die CREB tot overexpressie brengen voor 2- of 8-weken (McClung en Nestler, 2003). In opvallend contrast, langdurige overexpressie (8 weken) van ΔFosB verminderde de expressie van veel van deze zelfde genen en leidde tot een toename van de geneesmiddelbeloning (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003).

Eén gen dat in deze onderzoeken is geïdentificeerd, is cholecystokinine (cck), een neuropeptide geproduceerd in verschillende hersenregio's, inclusief het striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK kan dopaminerge transmissie moduleren (Vaccarino, 1992), is betrokken bij geneesmiddelbeloning en -versterking (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), en wordt in het striatum geïnduceerd door chronische cocaïne (Ding en Mocchetti, 1992). Bovendien de cck promotor is ontvankelijk gebleken voor zowel CREB- als AP-1-complexen (Haun en Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Omdat veel van de genen (inclusief cck) die verhoogde expressie vertoonde na zowel CREB als korte termijn ΔFosB-expressie waren bekende of vermoedelijke CREB-doelgenen (McClung en Nestler, 2003), wilden we bepalen of kortdurende ΔFosB-expressie leidt tot regulatie van deze genen (met een focus op cck) door de regulatie van CREB of door meer complexe mechanismen van genregulatie.

RESULTATEN

ΔFosB-overexpressie verhoogt tijdelijk de CREB-niveaus

We gebruikten Western-blotting om te onderzoeken of ΔFosB-overexpressie de CREB-eiwitniveaus in het striatum van muizen verhoogt. Voor deze studie gebruikten we bi-transgene muizen (lijn 11A) die zowel een NSE-tTA-transgen als een TetOp-ΔFosB-transgen dragen. In de afwezigheid van doxycycline vertonen deze muizen een robuuste toename van ΔFosB-expressie in de dynorphin-positieve neuronen in striatum (Kelz et al., 1999). Deze methode voor het tot overexpressie brengen van ΔFosB is uitgebreid gedocumenteerd en maakt regiospecifieke overexpressie mogelijk, die parallel loopt aan de ΔFosB-inductie die wordt gezien bij dieren die zijn blootgesteld aan chronische cocaïne (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). We ontdekten dat bij 11A-muizen ΔFosB tot overexpressie brachten, de CREB-eiwitniveaus significant werden opgereguleerd na 2 weken van expressie en deze niveaus keerden terug naar de basislijn na 8 weken van expressie (Figuur 1A, n = 8). Om te bepalen of de veranderingen in CREB-niveaus met kortdurende ΔFosB-overexpressie konden worden gerepliceerd in een ander systeem, brachten we ΔFosB tijdelijk tot overexpressie in PC12-cellen en ontdekten dat CREB-niveaus significant toenamen (p <0.05) in vergelijking met controles (Figuur 1B, n = 4). Deze resultaten tonen aan dat korte ΔFosB-expressie de CREB-eiwitniveaus verhoogt.

CREB-niveaus nemen toe met ΔFosB-overexpressie. Western blot analyse van lysaten van (A) muis striata van 11A muizen uit dox voor 2 of 8 weken of (B) PC12-cellen die ΔFosB tot overexpressie brengen. Gegevens in A worden getoond als procentuele verandering in off dox vergeleken ...

Zowel ΔFosB als CREB binden aan promoters van specifieke doelgenen in het striatum na kortstondige ΔFosB-overexpressie

We gebruikten ChIP (chromatin immunoprecipitatie) testen van striataal weefsel om te bepalen of ΔFosB of CREB binding optrad bij bepaalde targetgen-promoters en of deze binding verhoogd was na kortstondige ΔFosB overexpressie. We analyseerden binding op de BDNF en cck promoters, aangezien beide genen sterk opgereguleerd zijn na korte ΔFosB-overexpressie, CREB-overexpressie of chronische behandeling met cocaïne (McClung en Nestler, 2003). We analyseerden ook binding op de CDK5 promotor, omdat het een bekend direct doelwit is van ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Ten slotte hebben we binding gemeten op de prodynorphin promotor, aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat ze onder verschillende voorwaarden door zowel ΔFosB als CREB kunnen worden gebonden (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP-analyse werd uitgevoerd op striata van 11A-muizen die ΔFosB gedurende 2 weken tot overexpressie brengen met behulp van antilichamen die CREB of ΔFosB herkennen. Onder normale omstandigheden vonden we dat ΔFosB zich bindt aan de CDK5 en prodynorphin promotors, terwijl er geen detecteerbare binding is op de BDNF or cck promoters (Tabel 1). Bovendien verhoogde ΔFosB-overexpressie de binding van ΔFosB bij de CDK5 promotor, maar niet bij de prodynorphin promotor. Vervolgens hebben we de binding van CREB aan deze promoters gemeten en vastgesteld dat CREB zich bindt aan de CDK5, BDNF en prodynorphin promotors, maar niet voor de cck promotor, in normale striatum, en dat ΔFosB-overexpressie voor 2 weken de CREB-binding bij de BDNF en prodynorphin promotors, maar niet de CDK5 promotor. Samengenomen laten deze resultaten zien dat ΔFosB en CREB beide kunnen binden aan bepaalde genpromoters zoals prodynorphin en CDK5CREB-binding is echter specifiek voor andere promoters zoals BDNF. Bovendien leidt ΔFosB-overexpressie tot verhogingen van ΔFosB-binding bij bepaalde promoters, zoals zou worden verwacht, maar ook tot CREB-binding aan specifieke promoters, consistent met de ΔFosB-gemedieerde CREB-inductie die op dit tijdstip wordt waargenomen.

Binding van vermeende regulerende eiwitten aan verschillende promoters in muizen die AZosB gedurende twee weken tot overexpressie brengen.

