(MENS) Gedrags- en structurele reacties op chronische cocaïne vereisen een feedforward-lus waarbij ΔFosB en calcium / calmodulineafhankelijke proteïnekinase II in de Nucleus Accumbens Shell (2013) zijn betrokken

De transcriptiefactor ΔFosB en de hersenen-verrijkte calcium / calmoduline-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKIIα) worden in de nucleus accumbens (NAc) geïnduceerd door chronische blootstelling aan cocaïne of andere psychostimulerende drugs van misbruik, waarbij de twee eiwitten gesensibiliseerde geneesmiddelresponsen mediëren . Hoewel ΔFosB en CaMKIIα beide de expressie en functie van AMPA-glutamaatreceptor reguleren in NAc, dendritische wervelkolomvorming op NAc medium spiny neuronen (MSN's) en locomotor sensibilisatie voor cocaïne, is tot nu toe geen directe link tussen deze moleculen onderzocht. Hier laten we zien dat ΔFosB gefosforyleerd wordt door CaMKIIα aan de proteïne-stabiliserende Ser27 en dat CaMKII vereist voor de cocaïne-gemedieerde accumulatie van ΔFosB in rat NAc.

Omgekeerd laten we zien dat ΔFosB zowel noodzakelijk als voldoende is voor cocaïne-inductie van CaMKIIα-genexpressie in vivo, een effect dat selectief is voor D₁MSN-typen in het NAc-shellsubgebied.

Verder zijn inductie van dendritische stekels op NAc MSN's en verhoogde gedragsreactiviteit voor cocaïne na NAc overexpressie van ΔFosB beide afhankelijk van CaMKII.

Belangrijk is dat we voor de eerste keer inductie van ΔFosB en CaMKII in de NAc van laten zien menselijke cocaïneverslaafden, die mogelijke doelen suggereren voor toekomstige therapeutische interventie. Deze gegevens bevestigen dat ΔFosB en CaMKII betrokken zijn bij een voor het celtype en de hersenregio specifieke positieve feedforward-lus als een sleutelmechanisme voor het reguleren van de beloningscircuits van de hersenen als reactie op chronische cocaïne.

Introductie

Toenemend bewijsmateriaal ondersteunt de opvatting dat veranderingen in genexpressie bijdragen aan mechanismen van drugsverslaving (Robison en Nestler, 2011). Een belangrijke mediator van deze veranderingen is ΔFosB, een transcriptiefactor van de Fos-familie (Nestler, 2008). Chronische toediening van vrijwel elk drugsmisbruik induceert de langdurige accumulatie van ΔFosB in nucleus accumbens (NAc), een limbisch gebied dat essentieel is voor beloningsgedrag. Such-inductie lijkt specifiek te zijn voor de klasse NAc medium stekelig neuron (MSN) die D1-dopaminereceptoren tot expressie brengt. Induceerbare overexpressie van ΔFosB in deze NAc MSN's van het D1-type verhoogt de locomotorische en belonende reacties op cocaïne en morfine (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), inclusief verhoogde zelftoediening door cocaïne (Colby et al., 2003). Bovendien vermindert genetische of virale blokkade van ΔFosB-transcriptionele activiteit de lonende effecten van deze geneesmiddelen (Zachariou et al., 2006), wat aangeeft dat deze aanhoudende inductie van ΔFosB een cruciale bemiddelaar is van de blijvende veranderingen geïnduceerd in NAc door chronisch geneesmiddeltoediening.

De ongebruikelijke stabiliteit van ΔFosB (ten opzichte van alle andere Fos-familie-eiwitten) is zowel een intrinsieke eigenschap van het molecuul als gevolg van de afknotting van degron-domeinen die aanwezig zijn in FosB van volledige lengte (Carle et al., 2007) en een gereguleerd proces. ΔFosB is gefosforyleerd in vitro en in vivo bij Ser27, en deze reactie stabiliseert verder ΔFosB, ~ 10-vouw, in celcultuur en NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Hoewel is aangetoond dat Ser27-ΔFosB een substraat is voor caseïnekinase-2 in vitro (Ulery et al., 2006), het mechanisme van in vivo fosforylering blijft onbekend.

Calcium / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II (CaMKII) is een hoog tot expressie gebrachte serine / threonine kinase waarvan de a- en β-isovormen dodecamere homo- en hetero-holoenzymen vormen in vivoen zijn essentieel voor meerdere vormen van neuroplasticiteit (Lisman et al., 2002; Colbran en Brown, 2004). CaMKIIα wordt selectief geïnduceerd in NAc-schaal door chronische amfetamine (Loweth et al., 2010), en farmacologische blokkade van CaMKII-activiteit in NAc-schaal vermindert gedragssensibilisatie voor amfetamine (Loweth et al., 2008) en cocaïne (Pierce et al., 1998), terwijl virale overexpressie van CaMKIIα in dit NAc-subregio de locomotorische sensibilisatie en zelftoediening van amfetamine verbetert (Loweth et al., 2010). CaMKIIα kan het beloningsgedrag beïnvloeden via modulatie van AMPA-glutamaatreceptorsubeenheden (Pierce et al., 1998), omdat CaMKIIα-activiteit al lang in verband wordt gebracht met AMPA-receptorfunctie en synaptische targeting in verschillende vormen van neuroplasticiteit (Malinow en Malenka, 2002).

Deze literatuur vertoont verschillende parallellen tussen ΔFosB en CaMKII: beide zijn noodzakelijk en voldoende voor meerdere gedragseffecten van misbruikmisbruik, zowel opwaartse dendritische stekels in verschillende neuronale celtypen in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), en beiden oefenen ten minste enkele van hun gedragseffecten uit door modulatie van AMPA-receptoren (Kelz et al., 1999; Malinow en Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Ondanks deze parallellen is geen functionele koppeling tussen ΔFosB en CaMKII bekend. Hier stellen we wederzijdse regulatie vast tussen ΔFosB en CaMKII, en laten we zien dat de twee eiwitten een MSN-specifieke feed-forward lus van het D1-type vormen in de NAc-schaal die wordt geïnduceerd door cocaïne en een reeks cocaïnereacties reguleert in vivo.

Ga naar:

Materialen en methoden

Experiment 1: iTRAQ Proteomic Analysis of NAc Shell and Core After Cocaine Treatment (Fig 1A)

Volwassen (8 weken) mannelijke ratten kregen 20 mg / kg cocaïne of zoutoplossing-drager IP eenmaal daags gedurende zeven dagen toegediend. 24 uur na de laatste injectie, NAc-schaal en kern waren gemicrodissecteerd (Fig 1A) en flitsgevroren. iTRAQ-analyses werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figuur 1

Shell-specifieke inductie van CaMKII in NAc door cocaïne

Experiment 2: Kwantificerende eiwitveranderingen in Rat NAc Core en Shell na cocaïnebehandeling (Fig 1B-D)

Volwassen (8 weken) mannelijke ratten kregen 10 mg / kg cocaïne of zoutoplossing-vehikel IP eenmaal daags gedurende zeven dagen in bewegingsregistratiekamers toegediend. Locomotorische responsen op een enkele injectie van cocaïne (5 mg / kg IP) werden geregistreerd in die dieren die eerder waren behandeld met cocaïne ("chronisch" genoemd) en een deel van degenen die werden behandeld met zoutoplossing ("acuut" genoemd), en locomotorische responsen op zoutoplossing alleen werd opgenomen in de resterende chronische met zoutoplossing behandelde dieren ("zoutoplossing" genoemd). Locomotorische activiteitstesten werden uitgevoerd zoals beschreven (Hiroi et al., 1997). In het kort werden volwassen mannelijke ratten geplaatst in 18 "24" PAS open-field opnamevakken (San Diego Instruments) voor 30 min om te habitueren, kregen een enkele IP-injectie van zoutoplossing en werden gevolgd voor een extra 30 min., En kregen een enkele IP-injectie van 5 mg / kg cocaïne en gecontroleerd op 30 min.

24 u na deze laatste injectie werden ratten onthoofd zonder anesthesie om effecten van anesthetica op neuronale eiwitniveaus en fosfo-toestanden te vermijden. Hersenen werden in serie gesneden in een 1.2 mm-matrix (Braintree Scientific) en doelweefsel werd verwijderd in fosfaat-gebufferde zoutoplossing die protease (Roche) en fosfatase (Sigma Aldrich) -inhibitoren bevatte onder gebruikmaking van een 14-maatstans voor NAc-kern en een 12-maatstans van de resterende weefsel voor NAc-schaal (Zie Fig 1A) en onmiddellijk bevroren op droogijs. Monsters werden gehomogeniseerd door lichte sonificatie in gemodificeerde RIPA-buffer: 10 mM Tris-base, 150 mM natriumchloride, 1 mM EDTA, 0.1% natriumdodecylsulfaat, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholaat, pH 7.4, protease en fosfatase-remmers zoals hierboven. Na toevoeging van Laemmli-buffer werden de eiwitten gescheiden op 4-15% polyacrylamide gradiëntgels (Criterion System, BioRad) en Western-blotten werd uitgevoerd met behulp van het Odyssey-systeem (Li-Cor) volgens de protocollen van de fabrikant.

