Ethanol zelftoediening herstelt ontwenningsverschijnselen in dopamine en 5-hydroxytryptamine-afgifte in afhankelijke ratten (1996)

Neuroscience. 2010 Augustus 11; 169(1): 182-194. Gepubliceerd online 2010 mei 7. doi:  10.1016 / j.neuroscience.2010.04.056

Friedbert Weiss,Loren H. Parsons,Gery Schulteis,Petri Hyytiä,Marge T. Lorang,Floyd E. Bloom enGeorge F. Koob

+ Auteur Affiliations


  1. 1 Afdeling Neuropharmacology, The Scripps Research Institute, La Jolla, Californië 92037

Abstract

Basale voorhersenen dopamine (DA) en 5-HT neurotransmissie zijn betrokken bij de bemiddeling van de acute versterkende werking van ethanol. Neuroadaptatietheorieën voorspellen dat compenserende veranderingen in neurochemische systemen die acuut door alcohol worden geactiveerd, ten grondslag kunnen liggen aan ontwenningsverschijnselen na chronische toediening. Om deze hypothese te testen, werd de afgifte van DA en 5-HT gevolgd door microdialyse in de nucleus accumbens van afhankelijke mannelijke Wistar-ratten aan het einde van een 3-5 weken durende ethanol (8.7% g / v) vloeibaar dieet, gedurende 8 uur. van terugtrekking, en tijdens hernieuwde beschikbaarheid van ethanol waarbij (1) de mogelijkheid bestaat om zelf ethanol (10% g / v) gedurende 60 minuten operationeel toe te dienen, gevolgd door (2) onbeperkte toegang tot het ethanol-vloeistof-dieet. De resultaten werden vergeleken met controlegroepen die paren kregen met een ethanolvrij vloeibaar dieet en getraind om zelf ethanol of water toe te dienen. Bij niet-afhankelijke ratten verhoogde operante zelftoediening door ethanol zowel de DA- als de 5-HT-afgifte in de NAC. Terugtrekking uit het chronische ethanoldieet veroorzaakte een geleidelijke onderdrukking van het vrijkomen van deze zenders gedurende de wachttijd van 8 uur. Zelftoediening van ethanol herstelde en handhaafde DA-afgifte op het niveau van vooronttrekking, maar slaagde er niet in om de 5-HT-efflux volledig te herstellen. 5-HT-niveaus herstelden zich echter snel binnen 1 uur na herblootstelling aan een vloeibaar ethanol dieet. Deze bevindingen suggereren dat tekorten in de accumulatie van monoamine-afgifte kunnen bijdragen aan de negatieve affectieve gevolgen van ethanolonttrekking en daardoor ethanolzoekgedrag bij afhankelijke proefpersonen kunnen motiveren.

Introductie

Alcoholmisbruik en afhankelijkheid van hun medische en sociale pathologieën blijven een van de grootste problemen met alcohol- en drugsmisbruik in de VS en wereldwijd (Nelson en Stussman, 1994;Greenfield en Weisner, 1995; Rice en Harris, 1995). Alcohol heeft anxiolytische en euforische acties, en deze eigenschappen dragen vermoedelijk bij aan de acute versterkende effecten van alcohol die kunnen leiden tot voortgezet gebruik en uiteindelijk tot ernstig misbruik en afhankelijkheid bij gevoelige personen. Er is de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot de identificatie van neurotransmitter- en receptorsystemen die deelnemen aan de bemiddeling van de acute versterkende effecten van ethanol (zie voor een overzicht, zie Gianoulakis, 1989; Hoffman et al., 1990; Samson, 1992; Sellers et al., 1992; Froehlich en Li, 1993; Hunt, 1993; Grant, 1994; Tabakoff en Hoffman, 1996; Mihic en Harris, 1995).

Van de vele neurotransmittersystemen die betrokken zijn bij de farmacologische effecten van alcohol, hebben dopamine (DA) en 5-HT speciale aandacht gekregen vanwege hun vermeende rol in de motivationele effecten van ethanol (Cloninger, 1987; McBride et al., 1991;Engel et al., 1992; Samson, 1992; Sellers et al., 1992). In het geval van DA dwingende elektrofysiologische (Gessa et al., 1985; Brodie et al., 1990), neurochemisch (Imperato en DiChiara, 1986; Wozniak et al., 1991; Yoshimoto et al., 1991; Engel et al., 1992) en gedragsmatige (Imperato en DiChiara, 1986; Waller et al., 1986) Er zijn aanwijzingen dat gedragsrelevante doses ethanol de mesolimbische DA-beloningsroute activeren. Direct bewijs van een rol voor DA bij de beloning van ethanol komt uit de bevindingen dat operatief zelf toegediende ethanol de afgifte van DA in de NAC stimuleert (Weiss et al., 1993), dat de ratten zelf ethanol zullen toedienen in het gebied van het ventrale tegmentale cellichaam van de DA-beloningsroute van meso-accumbens (Gatto et al., 1994), en dat operant die reageert op ethanol wordt gemodificeerd door farmacologische middelen die een interactie aangaan met DA-neurotransmissie (McBride et al., 1990;Samson et al., 1991; Hodge et al., 1993; Rassnick et al., 1993). Ten slotte is de alcoholvoorkeur in genetische modellen van alcoholisme gekoppeld aan een verlaagd DA-gehalte in de NAC (Murphy et al., 1982; Murphy et al., 1987; Gongwer et al., 1989) en een verhoogde gevoeligheid voor de DA-afgifte en de locomotorische activeringseffecten van ethanol (Waller et al., 1986; Cloninger, 1987; Fadda et al., 1989; Engel et al., 1992; Weiss et al., 1993).

Er is voldoende bewijs voor een betrokkenheid van 5-HT bij ethanolzoekgedrag. Ethanol verhoogt dosisafhankelijk de afgifte van 5-HT in de NAC (Yoshimoto et al., 1992), terwijl farmacologische behandelingen die de synaptische beschikbaarheid van 5-HT verhogen of directe activering van 5-HT-transmissie door receptoragonisten de vrijwillige ethanolinname bij dieren onderdrukken (zie voor een overzicht de Sellers et al., 1992; LeMarquand et al., 1994) en kan het alcoholgebruik bij mensen verminderen (Naranjo et al., 1984, 1987, 1989, 1990; Gorelick, 1989; Monti en Alterwain, 1991). Een serotonerge rol bij ethanolmisbruik wordt ook ondersteund door bevindingen van duidelijke tekortkomingen in voorhersenen 5-HT-gehalte, verminderde 5-HT-innervatie of opregulering van 5-HT1A-receptoren in genetisch geselecteerde, alcohol prefererende knaagdierlijnen (Murphy et al., 1982, 1987;Yoshimoto et al., 1985; Yoshimoto en Komura, 1987; Gongwer et al., 1989; McBride et al., 1990, 1994). Ten slotte hangen de subjectieve effecten van ethanol, ten minste gedeeltelijk, af van 5-HT-neurotransmissie, aangezien agonisten van de 5-HT1A-receptor substitueren voor (Signs and Schechter, 1988; Grant en Colombo, 1993; Krystal et al., 1994), terwijl 5-HT3-antagonisten de discriminerende stimulerende eigenschappen van ethanol blokkeren (Grant en Barrett, 1991).

Tot op heden is het overgrote deel van de onderzoeken naar de neurofarmacologische basis van door ethanol onderhouden versteviging uitgevoerd bij niet-afhankelijke dieren. Echter, inzicht in de mechanismen voor het in stand houden van alcoholmisbruik vereist ook inzicht in de biologische basis van door ethanol onderhouden versterking bij afhankelijke personen. Er is gesuggereerd dat de ontwikkeling van afhankelijkheid aanpassingen op cellulair of moleculair niveau inhoudt die zich verzetten tegen de farmacologische werking van misbruikstoffen en daardoor leiden tot ontwenningsverschijnselen die de voortdurende consumptie van het medicijn zouden kunnen stimuleren (Koob en Bloom, 1988). Met het oog op eerder bewijs dat ethanol de afgifte van zowel DA als 5-HT in de NAC stimuleert (Imperato en DiChiara, 1986; Wozniak et al., 1991; Yoshimoto et al., 1992; Weiss et al., 1993), zou deze hypothese een tekort in de afgifte van deze neurotransmitters tijdens ethanolontwenning voorspellen. Bij uitbreiding zou deze hypothese ook een omkering van door ontwenning geïnduceerde neurochemische deficiënties na hernieuwde blootstelling aan ethanol voorspellen. Om deze hypothese te testen, onderzochten de huidige experimenten de effecten van chronische ethanolblootstelling en ethanolonttrekking op de afgifte van DA en 5-HT in de NAC met behulp van intracerebrale microdialyse, evenals de rol van accumale afgifte van monoamine in door ethanol onderhouden versterking in afhankelijk ratten.