Eerder werk heeft aangetoond dat veranderingen in genexpressie geïnduceerd door lange ΔFosB-overexpressie geassocieerd zijn met chromatin modificaties, in het bijzonder acetylatie van histon H3, bij specifieke genpromoters (Kumar et al., 2005). Om te bepalen of dit veranderingen in genexpressie kon veroorzaken bij kortere ΔFosB overexpressie op de lange termijn, maten we de binding van geacetyleerd histon H3 (een histonmodificatie geassocieerd met transcriptioneel actief chromatine), of een gemethyleerd histon H3 (Lys9, een histonmodificatie geassocieerd met transcriptioneel inactief chromatine). We vonden dat overexpressie van ΔFosB voor 2 weken resulteerde in geen veranderingen in de binding van geacetyleerd H3 aan een van de genpromoters die werden bestudeerd (Tabel 1). We vonden een significante afname van de binding van gemethyleerd histon H3 aan de prodynorphin promotor, maar niet bindend op de cck promotor en geen verandering in binding op de CDK5 en BDNF promoters, wat suggereert dat dit geen algemeen mechanisme is waarmee ΔFosB op de korte termijn genexpressie reguleert. We waren verrast en geïnteresseerd in het feit dat we geen verschillen vonden in onze ChIP-assays die de toename konden verklaren cck mRNA-expressie in de 11A-muizen na 2-weken van ΔFosB-expressie en besloten om dit mechanisme verder te onderzoeken.

KortetermijnΔFosB neemt toe cck expressie in meerdere systemen

Microarray-karakterisering van bi-transgene 11A-muizen die ΔFosB in het striatum tot overexpressie brengen, wees uit dat cck expressieniveaus stijgen na 2 weken van overexpressie en nemen vervolgens geleidelijk af met langere perioden van ΔFosB expressie (Figuur 2A, n = 3). We hebben dit effect gevalideerd voor cck met behulp van real-time PCR op een afzonderlijke groep dieren bij 2- en 8-weken en vond de resultaten op de twee tijdpunten vergelijkbaar met de microarray-analyse (gegevens niet getoond).

Overexpressie op korte termijn van ΔFosB neemt toe cck genexpressie. (A) cck mRNA-expressie in striatum na ΔFosB-overexpressie in 11A-muizen voor 1-, 2-, 4- of 8-weken. Microarray-analyse werd uitgevoerd op striatummonsters en cck niveaus ...

Om het vermogen van ΔFosB om te reguleren verder te onderzoeken cck expressie, we gebruikten PC12-cellen die transient getransfecteerd waren met a cck-luciferase-reporterplasmide en ofwel een ΔFosB-expressieplasmide of een gelijke hoeveelheid pCDNA. Beide twee (n = 5-9) en drie (n = 11-13) dagen van ΔFosB-overexpressie resulteerden in een aanzienlijke toename in cck-luciferase-expressie. Bovendien resulteerde drie dagen aan overexpressie van ΔFosB in aanzienlijk meer cck-luciferase-inductie in vergelijking met twee dagen van overexpressie (Figuur 2B). Overexpressie van ΔFosB induceerde geen expressie van een promoterloos luciferaseconstruct (gegevens niet getoond). Onder geen enkele behandeling was er een vermindering van cck-luciferase-activiteit duidelijk. Deze resultaten tonen aan dat korte-termijn ΔFosB-expressie de activiteit van de cck promotor, en laat het mechanisme waarmee ΔFosB overexpressie op lange termijn onderdrukt, onbeantwoord cck expressie.

ΔFosB-overexpressie verhoogt de binding op een vermoedelijke CREB-bindingsplaats in de cck promotor

Onze analyses hebben dat gevonden cck De expressie is verhoogd na de korte-termijn ΔFosB-expressie, maar onze ChIP-testen hebben aangetoond dat noch CREB noch ΔFosB binden aan de cck promotor. Om te bepalen of er veranderingen zijn in de eiwitbinding op de cck promotor na ΔFosB-overexpressie, gebruikten we elektroforetische mobiliteitshifttesten (EMSA) met een probe die de vermoedelijke CRE-achtige plaats aanwezig in de cck promotor. Met behulp van nucleaire extracten van striata van 11A-muizen die ΔFosB gedurende 2 weken tot overexpressie brachten, vonden we een toename in binding aan de vermeende CRE-site in de cck promotor (Figuur 3 A, C, n = 4). Interessant is dat 11A-muizen ΔFosB gedurende 8 weken tot overexpressie brengen, die een afname laten zien in cck expressie, toonden ook een verhoogde binding op deze site (Figuur 3B, C, n = 4). Ter vergelijking, we onderzochten de binding aan een consensus-CRE-site in muizen die ΔFosB tot over 2 weken tot overexpressie brachten en vonden robuuste CRE-binding in striatale extracten, maar geen toename in binding na ΔFosB-inductie (Figuur 3F, n = 4). Dus, ondanks een door ΔFosB geïnduceerde toename van de totale CREB-niveaus die op dit tijdstip worden waargenomen, liggen deze resultaten in lijn met onze ChIP-assays die aantonen dat verhoogde CREB-binding op promoters na AF-B-overexpressie specifiek is voor slechts bepaalde genen en geen wereldwijd fenomeen is . Bepalen of CREB gebonden is aan de cck promotor in onze EMSA-analyse, voerden we supershift-assays uit met een CREB-specifiek antilichaam. In overeenstemming met onze ChIP-assays vonden we geen enkele binding van CREB aan a cck sonde die de vermoedelijke CRE-site bevat in EMSA-assays, terwijl CREB een consensus-CRE-site significant bindt en vervangt (Figuur 3D, E, n = 4). De DNA-bindingsactiviteit op de cck promoter werd ook niet beïnvloed door een antilichaam tegen AFosB (gegevens niet getoond), onder omstandigheden die in verschillende eerdere onderzoeken zijn getoond voor het blokkeren van AFosB-binding aan betrouwbare AP-1-plaatsen (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). We hebben ook ChIP-assays uitgevoerd op striata van 11A-dieren na 8 weken van ΔFosB-expressie en vinden nog steeds geen binding van CREB of ΔFosB op de cck promotor (gegevens niet getoond). Dus, ΔFosB-expressie leidt wel tot een toename van de eiwitbinding aan de cck promotor na zowel 2- als 8-weken van expressie; de identiteit van deze factoren blijft echter onbekend.