Experiment 3: Kwantificerende eiwitveranderingen in Rat NAc Core en Shell na intrekking van cocaïne (Fig 1E)

Volwassen (8 weken) mannelijke ratten kregen 10 mg / kg cocaïne of zoutoplossing-drager IP eenmaal daags gedurende zeven dagen toegediend. 14 dagen na de laatste injectie kregen dieren die werden behandeld met zoutoplossing een andere injectie met zoutoplossing ("zoutoplossing" genoemd) en dieren die met cocaïne werden behandeld, kregen een andere zoutoplossing (een dag 14-ontwenning of "14d WD" genoemd) of een enkele injectie met cocaïne ( genaamd "14d WD Chal" voor uitdaging). Eén uur na de laatste injectie werden de dieren onthoofd en werd Western blotting uitgevoerd zoals in experiment 2.

Experiment 4: Kwantificerende eiwitveranderingen in Rat NAc Core en Shell na zelfregulatie door cocaïne (Fig 2A-C)

Ratten werden getraind om 0.5 mg / kg / infusie van cocaïne in sessies van één uur onder een 1-schema met vaste verhoudingen gedurende negen dagen zelf toe te dienen. Na negen baseline-sessies werden de ratten verdeeld in twee groepen, in evenwicht gehouden door de inname van cocaïne tijdens de laatste twee sessies. Eén groep ratten mocht zelf-cocaïne toedienen (0.5 mg / kg / infusie) in sessies van één uur (korte toegang, ShA), terwijl de andere groep ratten zelf-toegediende cocaïne had in sessies van zes uur (lange toegang, LgA). ) gedurende tien extra dagen (escalatiesessies).

Hersensecties werden verwerkt voor immunohistochemie zoals beschreven (Perrotti et al., 2004). Hersenen werden 18-24 uur na de laatste blootstelling aan het geneesmiddel geperfuseerd, resulterend in de afbraak van elk resterend FosB-eiwit met de volledige lengte, zodanig dat alle resterende immunoreactiviteit AFosB reflecteert. Deze degradatie werd bevestigd door Western-blotting, die geen significante kleuring met een antilichaam gericht tegen het C-uiteinde van FOSB van volledige lengte die AFosB niet kent (gegevens niet getoond) vertoont. Na het insnijden in 35 μm secties, werd het aantal ΔFosB immunopositieve cellen gekwantificeerd door een geblindeerde waarnemer in twee secties door het NAc van elke rat, en gemiddelde waarden per 40 x veld werden vervolgens berekend per regio voor elk dier. Elk dier werd beschouwd als een individuele waarneming voor statistische analyse. Gebieden van belang werden geïdentificeerd met behulp van Paxinos en Watson (Paxinos en Watson, 2007).

Kwantificering van CaMKIIα immunoreactiviteit werd uitgevoerd met behulp van een Licor-systeem zoals beschreven (Covington et al., 2009). Geïntegreerde intensiteiten van CaMKII en GAPDH werden bepaald met Odyssey-software. Resultaten worden gepresenteerd als geïntegreerde intensiteitswaarden per mm² en worden gepresenteerd als gemiddelden ± sem (n = 4-10 per groep). Waarden voor GAPDH werden gebruikt als referentie voor het normaliseren van CaMKII-intensiteit voor plakdikte en -omstandigheden.

Figuur 2

Inductie van CaMKII in NAc-schaal van zelf-toedienende ratten en menselijke cocaïneverslaafden

Experiment 5: Kwantificering van eiwitniveaus bij van cocaïne afhankelijke mensen (Fig 2D)

Procedure

Postmortem menselijke hersenweefsels werden verkregen van de Quebec Suicide Brain Bank (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Canada). Het behoud van weefsel verliep in wezen zoals beschreven (Quirion et al., 1987). In het kort, eenmaal geëxtraheerd, worden de hersenen op nat ijs in een doos van piepschuim geplaatst en snelden ze naar de faciliteiten van de Quebec Suicide Brain Bank. Hemisferen worden onmiddellijk gescheiden door een sagittale snede in het midden van de hersenen, hersenstam en de kleine hersenen. Bloedvaten, pijnappelklier, choroïdplexus, half cerebellum en halve hersenstam worden meestal ontleed uit de linker hemisfeer en vervolgens coronaal gesneden in 1 cm dikke plakjes voor invriezen. De laatste helft van de kleine hersenen wordt sagittaal in 1cm-dikke plakken gesneden voordat het invriest. Weefsels worden flash bevroren in 2-methylbutaan bij -40 ° C voor ~ 60 sec. Alle bevroren weefsels worden afzonderlijk bewaard in plastic zakken bij -80 ° C voor langdurige opslag. Specifieke hersengebieden worden ontleed uit bevroren coronale plakjes op een roestvrijstalen plaat met rondom droog ijs om de temperatuur van de omgeving te regelen. Western blotting werd uitgevoerd zoals beschreven in experiment 2.

cohorte

Het cohort was samengesteld uit 37 mannelijke en 3 vrouwelijke proefpersonen, variërend in leeftijd tussen 15-66 jaar. Alle proefpersonen stierven plotseling zonder een langdurige aandoening of langdurige medische ziekte. In elk geval werd de doodsoorzaak vastgesteld door het kantoor van de Coroner van Quebec en werd een toxicologisch onderzoek uitgevoerd met weefselmonsters om informatie te verkrijgen over medicatie en het gebruik van ongeoorloofde middelen op het moment van overlijden. De vakgroep bestond uit 20-individuen die voldeden aan de SCID-I-criteria voor cocaïneverslaving. De controlegroep bestond uit 20-patiënten zonder geschiedenis van cocaïneverslaving en geen grote psychiatrische diagnoses. Alle proefpersonen stierven plotseling van oorzaken die geen directe invloed op het hersenweefsel hadden. Groepen werden vergeleken voor de gemiddelde leeftijd van het subject, de koelvertraging en de pH. Voor alle onderwerpen werden psychologische autopsies uitgevoerd zoals eerder beschreven (Dumais et al., 2005), waardoor we toegang hebben tot gedetailleerde casusinformatie over psychiatrische en medische geschiedenis, evenals andere relevante klinische en sociodemografische gegevens. Kortom, een getrainde interviewer heeft het Gestructureerd klinisch interview voor DSM-IV Psychiatrische stoornissen (SCID-I) met een of meer informanten van de overledene. Een panel van artsen beoordeelde SCID-I-beoordelingen, casusrapporten, lijkschouwtekst en medische dossiers om consensus-psychiatrische diagnoses te verkrijgen.

Experiment 6: Chromatin Immunoprecipitation for Rat NAc (Fig 3A-C)

Volwassen (8 weken) mannelijke ratten kregen 10 mg / kg cocaïne of zoutoplossing-drager IP eenmaal daags gedurende zeven dagen toegediend. 24 uur na de laatste injectie, NAc-schaal en kern waren gemicrodissecteerd. Chromatin immunoprecipitatie (ChIP) werd uitgevoerd door het poolen van bilaterale NAc ponsen van schaal of kern van zeven ratten per groep in 14 totale groepen (98 dieren totaal, 7 cocaïne pools, 7 zoutoplossingen). Weefsels werden verknoopt, gewassen en bewaard bij -80 ° C tot chromatine-afschuiving door sonicatie. Geschoren chromatine werd overnacht geïncubeerd met antilichamen die eerder waren gebonden aan magnetische korrels (Dynabeads M-280, Invitrogen). Niet-immuun IgG werd gebruikt als een controle. Na omgekeerde verknoping en DNA-zuivering werd qPCR gebruikt om niveaus van CaMKIIa-promotor-DNA te meten. Primers werden ontworpen om een ​​gebied te amplificeren dat een AP-1 consensussequentie bevat, gelokaliseerd ~ 450 bp voorafgaand aan de transcriptiestartplaats (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figuur 3

Celtype- en regiospecifieke ΔFosB-inductie van CaMKIIα in vivo

Experiment 7: CaMKII-transcriptie en eiwitexpressie meten met celtypespecifieke ΔFosB-overexpressie (Fig 3D)

Mannelijke bitransgene muizen afgeleid van NSE-tTA (regel A) × TetOp-ΔfosB (regel 11) en NSE-tTA (regel B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (lijn 11) muizen (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) werden bedacht en verhoogd met 100 μg / ml doxycycline om de ΔFosB-expressie tijdens de ontwikkeling te onderdrukken. Nestgenoten werden verdeeld bij het spenen: de helft bleef achter op doxycycline en de andere helft werd overgeschakeld naar water en de dieren werden 8 tot 11 weken later gebruikt wanneer de transcriptionele effecten van ΔFosB maximaal zijn (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003). Voor transcriptionele analyses werden muizen snel onthoofd en werden hersenen verwijderd en op ijs geplaatst. Dissecties van NAc werden met een 14-gauge naaldpons genomen en snel ingevroren op droogijs totdat RNA werd geëxtraheerd. RNA-isolatie, qPCR en gegevensanalyse werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (LaPlant et al., 2009). In het kort werd RNA geïsoleerd met TriZol-reagens (Invitrogen), verder gezuiverd met de RNAeasy microkit van Qiagen en gecontroleerd op kwaliteit met Agilent's Bioanalyzer. Reverse transcriptie werd uitgevoerd met behulp van iScript (BioRad). qPCR werd uitgevoerd met een PCR-systeem van Applied Biosystems 7900HT RT met de volgende cyclusparameters: 10 min bij 95 ° C; 40-cycli van 95 ° C voor 1 min, 60 ° C voor 30 sec, 72 ° C voor 30 sec; graduele verwarming tot 95 ° C om dissociatiecurves te genereren ter bevestiging van enkele PCR-producten. Immunohistochemische analyses van ΔFosB- en CaMKIIα-eiwitexpressie werden uitgevoerd zoals beschreven in experiment 4.

