Geneesmiddelervaring epigenetisch primes Fosb-geninduceerbaarheid in rattenucleus accumbens (2012)

Abstract

Introductie

Drugsverslaving wordt gekenmerkt door dwangmatig drugs zoeken en nemen ondanks ernstige nadelige gevolgen (Kalivas et al., 2005; Hyman et al., 2006). Blootstelling aan chronische geneesmiddelen veroorzaakt persistente veranderingen in genexpressie in het ventrale striatum (of nucleus accumbens; NAc) en dorsale striatum (of caudate putamen; CPu), striatale structuren die betrokken zijn bij drugsbeloning en verslaving (Freeman et al., 2001; Robinson en Kolb, 2004; Shaham en Hope, 2005; Doolhof en Nestler, 2011). ΔFosB, een ingekort en stabiel eiwit gecodeerd door het onmiddellijk-vroege gen, FosB, is een goed gekarakteriseerde transcriptiefactor die wordt geïnduceerd in NAc en CPu door chronische blootstelling aan vrijwel alle drugs van misbruik, waarbij het gesensitiseerde gedragsreacties veroorzaakt op herhaalde toediening van geneesmiddelen (Nestler, 2008). Of eerdere chronische blootstelling aan een misbruikt geneesmiddel de latere inductie van AFosB verandert, blijft echter onbekend.

We hebben onlangs de hypothese aangenomen dat chromatine-modificaties in reactie op blootstelling aan chronische geneesmiddelen de induceerbaarheid van specifieke genen in regio's van doelwithersenen kunnen veranderen (Robison en Nestler, 2011). Toenemend bewijs heeft aangetoond dat drugs van misbruik na chronische toediening de structuur en transcriptionele toegankelijkheid van chromatine veranderen door talrijke typen modificaties, waaronder fosforylering, acetylatie en methylatie van histonstaarten. Meer recent werk in celkweeksystemen heeft zich gericht op de rekrutering van RNA-polymerase II (Pol II) naar de promoter van "induceerbare" genen voorafgaand aan hun expressie, met Pol II gebonden aanhoudend aan proximale promotergebieden en rond de transcriptiestartplaats (TSS). ) in een "vastgelopen" staat (Core en Lis, 2008; Nechaev en Adelman, 2008). Activering van de geblokkeerde Pol II wordt dan verondersteld verantwoordelijk te zijn voor zijn ontsnapping uit promoter- en TSS-gebieden en de transcriptie van deze "geprimede" genen (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille et al., 2012).

Hier laten we zien dat eerdere chronische blootstelling aan cocaïne, gevolgd door een verlengde wachttijd, de inducibiliteit van de FosB gen voor de daaropvolgende toediening van cocaïne, waarbij NAc wordt geprimed voor inductie, terwijl CPu dat niet is. Vervolgens identificeren we verschillende chromatin-handtekeningen bij de FosB genpromoter in NAc en CPu die geassocieerd zijn met een dergelijke afwijkende induceerbaarheid van de FosB gen, inclusief de rekrutering van geblokkeerde Pol II op de FosB proximale promotor in NAc alleen zo goed als veranderingen in verschillende activerende of repressieve histon-modificaties in beide hersengebieden. Deze resultaten bieden nieuw inzicht in de chromatinedynamiek in de FosB genpromotor en geven voor het eerst een mechanisme aan waarmee het afslaan van Pol II-primes FosB voor een grotere activering in NAc bij hernieuwde blootstelling aan cocaïne.

Materialen en methoden

Resultaten

Greater Fosb-induceerbaarheid in NAc, maar niet CPu, van cocaïne-ervaren ratten

Om de invloed van een vroegere chronische cocaïnekuur, gevolgd door een langdurige periode van terugtrekking, op induceerbaarheid van de FosB gen als reactie op een volgende cocaïne-uitdaging, ratten die tweemaal per dag ip met zoutoplossing of cocaïne (15 mg / kg) voor 10-dagen werden geïnjecteerd, kregen uitdagingsdoses van het geneesmiddel na 28 dagen van terugtrekking (Fig 1A). We hebben eerst de motorische respons in één groep dieren gemeten om de inductie van locomotorisibilisatie te bevestigen door eerdere blootstelling aan cocaïne, een te verwachten blijvend gevolg van de toediening van geneesmiddelen. Cocaïne-ervaren en -naïeve ratten vertoonden equivalente basale locomotorische activiteit, met een cocaïne-uitdaging voor niet-medicamenteuze dieren die hun motoriek verhoogden (Fig 1B. Herhaalde metingen tweewegs ANOVA, behandeling: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; cocaïne-uitdaging: F._2,66= 58.39, p <0.0001; behandeling x cocaïne-challenge: F._2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferroni-posttesten ^{^}p <0.001). Deze cocaïne-uitdaging veroorzaakte significant grotere locomotorische activiteit, dwz sensibilisatie, bij met cocaïne ervaren ratten (Bonferroni post-tests * p <0.001).