MATERIALEN EN METHODES

vakken

Mannelijke Wistar-ratten (Charles River) met een gewicht tussen 400-600 gm ten tijde van het testen werden gebruikt. De ratten werden gehuisvest in groepen van twee of drie in een vochtigheid en temperatuur (22 ° C) gecontroleerd vivarium op een 12 / 12 hr licht / donker cyclus (op 05: 00, uit 17: 00) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle procedures werden uitgevoerd in strikte naleving van de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren.

Gedragstestapparatuur

Ethanol-zelftoedieningstraining en microdialyse testen werden uitgevoerd in standaard operante kamers (Coulbourn Instruments, Allentown, PA) gemodificeerd zoals eerder beschreven (Weiss et al., 1993) om gelijktijdige presentatie van twee verschillende vloeibare versterkers mogelijk te maken en om componenten van het microdialyse-perfusiesysteem te accommoderen. In het kort waren de operante kamers uitgerust met twee intrekbare hendels. Reacties op het juiste operandum resulteerden in de presentatie van ofwel 0.1 ml ethanoloplossing of water in een van de twee houders (volumecapaciteit 0.15 ml) die 4 cm boven de roostervloer en tussen de hendels in het midden van de voorplaat van de operatiekamer waren geplaatst. De operante kamers bevonden zich in een laboratoriumverwerkingskamer die aan het vivarium was bevestigd en waren ingesloten in geluidgedempte, geventileerde omgevingscabines (Coulbourn Instruments, Allentown, PA). Vloeistofafgifte en gedragsregistratie werd gecontroleerd door een microcomputer.

Ethanol-zelftoedieningstraining

Ratten werden getraind om ethanol of water po zelf toe te dienen in een operabele taak met twee hendels, vrije keuze met behulp van een gemodificeerde (Weiss and Koob, 1991) verdwijnprocedure met zoete oplossing (Samson, 1986). Ratten werden aanvankelijk op een 22 uur durende waterontberingsschema geplaatst (beperkt tot twee opeenvolgende dagen) en getraind in dagelijkse sessies van 30 minuten om te reageren op een van de twee hefbomen voor een 0.2% (w / v) sacharine-oplossing volgens een schema van continue versterking. Na succesvolle acquisitie van operant reagerende, werd water weer ad libitum beschikbaar gesteld in de thuiskooi. Voor de volgende 6 dagen resulteerde het reageren op een enkele beschikbare hefboom in de afgifte van een oplossing van 0.1 ml ethanol (5%) / sacharine (0.2%). De dieren werden vervolgens getraind volgens een gelijktijdig schema, waarbij elke druk op de ene hendel resulteerde in afgifte van de ethanol / sacharine-oplossing, terwijl reacties bij de andere hendel resulteerden in de presentatie van water met een gelijk volume (0.1 ml). Tijdens de daaropvolgende training werden de ethanolconcentraties geleidelijk verhoogd tot 10% (w / v) terwijl de concentratie sacharine langzaam werd verlaagd, gevolgd door volledige eliminatie van de zoetstof uit de drinkoplossing. Na voltooiing van deze fase van het vervagen van zoete oplossingen die 19 dagen duurde, werden sessies met zelftoediening nog eens 16-21 dagen voortgezet totdat stabiele niveaus van ethanol (10% g / v) inname werden waargenomen. Alle vrije keuze trainingen en testen werden uitgevoerd zonder voedsel- of vloeistofbeperkingen.

Om de effecten van eenvoudige blootstelling aan de operante box op de afgifte van neurotransmitters te controleren, werden ook ethanol-naïeve ratten bereid die gewend waren aan de testomgeving. Om operante geschiedenissen te bieden die vergelijkbaar zijn met die van zelf-toedienende ratten met ethanol, werden deze controledieren aanvankelijk ook op een vochtbeperkingsschema van 22 uur geplaatst (beperkt tot twee opeenvolgende dagen), maar werden ze getraind om alleen op water te drukken. Na verwerving van operante respons, werd water weer ad libitum beschikbaar gesteld in de thuiskooi, maar de ratten kregen dagelijks 30 minuten toegang tot water in de zelftoedieningskamers. In overeenstemming met eerdere resultaten (Weiss et al., 1993), stopten deze dieren niet meer tegen water met aanzienlijke snelheden zonder verdere deprivatie, waardoor een geschikte "niet-gemotiveerde" controlegroep werd verschaft.

Stereotaxische chirurgie

Zodra stabiele niveaus van zelftoediening van ethanol waren verkregen, werden de ratten stereotactisch geïmplanteerd voor wakkere microdialyse met een chronische inwonende roestvrijstalen geleidecanule gericht op de NAC onder anesthesie met halothaan (1.0-1.5%). De geleidecanules (C313CS, Plastics One, Roanoke, VA) werden eenzijdig neergelaten tot 2.0 mm boven de dorsale rand van de dialyseplaats en vastgezet met roestvrijstalen schedelschroeven en tandcement. Met betrekking tot bregma waren de coördinaten anterieur +1.3, mediaal ± 1.6 en ventraal -4.2 volgens de atlas van (Paxinos en Watson, 1986). Met behulp van microdialysesondes met 2.0, 6.2 mm actieve membraantips (die buiten de geleidecanule uitsteken), bevonden de dialyseplaatsen zich tussen ventrale coördinaten -8.2 en -XNUMX.

Inductie van ethanolafhankelijkheid: vloeibare diëten

Beginnend 4 dagen na de operatie, werd het herstel van de respons op ethanol geverifieerd door dagelijkse 30 minuten zelftoedieningssessies met ethanol te hervatten. Toen weer stabiele inname werd waargenomen, werden ratten afhankelijk gemaakt van ethanol met behulp van de vloeibare dieetmethode (Lochry en Riley, 1980). Details van de vloeibare dieetprocedure aangepast in dit laboratorium zijn eerder gemeld (Rassnick et al., 1992). Kort samengevat, het ethanoldieet werd dagelijks vers bereid (9: 00 tot 10: 00 AM) door het aanvullen van Sustacal met chocoladesmaakstof, een qua voedingswaarde compleet vloeibaar voedsel (Mead Johnson, Inc.) met ethanol (95% w / v), een vitamine / mineralenmengsel (ICN Nutritional Biochemicals), en water om een ​​ethanolbevattend vloeibaar dieet (8.7% w / v) te creëren dat ongeveer 35% van ethanol afkomstige calorieën oplevert (Lochry en Riley, 1980). Deze procedure heeft meestal bloedethanolconcentraties (BAC's) opgeleverd die variëren van 80 tot 180 mg% in vergelijkbaar, eerder werk in ons laboratorium (Merlo Pich et al., 1995; Schulteis et al., 1996). Controleratten ontvingen een equicalorisch, niet-ethanol bevattend dieet dat sucrose bevatte. Om de calorie-inname en lichaamsgewichten bij ratten op controledieet gelijk te houden aan die van aan ethanol blootgestelde ratten, werd een paarvoervoorschrift gebruikt waarbij dieren die een ethanoldieet kregen onbeperkte toegang kregen, terwijl controledieet elke dag in beperkte hoeveelheden werd gegeven ( voor details Schulteis et al., 1996).

Intracraniële microdialyse

Perfusie systeem. Een eerder beschreven perfusiesysteem (Weiss et al., 1993) aangepast om de methoden vanParsons en rechtvaardigheid (1992) was gebruikt. In het kort bestonden de dialyse-inlaat- en uitlaatslangen uit gesmolten silica (40 μm id) en werden beschermd binnen de flexibele veerbedekking van een canuleconnector (C313CS, Plastics One, Roanoke, VA). De dialyse-inlaatslang werd van de perfusiepomp naar de microdialysesonde gevoerd via een tweekanaals vloeistofwartel (Instech, Plymouth Meeting, PA) die met behulp van een balanshefboom boven het midden van de kooi was geplaatst. De inlaatslang was via de vloeistofwartel verbonden met een Hamilton-spuit van 1 ml die kunstmatige CSF (aCSF) als perfusiemedium bevatte. Het perfusiemedium werd afgegeven door een pulsloze spuitpomp (CMA / 100; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN). Dialysaat werd handmatig verzameld in microfractieflacons van 250 μl. Monsters werden onmiddellijk ingevroren op droogijs en bewaard bij -70 ° C totdat ze werden getest.