Eiwitbinding op de cck promotor. (A, B) Verhuizing met elektroforetische mobiliteit met behulp van de cck CRE-achtige site met striataal weefsel van dieren die ΔFosB tot overexpressie brengen gedurende 2 weken (A) of 8 weken (B). In (A), concurrentie met overtollige ongelabelde concurrent ...

De vermeende CRE-site in de cck promotor is niet verantwoordelijk voor verhoogde promotoractiviteit

Omdat we een toename van de eiwitbinding vonden met behulp van een fragment van de cck promotor, die de vermeende CRE-site bevat, na ΔFosB-overexpressie, wilden we bepalen of deze site nodig is om te worden verhoogd cck expressie na ΔFosB-overexpressie. Om deze mogelijkheid te testen, hebben we PC12-cellen getransfecteerd met een cck-luciferase-plasmide dat zijn intacte CRE-achtige plaats bevat of een die een mutatie op de site bevat die elke interactie met CREB zou opheffen. Interessant genoeg nam de mutatie van de CRE-achtige site basaal af cck promotoractiviteit door 32% (Figuur 4A, n = 9), maar had geen effect op de cck promotor inductie door ΔFosB overexpressie (Figuur 4B, n = 11-13). Dit suggereert dat, hoewel het cck promotor vereist een intacte CRE-achtige plaats voor volledige basale activiteit, de verhoogde promoteractiviteit geïnduceerd door AFosB-overexpressie vereist geen CRE-achtige sequentie.

De cck-achtige CRE-site is niet nodig voor cck inductie door ΔFosB. (A) cck-luciferase-activiteit werd 2 dagen na transfectie met beide normaal gemeten cck-luciferase of een waarin de CRE-achtige site was gemuteerd. * p <0.05 (B) cck-luciferase ...

cFos bindt zich aan de cck promotor

Eerdere studies hebben dat gevonden cFos mRNA neemt toe met korte-termijn ΔFosB-expressie, maar na langdurige ΔFosB-expressie is het vermogen van cocaïnebehandeling om cFos in striatum te induceren, verminderd (McClung en Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Daarom is het mogelijk dat cFos bijdraagt aan de toename in cck expressie na kortstondige ΔFosB-expressie. We hebben ChIP-assays uitgevoerd met een antilichaam dat specifiek is voor cFos en de gemeten cFos-binding op de cck promotor met en zonder kortetermijn-IFosB-expressie. Terwijl we ontdekten dat cFos zich wel degelijk verbindt met de cck promotor, deze binding nam niet significant toe na AFosB-overexpressie (Figuur 5, n = 5). Dit suggereert dat omdat cFos de bindt cck promotor, het kan bijdragen aan de algemene regulering van cck maar het is waarschijnlijk niet betrokken bij de regulering van de cck promotor door ΔFosB.

cFos bindt zich aan de cck promotor. Chromatin immunoprecipitatie assays werden uitgevoerd met een specifiek antilichaam voor cFos met behulp van striataal weefsel van ΔFosB tot overexpressie brengende muizen, hetzij op dox, hetzij na 2 weken dox verwijdering. Real-time PCR-analyse was ...

DISCUSSIE

Deze studie bevestigt en breidt eerdere bevindingen uit die aantonen dat ΔFosB genexpressie in het striatum reguleert en we merken dat dit gebeurt via meerdere mechanismen na expressie op de korte termijn. We laten zien dat, na 2 weken van overexpressie, ΔFosB rechtstreeks bindt aan de promoters in bepaalde genen die leiden tot veranderingen in expressie (bijv. CDK5). Bovendien verhoogt het CREB-eiwitniveaus, een effect dat zowel in gekweekte cellen als in striatum wordt waargenomen, wat leidt tot verhoogde CREB-binding bij andere genpromoters (bijv. dynorphine en BDNF). In een eerdere studie hebben we gevonden dat overexpressie op korte termijn van ΔFosB in striatum leidt tot veel van dezelfde genexpressie-veranderingen die worden gevonden als CREB tot overexpressie wordt gebracht, en leidt tot vergelijkbare gedragsreacties in cocaïnemethoden (McClung en Nestler, 2003). Dus de huidige bevinding dat AFFB leidt tot een inductie van CREB, evenals binding van CREB aan bepaalde genpromoters, helpt verklaren waarom zoveel van de genexpressie-veranderingen gedeeld werden door deze twee transcriptiefactoren.

De inductie van CREB door ΔFosB is interessant, omdat is aangetoond dat drugs door misbruik veranderingen induceren in serine 133-gefosforyleerde CREB-niveaus (Mattson et al., 2005) en verhoog CRE-gemedieerde transcriptie (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), zonder de algemene niveaus van CREB te wijzigen. Het is mogelijk dat veranderingen in CREB-waarden van voorbijgaande aard zijn en daarom gemakkelijk kunnen worden gemist in andere onderzoeken. In onze handen hebben we cocaïne-geïnduceerde verhogingen van CREB-mRNA in bepaalde experimenten gezien, maar dit effect is zeer variabel (niet-gepubliceerde observatie). Omdat zowel de 11A-transgene muizen als de PC-12-cellen CREB-inductie vertonen na overexpressie van A77B op korte termijn, suggereert dit dat CREB inderdaad wordt geïnduceerd door ΔFosB (of een doelwit van ΔFosB), waardoor er nog een ander mechanisme is om door geneesmiddelen veroorzaakte veranderingen in gen te verklaren uitdrukking.

Verrassend genoeg hebben we geconstateerd dat noch CREB, noch ΔFosB binden aan de cck promotor ook al cck De expressie is duidelijk opgereguleerd na de korte-termijn ΔFosB-expressie. Cck is een overvloedig neuropeptide dat tot expressie komt in zowel de VTA als de NAc (Hokfelt et al., 1980) en is waarschijnlijk betrokken bij gedragsreacties op misbruik drugs (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). In celkweektesten, de cck promotor is uitgebreid gekarakteriseerd en bleek ontvankelijk te zijn voor CREB- en AP-1-familieleden (beoordeeld door Hansen, 2001). Haun en Dixon (1990) toonde aan dat AP-1-complexen zich kunnen binden aan de cck CRE-achtige site in vitroen later werd aangetoond, gebruikmakend van SK-N-MC neuroblastomacellen, dat de mutatie van de CRE-achtige site de responsiviteit van de promoter verminderde tot overmatig tot expressie gebrachte cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Inderdaad vinden we ook toegenomen cck promotor activiteit (Figuur 2) en binding op of rond het CRE-achtige element (Figuur 3) bij overexpressie van ΔFosB, een ander AP-1-familielid, maar we vinden geen directe binding van ΔFosB aan de cck promotor in vivo or in vitro, zelfs bij de overexpressie.