  

Figuur 1

Effect van eerdere chronische cocaïneblootstelling op de locomotorische activiteit en FosB inductie in NAc en CPu bij hernieuwde blootstelling aan het geneesmiddel

Om de effecten van dit cocaïne-voorbehandelingsregime op ΔFosB-expressie in NAc en CPu te evalueren, hebben we ΔFosB-eiwit gemeten met immunohistochemische methoden 24 uur nadat cocaïne-naïeve en cocaïne-ervaren dieren werden behandeld met 0, 1, 3 of 6 dagelijkse cocaïne-uitdaging injecties (15 mg / kg; zie Fig 1A). Zoals eerder vastgesteld (Nye et al., 1995), 3-cocaïnespuiten waren voldoende om ΔFosB-eiwit in NAc en CPu significant te induceren van niet-medicamenteuze dieren en de accumulatie bleef significant na 6-dagen van cocaïne-injecties (Fig 1C. Herhaalde metingen tweeweg ANOVA, NAc core, behandeling: F_1,28= 23.5, p <0.0001; cocaïne-uitdaging: F._3,28= 49.16, p <0.0001; behandeling x cocaïne-challenge: F._3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc-schaal, behandeling: F_1,28= 18.69, p <0.0001; cocaïne-uitdaging: F._3,28= 31.52, p <0.0001; behandeling x cocaïne-challenge: F._3,28= 3.21, p <0.05; CPu, behandeling: F._1,28= 9.47, p <0.001; cocaïne-uitdaging: F._3,28= 19.74, p <0.0001; behandeling x cocaïne-challenge: F._3,28= 0.94, p> 0.05. In NAc-kern, schaal en CPu, Bonferroni-posttests ^{^}p <0.05). Bij met cocaïne ervaren dieren was er geen bewijs van aanhoudende ΔFosB-inductie in NAc of CPu na 28 dagen van terugtrekking, consistent met eerdere rapporten dat het ΔFosB-signaal volledig verdwijnt tegen dit tijdstip (Nye et al., 1995), de reden waarom dit tijdstip in dit onderzoek werd gebruikt. Opvallend was echter dat cocaïne-ervaren ratten die 3- of 6-cocaïne-prikkelingsinjecties ontvingen een significant grotere ΔFosB-eiwitinductie vertoonden in NAc, een effect dat zowel in kern- als in schelpensubregio's zichtbaar is (Fig 1C. Bonferroni posttests * p <0.05). Daarentegen werd niet zo'n grotere inductie van ΔFosB-eiwit waargenomen in CPu; in plaats daarvan werd in deze regio gelijkwaardige ΔFosB-inductie gezien na 3 of 6 dagen cocaïne-challenge-injecties bij cocaïne-naïeve en ervaren ratten (Fig 1C).

Om inzicht te krijgen in de transcriptieveranderingen die optreden in NAc en CPu als reactie op een cocaïne-uitdaging, hebben we het tijdsverloop (45, 90 en 180 min) van de induceerbaarheid van ΔFosB en FosB mRNA-transcripten op een enkele cocaïne- of zoutoplossinginjectie bestudeerd bij cocaïne-naïeve en -ervoede ratten na 28-dagen van terugtrekking (zie Fig 1A). Ten opzichte van een zoutoplossing daagde een cocaïnetrekking een snelle toename van de ΔFosB- en FosB-mRNA-niveaus op alle drie tijdspunten in zowel NAc als CPu van cocaïne-naïeve dieren (Fig 1D. Herhaalde metingen unidirectioneel ANOVA per tijdpunt; Bonferroni post-tests ^{^}p <0.05). In NAc observeerden we grotere ΔFosB- en FosB-mRNA-inductie bij met cocaïne ervaren dieren vergeleken met cocaïne-naïeve dieren na de cocaïne-uitdaging, het effect was significant na 90 minuten, terwijl de induceerbaarheid van ΔFosB- en FosB-mRNA in CPu significant was. afgenomen bij dieren die ervaring hebben met cocaïne (Fig 1D. Bonferroni post-tests ^%p = 0.08, * p <0.05).

