Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Februari 1; 102(5): 1737-1742.
Abstract
Cocaïne, een drug van misbruik, verhoogt de synaptische dopaminegehaltes in het striatum door de heropname van dopamine op axonterminals te blokkeren. Cycline-afhankelijk kinase 5 (Cdk5) en zijn activator p35, eiwitten die betrokken zijn bij fosforylering van substraten in postmitotische neuronen, bleken opwaarts gereguleerd te zijn na chronische blootstelling aan cocaïne. Om de effecten van Cdk5 en p35-inductie op striatale dopamine-signalering verder te onderzoeken, hebben we twee onafhankelijke transgene muislijnen gegenereerd waarin Cdk5 of p35 specifiek in neuronen tot overexpressie werd gebracht. We rapporteren hier dat verhoogde Cdk5-activiteit, als gevolg van p35 maar niet van Cdk5-overexpressie, leidt tot verzwakking van door cocaïne gemedieerde dopamine-signalering. Verhoogde Cdk5-gemedieerde fosforylering van dopamine en cAMP-gereguleerd fosfo-eiwit, molecuulmassa 32 kDa (DARPP-32) op Thr-75, ging gepaard met verminderde fosforylering van DARPP-32 op Thr-34. Verhoogde Cdk5-gemedieerde fosforylatie van extracellulair signaalgereguleerd kinase-kinase 1 op Thr-286 ging gepaard met verminderde activering van extracellulair signaalgereguleerd kinase 1 / 2. Deze effecten droegen bij aan verzwakking van door cocaïne geïnduceerde fosforylering van cAMP-responselement-bindend eiwit evenals een geringere inductie van c-fos in het striatum. Deze resultaten ondersteunen het idee dat Cdk5-activiteit betrokken is bij veranderde genexpressie na chronische blootstelling aan cocaïne en dus van invloed is op de langdurige veranderingen in de onderliggende cocaïneverslaving.
Cocaïne verhoogt de synaptische dopaminegehaltes in het striatum en verandert genexpressie in de dopaminoceptieve neuronen door intracellulaire routes te activeren die het beginsignaal van de dopamine D1-receptor naar de kern overbrengen (1). Chronische blootstelling aan cocaïne up-reguleert verschillende transcriptiefactoren, resulterend in de langdurige veranderingen in genexpressie waarvan gedacht wordt dat ze ten grondslag liggen aan neuronale aanpassingen bij cocaïneverslaving (2). ΔFosB, geïdentificeerd als een dergelijke transcriptiefactor (3), is aangetoond dat het de gedragsresponsiviteit van dieren tegen cocaïne verbetert (4, 5). Daarom wordt verwacht dat identificatie van de doelwitgenen die worden gereguleerd door ΔFosB-inductie bijdraagt aan een beter begrip van het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan de cocaïneverslaving. Onlangs is aangetoond dat chronische behandeling van dieren met cocaïne de expressie van cycline-afhankelijk kinase 5 (Cdk5) en zijn activator p35 in het striatum opwaarts reguleert door de inductie van ΔFosB (6, 7).
Cdk5 is een lid van de Cdk-familie van serine / threonine-kinasen. In tegenstelling tot andere Cdks die belangrijke regulatoren zijn van celcyclusprogressie, is Cdk5 voornamelijk betrokken bij fosforylering van substraten in postmitotische neuronen (8). De neuronale specificiteit van Cdk5-activiteit wordt bereikt door de associatie met zijn activatoren, ofwel p35 of p39, die voornamelijk tot uitdrukking komen in postmitotische neuronen (8). Naast de essentiële rol van Cdk5 in de ontwikkeling van de hersenen (9, 10), it is ook betrokken bij dopaminerge transmissie in postnatale hersenen (11, 12). Remming van Cdk5-activiteit resulteert in verhoogde afgifte van dopamine in het striatum, wat wijst op een presynaptische functie van Cdk5 als een negatieve regulator van dopamine-afgifte (11). Bovendien moduleert Cdk5 de werkzaamheid van postsynaptische dopamine-signalering door fosforylering van dopamine- en cAMP-gereguleerd fosfo-eiwit, molecuulgewicht 32 kDa (DARPP-32) op Thr-75, dat DARPP-32 omzet in een remmer van cAMP-afhankelijke kinase (PKA) (12).