Veel werk heeft een rol aangetoond voor CREB in de regulering van cck promotor activiteit. De cck CRE-achtige site is geconserveerd over gewervelde dieren (Hansen, 2001) en in sommige celcultuurassays binden zowel CREB- als AP-1-complexen zich aan deze site en zijn ze noodzakelijk voor cck promotor activiteit (Haun en Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Daarnaast zijn er verschillende bekende activators van cck expressie (inclusief bFGF, PACAP, peptonen en depolarisatie) aangetoond via CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Onze cck-luciferase reporter gen data ondersteunen een essentiële rol voor de CRE-achtige site in regulatie van cck promotoractiviteit, omdat mutatie van deze site basaal vermindert cck promotor activiteit en cck-luciferase-expressie geïnduceerd door VP16-CREB, een constitutief actieve vorm van CREB, gaat verloren wanneer deze site wordt gemuteerd (ongepubliceerde waarneming). We waren dus verrast dat CREB niet lijkt te binden aan de cck promotor in striatale extracten, hetzij bij baseline of na kortstondige ΔFosB-overexpressie wanneer CREB-niveaus worden verhoogd. Dit stelt dat niveaus van CREB werkt zijn niet de enige factor bij het bepalen van de hoeveelheid binding op deze site, en dit wordt ondersteund door het werk van anderen (Cha-Molstad, et al., 2004). Sinds de promoters van andere, eerder geïdentificeerde CREB-doelgenen, zoals BDNF en prodynorphin, bond CREB, we hebben er alle vertrouwen in dat CREB niet bindend is voor de cck promotor in striatale nucleaire extracten. Verder is de inductie van cck-luciferase-activiteit door ΔFosB was niet afhankelijk van de intacte CRE-achtige site, wat suggereert dat ΔFosB niet reguleert cck expressie door de directe binding van CREB aan de cck promotor.

Ons onvermogen om CREB te ontdekken in interactie met de cck promotor wordt ondersteund door Renthal et al. (2009), die een ChIP-chip-benadering heeft gebruikt om te kijken naar globale veranderingen in gefosforyleerde CREB (pCREB) en ΔFosB-binding in striatum na chronische blootstelling aan cocaïne. In deze experimenten werden DNA-eiwitcomplexen geïmmunoprecipiteerd met AFosB- of pCREB-antilichamen en het geprecipiteerde DNA werd na het merken gehybridiseerd aan een promotormicro-array. Hoewel veel eerder gekarakteriseerde CREB-doelgenen werden geïdentificeerd met deze benadering (bijv. BDNF, prodynorf), cck werd niet geïdentificeerd. Bovendien is aangetoond dat de binding van CREB aan een consensus-CRE-plaats sterk varieert tussen gekweekte cellijnen (Cha-Molstad, et al., 2004). Alle eerdere onderzoeken die CREB-interacties met de cck promotor werden uitgevoerd in celkweek (niet hersenen waaruit onze EMSA- en ChIP-monsters waren afgeleid) en gebruikte gelverschuivingsassays om eiwit-DNA-interacties te onderzoeken. Hoewel een EMSA het potentieel van een factor om te binden aan een DNA-sequentie kan beoordelen, bieden ChIP-testen een nieuwe kijk op deze interacties in vivo. Bovendien zijn veel van de gegevens die inductie van cck promotor activiteit of CREB binding aan de cck promotor werden verkregen uit cellen die waren gestimuleerd door factoren zoals peptonen (Bernard et al., 2001), depolarisatie (Hansen, et al., 2004), of een verscheidenheid aan activatoren van intracellulaire signaalcascades, waaronder cAMP en ERK (Hansen et al., 1999). In onze experimenten was de enige "stimulus" die werd gebruikt de overexpressie van ΔFosB, die voldoende is om te induceren cck uitdrukking. Alles bij elkaar genomen suggereert dit dat het vermogen van CREB om te binden aan (en mogelijk te reguleren) het cck promotor is in hoge mate afhankelijk van het celtype en activering van specifieke signaleringsroutes. Bovendien, de cck CRE-achtig promotorelement (althans in niet-geïnduceerde PC12-cellen en in striatum van de muis) is geen direct doelwit van CREB of ΔFosB. Interessant is dat de regulering van FosB expressie door CREB is ook specifiek voor het celtype en het type stimulatie. Een studie door Andersson c.s.. vond dat injectie van CREB antisense oligonucleotiden in muizenstriatum de inductie van gedeeltelijk remde FosB na cocaïneadministratie (Andersson et al., 2001). Ze vonden echter ook dat het vermogen van L-Dopa om te induceren FosB expressie in 6-OHDA-gelabelde striatum werd niet beïnvloed door de aanwezigheid van CREB antisense oligonucleotiden.