Materialen en algemene procedures. Intracerebrale geleidecanules en concentrische microdialysesondes (buitendiameter: 300 μm; membraanmateriaal, geregenereerde cellulose; lengte, 2 mm) werden geconstrueerd zoals beschreven door Parsons en rechtvaardigheid (1992). De sondes werden geperfuseerd met aCSF met een snelheid van 0.2 μl / min en langzaam ingebracht onder korte, ondiepe halothaananesthesie (<5 min) 16 uur voor het begin van het testen en het verzamelen van dialysaat. [Vijf dieren werden getest met in de handel verkrijgbare microdialysesondes (CMA / 10; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) geperfuseerd met een stroomsnelheid van 0.5 μl / min.] Om ratten te laten wennen aan de microdialyse-testprocedures werden de dieren dagelijks verbonden met een inactief perfusiesysteem (zonder inbrengen van microdialyse-sondes) in de thuiskooi gedurende ∼2 weken vóór het testen.

Perfusie medium. ACSF bestaande uit 149 mm NaCl, 2.8 mm KCl, 1.2 mm CaCl2, 1.2 mm MgCl2 en 5.4 mm d-glucose (pH 7.2-7.4) werd gebruikt. Ascorbinezuur werd toegevoegd als antioxidant in een concentratie (0.25 mm) vergelijkbaar met die gevonden in striatale extracellulaire ruimte.

Experimenteel ontwerp en procedures

Effecten van chronische ethanolblootstelling (afhankelijk), onthouding en daaropvolgende operante zelftoediening op extracellulaire niveaus van DA en 5-HT (zoals gemeten door conventionele microdialyse) werden vergeleken met twee controle-omstandigheden bestaande uit (1) "ethanol-geacclimatiseerde" ratten. met dezelfde geschiedenis van ethanol-zelftoedieningstraining, maar niet afhankelijk gemaakt van ethanol (NIET-AFHANKELIJK) en (2) non-ethanol-blootgestelde ratten getraind om alleen water toe te dienen (ETHANOL-NAIVE). Om een ​​vergelijkbare verdeling van de ethanolinname in de twee aan ethanol blootgestelde experimentele groepen te garanderen, mogen alleen ratten met een stabiele ethanolinname (± 10% gedurende drie opeenvolgende dagen aan het einde van de zelftoedieningstraining) van ten minste 0.5 g / kg / 30 min sessie werden in het experiment opgenomen. Ratten die aan dit selectiecriterium voldeden, werden vervolgens zoveel mogelijk op basis van hun baselineaire ethanolinname gematched vóór hun toewijzing aan de NIET-AFDOENDE EN AFHANKELIJKE omstandigheden. De drie groepen ratten werden gehandhaafd op de ethanol (afhankelijke) of controlevloeistoffen (NONAFHANKELIJK en ETHANOL-NAIVE) als hun enige bron van voedingsstoffen en vloeistoffen. De duur van de blootstelling aan de vloeibare diëten was 3-5 weken (gemiddeld ± SEM aantal dagen: 26.95 ± 2.19) voor AFHANKELIJKE en NIET AFHANKELIJKE ratten, en 2-3 weken (16.84 ± 1.65 d) in de ETHANOL-NAIVE-groep. Gedurende deze tijd werden geen operante zelftoedieningssessies uitgevoerd en bleven de ratten beperkt tot hun kooien. Monitoring van extracellulaire DA- en 5-HT-concentraties in de NAC door microdialyse werd begonnen in de huiskooien van de ratten tijdens de laatste 2 uur blootstelling aan het ethanol-vloeibare dieet (of de overeenkomstige tijdsperiode in niet-afhankelijke en ethanol-naïeve ratten) en werd voortgezet tijdens de daaropvolgende stadia van terugtrekking en zelftoediening. Ethanolonttrekking werd vervolgens geprecipiteerd door vervanging van het vloeibare controledieet door ethanolbevattend dieet (40 ml) gedurende 8 uur. Om de hoeveelheden controledieet die door de drie behandelingsgroepen op de testdag wordt verbruikt, zoveel mogelijk te vereffenen, kregen NIET-AFDOENDE en ETHANOL-NAIVE ratten een beperkte hoeveelheid voeding om evenwijdig te zijn aan de hoeveelheden dieet die werden geconsumeerd door DEPENDENTE ratten. Specifiek, tussen het moment van inbrengen van microdialyse-sondes (op de avond voor het experiment) en het begin van de "ontwennings" -fase, kregen NIET-AFHANKELIJKE en ETHANOL-NAIVE-ratten 70 ml controledieet, wat overeenkomt met de gemiddelde hoeveelheid geconsumeerde ethanoldieet door de AFHANKELIJKE ratten. Aan het begin van de ontwenningsfase kregen de ETHANOL-NAIVE en NIET AFHANKELIJKE groepen nog eens 40 ml controledieet overeenkomend met de hoeveelheid die aan AFHANKELIJKE ratten werd gegeven. Alle ratten hadden het grootste deel van het controledieet verbruikt aan het einde van de ontwenningsfase en er waren geen duidelijke verschillen tussen de hoeveelheden geconsumeerd voedsel bij de groepen. Na 4-6 uur terugtrekken werden de ratten overgebracht in hun thuiskooien van het vivarium naar de laboratoriumruimte met de stations voor zelftoediening, waar ze in hun thuiskooien bleven tot 8 uur na ethanol. Hunter et al., 1974; Rassnick et al., 1992; Schulteis et al., 1996). Op dit moment werden de dieren in de operatiekamers geplaatst en kregen ze de gelegenheid om gedurende 10 minuten 60% (w / v) ethanol (AFHANKELIJK en NIET-AFHANKELIJK) of water (ETHANOL-NAIVE) toe te dienen. Dertig minuten na het einde van de zelftoedieningssessie werden de ratten teruggebracht naar hun huiskooien waar ze onbeperkt toegang kregen tot hun respectievelijke dieet. De tests werden bij alle ratten op hetzelfde tijdstip van de dag (6 uur tot 00 uur) uitgevoerd. Gedurende het gehele experiment werd dialysaat verzameld met tussenpozen van 10 minuten, behalve tijdens operante zelftoediening van ethanol wanneer bemonstering werd uitgevoerd met tussenpozen van 00 minuten.

HPLC-monoaminetests

DA- en 5-HT-dialysaatconcentraties werden gelijktijdig bepaald in elk monster door microboring reverse-phase HPLC. Dialysaat werd geïnjecteerd op een 5 μm ODS-2-kolom (0.5 x 100 mm; in huis verpakt) via een VALCO-hogedrukklep uitgerust met een interne monsterlus van 1.0 μl. De mobiele fase bestond uit een citroenzuur (0.02 m) / natriumfosfaat (monobasisch, 0.04 m) buffer met 0.82 mm 1-decaansulfonzuur als reagens voor ionenparing, 4.9 mm triethylamine, 0.2 mm Na2EDTA en 19% methanol (schijnbare pH 5.4). De mobiele fase werd door de kolom gepompt door een ISCO (model 500) HPLC-spuitpomp met een snelheid van 16 μl / min. Analyten werden elektrochemisch gedetecteerd met behulp van een EG&G Princeton Applied Research [(PARC) model 400] amperometrische controller, een glasachtige koolstofwerkelektrode (PARC, model MP 1304) en Ag / AgCl-referentie-elektrode (BAS, model RE1). Het toegepaste potentieel was 700 mV (versus Ag / AgCl). Detectielimieten gedefinieerd door een signaal: ruisverhouding van> 2 waren 0.5 nm voor zowel DA als 5-HT.