Deze waarnemingen suggereren dat Cdk5 en p35 stroomafwaartse regulatoren zijn van de verlengde activering van dopamine-signalering na chronische blootstelling aan cocaïne en dus aan cocaïneverslaving. Om de rol van Cdk5 bij striatale dopamine-signalering verder aan te pakken, hebben we twee transgene muislijnen gegenereerd waarin Cdk5 of p35 specifiek tot expressie werd gebracht in neuronen onder de controle van de p35-promotor. Onze bevindingen gaven aan dat de Cdk5-activiteit hoger was gereguleerd met verhoogde niveaus van p35-eiwit maar niet met Cdk5-eiwit, wat suggereert dat het niveau van p35-eiwit snelheidsbeperkend is voor Cdk5-activiteit. Wij bieden hier in vivo bewijs dat verhoogde Cdk5-activiteit, als gevolg van overexpressie van p35, leidt tot verzwakking van door cocaïne gemedieerde dopamine-signalering naar de kern via een remming van de PKA- en extracellulaire signaalgecontroleerde kinase (ERK) cascades.
Materialen en methoden
Antilichamen. Polyklonale antilichamen tegen Cdk5 (C-8) en p35 (C-19) werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology. De fosforylatie-afhankelijke en -onafhankelijke antilichamen tegen ERK-kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 en cAMP-reactie-element-bindend eiwit (CREB) werden verkregen van Cell Signaling Technology (Beverly, MA). De antilichamen tegen fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), totaal DARPP-32 (12) en c-fos (14) werden gebruikt zoals beschreven. Een antilichaam tegen actine werd gekocht bij Sigma.
Experimentele dieren. We hebben eerder het p35-gen van de muis gekloond Cdk5r1, dat codeert voor p35-eiwit en de genomische structuur ervan (15). Voor het genereren van de transgene muis met neuronale overexpressie van p35 (Tgp35), de 6-kb EcoRI-EcoRI-fragment dat het 1.2-kb-promotorgebied bevat, werd gesubkloneerd in een pGEM9Z (-) plasmide en een 45-bp-aanhangsel afgeleid van SV40 werd ingevoegd in de kpnI site stroomafwaarts van de poly (A+) signaal (Fig 1A). De tag bevatte a SpeI site voor genotypering van de dieren. Het 6-kb-fragment werd uit het plasmide gesneden en gezuiverd, gevolgd door pronucleaire injectie van het transgen om de transgene muizen te genereren. Om het expressieprofiel van het transgen onder de regulerende controle van de 1.2-kb p35-promotor te onderzoeken in vivo, een dubbele transgene muis (Tgp35; p35 - / -) werd verder gegenereerd door gebruik te maken van een uit twee stappen bestaande fokstrategie waarmee de Tgp35-muis werd geregenereerd in een endogene p35-nul-achtergrond. De andere muismodellen die in dit onderzoek werden gebruikt, omvatten p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- en een transgene muis met neuronale overexpressie van Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypen van deze muizen werden bepaald door het uitvoeren van hetzij Southern-blot-analyse hetzij PCR op genomisch DNA geïsoleerd uit de staartbiopten. Muizen werden gehuisvest onder een 12-h licht / 12-h donkere cyclus. Alle zorg werd gegeven in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health over de verzorging en het gebruik van laboratorium- en proefdieren.
Southern Blot-analyse. Genomisch DNA geëxtraheerd uit staartbiopten werd verteerd met EcoRI en SpeIk, elektroforese op een 0.9% agarosegel en overgebracht op een nylon membraan. Het membraan werd gehybridiseerd met een willekeurige primer 32P-gelabelde probe bij 42 ° C gedurende de nacht. De 485-bp-probe voor genotypering van p35-knock-out (p35 - / -) en Tgp35-muizen werd gegenereerd door PCR met behulp van de volgende primers: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'en 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Het gehybridiseerde membraan werd tweemaal gewassen in 2 x SSC / 0.1% SDS bij 42 ° C gedurende 10 min, en twee maal in 0.1 x SSC / 0.1% SDS bij 65 ° C gedurende 20 min en blootgesteld aan röntgenfilm.