Experiment 8: Effecten van Intra-NAc D1 en D2 Dopamine Receptorantagonisten op door cocaïne gemedieerde eiwitveranderingen (Fig 3H)

Volwassen (8 weken) mannelijke ratten kregen 10 mg / kg cocaïne of zoutoplossing ("voertuig" groep) IP eenmaal daags gedurende zeven dagen toegediend. 30 minuten voorafgaand aan elke cocaïne-injectie werden ratten IP toegediend, ofwel de D1-receptorantagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" -groep), of de D2-receptorantagonist eticlopride (0.5 mg / kg, "D2 Ant" -groep) of een zoutoplossing-controle-injectie ("cocaïne" -groep). 24 uur na de laatste injectie werden dieren onthoofd en eiwitten gekwantificeerd door Western blotting als per experiment 2.

Experiment 9: effecten van AAV-gemedieerde ΔFosB-overexpressie op eiwit-expressie (Fig 4 A-C)

Stereotaxische chirurgie werd uitgevoerd op volwassen mannelijke ratten (8 weken) om AAV-GFP (groen fluorescerend eiwit) of AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). 33-gauge-naalden (Hamilton) werden gebruikt voor alle operaties, waarbij 0.5 μl gezuiverd hoogtiterig virus bilateraal werd geïnfuseerd gedurende een 5 min-tijdsperiode, gevolgd door een extra 5 min na-infusiestilstand. Alle afstanden worden gemeten ten opzichte van Bregma: 10 ° hoek, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14 dagen na de operatie kregen de dieren een enkele IP-injectie van 10 mg / kg cocaïne in locomotorische controlekamers om de gedragseffecten van ΔFosB-overexpressie te beoordelen. 24 uur na deze laatste injectie werden ratten onthoofd zoals per experiment 2en weefselmicrodissectie werd uitgevoerd onder fluorescentiemicroscopische geleiding om GFP-positief NAc-weefsel te verkrijgen. Western blotting werd vervolgens uitgevoerd zoals per Experimenteer 2.

Figuur 4

ΔFosB is zowel noodzakelijk als voldoende voor cocaïne-gemedieerde D1-receptor-afhankelijke CaMKIIα-inductie in NAc-schaal

Experiment 10: Effecten van AAV-gemedieerde ΔJunD-overexpressie op van cocaïne afgeleide proteïne-expressie (Fig 4 D-F)

Stereotaxische injectie van AAV-GFP of AAV-GFP-AJunD werd uitgevoerd als per Experimenteer 8. 14 dagen na de operatie kregen dieren 10 mg / kg cocaïne of zoutoplossing IP eenmaal daags gedurende zeven dagen toegediend in de locomotoropnamekamers. Locomotorische responsen op een enkele injectie van cocaïne (5 mg / kg IP) of zoutoplossing werden geregistreerd. 24 uur na deze laatste injectie werden ratten onthoofd, weefsel geoogst en Western blots uitgevoerd zoals in Experimenteer 9.

Experiment 11: In vitro Eiwitkinase-testen (Fig 5A-D)

Recombinant CaMKIIα en AFosB werden gezuiverd uit insectencellen (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), en eiwitkinase-assays werden uitgevoerd (Colbran, 1993), zoals eerder beschreven. In het kort, CaMKII werd voorgeïncubeerd op ijs met 2.5 μM (of aangegeven concentratie) van ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 μM calmodulin en 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylatie werd geïnitieerd door toevoeging van 200 μM ATP met of zonder [y-³²P] ATP en toegestaan ​​om door te gaan voor 10 min bij kamertemperatuur (Afb.5A & B) of 2 min op ijs (Afb.5C & D). Producten werden opgelost door Western blotting (Afb.5A & B) of door autoradiogram en scintillatietelling (Fig B-D).

Figuur 5

ΔFosB is een krachtig substraat voor CaMKIIα

Experiment 12: Identificatie van Ser27 ΔFosB Fosforilatie (Fig 5E)

In vitro kinase-assays werden uitgevoerd zoals per experiment 11eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en banden overeenkomend met AFosB werden uitgesneden en onderworpen aan tandem-massaspectrometrie. De m / z toewijzingen van de overeenkomstige ionfragmenten in alle panelen zijn gelabeld bovenop de ionenpieken. Niet alle fragmentionen zijn gelabeld vanwege ruimtebeperkingen. Over het algemeen is de tekst voor de fragmentionenetiketten zwart gekleurd, behalve wanneer ze de aanwezigheid van de fosforylatieplaatsen van belang direct bevestigen of toevoegen, in welk geval ze rood zijn gemarkeerd. Bewijs voor backbone-fragmentatieproducten wordt gepresenteerd in de sequentie-uitlezing van het fosfopeptide met de gedetecteerde plaats van fosforyleringsresidu aangegeven in rood met een enkele aminozuurletteraanduiding. De numerieke beschrijving van de waargenomen fragmentionen is ook gemarkeerd op de peptidesequentie als b- en y-ionen. De zoomfactoren voor de secties van de m / z-as om de ionen van het lagere intensiteitsfragment te tonen, zijn gemarkeerd aan de bovenkant van elk fragment-massaspectrum. De fragmentionen getoond in paneel H bevestigen de aanwezigheid van Ser27 gefosforyleerde isovorm, echter binnen een mengsel van andere gefosforyleerde isovormen op plaatsen Ser28, Ser31, Ser34 en Thr37. De aanwezigheid van pa5, pa5-P, pb5 en pb5-P-ionen bevestigen op unieke wijze de fosforylatie van de Ser27-resten.

Experiment 13: Kwantificering van Ser27-fosforylatie (Fig 5F)

Standaardpeptiden werden ontworpen om de fosfo- en niet-fosfo-vormen van Ser27 AFFB na te bootsen. Na synthese en zuivering werd elk "zwaar" idiotypisch peptide opgelost in een 50 / 50 acetonitril / waterbuffer en verzonden voor aminozuuranalyse om absolute concentratie te bepalen op de synthetische peptidevoorraadoplossing. Elk "zwaar" peptide werd vervolgens direct geïnfundeerd in de 4000 QTRAP-massaspectrometer (MS) om de beste botsingsenergie voor MS / MS-fragmentatie en twee tot vier MRM-overgangen te bepalen. Vervolgens werden de zuivere "zware" peptiden onderworpen aan LCMS op de 4000 QTRAP om peptidescheiding te verzekeren. Het instrument werd uitgevoerd in de drievoudige quadrupolemodus, met Q1 ingesteld op de specifieke voorloper m / z-waarde (Q1 scant niet) en Q3 ingesteld op de specifieke m / z-waarde die overeenkomt met een specifiek fragment van dat peptide. In de MRM-modus werd een reeks van enkele reacties (ionenovergangen van de voorloper / fragment waarbij de botsingsenergie werd afgestemd om de intensiteit van de fragmentionen van belang te optimaliseren) achtereenvolgens gemeten en de cyclus (typisch 1-2 sec) werd doorgelust doorheen de volledige tijd van de HPLC-scheiding. MRM-overgangen werden bepaald uit de MS / MS-spectra van de bestaande peptiden. Twee transities per peptide, overeenkomend met hoge intensiteit fragment-ionen, werden vervolgens geselecteerd en de collisie-energie geoptimaliseerd om de signaalsterkte van MRM-overgangen te maximaliseren met behulp van automatiseringssoftware. Pieken resulterend uit standaardpeptiden en AFosB-monsters blootgesteld aan CaMKII of controle werden vervolgens vergeleken om de absolute abundantie van elke peptidevorm in de reactie te bepalen. Gegevensanalyse op LC-MRM-gegevens wordt uitgevoerd met AB Multiquant 1.1-software.

Experiment 14: Inductie van ΔFosB in CaMKII tot overexpressie brengende muizen (Afb.5G & H)

Transgene muizen die T286D CaMKII tot overexpressie brengen (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) en wildtype nestgenoten werden verhoogd in afwezigheid van doxycycline om transgene expressie mogelijk te maken. Volwassen muizen kregen 20 mg / kg cocaïne of zoutoplossing IP eenmaal daags gedurende 14 dagen toegediend. 24 uur na de laatste injectie werden de dieren onthoofd en immunohistochemie en kwantificatie van ΔFosB-expressie uitgevoerd zoals in experiment 4.

Experiment 15: effecten van HSV-gemedieerde ΔFosB-overexpressie en CaMKII-remming op NAc-dendritische stekels (Fig 6A-E)

Volwassen mannelijke muizen (8 weken) werden stereotaxisch geïnjecteerd in NAc met HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I of HSV-GFPAC3I-ΔFosB. In deze constructies wordt AC3I, een op peptide gebaseerde remmer van CaMKII-activiteit, gefuseerd aan de C-terminus van GFP. GFPAC3I werd gekloond met behulp van PCR met behulp van de pMM400-vector met GFPAC3I als sjabloon met de volgende primers: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (klem Nikikozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Het resulterende PCR-product werd geïnsereerd in de p1005 + - en p1005 + - A-FosB-vectoren met behulp van NheI- en BspEI-plaatsen. Het construct werd gevalideerd door middel van sequencing. Stereotaxische coördinaten waren: 10 ° hoek, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusie en hersensectie werden uitgevoerd zoals per experiment 4.