Bloedalcoholbepaling

BAC's werden eenmaal in elke rat 3-4 d gemeten na postexperimentele herbelichting met het ethanoldieet. BAC's werden bepaaldna voltooiing van de experimenten alleen vanwege de mogelijkheid om artefacten op de afgifte van neurotransmitters te introduceren door middel van bloedafnameprocedures tijdens microdialysetests. Een monster van 0.1 ml bloed werd verkregen door middel van de staartbloedingsmethode tussen 12 en 00 uur. Bloed werd verzameld in verzegelde Eppendorf-flesjes met 2 μl heparine (00 USp-eenheden / ml) als antistollingsmiddel en gecentrifugeerd bij 4 tpm. . Het serum werd geëxtraheerd met trichloorazijnzuur en getest op ethanolgehalte met behulp van de NAD-NADH-enzym spectrofotometrische methode (Sigma, St. Louis, MO).

histologie

Microdialyse-locaties werden histologisch onderzocht na voltooiing van de experimenten. Hersenen werden verwijderd na het doden met 5% halothaan en opgeslagen in 10% formaldehyde. Probe-plaatsingen binnen de NAC werden vervolgens geverifieerd uit 50 μm bevroren, met cresyl violet gekleurde secties. In alle onderzochte gevallen bevond ten minste 80% van het actieve deel van het dialysemembraan zich binnen de anatomische grenzen van de NAC (Fig. 1).

Fig. 1.

Anatomische locatie van de microdialysesondes.Verticale markeringen vertegenwoordigen de "actieve" gebieden van de dialysemembranen. Alle sondeplaatsingen waren verdeeld tussen 1.20 en 2.20 mm anterieur en 0.80-1.80 mm lateraal van bregma.

Gegevensanalyse

Verschillen in dialysaat-neurotransmitterconcentraties tussen de AFHANKELIJKE, NIET-AFHANKELIJKE en ETHANOL-NAIVE-groepen werden geanalyseerd door middel van gemengde faculteit (groepen x bemonsteringsintervallen) ANOVA's met behulp van afzonderlijke analyses voor DA en 5-HT. Dialysaatfracties verzameld tijdens de operante zelftoedieningsfase werden geanalyseerd op verschillen in monoamineconcentraties ten opzichte van de laatste drie monsters van de wachttijd, en op 'percentage van de basislijn'-veranderingen van gemiddelde DA- en 5-HT-concentraties gedurende het laatste uur van terugtrekking . Na bevestiging van significante hoofdeffecten of interacties in de totale ANOVA's, werden verschillen tussen individuele gemiddelden bepaald door Simple Effects ANOVA en Duncan's Multiple Range post-hoc-tests. Gegevens over zelftoediening van ethanol van de AFHANKELIJKE en NIETAFHANKELIJKE ratten werden geanalyseerd op verschillen in ethanolinname door tweezijdige studenten.t test.

RESULTATEN

Ethanol zelftoediening en gedragsobservaties

Operante zelfbeheerstraining

Veertig-drie ratten werden onderworpen aan de sacharine-vervagende ethanol zelf-toedienende trainingsprocedure. Zoals in eerdere werken (Weiss et al., 1990; Weiss et al., 1993), ontwikkelde de meerderheid van de dieren stabiele percentages van zelftoediening door ethanol met dagelijkse innames die voldoende waren om farmacologisch relevante BAC's te produceren. Ratten die geen significante of betrouwbare dagelijkse ethanolinname ontwikkelden (n = 11) werden uitgesloten van verdere training en testen. Gemiddeld ± SEM 30 minuten ethanolverbruik aan het einde van zelftoedieningstraining was 0.72, 0.10 ± XNUMX, XNUMX g / kg bij ratten die vervolgens werden toegewezen aan de AFHANKELIJKE (n = 11) conditie, en 0.68 ± 0.05 gm / kg bij ratten toegewezen aan de ONAFHANKELIJKE (n = 10) groep. Het waterverbruik was variabel maar bleef gemiddeld onder de 40% van de ethanolinname. Alle ratten van de ETHANOL-NAIVE (n = 11) controlegroep die met succes reageerde op water, maar stopte met reageren bij afwezigheid van voortdurende watergebrek tijdens de basislijnfase.

Vloeibaar dieet

De dagelijkse vloeistofconsumptie aan het begin van het vloeibare dieet varieerde van ongeveer 70 tot 80 ml / dag, overeenkomend met dagelijkse doses ethanol van 6.1-7.0 g. De inname via het dieet nam tijdens de behandelingsperiode van 3-5 weken toe tot 100-120 ml / dag (overeenkomend met 8.7-10.4 g ethanol). De gemiddelde ± SEM-bloedalcoholconcentraties op dagen 3 of 4 na hernieuwde blootstelling aan het ethanoldieet, zoals gemeten tussen 2 en 3 uur na het bijvullen van drinkflessen met vers vloeibaar dieet, waren 98.0 ± 21.7 mg%. Er werden geen significante verschillen in gemiddelde ± SEM lichaamsgewichten opgemerkt aan het einde van de blootstelling aan de vloeibare diëten onder de AFHANKELIJKE (549.9 ± 20.4 gm), paargevoede NIET-AFHANKELIJKE (503.8 ± 5.4 gm), en controle dieetpaargevoerde ETHANOL-NAIVE (463.5 ± 32.3 gm) groepen (F (2,29) = 3.37; NS).

Ethanol-opname

Gedragsobservatie na verwijdering van het ethanoldieet bevestigde de aanwezigheid van een mild ontwenningssyndroom vergelijkbaar met dat beschreven in ander werk met behulp van vergelijkbare vloeistofdieetprocedures om ethanolafhankelijkheid te induceren (Hunter et al., 1974; Merlo Pich et al., 1995; Schulteis et al., 1996). Hoewel er geen specifieke kwantitatieve metingen werden gebruikt, omvatten tekenen van ontwenning die werden waargenomen, hyperreactiviteit, incidentele tremor of stijfheid van de staart.

Effecten van chronische ethanol op basale neurotransmitterniveaus

Hoewel DA en 5-HT gelijktijdig in dezelfde dieren werden gevolgd, bleven in sommige gevallen basale niveaus voor één of beide analyten onder de detectielimieten. Dientengevolge waren de gegevens voor DA niet beschikbaar voor twee ratten in elk van de groepen DEPENDENT, NONDEPENDENT en ETHANOL-NAIVE, terwijl de 5-HT-gegevens niet beschikbaar waren voor drie onafhankelijke, twee niet-afhankelijke en drie ETHANOL NAIVE-dieren. De resulterende grootte van de monsters was n = 9/8 (DA / 5-HT) in DEPENDENT, n = 8/8 (DA / 5-HT) in de ONAFHANKELIJKE, enn = 9/8 (DA / 5-HT) in de ETHANOL-NAIVE-groepen.

De gemiddelde ± SEM basale dialysaat neurotransmitterconcentraties zoals gemeten tijdens de laatste 2 uur blootstelling aan het vloeibare controledieet bij ETHANOL-NAIVE-ratten waren 3.45 ± 0.64 nm voor DA en 1.15 ± 0.22 nm voor 5-HT. In vergelijking met de ETHANOL-NAIVE-controlegroep waren basale dialysaat DA-niveaus in wezen onveranderd bij AFHANKELIJKE ratten met waarden van 3.90, 0.68 ± XNUMX, XNUMX nm. Daarentegen waren de dialysaat-5-HT-concentraties duidelijk verhoogd bij deze dieren tot 1.78 ± 0.28 nm (zie Fig. 3). Statistische analyse bevestigde dat 5-HT-efflux in AFHANKELIJKE ratten significant hoger was dan in ETHANOL-NAIVE (p <0.05) en ONAFHANKELIJK (p <0.05) dieren (Duncan's naar ANOVA:F (2,21) = 3.98; p <0.03).

Fig. 3.

Dopamine (top) en serotonine (bodem) efflux tijdens het laatste uur van blootstelling aan ethanol vloeibaar dieet (AFHANKELIJK) of equicalorisch controledieet (NIET-AFHANKELIJK en ETHANOL-NAIVE) en een daaropvolgende wachttijd van 8 uur. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM-percentage van basale waarden over sets van drie opeenvolgende monsters van 20 minuten verzameld met tussenpozen van 2 uur [*p <0.01; verschillend van basale (tijd 0) niveaus]. inzetstukken, Gemiddelde ± SEM DA (top) en 5-HT (bodem) Dialysaatconcentraties in onafhankelijke, niet-afhankelijke en ETHANOL-NAIVE-ratten. De concentratiegegevens komen overeen met prewithdrawal baseline (tijd 0) en 7-8 hr opnamepunten van het percentage basislijngegevens hierboven. Onttrekking van ethanol was geassocieerd met een significante verlaging van dialysaatniveaus van zowel DA als 5-HT [*F (1,23) = 23.02, p <0.001; **F (1,21) = 13.46, p <0.0001. Verschilt van de respectievelijke AFHANKELIJKE basislijn voor pre-intrekking (BSL); eenvoudige effecten ANOVA's]. Let ook op de aanhoudende verhoging van de basale DA-output bij ONAFHANKELIJKE, aan ethanol geacclimatiseerde ratten [+ p <0.05; verschillend van zowel DEPENDENT als ETHANOL-NAIVE baseline (BSL)].