Behandeling met geneesmiddelen. Cocaïne (Sigma) werd opgelost in steriele zoutoplossing. Dieren werden ip-geïnjecteerd met cocaïne (15 mg / kg) of een gelijk volume zoutoplossing op de leeftijd van 3 maanden en gedood door onthoofding op verschillende tijdstippen (15, 30, 60 en 120 min.) Na de injectie. Hersenen werden snel verwijderd en gekoeld in ijskoude PBS. De striata werden vervolgens ontleed en onderworpen aan Northern- of Western-blot-analyse. Voor immunohistochemische analyse werden striatale secties verkregen van muizen 2 h na de injectie.
Northern Blot-analyse. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de striata met TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en onderworpen aan Northern-blot-analyse zoals beschreven (18). Voor detectie van c-fos-mRNA werd een 189-bp-fragment van muizen-c-fos-cDNA als een probe gebruikt zoals beschreven (19). De niveaus van c-fos mRNA werden gekwantificeerd door de optische dichtheid van de specifieke band te meten met behulp van een beeldanalysesysteem met nih beeldsoftware, versie 1.62.
Western Blot-analyse. Striatale weefsels werden gesoniceerd in 1% SDS en gekookt voor 10 min. De eiwitconcentratie in elk monster werd bepaald door BCA-eiwitassay (Pierce). Gelijke hoeveelheden eiwit werden gescheiden door SDS / PAGE alvorens te worden overgebracht op een nitrocellulosemembraan. De membranen werden geblokkeerd in 1 x PBS met 5% magere melk en 0.05% Tween 20 en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C. Incubatie met aan peroxidase geconjugeerd anti-muis- of konijnen-IgG (Sigma) werd uitgevoerd bij kamertemperatuur gedurende 60 min. Een signaal werd gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Pierce) en de optische dichtheden van de banden werden gekwantificeerd zoals hierboven beschreven.
Cdk5-kinasebepaling. Striatale lysaten werden bereid met een lysisbuffer bestaande uit 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride / 1 μg / ml aprotinine / 1 μg / ml leupeptine / fosfataseremmers (fosfataseremmermengsel I en II, Sigma). De lysaten werden geïmmunoprecipiteerd met hetzij anti-Cdk5 (C-8) hetzij anti-p35 (C-19) antilichamen. De Cdk5-immunoprecipitaten werden bereid door incubatie van 300 μl van het lysaat (overeenkomend met 300 μg eiwit) met anti-Cdk5-antilichaam (3 μg) overnacht bij 4 ° C gevolgd door verdere incubatie met 25 μl Proteïne A-agaroseparels (50 % slurry in de lysisbuffer; Santa Cruz Biotechnology) voor 3 h bij 4 ° C. Voor de bereiding van p35-immunoprecipitaten werd 500 pl van het lysaat (overeenkomend met 1 mg eiwit) geïncubeerd met anti-p35-antilichaam (3 μg) zoals hierboven beschreven. De immunoprecipitaten werden twee keer gewassen met de lysisbuffer en tweemaal met een kinasebuffer bestaande uit 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, opnieuw gesuspendeerd in 60 μl van de kinasebuffer. Kinase-activiteit werd gemeten door histon H1 als substraat te gebruiken (18).
Immunohistochemie. Muizen werden geanesthetiseerd door ip-injecties van avertine (250 mg / kg, Fluka) en transcardiaal geperfuseerd met 0.1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7.4, gevolgd door Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), een niet-verknoopbaar fixeermiddel. Ontlede hersenen werden verder gefixeerd in hetzelfde fixeermiddel gedurende de nacht bij 37 ° C. Vervolgens werden de hersenen ingebed in paraffine, in 5-μm dikke coronale coupes gesneden en onderworpen aan immunohistochemie door avidine-biotine-peroxidasecomplextechniek (Vector Laboratories) met diaminobenzidine als substraat te gebruiken. De secties werden overnacht geïncubeerd met een affiniteitsgezuiverd polyklonaal antilichaam tegen c-fos bij 4 ° C. De kleuringsspecificiteit werd beoordeeld door weglating van het primaire antilichaam.