Karakterisering van stroomopwaartse signaalroutes in NAc en CPu van cocaïne-ervaren ratten

Een mogelijke verklaring voor de veranderde induceerbaarheid van de FosB gen in NAc en CPu na een eerder chronisch verloop van cocaïne is dat een op afstand gelegen geschiedenis van blootstelling aan cocaïne langdurige veranderingen kan veroorzaken in signaalroutes die stroomopwaarts zijn van FosB geninductie zodanig dat een cocaïne-uitdaging vervolgens het gen in een afwijkende mate induceert. Om deze hypothese te bestuderen, analyseerden we de twee transcriptiefactoren, SRF en CREB, waarvan recent is aangetoond dat ze nodig zijn voor de cocaïne-inductie van ΔFosB in deze hersenregio's (Vialou et al., 2012) samen met stroomopwaartse proteïnekinasen, ERK en AKT, ook betrokken bij cocaïnewerking (Valjent et al., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). We hebben geen veranderingen in totale of gefosforyleerde niveaus van deze verschillende eiwitten gedetecteerd die de veranderde induceerbaarheid van FosB waargenomen, inclusief geen wijzigingen in SRF, CREB of AKT (Fig 2B, C). Het gebrek aan verandering in pSRF en pCREB in NAc als reactie op een cocaïne-uitdaging komt overeen met een recent rapport, waarin werd aangetoond dat beide significant door chronische cocaïne werden geïnduceerd (Vialou et al., 2012).

  

Figuur 2

Effect van eerdere chronische cocaïnerichting op stroomopwaartse moleculaire signaalcascades in NAc en CPu

In NAc en CPu van geneesmiddel-naïeve dieren, 20 min na een initiële blootstelling aan geneesmiddelen (Fig 2A), een enkele uitdaging met cocaïne verlaagde de niveaus van pERK42 / 44 (Fig 2B, C. Tweezijdige t-toets voor studenten: * p <0.05). Er zijn eerdere meldingen van verhoogde pERK-niveaus in deze regio's na acute toediening van cocaïne (Valjent et al., 2000). Dit is moeilijk te vergelijken met andere artikelen waarin de fosforylatie van ERK in NAc wordt onderzocht tijdens het stoppen met herhaalde cocaïnespuiten (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), zoals in onze studie werd pERK gekwantificeerd na 28 dagen van terugtrekking en na een cocaïne- of zoutoplossinguitdaging. Ten opzichte van geneesmiddel-naïeve dieren die voor de eerste keer cocaïne ondergingen, veroorzaakte herblootstelling aan cocaïne bij cocaïne-ervaren ratten, na 28-dagen van terugtrekking, een significante toename in pERK42 / 44-niveaus in CPu (Fig 2B, C. Tweezijdige student t-toets: * p <0.05).

Chromatin landschap op de Fosb-genpromotor in NAc en CPu van cocaïne-ervaren ratten

We hebben vervolgens onderzocht of veranderingen in FosB geninduceerbaarheid zijn geassocieerd met veranderingen in de chromatinestructuur. ChIP werd uitgevoerd op NAc en CPu met behulp van antilichamen gericht tegen drie goed gekarakteriseerde vormen van histon-modificaties: trimethylering van Lys4 van histon H3 (H3K4me3) geassocieerd met genactivering en H3K27me3 en H3K9me2 geassocieerd met genrepressie. We analyseerden cocaïne-naïeve en -ervoede ratten na 28 dagen van terugtrekking, hetzij zonder of met een uitdaging injectie van cocaïne, met dieren onderzocht 1 uur later (Fig 3A). In NAc vonden we geen significante veranderingen in de binding van een van deze drie histonaanpassingen aan de FosB genpromotor in afwezigheid van een cocaïne-uitdaging, hoewel er een trend was voor lagere niveaus van H3K9me2 (Fig 3B-D. Tweestaart studententest. ^#p = 0.2 in vergelijking met de respectievelijke medicijn-naïeve controles). Dit effect werd significant na een cocaïne-uitdaging en was specifiek voor het proximale promotorgebied van het gen (Fig 3C. * p <0.05). Hoewel de niveaus van H3K9me2 bij sommige genen erg laag zijn, is de FosB genpromoter toont merkbare niveaus van dit merk in NAc onder controle-omstandigheden (Maze et al., 2010, data niet weergegeven). In CPu daarentegen vonden we kleine maar significante afnames in H3K4me3-binding en toenamen in H3K27me3-binding, bij de FosB promotor in afwezigheid van een cocaïne-uitdaging, effecten verloren na de uitdaging (Fig 3D. * p <0.05).