Terwijl er geen verschillen waren in basale dialysaat DA-niveaus tussen AFHANKELIJKE EN ETHANOL-NAIVE ratten, was DA-efflux aanzienlijk verhoogd bij ratten van de NIET-AFHANKELIJKE groep tot 6.21 ± 0.72 nm (F (2,23) = 4.76;p <0.02). Dialysaat DA-niveaus in deze groep waren significant hoger dan in beide AFHANKELIJKE (p <0.05) en ETHANOL-NAIVE (p <0.05) ratten. Er werden geen verschillen met ETHANOL-NAIVE-controles gevonden in de gemiddelde ± SEM basale 5-HT-concentratie van NIET-AFHANKELIJKE ratten, die 0.97 ± 0.11 n was.m (Fig. 2).

Fig. 2.

Top, Gemiddelde ± SEM-dialysaat-dopamineconcentraties gecontroleerd door microdialyse in de nucleus accumbens van AFHANKELIJKE ratten na blootstelling aan chronisch ethanol-vloeibaar dieet, ONAFHANKELIJKE maar aan ethanol blootgestelde ratten en ETHANOL-NAIVE controledieren. Er werden geen verschillen in de basale dopamine-output van ethanol-naïeve ratten waargenomen bij afhankelijke ratten. De basale dopamine-afgifte was echter aanzienlijk verhoogd bij niet-afhankelijke ratten die tijdens zelftoedieningstraining beperkte blootstelling aan ethanol hadden gekregen (*p <0.05; anders dan ETHANOL-NAIVE en AFHANKELIJKE groepen). Onder, Dialysaatserotonineconcentraties in AFHANKELIJKE, NIET-AFDELENDE en ETHANOL-NAIVE ratten. Basale 5-HT efflux was significant verhoogd in ethanol-afhankelijke ratten (*p <0.05; verschillend van ETHANOL-NAIVE en ONAFHANKELIJKE ratten).

Door ontwenning geïnduceerde veranderingen in DA- en 5-HT-niveaus

Onttrekking van ethanol was geassocieerd met een geleidelijke afname van de dialysaatspiegels van zowel DA als 5-HT gedurende de wachttijd. Acht uur na ethanol waren de gemiddelde ± SEM DA-niveaus verlaagd van 3.9 ± 0.68 nm tot 2.31 ± 0.48 nm of 64.2 ± 8.4% van de basale niveaus voor ontwenning. Een vergelijkbare onderdrukking trad op in 5-HT-efflux, die was verminderd van 1.78 ± 0.26 nm tot 0.89 ± 0.15 nm of 55.1 ± 10.6% van de concentraties voor afname. Deze gegevens zijn samengevat in figuur 3, wat ook illustreert dat de DA- en 5-HT-niveaus in deze periode ongewijzigd bleven in de groepen ETHANOL-NAIVE en NON DEPENDENT. De intrekking-geïnduceerde onderdrukking van afgifte van neurotransmitter werd bevestigd door significante interacties tussen behandelingsgroepen en bemonsteringstijd voor dialysaatconcentraties (DA:F (8,92) = 5.86; p <0.0001; 5-HT: F (8,84) = 9.02; p <0.00001) en percentage van de basislijnwaarden vóór intrekking (DA:F (8,92) = 5.93; p <0.0001; 5-HT: F (8,84) = 4.28; p <0.0002). Daaropvolgende analyse van eenvoudige effecten (bemonsteringstijd) bevestigde significante afnames in dialysaatconcentraties (DAF (4,92) = 16.12; p <0.0001; 5-HT: F (4,84) = 23.38; p <0.0001) en percentage van basislijnniveaus (DAF (4,92) = 16.03; p <0.0001; 5-HT: F (4,84) = 9.67; p <0.0001) na verloop van tijd in de AFHANKELIJKE maar niet in de NIETAFHANKELIJKE of ETHANOL-NAIVE groepen.

Effecten van zelftoediening door ethanol op DA en 5-HT-afgifte

Operant zelfbeheer

De gemiddelde ± SEM 60 min-volumes en hoeveelheden operatief zelf-toegediende ethanol aan het einde van de wachttijd van 8 uur waren 5.55 ± 0.78 ml of 0.95 ± 0.14 g / kg bij afhankelijke ratten. De inname van ethanol in deze groep was aanzienlijk hoger dan die bij niet-afhankelijke ratten van de aan ethanol geacclimatiseerde, niet-afhankelijke groep, die 2.90 ± 0.55 ml of 0.57 ± 0.10 g / kg was (Fig. 4). Het grotere ethanolverbruik in AFHANKELIJK van de NIET-ONAFHANKELIJKE groep werd bevestigd door statistische analyse (t 19 = 2.25;p <0.05).

Fig. 4.

Alcoholgebruik tijdens een 60 minuten durende operante zelftoedieningssessie in (DEPENDENT, n = 10) en (ONAFHANKELIJK, n = 11) ratten gemeten 8 uur na verwijdering van ethanol of controle vloeibaar dieet. De hoeveelheid zelf-toegediende alcohol tijdens de ontwenningsproef was significant groter bij afhankelijke dan bij niet-afhankelijke ratten (*p <0.05; significant verschillend van niet-afhankelijke ratten, Student's t test).

Bij sommige dieren was slechts een van de twee neurotransmitters detecteerbaar aan het begin van zelftoediening. De AFHANKELIJKE groep (origineeln = 11) omvatte drie ratten waarvoor gegevens over DA of 5-HT maar niet beide analyten beschikbaar waren voor statistische vergelijking. Het gemiddelde alcoholgebruik in de DA- en 5-HT-“groepen” als gevolg van de “asymmetrie” in de detecteerbaarheid van de twee zenders was identiek gedurende de sessie van 1 uur (DA: 0.93 ± 0.44 g / kg; 5-HT: 0.95 ± 0.18 gm / kg) hoewel er een verschil was in de verdeling van de ethanolinname in de tijd (Fig. 5 E). In de NONDEPENDENT-groep (origineel n = 10), DA-niveaus waren onder de detectielimiet bij drie en 5-HT-concentraties bij vier dieren. Onder ETHANOL-NAIVE-ratten (origineel n = 11), DA was niet detecteerbaar bij twee dieren, terwijl 5-HT niet detecteerbaar bleef bij drie dieren. De resulterende steekproefgrootten voor dit deel van het experiment waren als volgt: AFHANKELIJK (DA / 5-HT: n = 8/8), ONAFHANKELIJK (DA / 5-HT:n = 7/6), ETHANOL-NAIVE (DA / 5-HT: n = 9/8).

Fig. 5.

Effecten van zelftoediening door operante alcohol bij NIET-AFHANKELIJKE en AFHANKELIJKE ratten die ethanolonttrekking ondergaan op DA- en 5-HT-efflux in de nucleus accumbens. Dialysaatneurotransmitterniveaus worden vergeleken met die in ETHANOL-NAIVE-ratten die zijn getraind om zelf water toe te dienen. De gemiddelde wateropname in deze groep was verwaarloosbaar (<0.8 ml) en wordt niet weergegeven. A, Veranderingen in de output van neurotransmitters ten opzichte van niveaus die zijn geregistreerd tijdens het laatste uur van terugtrekking. De gegevens worden uitgedrukt als percentage van de basislijnwaarden, berekend als het gemiddelde van drie monsters van 20 minuten die zijn verzameld tijdens uur 8 van terugtrekking, weergegeven in B-D. De overeenkomstige dialysaatneurotransmitterconcentraties worden weergegeven in B (ETHANOL-NAÏEF) C (NONDEPENDENT), enD (AFHANKELIJK). Om de veranderingen in efflux van neurotransmitters over de verschillende experimentele fasen te illustreren, B-D toon ook prewithdrawal (BSL) en intrekking (WD) dialysaatconcentraties van DA en 5-HT tijdens uur 8 van terugtrekking. Stippellijnen vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM pre-ontwenningsdialysaat DA- of 5-HT-concentraties. E, Hoeveelheden zelf-toegediende ethanol (10% g / v) gedurende 10 minuten intervallen voor de AFHANKELIJKE (stevige staven) en ONAFHANKELIJK (open staven) groepen. Ethanol zelf-toediening in onafhankelijke ratten herstelde DA-niveaus tot prewithdrawal-waarden. Daarentegen slaagde ethanol zelftoediening er niet in om 5-HT-concentraties weer op prehistorische niveaus terug te brengen. Ethanol herstelde echter effectief de afgifte van 5-HT tot niveaus vergelijkbaar met die in de ETHANOL-NAIVE-controlegroep (voor statistische vergelijkingen zie Resultaten).