Spine-analyse werd uitgevoerd zoals beschreven (Christoffel et al., 2011). In het kort werden dendritische segmenten 50-150 μm weg van de soma willekeurig gekozen uit HSV-geïnfecteerde cellen die GFP tot expressie brengen. Beelden werden verkregen op een confocale LSM 710 (Carl Zeiss) voor morfologische analyse met behulp van NeuronStudio met het algoritme van de rayburst. NeuronStudio classificeert stekels als dun, paddestoel of stompe op basis van de volgende waarden: (1) beeldverhouding, (2) hoofd-halsverhouding en (3) kopdiameter. Stekels met een nek kunnen worden geclassificeerd als dun of als paddestoel, en die zonder een significante nek worden geclassificeerd als stompe. Stekels met een nek zijn gelabeld als dun of paddestoel op basis van de kopdiameter.

Figuur 6

Blokkade van CaMKII-activiteit voorkomt de morfologische en gedragseffecten van ΔFosB in NAc

Experiment 16: effecten van HSV-gemedieerde ΔFosB-overexpressie en CaMKII-inhibitie op cocaïneresponses (Fig 6F)

Volwassen mannelijke muizen werden geïnjecteerd met virussen als per experiment 15en de locomotorische responsen op een enkele 5 mg / kg injectie van cocaïne werden gemeten als per Experimenteer 9. Locomotordata worden uitgedrukt als totale bundelonderbrekingen over 30 min na cocaïne-injectie.

Extra informatie

Dierlijke huisvesting

Mannelijke Sprague Dawley-ratten (250-275 g; Charles River Laboratories) waren in paren ondergebracht. Acht weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen (The Jackson Laboratory) waren in een groep ondergebracht met een maximum van vijf dieren per kooi. Alle dieren waren gewend aan de dierenfaciliteit voor ≥1 een week voor experimentele manipulaties en gehuisvest in geconditioneerde kamers (23-25 ° C) op een 12 uur lichte / donkere cyclus (lichten aan bij 7: 00 AM) met toegang tot voedsel en water ad libitum. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Society for Neuroscience en de institutionele commissie voor verzorging en gebruik van dieren (IACUC) op de berg Sinaï.

Drugs

Geneesmiddelen werden IP toegediend en opgelost in steriele zoutoplossing, waaronder cocaïne (5-20 mg / kg per 10 μl voor muizen, per 1 ml voor ratten, NIDA) en SCH 23390 of eticlopride hydrochloride (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . Voor stereotaxische chirurgie werden muizen geanesthetiseerd met een "cocktail" van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) (Henry Schein) in steriele zoutoplossing.

Antilichamen

CaMKIIα (totaal): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (totaal): mobiele signalen 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (totaal): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van het Prism 6-softwarepakket (GraphPad). Student's t-tests werden gebruikt voor alle paarsgewijze vergelijkingen (aangegeven in Resultaten waarbij t-waarde wordt gegeven) en one-way ANOVA's werden gebruikt voor alle meervoudige vergelijkingen (aangegeven in de resultatensectie waarin de F-waarde wordt gegeven).

Ga naar:

Resultaten

Chronische cocaïne induceert CaMKII in de NAc Shell

Veel studies hebben aangetoond dat MSN's in de NAc-schaal en kern verschillende biochemische en fysiologische reacties hebben op chronische blootstelling aan misbruikt drugs (Kourrich en Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) en dat de twee subregio's op verschillende manieren drugszoekgedrag reguleren (Ito et al., 2004). Om de differentiële effecten van cocaïne op de eiwitbestanddelen van de NAc-schaal te bepalen vs kern, we gebruikten Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) en tandem massaspectroscopie (MS / MS). Volwassen mannelijke ratten werden IP geïnjecteerd met cocaïne (20 mg / kg) of zoutoplossing dagelijks gedurende 7 dagen; 24 uur na de laatste injectie, NAc-schaal en kern waren gemicrodissecteerd (Fig 1A) en flitsgevroren. Eiwitten in deze monsters werden vervolgens gekwantificeerd met behulp van iTRAQ. Alle vier CaMKII-isovormen vertoonden grote toenamen in expressie na cocaïnebehandeling die specifiek waren voor de NAc-schaal in vergelijking met de kern. Verschillende proteïnefosfatasen, inclusief PP1 katalytische en regulerende subeenheden en PP2A, die eerder in andere systemen met verschillende CaMKII-substraten waren geassocieerd (Colbran, 2004), volgde een vergelijkbaar patroon. Deze bevindingen leverden nieuw, onbevooroordeeld bewijs dat de CaMKII-signaalroute prominent gereguleerd wordt door cocaïne in NAc op een shell-specifieke manier.

Om deze bevinding meer kwantitatief te valideren, behandelden we ratten zoals hierboven met cocaïne (in variërende doses) of zoutoplossing en gemeten locomotorische responsen op een cocaïne (5 mg / kg) of zoutuitdagingsdosis. Herhaalde blootstelling aan 10 mg / kg cocaïne resulteerde in het typische patroon van locomotorensensibilisatie (Fig 1B). Verdere studies met dit doseringsregime onthulden door gebruik van Western-blotting dat herhaald cocaïne CaMKIIα selectief induceert in NAc-schaal 24 uur na de laatste injectie van cocaïne (Fig 1C en D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Bovendien was de fosforylatie van het canonieke CaMKII-substraat Ser831 van de GluA1-subeenheid van de AMPA-receptor significant verhoogd in NAc-schaal en niet in de kern (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), terwijl CaMKIIα Thr286 autofosforylering een sterke maar niet sterke significante trend in de richting van inductie in de schaal alleen (Fig 1D). Verschillende andere glutamaatreceptoren werden niet beïnvloed. In tegenstelling tot deze maten van CaMKII vertoonden dezelfde weefselmonsters de inductie van ΔFosB in beide schillen (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) en kern (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) van het NAc (Fig 1C en D), in overeenstemming met eerdere bevindingen (Perrotti et al., 2008).

Omdat verschillende eerdere studies naar de regulatie van cocaïne van AMPA-receptoren dieren analyseerden na ~ 14 dagen van terugtrekking uit chronische cocaïne (zie discussie), hebben we deze biochemische analyses op dit moment herhaald. We ontdekten dat, 14 dagen na de laatste injectie van cocaïne, ΔFosB nog steeds verhoogd is in NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), terwijl noch CaMKII noch fosforylering van GluA1 Ser831 verhoogd blijft (Fig 1E). Echter, 1 uur na een enkele 10 mg / kg uitdagingsdosis cocaïne, niveaus van totaal CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) en van GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforylering zijn beide in dezelfde mate verhoogd als na initiële chronische blootstelling aan cocaïne (Fig 1E). Deze gegevens geven aan dat NAc-schaalneuronen geprimed zijn voor CaMKII-inductie gedurende langdurige perioden van onthouding, misschien via directe priming van de CaMKII-genpromotor (zie discussie). Bovendien suggereert het feit dat ΔFosB-inductie persistenter is dan CaMKII-inductie het bestaan ​​van aanvullende mechanismen, al dan niet op basis van chromatine, die een "rem" op de CaMKII-regulering uitoefenen, zoals besproken in de discussie.

Om deze waarnemingen verder te versterken, hebben we modellen onderzocht voor zelftoediening van cocaïne, waarbij sprake is van inname van overvloedige geneesmiddelen. Volwassen mannelijke ratten kregen korte of lange toegang tot cocaïne; zoals verwacht (Ahmed en Koob, 1998), leidden alleen lange toegangsvoorwaarden tot een escalerende zelftoediening van het geneesmiddel (Fig 2A). ΔFosB werd in grotere mate geïnduceerd door lang vs korte toegang tot cocaïne in beide NAc-shells (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) en core (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Daarentegen werd CaMKIIα alleen in de NAc-schaal geïnduceerd door lange toegang tot cocaïne (Fig 2B en C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Het is interessant om de gemiddelde dagelijkse inname van cocaïne bij dieren met een korte toegang (~ 12 mg / kg IV), dieren met een lange toegang (~ 70 mg / kg IV) en dieren die experimenteel worden toegediend (10 mg / kg) te vergelijken, en vraag waarom de laatste robuuste inductie van ΔFosB en CaMKII oproept, terwijl short-access dat niet doet. Deze discrepantie is waarschijnlijk te wijten aan verschillen in piek-cocaïnespiegels (door een experimenteerder toegediend cocaïne wordt gegeven als een enkele bolus IP, terwijl zelf toegediende cocaïne wordt toegediend via meerdere IV-doses), of door verschillen in lengte van blootstelling aan geneesmiddelen (7-dagen voor experimentator). administratie, 19 dagen voor zelftoediening).

Ondanks de grote literatuur over ΔFosB en CaMKII bij cocaïnewerking, zijn er geen studies van deze eiwitten bij menselijke cocaïnegebruikers. Hier presenteren we het eerste bewijs dat niveaus van beide ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) en CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) zijn verhoogd in NAc van cocaïne-afhankelijke mensen (Fig 2D, Tabel 1). Deze gegevens geven aan dat ons onderzoek van ΔFosB en CaMKII inductie door cocaïne in knaagdier NAc klinisch relevant is voor verslaving aan menselijke cocaïne.