  

Figuur 3

Effect van eerdere chronische blootstelling aan cocaïne op epigenetische priming van de FosB gen in NAc en CPu

Vervolgens hebben we Pol II onderzocht die zich aan de FosB gen, gebaseerd op recente bevindingen in celkweek, dat het blokkeren van Pol II op TSSs, dat wordt gekenmerkt door zijn fosforylatie bij Ser 5 in zijn CTD-herhalingsregio, geassocieerd is met het primen van genen (zie Inleiding). We hebben dus de binding van Pol II-pSer5 geanalyseerd FosB op vier verschillende gebieden van het gen (Fig 3B). Deze analyse bracht een significante verrijking van Pol II-pSer5 aan het licht in de FosB gen op zijn proximale promotorregio en rond zijn TSS in NAc van cocaïnegebonden dieren, na langdurig stoppen, in afwezigheid van een cocaïne-uitdaging vergeleken met controles (Fig 3E. * p <0.05). Deze verrijking was niet duidelijk in twee genlichaamsgebieden van FosB, consistent met pol II-blokkering beschreven in eenvoudigere experimentele systemen. Interessant is dat de binding van Pol II-pSer5 na een cocaïne-uitdaging nog steeds tekenen van verrijking vertoonde, hoewel niet FosB proximale promotorregio (Fig 3E. ^%p = 0.1), maar keerde terug naar controleniveaus op de TSS. Bevindingen in CPu waren meer variabel, waarbij geen duidelijk patroon van binding van Pol II-pSer5 werd waargenomen.

Discussie

De huidige studie biedt nieuw inzicht in de aanhoudende regulering van FosB weken na het stoppen van herhaalde blootstelling aan cocaïne. We laten zien dat eerdere chronische cocaïneadministratie de FosB gen meer induceerbaar in NAc, resulterend in snellere accumulatie van ΔFosB na hernieuwde blootstelling aan het geneesmiddel. Gezien het overwicht van bewijs dat ΔFosB-inductie in NAc sensibiliserende gedragsreacties op cocaïne medieert (Nestler, 2008), onze bevindingen onthullen een nieuw mechanisme voor de snellere heropstart van dergelijke gevoelige reacties na langdurige terugtrekking.

We tonen aan dat de verhoogde inductie van ΔFosB in NAc geassocieerd is met chromatine veranderingen in de FosB gen waarvan wordt verwacht dat het het voor een hogere inductie stimuleert. We laten dus een verhoogde Pol II-binding zien aan de proximale promoter en TSS-regio's van het gen die aanwezig zijn na 4 weken van terugtrekking uit eerdere chronische cocaïneadministratie. Een dergelijke Pol II-verrijking aan de TSS gaat snel verloren bij het uitdagen en aanvallen van cocaïne FosB inductie, consistent met een model in celkweek dat tot stilstand is gekomen Pol II wordt vrijgemaakt van TSS's na genactivering (zie Inleiding). Een cocaïne-uitdaging induceert ook een snelle afname van de binding van H3K9me2 - een kenmerk van genrepressie - voor de FosB promotor. In tegenstelling hiermee detecteerden we geen blijvende inductie van verschillende transcriptiefactoren, of van hun stroomopwaartse kinasen, waarvan bekend is dat ze mediëren FosB inductie door cocaïne. Deze resultaten ondersteunen onze hypothese dat de verhoogde inductie van AFosB in NAc wordt gemedieerd via epigenetische priming van de FosB gen en niet via opregulatie van stroomopwaartse gebeurtenissen.

Zeer verschillende resultaten werden verkregen voor CPu. Er was geen bewijs voor Pol II die afhaakte FosB bij cocaïne-ervaren ratten voorafgaand aan een cocaïne-uitdaging, hoewel er kleine maar significante histon-modificaties waren die consistent zijn met genrepressie: verhoogde H3K27meXXUMUM binding en verminderde H3K3me4 binding. Er was ook geen verandering in stroomopwaartse transcriptiefactoren of kinasen die consistent waren met gereduceerd FosB inductie. Deze bevindingen suggereren dat epigenetische modificaties na chronische cocaïneadministratie dienen om te temperen FosB induceerbaarheid van genen in CPu, in tegenstelling tot de priming die wordt gezien in NAc. Hoewel deze effecten de inductie van AFosB mRNA na hernieuwde blootstelling aan cocaïne onderdrukken, is er geen verlies van accumulatie van AFosB-eiwit. Het onderliggende mechanisme van deze paradox moet nu verder worden onderzocht.

Meer in het algemeen ondersteunen onze resultaten een model waarbij veranderingen in het chromatine-landschap bij specifieke genen in reactie op chronische cocaïneadministratie dienen om die genen te primen of bot te maken voor daaropvolgende inductie na hernieuwde blootstelling aan het medicijn. Dergelijke chromatineveranderingen, die kunnen worden beschouwd als "epigenetische littekens", zouden worden gemist in analyses van steady-state mRNA-niveaus van genen. Op deze manier belooft karakterisering van het epigenoom van verslaving nieuwe informatie over de moleculaire pathogenese van de aandoening, die kan worden ontgonnen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.

Danksagung

Referenties