Geen significante veranderingen in DA- of 5-HT-concentraties werden waargenomen op enig moment in de dialysaten van ETHANOL-NAIVE-controleratten die de gelegenheid kregen om op water te reageren. Daarentegen verhoogde zelftoediening van ethanol de DA- en 5-HT-efflux op betrouwbare wijze (Fig. 5). Bij AFHANKELIJKE ratten die ontwenningsverschijnselen ondergingen, veroorzaakte zelftoediening van ethanol een toename van 200-250% in DA-efflux ten opzichte van ontwenningsniveaus. In feite herstelde ethanol DA-efflux bij deze dieren tot pre-ontwenningsniveaus binnen de eerste 10 minuten van zelftoediening. Bovendien werden, eenmaal hersteld, extracellulaire DA-concentraties op deze niveaus gehandhaafd door ethanolopname gedurende de rest van de 1 uur durende test. Snelle toenames tot 145% van de ontwenningsniveaus werden ook opgemerkt in 5-HT-efflux na het begin van zelftoediening bij afhankelijke ratten. Ethanol slaagde er echter niet in om de extracellulaire 5-HT-concentraties effectief te herstellen tot waarden die vóór intrekking waren geregistreerd. De effecten van zelftoediening van alcohol op DA-afgifte werden bevestigd door significante interacties tussen groepen x bemonsteringstijd voor beide dialysaatconcentraties (F (20,210) = 2.45; p <0.001) en percentage van basislijnniveaus (F (16,168) = 3.27; p <0.0001), en door daaropvolgende Simple Effects ANOVA's van veranderingen over de bemonsteringstijd in de AFHANKELIJKE groep alleen (dialysaatconcentraties: F (10,210) = 5.28;p <0.0001; percentage basisgegevens:F (10,210) = 4.32; p <0.0001). Door alcohol geïnduceerde verhogingen van de 5-HT-efflux werden op vergelijkbare wijze bevestigd door significante interacties tussen groepen x bemonsteringstijd (dialysaatconcentraties: F (20,190) = 1.67;p <0.05) of een hoofdeffect van groepen (percentage basislijnveranderingen: F (8,152) = 3.9; p <0.0005) in de totale ANOVA, gevolgd door analyse van eenvoudige effecten van bemonsteringstijd (dialysaatconcentraties:F (10,190) = 3.27; p <0.001; procent van de basislijn: F (8,152) = 3.59;p <0.001) bij AFHANKELIJKE ratten.

Zelftoediening door ethanol produceerde ook een voorbijgaande toename van de gemiddelde ± SEM-efflux van DA en 5-HT in de NIETAFHANKELIJKE groep die 130 ± 4.0, 141% (DA) en 25.2 ± 5, XNUMX% (XNUMX-HT) van de basale waarden bereikte (Fig.5 C). Dit effect werd bevestigd door analyses van eenvoudige effecten na totale ANOVA (hierboven), die betrouwbare verschillen in beide dialysaatconcentraties aan het licht bracht (DA:F (2,210) = 4.32; p <0.0001) of percentage basislijngegevens (5-HT: F (8,152) = 2.00; p <0.05) over de bemonsteringstijd.

Herinvoering van vloeibare diëten

Na voltooiing van de operante zelftoedieningstest werden de effecten van herblootstelling aan de ethanolbevattende en controlevloeibare diëten gedurende een periode van 1 uur onderzocht in verschillende willekeurig geselecteerde AFHANKELIJKE (n = 5) en ETHANOL-NAIVE (n = 7) ratten. Gedurende deze tijd van hernieuwde beschikbaarheid van het ethanol-vloeibare dieet, nam de DA-efflux enigszins af ten opzichte van de niveaus die werden bereikt tijdens operante zelftoediening die enigszins (maar niet-significant) verhoogd waren ten opzichte van de basislijn voor pre-ontwenning (Fig. 6). De gemiddelde ± SEM-dialysaat DA-concentraties tijdens het eerste uur na intrekking van toegang tot het ethanoldieet (3.65 ± 0.71 nm) was significant verschillend van ontwenningsniveaus (2.24 ± 0.74 nm; geplande vergelijking na totale ANOVA:F (3,39) = 5.24; p <0.01), maar bleef statistisch niet te onderscheiden van basale niveaus die bij deze dieren waren geregistreerd voordat de ethanol werd teruggetrokken (3.98 ± 0.97 nm) en van ETHANOL-NAIVE-ratten (4.14 ± 0.53).

Fig. 6.

Effecten van hernieuwde blootstelling aan ethanol en vloeibare controlevloeistoffen op DA- en 5-HT-niveaus in AFHANKELIJK (n = 5) en ETHANOL-NAIVE (n = 7) ratten. Ter vergelijking zijn ook monoaminespiegels tijdens pre-stopzetting, stopzetting (uur 8) en operante zelftoediening opgenomen. Alle gegevens vertegenwoordigen gemiddelden van 1 uur tijdens de respectieve fasen. [*DA, Anders dan Pre-Terugtrekking (p <0.05) enSelf-Administration (p <0.01) en verschillend van de overeenkomstige aandoening bij ETHANOL-NAIVE-ratten (p <0.05). 5-HT, Anders danOpname en Self-Administration(p <0.05) en verschilt van de overeenkomstige ETHANOL-NAIVE-aandoening (p <0.001]).

Dialysaat 5-HT-concentraties in de AFHANKELIJKE groep stegen na herblootstelling aan het ethanol-vloeibare dieet tot niveaus boven die geregistreerd tijdens operante zelftoediening (1.25 ± 0.22 versus 1.46 ± 0.13 nm; Fig. 6). Hoewel de gemiddelde 5-HT-efflux geen niveaus van vooronttrekking bereikte (1.46 ± 0.13 versus 2.01 ± 0.41 nm), waren de statistische verschillen tussen pre- en post-opname 5-HT niet meer duidelijk na toegang tot het ethanol-vloeistofdieet.

Er werden geen verschillen ten opzichte van de DA- en 5-HT-basisniveaus geregistreerd in NIET-AFDELINGSTE ratten die toegang kregen tot controledieet na operante zelftoediening (gegevens niet getoond).

DISCUSSIE

De resultaten bevestigen dat zelftoediening door ethanol de extracellulaire niveaus van DA en 5-HT in de NAC verhoogt, twee neurotransmitters die betrokken zijn bij de acute farmacologische en versterkende werking van ethanol, terwijl terugtrekking van ethanol gepaard gaat met een significante onderdrukking in de versie van deze monoaminen. De resultaten geven ook aan dat afhankelijke ratten tijdens intrekking zullen "werken" om ethanol te verkrijgen in een operante zelftoedieningstaak en dat ethanolconsumptie de intrekking-geassocieerde extraneuronale DA- en 5-HT-tekorten omkeert.