Resultaten
Generatie van transgene muizen met neuronale overexpressie van p35. Het transgen dat werd gebruikt voor het verkrijgen van verhoogde neuronale expressie van p35 omvatte het 6-kb-fragment van het gekloneerde p35-gen van muis bevattende de 1.2-kb-promoter en de gehele coderende sequentie van p35 (Fig 1 A). De genotypen van muizen werden bepaald door Southern blot-analyse door een probe te gebruiken die was ontworpen om p35 - / - en Tgp35-muizen te onderscheiden van wildtype muizen (Fig 1 A en B). Om de transgenexpressie onder de controle van de 1.2-kb p35-promotor te onderzoeken, ontwikkelden we dubbel transgene muizen (Tgp35; p35 - / -) waarin p35-expressie alleen uit het transgen werd aangedreven. De p35-expressie in Tgp35; p35 - / - muizen werd alleen in de hersenen waargenomen (Fig 1C), waarbij het ruimtelijke expressiepatroon vergelijkbaar was met dat van wildtype muizen (Fig 1D). Gebrek aan p35 is aangetoond dat het resulteert in een abnormale gelaagdheidstructuur in de hersenschors en de hippocampus van muizen (10). De Tgp35; p35 - / - muizen toonden echter een volledige redding van het fenotype van p35 - / - hersenen (Fig 1E). Deze gegevens gaven aan dat de 1.2-kb p35-promoter de expressie van het transgen met een vergelijkbaar expressieprofiel als die van p35 van het endogene p35-gen controleerde.
Het p35-eiwitniveau is snelheidsbeperkend voor de up-regulering van Cdk5-activiteit. We onderzochten de gen-doseringseffecten van de genen die coderen voor p35 en Cdk5 op eiwitexpressie in striatale extracten van p35 - / -, p35 +/-, wildtype, Tgp35, Cdk5 +/- en TgCdk5-muizen op de leeftijd van 3 maanden. De niveaus van p35 en Cdk5 eiwit correleerden goed met de gen-doseringen, respectievelijk (Fig 2 A en B). Tgp35-muizen vertoonden een ≈1.6-voudige toename in p35-eiwitniveau in vergelijking met wildtype muizen, terwijl Cdk5-eiwitniveaus niet werden beïnvloed door de verschillende niveaus van p35-eiwit. TgCdk5-muizen vertoonden een ≈1.9-voudige toename in Cdk5-eiwitniveau in vergelijking met wildtype muizen, terwijl p35-eiwitniveaus niet werden beïnvloed door de verschillende niveaus van Cdk5-eiwit. Om de effecten van verschillende hoeveelheden p35-eiwit op Cdk5-activiteit te onderzoeken, werd Cdk5 geïmmunoprecipiteerd uit striatale extracten met anti-Cdk5-antilichaam en werd kinase-activiteit gemeten. Evenzo, om de effecten van verschillende hoeveelheden Cdk5-eiwit op kinaseactiviteit te onderzoeken, werd p35 geïmmunoprecipiteerd uit striatale extracten met anti-p35-antilichaam en werd kinase-activiteit gemeten. Cdk5-activiteit correleerde goed met het niveau van p35-eiwit maar niet met het niveau van Cdk5-eiwit (Fig 2 C en D). Deze resultaten gaven aan dat de hoeveelheid p35-eiwit een snelheidsbeperkende factor is voor Cdk5-activiteit. Daarom gebruikten we Tgp35-muizen om de effecten van verhoogde Cdk5-activiteit op striatale dopamine-signalering te onderzoeken.
Cocaïne-geïnduceerde fosforylatie van DARPP-32 op Thr-34 is verzwakt in Tgp35 muizen. De functie van DARPP-32 is afhankelijk van de fosforyleringstoestand op meerdere locaties (20). PKA fosforyleert DARPP-32 op Thr-34, terwijl Cdk5 DARPP-32 fosforyleert op Thr-75. We onderzochten de fosforylatietoestand van DARPP-32 in striatale extracten van wild-type en Tgp35 muizen. Het niveau van fosfo-Thr-75 DARPP-32 was hoger bij Tgp35-muizen (Fig 3A; 1.6 ± 0.2-vouw boven de waarde van wildtype muizen). Vervolgens hebben we de effecten van verhoogde Cdk5-activiteit op striatale dopamine-signalering onderzocht. We onderzochten de door cocaïne geïnduceerde PKA-activering in Tgp35-muizen door de fosforyleringstoestand van DARPP-32 op Thr-34 te analyseren. Het niveau van fosfo-Thr-34 DARPP-32 was verhoogd in wild-type muizen 15 min na de cocaïne-injectie (Fig 3B; 1.8 ± 0.2-vouw boven het basale niveau). Het effect van cocaïne op Thr-34-fosforylatie van DARPP-32 was echter verzwakt in Tgp35-muizen (1.2 ± 0.3-vouw boven het basale niveau). Deze resultaten gaven aan dat een toename van de activiteit van Cdk5 de door cocaïne geïnduceerde PKA-activatie verzwakte, waarschijnlijk door de DARPP-32-fosforylering op Thr-75 (6, 12). Het is ook mogelijk dat een toename in presynaptische Cdk5-activiteit leidt tot verminderde dopamine-afgifte en dat dit bijdraagt aan het verminderde effect van cocaïne. Met name een enkele injectie van cocaïne had geen effect op de niveaus van p35- en Cdk5-eiwit en de kinase-activiteit (Fig 3 C en D). Dit staat in contrast met een eerdere studie waarin is aangetoond dat chronische blootstelling aan cocaïne de expressie van p35 en Cdk5 (6).