Tabel 1

Karakterisatie van monsters van menselijke cocaïneverslaafden en gematchte controlegroep

ΔFosB reguleert CaMKII-transcriptie selectief in D1-type MSN's van NAc Shell

De bevinding dat zowel CaMKII als AFosB opgereguleerd worden door cocaïne in het NAc van het knaagdier, leidde ons om te bepalen of AFosB de transcriptie van het CaMKII-gen zou kunnen reguleren. We hadden eerder CaMKIIα als een mogelijk doelwit voor ΔFosB gerapporteerd in een onpartijdige microarray-analyse van NAc (McClung en Nestler, 2003), maar deze bevinding werd niet verder gevalideerd in die studie. We hebben eerst kwantitatieve ChIP (qChIP-ChIP gevolgd door kwantitatieve PCR) gebruikt om te bepalen of ΔFosB bindt aan de CaMKIIα-genpromotor in NAc van volwassen mannelijke ratten en vond opvallend dat deze binding aanzienlijk verhoogd is, door chronische toediening van cocaïne, in de schaal ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), maar niet de kern, subregio (Fig 3A). Om de mechanismen gerelateerd aan dit subregion-specifieke verschil in ABosB-binding met de CaMKIIα-promotor verder te begrijpen, hebben we qCHIP gebruikt om de toestand van histonmodificaties in dit genoomgebied te karakteriseren. Eerdere onderzoeken toonden cocaïne-inductie van H3-acetylering aan in de CaMKIIα-promotor in totaal NAc van de muis (Wang et al., 2010). In tegenstelling hiermee vonden we dat cocaïne H3-acetylatie aan de CaMKIIα-promotor selectief in NAc-kern verlaagt (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), zonder dat in de schaal verandering optreedt, consistent met subregionspecifieke chromatinewijzigingen die verder gaan dan ΔFosB-binding. qCHIP voor het repressieve teken, dimethylated H3 lysine 9 (H3K9me2), onthulde trends voor dalingen in zowel de shell- als core-subregio's (Fig 3C).

Bepalen of ΔFosB de CaMKIIα-transcriptie reguleert in vivo, we gebruikten twee bitransgene muislijnen die ATFB induceerbaar in overexpressie brengen in D1 vs MSN's van het D2-type op een manier gecontroleerd door doxycycline-toediening in drinkwater (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Volwassen mannelijke muizen die ΔFosB tot overexpressie brengen uitsluitend in MSN's van het D1-type hadden significant verhoogde niveaus van CaMKIIα-mRNA in NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), een effect dat niet wordt waargenomen bij overexpressie van ΔFosB in voornamelijk D2-type MSN's (Fig 3D). De toename in CaMKIIα-mRNA, veroorzaakt door ΔFosB-expressie in MSN's van het D1-type, ging gepaard met een gelijktijdige toename van het CaMKIIα-eiwit in beide NAc-granaten (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) en kern (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Figuren 3E en F). Deze gegevens tonen aan dat ΔFosB in staat is CaMKIIα-genexpressie in D1-type MSN's in beide subregio's aan te sturen, hoewel Figuur 3B suggereert dat cocaïne-gemedieerde chromatine-veranderingen aan de CaMKIIα-promotor (bijv. verminderde acetylering) verhinderen dat ΔFosB CaMKII opwaarts reguleert in het kernsubgebied na cocaïne.

Omdat onze transgene muisgegevens aangaven dat ΔFosB-inductie van CaMKII-genexpressie specifiek is voor MSN's van het D1-type in NAc, hebben we vervolgens geprobeerd te bepalen of cocaïne-afhankelijke opregulatie van CaMKII activering van de D1-dopaminereceptor vereist. Volwassen mannelijke ratten kregen zoals voorheen chronische cocaïne of zoutoplossing toegediend, maar 30 minuten voor elke injectie kregen ratten in de cocaïnegroep IP-injectie van zoutoplossing, de D1-antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg) of de D2-receptorantagonist eticlopride (0.5 mg / kg). Dieren werden 24 uur na de laatste injectie met cocaïne geanalyseerd. Western blotting onthulde dat de D1, maar niet de D2, antagonist de door cocaïne gemedieerde toename van ΔFosB volledig blokkeerde (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), zoals eerder gerapporteerd (Nye et al., 1995), evenals in CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G en H). Deze gegevens ondersteunen de hypothese dat cocaïne een ΔFosB-gemedieerde toename van CaMKII-genexpressie veroorzaakt, specifiek in D1-type MSN's van NAc-schaal. Het zou in toekomstige studies belangrijk zijn om direct dit celtypespecifieke effect van cocaïne op CaMKII-expressie in dit hersengebied aan te tonen.

ΔFosB is zowel noodzakelijk als voldoende voor cocaïne-inductie van CaMKII in NAc Shell

Om het gebruik van bitransgene muizen aan te vullen, onderzochten we vervolgens de rol van ΔFosB bij het mediëren van cocaïne-inductie van CaMKIIα door gebruik van virale gemedieerde genoverdracht bij ratten. We bilateraal geïnjecteerd adeno-geassocieerde virale (AAV) deeltjes in NAc schaal van volwassen mannelijke ratten (waar shell selectief kan worden gericht) om ΔFosB plus GFP of GFP alleen al tot overexpressie. De dieren kregen vervolgens een enkele IP-injectie van 10 mg / kg cocaïne. De dieren die ΔFosB / GFP tot overexpressie brachten vertoonden een verhoogde locomotorische reactie in vergelijking met dieren die GFP alleen tot overexpressie brengen (Fig 4A). 24 uur na de enkele cocaïne-injectie werd GFP-positief NAc-weefsel uit deze dieren gesneden door dissectie onder een fluorescente lichtbron. Western blotting van dit weefsel (Fig 4B en C) onthulde een sterke ΔFosB-overexpressie evenals een significante toename van het totale CaMKIIα-eiwit in vergelijking met GFP-dieren (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), vergelijkbaar met de inductie die werd waargenomen bij chronische cocaïneadministratie. Bovendien was CaMKIIα-autofosforylering op Thr286 (indicatief voor enzymactivering) verhoogd door overospie van FMosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), evenals fosforylatie van het CaMKII-substraat, Ser831 van GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), waarbij de acties van chronische cocaïne opnieuw worden nagebootst (Fig 1C en D). Tsamen geven deze gegevens verder bewijs dat ΔFosB-expressie in NAc-schaal voldoende is voor locomotorisibilisatie voor cocaïne en voor CaMKII-inductie en -activering in deze subregio.

We hebben een vergelijkbare benadering gebruikt om te bepalen of ΔFosB ook nodig is voor door cocaïne gemedieerde inductie van CaMKIIα in de NAc-schaal. AAV werd gebruikt om een ​​verkort JunD-eiwit tot overexpressie te brengen, genaamd ΔJunD, dat een negatieve regulator is van ΔFosB-transcriptionele activering (Winstanley et al., 2007) plus alleen GFP of GFP. Twee weken later, wanneer transgenexpressie maximaal is, kregen dieren dagelijks 10-dagen cocaïne (7 mg / kg) of zoutoplossing voor 5-dagen en werden ze getest op locomotorische reacties op een cocaïneweergave (24 mg / kg) XNUMX uur na de laatste chronische injectie (Fig 4D). ΔJunD-overexpressie voorkwam sensibilisatie van de locomotor voor cocaïne en voorkwam ook CaMKIIα-inductie en -activering in NAc-schaal (Fig 4E en F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), wat aangeeft dat ΔFosB-transcriptionele activiteit noodzakelijk is voor door cocaïne gemedieerde inductie van CaMKIIα in deze subregio. Interessant genoeg vonden we dat ΔJunD verminderde niveaus van ΔFosB onder zowel met zoutoplossing als met cocaïne behandelde aandoeningen (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), wat de nieuwe mogelijkheid vergroot dat ΔFosB afhankelijk is van AP-1-activiteit voor zijn eigen expressieniveaus.

CaMKII Fosforylaat ΔFosB bij Ser27

gebruik in vitro proteïne kinase assays, we hebben vastgesteld dat gezuiverd ΔFosB een robuust substraat is voor CaMKIIα. Incubatie van His₆-ΔFosB met CaMKIIα en ATP veroorzaakten een opwaartse verschuiving in de elektroforetische mobiliteit van ΔFosB (Fig 5A); de verschillende resulterende banden suggereerden meerdere fosforylatieplaatsen. soortgelijk in vitro kinase-assays met [γ-³²P] ATP toonde incorporatie van radioactief gelabeld fosfaat in de verschoven ΔFosB-banden (Fig 5B), wat directe fosforylering van het eiwit aantoont. We hebben een fosfo-specifiek antilichaam gegenereerd voor de eerder gekarakteriseerde Ser27 van ΔFosB (Ulery et al., 2006). Hoewel dit antilichaam geen signaal produceert tegen hersenextracten die Ser27-gefosforyleerd AFosB bevatten (gegevens niet getoond), waren we in staat om Ser27-fosforylering in de in vitro kinase-test met CaMKII (Fig 5B). Kinetische analyses van de CaMKII-fosforylatie van AFosB geven aan dat het een krachtig substraat voor het kinase is (Fig 5C), met een schijnbare K_M van 5.7 ± 2.0μM en K_KAT van 2.3 ± 0.3min^-1. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met veel goed gekarakteriseerd in vivo substraten van CaMKII (Colbran en Brown, 2004). Daarnaast hebben we vastgesteld dat CaMKII ΔFosB fosforyleert met een stoichiometrie van 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), wat aangeeft dat er ten minste drie plaatsen van CaMKII-fosforylering in de His zijn₆-ΔFosB-eiwit, in overeenstemming met Fig 5A.