Van centraal belang in deze studie was de verkenning van de betrokkenheid van DA en 5-HT bij de versterkende effecten van alcohol in afhankelijke onderwerpen. Traditioneel was het moeilijk om aan te tonen dat ethanolonttrekking ethanol-zoekgedrag bij dieren stimuleert (zie voor een overzicht Cicero, 1980; Grant et al., 1990; Meisch en Stewart, 1994), hoewel positieve resultaten zijn verkregen bij ratten die de gelegenheid kregen om de inname van ethanol te associëren met de verlichting van ontwenningsverschijnselen gedurende meerdere episoden van gedwongen onthouding (Hunter et al., 1974). Onlangs werd echter aangetoond dat ratten bij geschikte ethanolinitiatieprocedures zelf aanzienlijke hoeveelheden ethanol zullen toedienen, zelfs tijdens hun eerste onthaalervaring (Schulteis et al., 1996). De huidige resultaten bevestigen deze waarneming en verschaffen een mogelijke neurochemische basis voor de versterkende effecten van ethanol in afhankelijke ratten. In het bijzonder suggereren de gegevens dat de ratten hun inname van ethanol tijdens zowel operante zelftoediening als daaropvolgende vloeibare dieetconsumptie reguleerden op een wijze die DA efflux op prewithdrawal-niveaus herstelde en handhaafde. In een vorig rapport werd aangetoond dat een intragastrische ethanol-prikkelingsdosis de deficiënte DA-afgifte in het ventrale striatum herstelde en de ethanolontwenningsverschijnselen omkeerde (Rossetti et al., 1992). De schijnbare gedragsmatige "titratie" van ethanolinname om terugvalcondities terug te winnen in het onderhavige experiment verlengt deze bevinding door het impliceren van geaccumuleerde DA-afgifte in door ethanol gehandhaafde versterking in afhankelijke subjecten en, bij uitbreiding, in voortgezet misbruik en afhankelijkheid.

In tegenstelling tot DA herstelden de 5-HT-niveaus slechts gedeeltelijk tijdens zelftoediening door operante ethanol. Er zijn verschillende verklaringen die deze bevinding kunnen verklaren. Het is mogelijk dat, in tegenstelling tot de acute effecten ervan bij niet-afhankelijke ratten, ethanol een meer geleidelijk of vertraagd effect heeft op de 5-HT-afgifte bij afhankelijke ratten, hoewel dit onwaarschijnlijk lijkt omdat ethanol een snelle initiële toename van 5-HT-efflux veroorzaakte binnen 10 minuten. van het begin van zelftoediening. Als alternatief kunnen 5-HT-synthese en / of afgiftemechanismen worden aangetast tijdens chronische blootstelling aan ethanol of tijdens ontwenning, wat resulteert in een algehele verminderde respons op de effecten van ethanol, zoals bijvoorbeeld wordt gesuggereerd door de verzwakking van de effecten van ethanol op accumulatie. 5-HIAA-niveaus bij ethanoltolerante P-ratten (Murphy et al., 1988). Een derde interpretatie houdt verband met de waarneming dat vóór het gebruik 5-HT-gehalten in de afhankelijke groep aanzienlijk verhoogd waren ten opzichte van ethanol-naïeve ratten. Als de adaptieve veranderingen die ten grondslag liggen aan de verhoging van 5-HT-afgifte door chronische ethanol van korte duur zijn en een snelle omkering ondergaan tijdens het stoppen, zou een volledige restauratie naar prewithdrawal-niveaus niet worden verwacht. In feite kan in dit geval de "gedeeltelijke" restauratie van 5-HT-efflux functioneel tot een "volledige" restauratie bedragen.

Gezien de implicaties van de 5-HT-gegevens voor de motivatie-effecten van ethanolontwenning, is het waarschijnlijk dat de omkering van een neurotransmittertekort - zelfs als slechts gedeeltelijk - dat ten grondslag ligt aan ontwenningsproblemen het zoeken naar alcohol bevordert. Inderdaad, bij het beoordelen van de literatuur, Le Marquand en collega's (LeMarquand et al., 1994) concluderen dat verminderde functionele activiteit van 5-HT-systemen die gepaard gaan met onttrekking van ethanol de biochemische omstandigheden voor een hervatting van de inname van ethanol kan produceren. De specifieke rol van accumaal 5-HT bij de affectieve veranderingen die gepaard gaan met ethanolonttrekking moet echter nog worden vastgesteld. Alcoholvoorkeur bij genetisch geselecteerde ratten van de Indiana P- en HAD-lijnen is in verband gebracht met verminderde functionele activiteit van 5-HT-neurotransmissie in de NAC (Murphy et al., 1982, 1987; Gongwer et al., 1989; McBride et al., 1990), en deze ratten vertonen een verhoogde anxiogene respons in een verscheidenheid aan gedragsmatige angstmetingen (Stewart et al., 1993). In de mate dat zich opeenhopende serotonergische tekorten ten grondslag liggen aan de verhoogde angst van deze dieren, kan men speculeren dat de affectieve omstandigheden die ethanol drinken in alcohol die ratten de voorkeur geeft en de hervatting van drinken tijdens ontwenning een gemeenschappelijke neurochemische basis delen.

De progressieve afname van extracellulaire DA en 5-HT tijdens de 8 uur durende ethanolonttrekkingsperiode voorafgaand aan de zelftoedieningssessie breidt eerdere observaties uit van met terugtrekking geassocieerde afnames in striatale DA-omzet en het gehalte aan volledig weefsel (Gil et al., 1992), evenals verlagingen van het 5-HT-metabolisme en het gehalte aan 5-HT of zijn metaboliet, 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA), in knaagdieren, complete hersenen, limbische en striatale weefselpreparaten (Kahn en Scudder, 1976; Tabakoff et al., 1977; Badawy en Evans, 1983; Kempf et al., 1990; Wahlström et al., 1991; Yamamura et al., 1992). Wat nog belangrijker is, deze resultaten lokaliseren terugtrekkingsgerelateerde tekortkomingen in de monoamine functie tot een hersenbeloningsregio die is betrokken bij de acute versterkende effecten van alcohol en andere misbruikmiddelen.

Met betrekking tot de mechanismen die de afgifte of extraneuronale concentraties van DA en 5-HT in de NAC reguleren, suggereren deze gegevens de ontwikkeling van een "binnen-systeemaanpassing" gedurende de loop van chronische ethanolblootstelling zodat dezelfde neurochemische systemen die worden geactiveerd door de acute farmacologische werking van ethanol vertonen een functioneel tekort bij afwezigheid van voortdurende stimulatie door het geneesmiddel (Koob en Bloom, 1988). Alcohol verhoogt acuut de vuursnelheid van A 10 ventrale tegmentale DA-neuronen (Gessa et al., 1985; Brodie et al., 1990) terwijl A 10 neuronale activiteit drastisch wordt geremd tijdens het terugtrekken van ethanol (Diana et al., 1992, 1993). Dus, het niet observeren van een verhoging van prewithdrawal DA-niveaus bij dieren die zijn blootgesteld aan het vloeibare ethanoldieet boven die in ethanol-naïeve ratten (Fig. 3), in combinatie met de steile daling in DA efflux zodra ethanol werd verwijderd, kan een onderdrukking in meso-accumbens DA-activiteit weerspiegelen om chronische stimulatie door ethanol te "balanceren". Adaptieve veranderingen op biochemisch niveau kunnen ook dienen als mechanismen voor zowel het ontbreken van verschillen tussen afhankelijke en ethanol-naïeve ratten bij de prewithdrawal DA-afgifte, en de vermindering van extraneuronale DA tijdens ontwenning. Blootstelling aan chronische ethanol onderdrukt bijvoorbeeld K+-gestimuleerde DA-release (Darden en Hunt, 1977) vermoedelijk via remming van Ca2+ instroom (Kim et al., 1994) of door ontkoppeling van calciuminvoer en DA-afgifte (Leslie et al., 1986). Belangrijker is dat, terwijl toediening van acute ethanol DA-synthese stimuleert, dit effect stomp is gemaakt in chronisch met ethanol behandelde dieren (Tabakoff en Hoffman, 1978;Fadda et al., 1980).

Een neuroadaptive-account is mogelijk minder voor de hand liggend in het geval van 5-HT, waarbij prewithdrawal (dwz chronische ethanolgestimuleerde) niveaus waren verhoogd ten opzichte van zowel ethanol-naieve als niet-afhankelijke ratten, een bevinding die eerdere gegevens bevestigt die aantonen dat chronische ethanolbehandelingen toenemen voorhersenen weefselniveaus van 5-HT en 5-HIAA (Tytell en Myers, 1973; Mena en Herrera, 1980; Hunt en Majchrowicz, 1983; Morinan, 1987; Kaneyuki et al., 1991). Het is echter bekend dat de toename in hersen 5-HIAA-gehalte geproduceerd door een ethanoluitdaging wordt verlaagd in ethanol-tolerante alcohol-prefererende (P) ratten, in het bijzonder in de NAC (Murphy et al., 1988; McBride et al., 1990). Het is dus mogelijk dat de verhoogde 5-HT-efflux aan het einde van het chronische ethanolregime verminderd was (dat wil zeggen, toonde een adaptieve verzwakking) ten opzichte van de initiële serotonergische reactie op het ethanoldieet. Hoewel deze hypothese op bevestiging wacht, was de onderdrukking van 5-HT-afgifte tijdens de ontwenningsfase duidelijk suggestief voor de aanwezigheid van neuroadaptieve veranderingen in 5-HT-functie als reactie op chronische ethanol.