Omdat CREB en AFosB indirect lijken te reguleren cck promotor en veranderingen in de chromatine structuur zijn gedocumenteerd in reactie op een verscheidenheid aan stimuli die ΔFosB induceren (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), redeneerden we dat ΔFosB de activiteit van de promotor indirect zou kunnen moduleren door de chromatine structuur te veranderen. Bij muizen met een overexpressie van ΔFosB voor 2-weken was er echter geen verandering in histon H3-acetylering bij de cck promotor (Tabel 1). Dit wordt ondersteund door de ChIP-chipgegevens van Renthal et al. (2009), die geen verandering in gehythyleerde H3 binding op de cck promotor bij muizen die zijn blootgesteld aan chronische cocaïne. Sinds de cck promotor is actief in het striatum, er werd geen repressieve gemethyleerde histon-H3-binding verwacht of waargenomen. Interessant genoeg zagen we ook geen verandering als gevolg van ΔFosB-overexpressie in geacetyleerde H3-binding bij de BDNF promotor (die verhoogde CREB-binding liet zien) of op de CDK5 en prodynorphin promoters (die toegenomen ΔFosB-binding vertoonden). Omdat er een groot aantal histon-aanpassingen zijn geassocieerd met veranderingen in promotoractiviteit (beoordeeld door Rando en Chang, 2009), er zijn waarschijnlijk andere chromatinemodificaties die associëren met inductie van deze genen. Elke enkele chromatinemodificatie, hoewel vaak voorspellend voor het niveau van promoteractiviteit, kan niet veranderen tijdens de activering van een bepaald gen. In toekomstig werk zou het interessant zijn om te kijken naar andere mogelijke veranderingen in de chromatinestructuur rondom de cck promotor na ΔFosB-overexpressie. Interessant is dat chronische cocaïne (waarschijnlijk via ΔFosB-inductie) is aangetoond dat het expressie van sirtuin 1 en 2, klasse III histondeacetylases induceert die de neuronale fysiologie, ERK-signalering en gedragsreacties op cocaïne lijken te veranderen (Renthal et al., 2009). Inductie van een histondeacetylase zou het vermogen hebben om tegelijkertijd de expressie van een groot aantal genen te reguleren via globale veranderingen in de structuur van de chromatine.

Een mogelijke kandidaat betrokken bij cck regulatie na ΔFosB-overexpressie was het APF-1-familielid cFos. De expressie van cFos wordt gereguleerd door CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004) en cFos-overexpressie (overeenkomend met overexpressie van zijn bindingspartner cJun) neemt toe cck promotor activiteit (Rourke et al., 1999). Daarom kunnen verhoogde CREB-niveaus als gevolg van kortstondige ΔFosB-overexpressie de cFos-niveaus verhogen en resulteren in een verhoogde binding aan de cck CRE-achtige site. cfos mRNA wordt bij muizen geïnduceerd na 2 weken overexpressie van ABosB (McClung en Nestler, 2003) en afgenomen bij muizen die werden blootgesteld aan chronische cocaïne of lange ΔFosB-overexpressie (Renthal et al., 2008). Hier zien we dat cFos zich rechtstreeks bindt aan de cck promotor in striataal weefsel, maar ΔFosB-overexpressie verhoogt de binding niet significant. Dit suggereert dat cFos weliswaar betrokken zou kunnen zijn bij het reguleren cck expressie in het algemeen is een verandering in binding van cFos alleen niet waarschijnlijk het mechanisme waarmee ΔFosB reguleert cck uitdrukking. Het is echter mogelijk dat ΔFosB ofwel post-translationele veranderingen in cFos (bijv. Gewijzigde fosforylatie) induceert of de expressie van een bindingspartner (zoals cJun) of co-activator-eiwit induceert. Omdat de intacte CRE-achtige site (waarvan eerder is aangetoond dat het een bindingsplaats voor AP-1-complexen is, zie Haun en Dixon, 1990) is niet vereist voor de verhoogde cck promotoractiviteit waargenomen met ΔFosB-overexpressie (zoals vastgesteld in onze reporter-genexperimenten), het spreekt vanzelf dat andere trans-werkende factoren ook worden gereguleerd door ΔFosB.

De cck promotorfragment dat wordt gebruikt in onze luciferase-reportergenexperimenten, bevat een geconserveerde Sp1-bindingsplaats en een E-box (besproken door Hansen, 2002). In het bijzonder is aangetoond dat E-box-sequenties talrijke transcriptiefactoren binden (beoordeeld door Forrest en McNamara, 2004). Met behulp van PC12-cellen hebben we gezien dat de mutatie van de E-box afneemt cck promotoractiviteit, maar verandert niet de respons van de promotor op ΔFosB (gegevens niet getoond). Interessant is dat een cck-luciferasereporter die mutaties bevat in zowel de CRE-site als de E-box heeft geen detecteerbare basale activiteit en reageert niet op ABosB-overexpressie (ongepubliceerde waarneming). Een andere mogelijke bemiddelaar van ΔFosB-actie op de cck promotor zijn ATF's waarvan bekend is dat bepaalde vormen in het striatum worden geïnduceerd door blootstelling aan chronische psychostimulantia (Green et al., 2008). We hebben echter geen bewijs gevonden voor ΔFosB-inductie van deze ATF's (gegevens niet weergegeven) en van ATF's zou niet worden verwacht dat ze binden aan de gemuteerde CRE-achtige site op de cck promotor.

Een waarschuwing van deze studie is dat we een bi-transgeen systeem gebruiken om FosB tot overexpressie te brengen en dus moet je conservatief parallellen trekken tussen dit paradigma en het toedienen van chronische cocaïne. De 11A-transgene muizen bieden echter de unieke mogelijkheid om naar de specifieke effecten van ΔFosB in het striatum te kijken, omdat overexpressie beperkt is tot dit hersengebied (Chen et al., 1998), terwijl toediening van cocaïne veranderingen in een groot aantal andere hersenregio's induceert die vervolgens indirect het striatum kunnen beïnvloeden. Bovendien hebben verschillende studies vergelijkbare gedrags- en moleculaire fenotypen gedocumenteerd in de 11A-muizen in vergelijking met niet-transgene dieren die werden behandeld met chronische cocaïne (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Bovendien, Bibb et al. (2001) rapporteerde vergelijkbare niveaus van striataal Cdk5 mRNA- en eiwitinductie in dezelfde 11A-stam in vergelijking met met cocaïne behandelde, niet-transgene nestgenoten, evenals vergelijkbare veranderingen in de CDK5-doelen, p35 en DARPP-32.

Concluderend vinden we dat kortdurende ΔFosB-expressie leidt tot de inductie van genen in het striatum via meerdere mechanismen. Deze omvatten directe promoterbinding, inductie van CREB-eiwit en activiteit, chromatinemodificatie, naast nog te bepalen routes.