Om individuele locaties van fosforylering te onderzoeken, hebben we MS-analyses van monsters van ons gebruikt in vitro kinase-assays. Fig 5E demonstreert ΔFosB-fosforylering bij de eerder gekarakteriseerde Ser27 en op verschillende extra plaatsen (gegevens niet getoond). Gegeven de eerdere functionele karakterisering van Ser27, hebben we ons op deze site geconcentreerd door het genereren van gelabelde synthetische peptiden die de fosfo- en niet-fosfo-toestanden van Ser27 nabootsen en vervolgens bekende hoeveelheden van deze peptiden als standaarden gebruiken in MRM-analyses van ΔFosB voor en na in vitro fosforylering door CaMKII. Daaropvolgende kwantificatie (Fig 5F) bevestigt dat Ser27 een krachtig substraat is voor CaMKII. Deze resultaten geven aan dat, van meerdere gefosforyleerde resten in AFosB, Ser27 een bijzonder effectief substraat is voor CaMKII.

CaMKII bemiddelt cocaïne accumulatie van ΔFosB in de NAc Shell

Omdat CaMKII ΔFosB kan fosforyleren in vitro op een site die de stabiliteit drastisch verbetert in vitro en in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), bepaalden we of CaMKII-activiteit ΔFosB-niveaus in NAc regelt in vivo. Om deze vraag aan te pakken, gebruikten we eerst een muislijn die een calciumonafhankelijke mutant van CaMKIIα (T286D) tot overexpressie brengt in meerdere hersenregio's, waaronder NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). We injecteerden volwassen 20 mg / kg cocaïne of zoutoplossing voor 14 dagen volwassen gematchte volwassen mannelijke mutant- en wildtype nestgenoten met één leeftijd en analyseerden de dieren één dag na de laatste injectie. We vonden dat de basale niveaus van ΔFosB verhoogd waren in de mutante dieren in de NAc-schaal (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), maar niet de kern (Fig 5G en H). Verrassend genoeg werd cocaïne-afhankelijke inductie van AFosB geblokkeerd in de mutante dieren in zowel de schaal als de kern, wat suggereert dat hoewel CaMKII de ABosB-stabiliteit direct in de NAc-schaal kan reguleren, deze ook stroomopwaarts van ΔFosB in door cocaïne geactiveerde routes in beide NAc-subregio's kan liggen .

CaMKII-activiteit is vereist voor ΔFosB-gemedieerde structurele en gedragspolysticiteit

Cocaïne-inductie van dendritische stekels op NAc MSN's is een van de best bewezen door medicijnen geïnduceerde aanpassingen in dit hersengebied, en een dergelijke inductie van de wervelkolom is gecorreleerd met gesensitiseerde gedragsreacties op het medicijn (Robinson en Kolb, 2004; Russo et al., 2010) en meldde selectief te zijn voor MSN's van het type D1 (Lee et al., 2006). We hebben onlangs aangetoond dat cocaïne-inductie van dendritische stekels in NAc afhankelijk is van ΔFosB en het stroomafwaartse transcriptionele programma (Maze et al., 2010). Hoewel er uitgebreide literatuur is over de betrokkenheid van CaMKII bij de morfologie van de dendritische wervelkolom en inductie in andere hersengebieden en experimentele systemen (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), is zijn rol in NAc MSN wervelkolomvorming niet bestudeerd. Daarom bepaalden we of CaMKII-activiteit vereist is voor ΔFosB-gemedieerde inductie van MSN dendritische stekels door gebruik te maken van HSV-gemedieerde overexpressie van het CaMKII-remmende peptide AC3I gefuseerd aan GFP, een construct dat eerder werd getoond om CaMKII-activiteit te remmen in vivo (Zhang et al., 2005.; Klug et al., 2012). Virale overexpressie van ΔFosB in NAc-schaal van volwassen muizen induceerde een significante toename van de dendritische wervelkolomdichtheid van MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A en B) zoals eerder gemeld (Maze et al., 2010), en deze toename werd voornamelijk aangedreven door dunne (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) en stompe (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) wervelkolomtypen (beide dachten dat ze onvolgroeide stekels waren) (Fig 6C-E). Er werd geen effect gezien op meer volwassen, paddestoelvormige stekels. Toen GFP-AC3I echter tot co-expressie was gebracht, was de inductie van FOSB door de wervelkolom volledig opgeheven (Fig 6A-E), wat aangeeft dat CaMKII-activiteit vereist is voor ΔFosB-inductie van dendritische stekels in NAc-schaal.

We hebben vervolgens dezelfde virale hulpmiddelen gebruikt om te bepalen of CaMKII-activiteit vereist is voor de effecten van ΔFosB op gedragsgevoeligheid voor cocaïne. 72 uur na virale injectie in NAc-schaal kregen de dieren een enkele injectie van 5 mg / kg cocaïne en werd hun locomotorische activiteit geregistreerd. Zoals eerder getoond met meer uitgebreide AAV-overexpressie van ΔFosB (Fig 4A), HSV-gemedieerde overexpressie van ΔFosB verhoogde de locomotorische gevoeligheid voor cocaïne (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Net als bij inductie van dendritische stekels blokkeerde remming van CaMKII-activiteit door co-expressie van GFP-AC3I de door ΔFosB gemedieerde toename van de cocaïnegevoeligheid volledig, wat aangeeft dat CaMKII-activiteit vereist is voor door ΔFosB geïnduceerde veranderingen in de gedragseffecten van cocaïne.

Ga naar:

Discussie

De huidige studie schetst een nieuw feed-forward mechanisme waarbij cocaïne ΔFosB induceert in NAc, dat de transcriptie van het CaMKIIα-gen selectief reguleert in NAc-schaal. CaMKIIα fosforyleert vervolgens en stabiliseert ΔFosB wat leidt tot grotere ΔFosB-accumulatie en tot verdere CaMKIIα-inductie (Fig 6G). De co-escalerende niveaus van de twee eiwitten tijdens chronische blootstelling aan cocaïne dragen vervolgens op essentiële manieren bij aan gesensibiliseerde gedragsreacties op het medicijn. Dit is een bijzonder aansprekende hypothese omdat zowel ΔFosB als CaMKII elk eerder zijn aangetoond voor verhoogde gedragsreacties op cocaïne (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), en we repliceren deze bevinding voor ΔFosB in NAc-schaal specifiek met behulp van een virale benadering (4 en and66).

Hoewel transgene ATOB-overexpressie in MSN's van het D1-type CaMKII-inductie in zowel de NAc-schaal als de kern van cocaïne-naïeve dieren kan veroorzaken, drijft de accumulatie van endogeen ΔFosB, die in beide subregio's voorkomt, de inductie van CaMKII specifiek in NAc-schaal op . Dit verschil kan betrekking hebben op de hogere niveaus van ΔFosB geïnduceerd in ons bitransgeen model, maar het kan ook het vermogen van cocaïne weerspiegelen om de CaMKIIα-promotor in de schaal verschillend te veranderen. vs kern-MSN's om ΔFosB-binding te bevorderen in de eerste of uit te sluiten in de laatste subregio. In feite ondersteunen onze ChIP-gegevens, die een cocaïne-gemedieerde deacetylatie van histonen aan de CaMKIIa-genpromotor alleen in NAc-kern onthullen, de mogelijke betrokkenheid van een chromatine-mechanisme. In overeenstemming met deze hypothese was ΔFosB-overexpressie in MSN's van het D1-type in staat CaMKIIα-inductie in NAc-kern te veroorzaken in afwezigheid van cocaïne (Fig 3F), wat suggereert dat er actieve modificaties van de CaMKIIα-promoter zijn die deze inductie tijdens chronische blootstelling aan cocaïne voorkomen. Regulering van het chromatine-landschap op de CaMKII-promoter zou ook kunnen verklaren waarom CaMKII wordt geïnduceerd door een uitdagingsdosis cocaïne in NAc-schaal van chronische cocaïne-onttrekkende ratten (Fig 1E) maar niet van niet-medicamenteuze dieren (Fig 1D). Dit kan een epigenetisch "gen priming" -effect van ΔFosB (Robison en Nestler, 2011), en zou dus één moleculair mechanisme kunnen zijn van de incubatie van cocaïnewens (Pickens et al., 2011). Echter, voor deze verandering van chromatine om oorzakelijk verband te houden met incubatie van hunkering, zou deze in de loop van de tijd moeten toenemen. Het zal interessant zijn om te bepalen of dit het geval is, en om te bestuderen of andere genen ΔFosB-afhankelijke, subregion-specifieke regulatie door cocaïne laten zien. Het is ook belangrijk op te merken dat de feed-forward lus die we beschrijven niet leidt tot een eindeloze accumulatie van CaMKII of ΔFosB (Fig 1E); het ontrafelen van de moleculaire "rem" die hiervoor verantwoordelijk is, is een belangrijk doel van toekomstige studies.