De extracellulaire monoaminedekorten in de NAC kunnen dan ten grondslag liggen aan bepaalde alcoholontwenningsverschijnselen, in het bijzonder affectieve veranderingen die tegengesteld zijn aan die veroorzaakt door ethanol acuut. Ethanol kan de beloning voor hersenstimulatie acuut verhogen (een fenomeen dat, althans gedeeltelijk, afhankelijk is van de functionele integriteit van mesolimbische DA-transmissie) (Moolten en Kornetsky, 1990; Lewis, 1991), terwijl terugtrekking van ethanol gepaard gaat met een tekort op de beloning, gemeten aan de hand van verhogingen van de drempels voor intracraniële zelfstimulering (Schulteis et al., 1995). Er is ook enig bewijs dat 5-HT-activatie de beloning voor hersenstimulatie kan ondersteunen of versterken (Gibson et al., 1970;Miliaressis et al., 1975; Redgrave en Horrell, 1976). Daarom kan worden verwacht dat een extraneuronaal tekort van deze zender een DA-afhankelijk beloningsdeficit verergert, met name in het licht van recent bewijs van een faciliterende rol van 5-HT op DA-afgifte in de NAC (Chen et al., 1991; Devaud en Hollingsworth, 1991; Yoshimoto en McBride, 1992; Parsons en justitie, 1993). In dit verband is het interessant om op te merken dat de progressie van de extracellulaire tekorten in het huidige onderzoek nauw overeenkwam met het verschijnen en het temporele profiel van gedragsontwenningsverschijnselen in gerelateerd werk, waaronder beloningsstoornissen in de hersenstimulatie, hyperirritibiliteit, gedragsinhibitie en anxiogene effecten (Baldwin et al., 1991; Rassnick et al., 1992;Schulteis et al., 1995). Aldus kan de synchrone opkomst van deze gedrags- en neurochemische veranderingen een weerspiegeling zijn van een rol voor DA en 5-HT in de negatieve affectieve omstandigheden die gepaard gaan met onttrekking van ethanol.

Hoewel de rol van DA en 5-HT in ethanolbeloning en -afhankelijkheid in de huidige studie van primair belang was, zijn de effecten van zelftoediening door ethanol op de afgifte van deze zenders in niet-afhankelijke ratten ook interessant. De toename van de DA-emissie in de niet-afhankelijke groep bevestigt een eerder rapport (Weiss et al., 1993) en ondersteunt verder de rol van DA bij de acute versterkende werking van ethanol. Van bijzonder belang was echter de waarneming dat zelftoediening van ethanol door niet-afhankelijke ratten de 5-HT-efflux verhoogde, omdat deze resultaten de bevindingen van verhoogde 5-HT-afgifte in de NAC na systemische en lokale alcoholtoediening vergroten (Yoshimoto et al., 1991, 1992) naar een mogelijke rol voor 5-HT in de acute versterkende werking van ethanol.

De bevinding dat de basale DA-output substantieel verhoogd was bij NIET-AFHANKELIJKE ratten, vergeleken met zowel de ETHANOL-NAIVE- als DEPENDENT-groepen, was verrassend aangezien de niet-afhankelijke dieren gedurende 2-3 weken geen toegang hadden gekregen tot ethanol - terwijl ze eerder op het vloeibare controledieet waren geplaatst. de microdialysetest. Een mogelijkheid om deze observatie te verklaren is dat intermitterende toegang tot alcohol kan leiden tot een aanhoudende verhoging van de afgifte van basale DA. Als alternatief kan deze bevinding worden toegeschreven aan de selectie van experimentele dieren versus controledieren. Met ethanol getrainde ratten werden alleen in de NIET-AFHANKELIJKE of AFHANKELIJKE groepen ingedeeld als ze voldeden aan een selectiecriterium (stabiele dagelijkse ethanolopname van ≥ 0.5 gm / kg ethanolopname), terwijl alle ETHANOL-NAIVE-ratten lukraak werden getest. Als wordt aangenomen dat er een dopaminerge "afwijking" is die ratten vatbaar maakt voor een verhoogde ethanolopname, kan dit selectieproces een "neurochemische neiging" hebben geïntroduceerd in de richting van verbeterde basale DA-afgifte in de AFHANKELIJKE en NIETAFHANKELIJKE monsters. Volgens deze verklaring kan de verbeterde DA-efflux bij NIET-AFHANKELIJKE ratten een gevolg zijn van de selectieprocedure die de opname van proefpersonen met deze neurochemische eigenschap bevorderde. Gezien de verschillen in basale DA-efflux tussen de AFHANKELIJKE en NIETAFHANKELIJKE groepen, zou dit account ook de conclusie oproepen dat chronische ethanol leidt tot een onderdrukking van basale DA-afgifte in deze populatie van ratten.

Verschillende overwegingen pleiten echter tegen deze interpretatie. De afwezigheid van verschillen in extracellulaire DA tussen ETHANOL-NAIVE en DEPENDENTE rattengegevens zijn in goede overeenstemming met vorige in vitro onderzoeken die hebben aangetoond dat chronisch met ethanol behandelde dieren niet verschillen van onbehandelde controles in striatale of accumale DA-synthese en DOPAC-niveaus (Tabakoff en Hoffman, 1978; Fadda et al., 1980; Patel en Pohorecky, 1989; Gil et al., 1992). Gezien de consistentie tussen de huidige en deze eerdere gegevens over het hele weefsel (die gebruik maakten van een of andere vorm van geforceerde toediening van ethanol en dus geen potentiële selectiebias inhielden), lijkt het onwaarschijnlijk dat alleen de huidige selectieprocedures de verbeterde DA release in de NONDEPENDENT-groep. Meer directe ondersteuning voor de mogelijkheid dat dit effect gerelateerd is aan intermitterend ethanolgebruik, in plaats van een selectiebias, komt van recent werk in dit laboratorium dat aantoont dat willekeurig geselecteerde Wistar-ratten die werden onderworpen aan herhaalde intraperitoneale ethanolinjecties een sterk verhoogde basale extracellulaire DA-concentraties in de NAC zoals gemeten 24 uur na de laatste ethanolbehandeling (AD Smith en F. Weiss, niet-gepubliceerde waarnemingen). Aan de andere kant, hoewel deze gegevens de hypothese ondersteunen dat herhaalde blootstelling aan ethanol de basale DA-efflux in de NAC kan verhogen, aanhoudendverhoging van de basale DA-uitstroom in de NIET-AFDELINGSE groep vereist duidelijk bevestiging en de potentiële betekenis van deze bevinding voor ethanolzoekend gedrag moet nog worden opgehelderd.

Concluderend suggereren de resultaten dat twee neurotransmittersystemen waarvan wordt gedacht dat ze de acute versterkende eigenschappen van alcohol mediëren, ook een rol kunnen spelen in de versterkende werking van alcohol in afhankelijke personen. Deze resultaten bieden ondersteuning voor neuroadaptation-theorieën die ontwenning zien als het gevolg van fysiologische veranderingen in circuitstructuren van hersenenbeloningen die manifest worden als tegengesteld reagerende reacties zodra blootstelling aan het geneesmiddel wordt beëindigd.

voetnoten

    • Ontvangen November 2, 1995.
    • Revisie ontvangen Februari 23, 1996.
    • Aanvaard Februari 28, 1996.
  • Dit werk werd ondersteund door National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism Subsidies AA 08164 en AA 10531 (FW) en door National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism Specialized Center Grant AA 06420 (GK, FW; Directeur, GFK). PH was een gastwetenschapper van het Biomedical Research Center, Alko Ltd., Helsinki, Finland. Dit is publicatienummer NP-8871 van The Scripps Research Institute.

    Correspondentie moet worden gericht aan Friedbert Weiss, Department of Neuropharmacology (CVN-15), The Scripps Research Institute, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037.

REFERENTIES

Artikelen die dit artikel citeren