EXPERIMENTELE PROCEDURES

Dieren

Mannelijke bi-transgene 11A-dieren (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) werden in deze studie gebruikt en worden gekenmerkt Kelz et al., 1999. Om ΔFosB tot overexpressie te brengen, werden muizen verwijderd uit doxycycline tussen 3 en 6 weken oud, terwijl controlemuizen op doxycycline werden gehouden. Alle muizen werden in een groep gehuisvest en onderhouden op een 12: 12 licht / donker-cyclus, lichten op bij 7 am en lichten af bij 7 pm, met ad lib toegang tot voedsel en water. Alle muisexperimenten waren in overeenstemming met protocollen die waren goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas in Dallas.

Reporter- en expressieplasmiden

Het wildtype (WT) cck promoter-luciferasereporter werd bereid door een bij benadering 200 bp PCR-fragment in te voegen in de pGL3-luc-vector (Promega). Dit fragment werd verkregen uit muizengenomisch DNA (primers: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' stroomopwaarts en 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' stroomafwaarts) en oorspronkelijk ingevoegd in pGEM-T Easy vector (Promega, #A1360). Het promotorfragment werd vervolgens gekloneerd in de Kpn1 / Xho1-restrictie-enzymplaatsen van pGL3-luc.

De CRE-puntmutatie in de maken cck promotor, een mutagene primer gericht tegen een eerder gerapporteerde CRE-achtige site (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3', antisense primer: 3.1'CTGTTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG XNUMX ') werd gebruikt in . Dit converteert de gerapporteerde CRE-achtige site (ACTGCGTCAGC) naar ACTGAGCTCC. Alle reporterplasmiden werden bevestigd door middel van DNA-sequentiebepaling. Het ΔFosB-expressieplasmide bevat een ΔFosB-sequentie van volledige lengte die is ingevoegd in de meervoudige kloneringssite van pCDNA XNUMX en is eerder beschreven (Ulery en Nestler, 2007).

Celkweek en DNA-transfecties

Rattenfeochromocytoom (PC12) -cellen werden gehandhaafd in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium F-12, aangevuld met 10% paardenserum, 5% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine bij 37 ° C en 5% CO₂. Cellen werden getransfecteerd door elektroporatie met behulp van een BTX 360-elektroporator (350V, 0 ohm en 850 μF) in 800 μl Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing in cuvetten met een opening van 4 mm met 10 μg van de reporter en 5 μg van het expressieconstruct. Leeg vectorplasmide (pCDNA) werd gebruikt om de totale hoeveelheden DNA te normaliseren. Na transfectie werden de cellen gedurende de aangegeven tijd op 35 mm met collageen beklede schalen gekweekt.

Luciferase-assays

Twee of drie dagen na transfectie werden de cellen driemaal gewassen in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing, gelyseerd (met gebruikmaking van 3 mM glycylglycine, 25 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), verzameld en gecleared via centrifugatie. 30 μL lysaat werd gecombineerd met 140 μL-luciferasebepalingsbuffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kaliumfosfaat, 1 mM co-enzym A, pH 7.8). Luminescentie-activiteit werd gemeten met behulp van een FLx-800 microplaat-fluorescentielezer na een geautomatiseerde injectie van 40 μL 1 mM luciferine per putje. Luciferaseactiviteit werd genormaliseerd op het totale eiwitgehalte zoals bepaald door een BioRad-eiwitassay.

Verplaatsingsassay met elektroforetische mobiliteit

Nucleaire extracten van bilaterale plakjes striatum van bi-transgene 11A-muizen (die op of buiten doxycycline werden gehouden voor 2- of 8-weken) (McClung en Nestler, 2003) werden bereid volgens Huang en Walters (1996). ³²P-gelabelde dubbelstrengige oligonucleotideprobes werden bereid met behulp van het Promega Gel Shift Assay-systeemprotocol (#E3300) en probes werden gezuiverd met behulp van Roche Quick Spin Columns. De consensus-CRE- en AP-1-probesequenties waren van Promega (respectievelijk #E328A en E320B) en de cck CRE-sequenties waren (Cck-CRE-sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE-antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bindingsreacties en elektroforese werden uitgevoerd met behulp van modificaties van de Promega Gel Shift Assay-systeemprocedure (#E3300). 50,000 CPM van gelabelde probe werd gecombineerd met 10 μg striataal nucleair extract. Koud competitor-DNA of antilichamen werden toegevoegd voorafgaand aan introductie van de radioactief gemerkte probes. Voor supershift-experimenten werd 2 μg CREB-antilichaam (Upstate Biotechnology # 06-083) gebruikt. Reacties werden geëlektroforeerd op 4% polyacrylamidegels, gedroogd en blootgesteld aan film (met behulp van versterkende schermen voor 1 uur tot 2 dagen).

immunoblotting

Voor PC12-cellen werden 35 mm-platen van getransfecteerde cellen gewassen in ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing en lysaten werden bereid in ijskoude RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholaat, 1 % Triton X-100, 0.1% natriumdodecylsulfaat) met proteaseremmers. Na sonicatie, klaring en Bradford-eiwittest werden de lysaten volledig gedenatureerd en werd 50 μg van elk monster geëlektroforeerd op 10% SDS-polyacrylamidegels. Eiwitten werden overgebracht naar PVDF-membraan, gedurende 1 uur geblokkeerd in 3% magere melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0.1% Tween-20 (TBS-T-melk), en overnacht bij 4 ° C onderzocht met primaire antilichamen (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, gebruikt bij 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, gebruikt bij 1: 80,000) verdund in TBS-T-melk. Na meerdere wasbeurten in TBS-T, werden blots gedurende één uur bij kamertemperatuur onderzocht met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde secundaire antilichamen (Sigma), 1: 5,000 verdund in TBS-T-melk. Na meerdere wasbeurten in Tris-gebufferde zoutoplossing werd de kleurreactie uitgevoerd volgens de instructies van BioRad (# 170-6432). Membranen werden een nacht gedroogd, gescand op een flatbedscanner en densitometrie uitgevoerd met ImageJ (zie hieronder).