De bekende functies van ΔFosB en CaMKII in verschillende experimentele systemen en hersengebieden komen op vele niveaus samen (Fig 6F). Beide moleculen zijn nauw verbonden met de groei van dendritische spine: CaMKII werkt in op het actine cytoskelet (Okamoto et al., 2009), regelt de grootte van de wervelkolom (Matsuzaki et al., 2004), en is zowel noodzakelijk als voldoende voor door plasticiteit geïnduceerde verhogingen van filopodie en synapsaantal in organotypische plakculturen in de hippocampus (Jourdain et al., 2003), while ΔFosB is zowel noodzakelijk als voldoende voor door cocaïne geïnduceerde dendritische wervelkolomvorming in NAc MSN's (Maze et al., 2010). Bovendien zijn beide moleculen geassocieerd met regulatie van AMPA-glutamaatreceptoren. CaMKII reguleert de totale niveaus van AMPA-receptorsubeenheden niet, maar stuurt de insertie van AMPA-receptoren naar synapsen en verhoogt de AMPA-kanaalgeleiding door GluA1 te fosforyleren in Ser831 in hippocampale pyramidale neuronen in kweek en in vivo (beoordeeld in (Malinow en Malenka, 2002; Colbran en Brown, 2004)). Een dergelijke toegenomen handel in GluA1 naar de synaps is ook betrokken bij chronische cocaïnewerking (Boudreau en Wolf, 2005). Bovendien worden gedragsreacties op AMPA-receptoractivatie in NAc versterkt door CaMKIIα-overexpressie op een D1-manier, afhankelijk van de dopaminereceptor (Singer et al., 2010). Er is aangetoond dat langdurige D1-specifieke overexpressie van ΔFosB GluA2-transcriptie induceert in NAc (Kelz et al., 1999), die AMPA-responsen gemedieerd via GluA1 dempt, terwijl we hier aantonen dat kortdurende ΔFosB-overexpressie, evenals kortere termijn blootstelling aan cocaïne geen effect hebben op deze subeenheid (Fig 1). Desalniettemin hebben we onlangs gevonden dat kortdurende ΔFosB-overexpressie toch AMPA-responsen in MSN's van het D1-type in NAc vermindert (Grueter et al., 2013). Deze gegevens suggereren temporeel verschillende mechanismen die een tijdafhankelijke reeks van neuroadaptaties van cocaïne kunnen vormen die ten grondslag liggen aan verschillende aspecten van verslavingsprogressie die nog niet goed worden begrepen. Op gedragsniveau zijn zowel CaMKII als ΔFosB nodig voor locomotorische sensitisatie voor cocaïne (zie hierboven), en beide zijn nodig voor langdurige zelftoediening door cocaïne bij knaagdieren (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), wat suggereert dat de twee eiwitten belangrijk zijn voor zowel korte- als lange termijn gedragsaanpassingen aan blootstelling aan drugs, zij het via gedeeltelijk verschillende onderliggende mechanismen. Vermoedelijk regelen ΔFosB en CaMKII dergelijke complexe gedragsaanpassingen door veranderingen in NAc-synaptische functie, hoewel veel verder werk nodig is om synaptische fenomenen direct te koppelen aan gedragsverandering.

Het CaMKII-holoenzym heeft tegelijkertijd een wisselwerking met een verscheidenheid aan synaps-geassocieerde eiwitten (Robison et al., 2005) waarvan wordt gedacht dat ze de targeting reguleren naar de postsynaptische dichtheid (PSD), een fenomeen waarvan wordt gesuggereerd dat het belangrijk is voor synaptische plasticiteit. In het bijzonder is onlangs aangetoond dat de interactie van CaMKII met de GluN2B-subeenheid van de NMDA-type glutamaatreceptor zowel de synaptische plasticiteit als het leren reguleert (Halt et al., 2012). Hoewel het AC3I-peptide het auto-remmende domein van CaMKII nabootst en dus enzymatische katalytische activiteit remt, blokkeert het ook meerdere eiwit-eiwit-interacties (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). De gedrags- en morfologische effecten van HSV-GFP-AC3I die hier worden gerapporteerd, kunnen dus plaatsvinden door verminderde fosforylatie van CaMKII-doeleiwitten, veranderingen in CaMKII-targeting of een verandering in de voorgestelde structurele rol van CaMKII bij synapsen (Lisman et al., 2002).

De beperking van de voorgestelde ΔFosB-CaMKII-lus naar de NAc-schaal is van speciale noot, omdat recent werk verschillende fysiologische verschillen tussen de NAc-schaal en -kern heeft aangetoond als reactie op cocaïneadministratie, een notie die wordt bevestigd door onze onbevooroordeelde iTRAQ (Table S1) -gegevens . MSN's in de NAc-schaal vertonen een depressie in het bakvermogen na chronische cocaïne die wekenlang aanhoudt, terwijl de kern-MSN's van dezelfde dieren een voorbijgaande (1-3-dag) toename van de vurencapaciteit vertonen die terugkeert naar basale niveaus binnen 2 weken (Kourrich en Thomas, 2009). Bovendien worden verschillende synaptische eiwitten differentieel gereguleerd in NAc-schaal vs kern van dieren die zijn blootgesteld aan chronische cocaïne, waaronder GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Aangezien chronische amfetamine CaMKIIα specifiek induceert in NAc-schaal (Loweth et al., 2010), het is niet verrassend dat we een vergelijkbaar effect vinden met cocaïne. Echter, omdat ΔFosB wordt geïnduceerd in zowel de NAc-schaal als kern door chronische cocaïne (Perrotti et al., 2008) en omdat we aantonen dat CaMKIIα-inductie in de schaal van FMB afhankelijk is, leveren onze bevindingen nieuw bewijs voor verschillende transcriptionele mechanismen op de CaMKIIα-promotor tussen deze twee subregio's, die verantwoordelijk zijn voor de selectieve inductie van CaMKIIα in de schaal.

Veel recent werk is gericht op het afbakenen van verschillen tussen DMSUMM- en D1-type NAc MSN's. Hoewel zowel D2- als D1-receptoren betrokken zijn bij de belonende effecten van cocaïne (Zelf, 2010), recent werk toont aan dat optogenetische activering van MSN's van het D1-type gedragsreacties op cocaïne verhoogt, terwijl MSN-activatie van het D2-type het tegenovergestelde effect heeft (Lobo et al., 2010). In overeenstemming met deze bevindingen hebben D1-receptor knockout-muizen een tekort aan acquisitie van cocaïne zelftoediening (Caine et al., 2007), terwijl knock-outs van D2 dat niet zijn (Caine et al., 2002). Directe toediening van D1-agonisten aan NAc veroorzaakt het zoeken naar cocaïne in herstelparadigma's (Zelf, 2010). Interessant is dat dit effect D1-receptor-afhankelijke verhogingen van de CaMKII-activiteit in de NAc-schaal vereist, maar niet de kern (Anderson et al., 2008), een resultaat dat goed aansluit op de D1- en shell-specifieke ΔFosB-CaMKII-loop die hier wordt voorgesteld.

We hebben eerder gemeld dat Ser27 in ΔFosB gefosforyleerd kan worden door caseïnekinase-2 (Ulery et al., 2006), echter, hier bevestigen we dat CaMKII ΔFosB fosforyleert op deze en andere sites met veel grotere kinetiek en stoichiometrie en de hoger schijnbare M kan repliceren._r waargenomen voor ΔFosB (Fig 5A) met blootstelling aan cocaïne in vivo (Nestler, 2008). We weten al dat Ser27-fosforylering de stabiliteit van ΔFosB en de transcriptionele activiteit verhoogt (Ulery et al., 2006; Ulery en Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Toekomstig werk zal zich nu concentreren op de identificatie en de functionele gevolgen van nieuwe sites van ΔFosB-fosforylatie die in dit onderzoek zijn aangegeven.

De feed-forward lus die hier wordt beschreven, biedt een aannemelijk nieuw mechanisme waardoor herhaalde toediening van cocaïne progressieve abnormaliteiten in het NAc veroorzaakt. Als zodanig kan deze biochemische route een belangrijk doelwit vormen voor toekomstige therapeutische interventie bij verslavende aandoeningen. Omdat CaMKII alomtegenwoordig is en vereist voor veel basale neuronale en gedragsfuncties, is direct gebruik van CaMKII-remmers vermeden als een verslavingsbehandeling. Onze gegevens suggereren dat meer subtiele targeting van het mechanisme van CaMKII-inductie, dat specifiek is voor een individueel celtype en subregio van de beloningscircuits van de hersenen, een therapeutisch doel zou kunnen verschaffen dat de complicaties van systemische CaMKII-remming zou vermijden.

Ga naar:

Danksagung

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Centre DA018343 (AJR en EJN) en Hartwell Foundation (AJR). De auteurs willen Gabby Rundenko bedanken voor de genereuze gave van gezuiverd ΔFosB en Roger Colbran voor de genereuze gave van gezuiverd CaMKIIα.

Ga naar:

Referenties

1. Ahmed SH, Koob GF. Overgang van matige naar excessieve inname van geneesmiddelen: verandering in hedonisch setpoint. Wetenschap. 1998, 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: een biochemische brug die de dopamine- en glutamaatsystemen van accumbens verbindt bij het zoeken naar cocaïne. Nat Neurosci. 2008, 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Gedragssensibilisatie voor cocaïne is geassocieerd met verhoogde AMPA-receptoroppervlakte-expressie in de nucleus accumbens. J Neurosci. 2005, 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Expressie en karakterisering van de alfa-subeenheid van Ca2 + / calmoduline-afhankelijk eiwitkinase II met behulp van het baculovirus-expressiesysteem. Biochem Biophys Res Commun. 1990, 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rol van dopamine D2-achtige receptoren bij cocaïne zelftoediening: onderzoeken met D2-receptor-mutante muizen en nieuwe D2-receptor antagonisten. J Neurosci. 2002, 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Gebrek aan zelftoediening van cocaïne in dopamine D1-receptor knock-out muizen. J Neurosci. 2007, 27: 13140-13150. [PMC gratis artikel] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasoom-afhankelijke en -onafhankelijke mechanismen voor destabilisatie van FosB: identificatie van FosB-degron-domeinen en implicaties voor DeltaFosB-stabiliteit. Eur J Neurosci. 2007, 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene dieren met induceerbare, gerichte genexpressie in de hersenen. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB-kinase reguleert door sociale tegenslagen gestresste synaptische en gedragsmatige plasticiteit. J Neurosci. 2011, 31: 314-321. [PMC gratis artikel] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inactivatie van Ca2 + / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II door basale autofosforylering. J Biol Chem. 1993, 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Eiwitfosfatasen en calcium / calmoduline-afhankelijke proteïne kinase II-afhankelijke synaptische plasticiteit. J Neurosci. 2004, 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Calcium / calmoduline-afhankelijk eiwitkinase II en synaptische plasticiteit. Curr Opin Neurobiol. 2004, 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatale celtypespecifieke overexpressie van DeltaFosB verhoogt de stimulans voor cocaïne. J Neurosci. 2003, 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepressieve acties van histondeacetylase-remmers. J Neurosci. 2009, 29: 11451-11460. [PMC gratis artikel] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kwantitatieve proteomics van caveolin-1-gereguleerde eiwitten: karakterisatie van polymerase i en transcript-afgiftefactor / CAVIN-1 IN endotheelcellen. Mol Cell Proteomics. 2010, 9: 2109-2124. [PMC gratis artikel] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Risicofactoren voor zelfmoord voltooid bij depressie: een case-control studie van impulsief en agressief gedrag bij mannen. Am J Psychiatry. 2005, 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB moduleert differus nucleus accumbens directe en indirecte route functie. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 in druk. [PMC gratis artikel] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII-binding aan GluN2B is cruciaal tijdens geheugenconsolidatie. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB-mutante muizen: verlies van chronische cocaïne-inductie van Fos-gerelateerde eiwitten en verhoogde gevoeligheid voor de psychomotorische en belonende effecten van cocaïne. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397-10402. [PMC gratis artikel] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Differentiële controle over het zoeken naar cocaïne door nucleus accumbens core en shell. Nat Neurosci. 2004, 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisatie en DNA-bindende eigenschappen van de transcriptiefactor DeltaFosB. Biochemie. 2007, 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Calcium / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II draagt ​​bij aan activiteit-afhankelijke groei van filopodia en vorming van wervelkolom. J Neurosci. 2003, 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Expressie van de transcriptiefactor deltaFosB in de hersenen regelt de gevoeligheid voor cocaïne. Natuur. 1999, 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetische inhibitie van CaMKII in Dorsal Striatal Medium Spiny Neurons vermindert functionele excitatiesynapsen en verbetert de intrinsieke exciteerbaarheid. PLoS One. 2012, 7: e45323. [PMC gratis artikel] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Extinctie training na cocaïne zelftoediening induceert glutamaterge plasticiteit om het zoeken naar cocaïne te remmen. J Neurosci. 2010, 30: 7984-7992. [PMC gratis artikel] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Vergelijkbare neuronen, tegengestelde aanpassingen: psychostimulerende ervaring verandert op differentiële wijze de vureneigenschappen in accumbens kern versus schil. J Neurosci. 2009, 29: 12275-12283. [PMC gratis artikel] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-onafhankelijk effect van Striatal alphaCaMKII bevordert de sensitisatie van Cocaïnespons. J Neurosci. 2012, 32: 6578-6586. [PMC gratis artikel] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . De rol van nucleaire factor kappaB bij ovariële hormoongemedieerde stressovergevoeligheid bij vrouwelijke muizen. Biol Psychiatry. 2009, 65: 874-880. [PMC gratis artikel] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaïne-geïnduceerde dendritische wervelkolomvorming in D1 en D2 dopamine receptor-bevattende middelgrote stekelige neuronen in nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC gratis artikel] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. De moleculaire basis van CaMKII-functie in synaptisch en gedragsgeheugen. Nat Rev Neurosci. 2002, 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Celtype-specifiek verlies van BDNF-signalering bootst optogenetische controle van cocaïnebeloning na. Wetenschap. 2010, 330: 385-390. [PMC gratis artikel] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Remming van CaMKII in de nucleus accumbens schaal vermindert de verhoogde amfetamine-inname in gesensitiseerde ratten. Neurosci Lett. 2008, 444: 157-160. [PMC gratis artikel] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Transiënte overexpressie van alfa-Ca2 + / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II in de nucleus accumbens omhulsel verbetert gedragsreacties op amfetamine. J Neurosci. 2010, 30: 939-949. [PMC gratis artikel] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-receptortrafficking en synaptische plasticiteit. Annu Rev Neurosci. 2002, 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Structurele basis van versterking op lange termijn in enkele dendritische stekels. Natuur. 2004, 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Controle van geheugenvorming door gereguleerde expressie van een CaMKII-transgen. Wetenschap. 1996, 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Essentiële rol van het histon-methyltransferase G9a in door cocaïne geïnduceerde plasticiteit. Wetenschap. 2010, 327: 213-216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulatie van genexpressie en cocaïnebeloning door CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Beoordeling. Transcriptionele verslavingsmechanismen: rol van DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-3255. [PMC gratis artikel] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmacologische studies van de regulatie van chronische FOS-gerelateerde antigeeninductie door cocaïne in het striatum en nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995, 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. De rollen van CaMKII en F-actine in de structurele plasticiteit van dendritische stekels: een potentiële moleculaire identiteit van een synaptische tag? Fysiologie (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB in de nucleus accumbens reguleert voedselversterkt instrumentaal gedrag en motivatie. J Neurosci. 2006, 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. De hersenen van de rat in stereotaxische coördinaten. 6de editie. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Induceerbare, hersenregio-specifieke expressie van een dominante negatieve mutant van c-Jun in transgene muizen verlaagt de gevoeligheid voor cocaïne. Brain Res. 2003, 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergente CaMK- en RacGEF-signalen regelen de dendrietstructuur en -functie. Trends Cell Biol. 2008, 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Inductie van deltaFosB in beloningsgerelateerde hersenstructuren na chronische stress. J Neurosci. 2004, 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Verschillende patronen van DeltaFosB-inductie in de hersenen door misbruik van drugs. Synapse. 2008, 62: 358-369. [PMC gratis artikel] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologie van de incubatie van het hunkeren naar drugs. Trends Neurosci. 2011, 34: 411-420. [PMC gratis artikel] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Calcium-gemedieerde second messengers moduleren de expressie van gedragssensibilisatie voor cocaïne. J Pharmacol Exp Ther. 1998, 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Menselijke breinreceptorautoradiografie met behulp van volledige halfrondsecties: een algemene methode die weefselartefacten minimaliseert. Synapse. 1987, 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Structurele plasticiteit geassocieerd met blootstelling aan drugs van misbruik. Neurofarmacologie. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transcriptionele en epigenetische verslavingsmechanismen. Nat Rev Neurosci. 2011, 12: 623-637. [PMC gratis artikel] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalente interacties van calcium / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II met de postsynaptische dichtheids-eiwitten NR2B, densin-180 en alpha-actinine-2. J Biol Chem. 2005, 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae met behulp van amine-reactieve isobare tagging-reagentia. Mol Cell Proteomics. 2004, 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. De verslaafde synaps: mechanismen van synaptische en structurele plasticiteit in nucleus accumbens. Trends Neurosci. 2010, 33: 267-276. [PMC gratis artikel] [PubMed]
56. Self DW. In: The Dopamine Receptors. Neve KA, redacteur. New York: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Zanger BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Transiente virale gemedieerde overexpressie van alfa-calcium / calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II in de nucleus accumbens schaal leidt tot langdurige functionele upregulatie van alpha-amino-3-hydroxyl-5 -methyl-4-isoxazol-propionaatreceptoren: dopamine-type-1-receptor en proteïnekinase A-afhankelijkheid. Eur J Neurosci. 2010, 31: 1243-1251. [PMC gratis artikel] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mechanisme en regulatie van calcium / calmoduline-afhankelijke proteïnekinase II gericht op de NR2B-subeenheid van de N-methyl-D-aspartaatreceptor. J Biol Chem. 2000, 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylering van DeltaFosB bemiddelt de stabiliteit in vivo. Neuroscience. 2009, 158: 369-372. [PMC gratis artikel] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulatie van DeltaFosB-transcriptionele activiteit door Ser27-fosforylatie. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulering van DeltaFosB-stabiliteit door fosforylatie. J Neurosci. 2006, 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB in hersenkredietcircuits medieert veerkracht tegen stress en antidepressieve reacties. Nat Neurosci. 2010, 13: 745-752. [PMC gratis artikel] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Chronische door cocaïne geïnduceerde H3-acetylatie en transcriptionele activatie van CaMKIIalpha in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de motivatie voor medicijnversterking. Neuropsychopharmacology. 2010, 35: 913-928. [PMC gratis artikel] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regelt wielrennen. J Neurosci. 2002, 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-inductie in orbitofrontale cortex medieert tolerantie voor door cocaïne geïnduceerde cognitieve dysfunctie. J Neurosci. 2007, 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Een essentiële rol voor DeltaFosB in de nucleus accumbens in morfineactie. Nat Neurosci. 2006, 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, prijs EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulin kinase II-remming beschermt tegen structurele hartziekte. Nat Med. 2005, 11: 409-417. [PubMed]