Voor striatale extracten werden Western blot-assays uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd (Hope et al., 1994). Weefsel werd verwijderd van onthoofde muizen, op ijs geplaatst en verdeeld in een hersenmatrix met een dikte van 1 mm. Weefselponsen werden vervolgens genomen en bij -80 ° C tot gebruik bevroren. Weefsel werd gesoniceerd op ijs in een gemodificeerde op detergens gebaseerde buffer die zowel fosfatase- als proteaseremmers bevat (Roche, Sigma). Na sonicatie werden monsters gedenatureerd in kokend water en gecentrifugeerd bij 15,000xg gedurende 15 minuten; supernatant werd vervolgens verzameld en verwerkt; eiwitconcentratiehoeveelheden werden vervolgens gekwantificeerd met behulp van een Bradford-test (Bio-Rad). Monsters werden gelopen op een 10% acrylamide / bisacrylamidegel, overgebracht naar een PVDF-membraan, geblokkeerd in 5% melk en geïncubeerd met primaire antilichamen (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blots werden vervolgens gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescentiesysteem (Pierce). Alle monsters werden genormaliseerd naar GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Standaardcurves werden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat we in het lineaire bereik van de assay zijn.

Densitometrie analyse

Voor PC12-immunoblots werd densitometrie-analyse uitgevoerd met ImageJ met rodbard-kalibratie. Gemiddeld achtergrondsignaal werd afgetrokken van elke meting en de verhouding van CREB tot GAPDH-signaal werd voor elk monster berekend. Voor striatale immunoblots en EMSA-analyse werd Scion Image 1.62c gebruikt met achtergrondaftrekking.

Chromatin immunoprecipitatie (ChIP)

ChIP-assays werden uitgevoerd volgens de methoden van Tsankova et al. (2004) en Kumar et al. (2005). In het kort werden bilaterale striatale monsters van 11A-muizen die op of buiten doxycycline werden gehouden, verknoopt met 1% formaldehyde en verknoping werd geblust met glycine (eindconcentratie van 0.125 M). Deze monsters waren van volledige hersenschijfjes genomen op het niveau van de nucleus accumbens met de cortex verwijderd. Chromatine werd afgeschoven tot fragmenten van ongeveer 0.2 tot 1 kb via ultrasoonapparaat, geklaard met Protein G-korrels (Thermo Scientific # 22852) en invoermonsters werden ingevroren bij -80 ° C. Voor elke neerslag werd tussen 60 en 100 μg chromatine gebruikt. 5-10 μg van elk primair antilichaam werd gebruikt (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, geacetyleerd H3: Upstate Biotechnology # 06-599, gemethyleerd H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antilichaam-chromatinecomplexen werden onderworpen aan immunoprecipitatie met Protein G plus-korrels volgens de instructies van de fabrikant (Thermo Scientific # 22852). Na reverse crosslinking van input en geprecipiteerde monsters, werd elk monster onderworpen aan kwantitatieve PCR (qPCR). Het gebruik van al deze antilichamen voor ChIP is uitgebreid gevalideerd (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Niveaus van eiwitbinding bij elke genpromotor van belang werden bepaald door het meten van de hoeveelheid geassocieerd DNA door qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Input- of totaal-DNA (niet-geïmmunoprecipiteerd) en immuungeprecipiteerd DNA werden geamplificeerd in triplo in de aanwezigheid van SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct-waarden van elk monster werden verkregen met behulp van de Sequence Detector 1.1-software. Relatieve kwantificatie van template-DNA werd uitgevoerd met behulp van de ΔΔCt-methode (Tsankova et al., 2004). Primers gebruikt: BDNF-promoter 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5-promotor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck-promoter: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorfinepromoter: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

statistische analyse

Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde. Statistisch verschil werd bepaald door de tweezijdige t-test van Student (p <0.05). Als er meerdere vergelijkingen werden gemaakt, werden de p-waarden aangepast met behulp van Bonferroni-correctie.

Danksagung

We willen Will Renthal en Arvind Kumar bedanken voor nuttige discussies. We willen ook NIDA bedanken voor het financieren van deze experimenten.

voetnoten

Disclaimer uitgever: Dit is een PDF-bestand van een onbewerkt manuscript dat is geaccepteerd voor publicatie. Als service aan onze klanten bieden wij deze vroege versie van het manuscript. Het manuscript zal een copy-editing ondergaan, een typografie en een review van het resulterende bewijs voordat het in zijn definitieve citeervorm wordt gepubliceerd. Houd er rekening mee dat tijdens het productieproces fouten kunnen worden ontdekt die van invloed kunnen zijn op de inhoud en alle wettelijke disclaimers die van toepassing zijn op het tijdschrift.

Classificatie voorwaarden:

Sectie: #1 Cellulaire en moleculaire biologie van zenuwstelsel

Referenties

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP responselement-bindend eiwit is vereist voor dopamine-afhankelijke genexpressie in het intacte maar niet het met dopamine gedenerveerde striatum. J Neurosci. 2001, 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB-activiteit in de nucleus accumbens-schaal bestuurt de gating van gedragsreacties op emotionele stimuli. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435-40. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Cocaïnebehandeling verhoogt extracellulair cholecystokinine (CCK) in de nucleus accumbens-schaal van wakkere, vrij bewegende ratten, een effect dat wordt versterkt bij ratten die gedragsgevoelig zijn voor cocaïne. J Neurochem. 2002, 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimuleren intestinale cholecystokininegen transcriptie via cyclische adenosine monofosfaat responselement bindende factoren. Endocrinology. 2001, 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Effecten van chronische blootstelling aan cocaïne worden gereguleerd door het neuronale eiwit Cdk5. Natuur. 2001, 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Cel-type-specifieke binding van de transcriptiefactor CREB aan het cAMP-responselement. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572-7. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulatie van delta FosB en FosB-achtige eiwitten door elektroconvulsieve aanvallen en cocaïnebehandelingen. Mol Pharmacol. 1995, 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene dieren met induceerbare, gerichte genexpressie in de hersenen. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Inductie van cycline-afhankelijk kinase 5 in de hippocampus door chronische elektroconvulsieve aanvallen: rol van ΔFosB. J Neurosci. 2000, 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Veelvuldige ontmoetingen van vele soorten: Fos-Jun-interacties die de specificiteit van transcriptieregulerende middelen mediëren. Oncogene. 2001, 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronale aanpassing aan amfetamine en dopamine: moleculaire mechanismen van regulatie van het gen voor prodynorfine in rattenstriatum. Neuron. 1995, 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Controle van CCK-gentranscriptie door PACAP in STC-1-cellen. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000, 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminerge regulatie van het mRNA-gehalte van cholecystokinine in rattenstriatum. Brain Res Mol Brain Res. 1992, 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id-familie van transcriptiefactoren en vorming van vasculaire laesies. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004, 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Mede-vereiste van cyclische AMP- en calcium-afhankelijke proteïnekinasen voor transcriptionele activering van cholecystokininegen door eiwithydrolysaten. J Biol Chem. 2002, 277: 22407-13. [PubMed]
Groene TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Inductie van activerende transcriptiefactoren (ATF's) ATF2, ATF3 en ATF4 in de nucleus accumbens en hun regulatie van emotioneel gedrag. J Neurosci. 2008, 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Overloop van dopamine en cholecystokinine in rattenucleus accumbens in reactie op acute toediening van geneesmiddelen. Synapse. 2000, 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogeen-geactiveerde proteïnekinase en proteïnekinase A-signaleringsroutes stimuleren de transcriptie van cholecystokinine via activering van cyclisch adenosine 3 ', 5'-monofosfaat-responselement-bindend eiwit. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulatie van transcriptie van neuronale cholecystokininegen. Scand J Clin Lab Invest suppl. 2001, 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Cholecystokinine-gentranscriptie: promotorelementen, transcriptiefactoren en signaalroutes. Peptiden. 2001, 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl en forskoline verhogen synergistisch de cholecystokinine-genexpressie via coördinaatactivering van CREB en de co-activator CBP. J Neurochem. 2004, 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Een transcriptionele versterker die essentieel is voor de expressie van het cholecystokininegen van de rat bevat een sequentie die identiek is aan het -296-element van het menselijke c-fos-gen. J Biol Chem. 1990, 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Essentiële rol van het fosB-gen in moleculaire, cellulaire en gedragsmatige acties van chronische elektroconvulsieve aanvallen. J Neurosci 1998. 1998, 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bewijs voor coëxistentie van dopamine en CCK in meso-limbische neuronen. Natuur. 1980, 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Chronische behandeling met elektroconvulsieve aanvallen (ECS) resulteert in de expressie van een langdurig AP-1-complex in hersenen met veranderde samenstelling en kenmerken. J Neurosci. 1994, 14: 4318-28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Inductie van een langdurig AP-1-complex dat bestaat uit veranderde Fos-achtige eiwitten in de hersenen door chronische cocaïne en andere chronische behandelingen. Neuron. 1994, 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminerge regulatie van AP-1 transcriptiefactor DNA-bindingsactiviteit in rattenstriatum. Neuroscience. 1996, 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Het definiëren van het CREB-regulon: een genoom-brede analyse van transcriptiefactorregulerende regio's. Cel. 2004, 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Wat draait CREB op? Cell Signal. 2004, 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Tegengestelde effecten van CCK (A) en CCK (B) antagonisten op de ontwikkeling van geconditioneerde activiteit bij ratten. Gedrag Pharmacol. 1996, 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bewijs voor de betrokkenheid van CCK (A) -receptoren bij de verwerving van geconditioneerde activiteit geproduceerd door cocaïne bij ratten. Brain Res. 1997, 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Expressie van de transcriptiefactor deltaFosB in de hersenen regelt de gevoeligheid voor cocaïne. Natuur. 1999, 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatine-hermodellering is een sleutelmechanisme dat ten grondslag ligt aan door cocaïne geïnduceerde plasticiteit in striatum. Neuron. 2005, 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Door cocaïne geïnduceerde CREB-fosforylatie in nucleus accumbens van door cocaïne gesensibiliseerde ratten wordt mogelijk gemaakt door versterkte activering van extracellulair signaalgerelateerd kinase, maar niet door proteïnekinase A. J Neurochem. 2005, 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulatie van genexpressie en cocaïnebeloning door CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: een moleculaire switch voor langdurige aanpassing in de hersenen. Brain Res Mol Brain Res. 2004, 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: een moleculaire bemiddelaar van langetermijn neurale en gedragsmatige plasticiteit. Brain Res. 1999, 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Bestaat er een gebruikelijke moleculaire route voor verslaving? Nat Neurosci. 2005, 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transcriptionele verslavingsmechanismen: rol van DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-55. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Verschillende patronen van DeltaFosB-inductie in de hersenen door misbruik van drugs. Synapse. 2008, 62: 358-69. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Genoom-brede overzichten van chromatine structuur. Annu Rev Biochem. 2009, 78: 245-71. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB bemiddelt epigenetische desensitisatie van het c-fos-gen na chronische blootstelling aan amfetamine. J Neurosci. 2008, 28: 7344-9. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genoom-brede analyse van chromatine regulatie door cocaïne onthult een rol voor sirtuins. Neuron. 2009, 62: 335-48. [PMC gratis artikel] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokininemodulatie van de mesolimbische dopaminefunctie: regulatie van gemotiveerd gedrag. Pharmacol Toxicol. 2002, 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatieve coöperativiteit tussen naast elkaar geplaatste E-box en cAMP / TPA reagerende elementen in de cholecystokininegenpromotor. FEBS Lett. 1999, 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regionale en cellulaire mapping van CRE-gemedieerde transcriptie tijdens naltrexon-geprecipiteerde morfineontwenning. J Neurosci. 2002, 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulatie van CRE-gemedieerde transcriptie in muizenhersenen door amfetamine. Synapse. 2003, 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membraandepolarisatie en calcium induceren c-fos transcriptie via fosforylatie van transcriptiefactor CREB. Neuron. 1990, 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histon-modificaties op genpromotorgebieden in hippocampus van de rat na acute en chronische elektroconvulsieve aanvallen. J Neurosci. 2004, 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulatie van DeltaFosB-transcriptionele activiteit door Ser27-fosforylatie. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamine-CCK interacties in psychostimulant beloning en gerelateerd gedrag. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: een essentiële rol voor ΔFosB in de nucleus accumbens in morfineactie. Nature Neurosci. 2006, 9: 205-11. [PubMed]