Up-regulering van Cdk5-activiteit vermindert door cocaïne geïnduceerde activering van ERK1 / 2. Recent bewijs geeft aan dat activering van de dopaminereceptor in het striatum ook andere signaalcascades activeert, inclusief de ERK-route (21, 22), die een belangrijke rol speelt in de gedragsreactie op cocaïne (23). We onderzochten daarom of Cdk5-activiteit de door cocaïne geïnduceerde activering van de ERK-route zou kunnen beïnvloeden. Activatie van de ERK-route werd waargenomen na cocaïne-injectie in striatale extracten van wildtype muizen, zoals blijkt uit verhoogde fosforylering van MEK1 / 2 op Ser-217 en Ser-221 (1.5 ± 0.2-vouw boven het basale niveau) en van ERK1 / 2 op Thr-202 en Tyr-204 (ERK2-fosforylatie: 1.5 ± 0.2-vouw boven het basale niveau) (Fig 4 A en B). De door cocaïne geïnduceerde activering van MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-vouw boven het basale niveau) en van ERK1 / 2 (ERK2-fosforylatie: 1.2 ± 0.2-vouw boven het basale niveau) werd verzwakt in Tgp35-muizen (Fig 4 A en B). Bovendien waren de basale niveaus van fosfo-ERK1 / 2 lager in Tgp35-muizen (0.8 ± 0.2-voudig lager dan de waarde van wildtype muizen), terwijl deze trend niet statistisch significant was. Dit laatste resultaat kan worden toegeschreven aan Cdk5-afhankelijke fosforylatie van MEK1 op Thr-286, wat resulteert in een afname van de katalytische activiteit (24). Om deze mogelijkheid te beoordelen, onderzochten we de fosforylatietoestand van MEK1 op Thr-286 en ontdekten dat hogere niveaus van fosfo-Thr-286 MEK1 aanwezig waren in striatale extracten van Tgp35-muizen (Fig 4C; 1.3 ± 0.1-vouw boven de waarde van wildtype muizen). Verder werd de fosforyleringstoestand van MEK1 op Thr-286 niet veranderd door een enkele injectie van cocaïne, in overeenstemming met de bevinding dat de Cdk5-activiteit niet door de behandeling werd beïnvloed (Fig 3D).
Propagatie van dopamine-signalering naar de kern wordt verzwakt door verhoogde Cdk5-activiteit. Cocaïne-geïnduceerde activering van multiple signalering cascades met PKA en ERK leidt tot de daaropvolgende activering van de transcriptiefactor CREB in de kern door zijn fosforylatie bij Ser-133 (22, 25). Om te onderzoeken of de Cdk5-gemedieerde remmende effecten op PKA- en ERK-activatiecascades kunnen convergeren op CREB-fosforylering in de kern, onderzochten we de fosforyleringstoestand van CREB bij Ser-133 in striatale extracten van wildtype en Tgp35-muizen. Het basale niveau van fosfo-CREB was lager bij Tgp35-muizen (0.7 ± 0.1-vouw van de waarde van wildtype muizen) (Fig 5). Als reactie op de injectie van cocaïne was het fosfo-CREB-niveau verhoogd in het striatum van wildtype muizen (1.5 ± 0.1-vouw boven het basale niveau), maar deze reactie op cocaïne was verzwakt in Tgp35-muizen (1.2 ± 0.1- vouwen boven het basale niveau) (Fig 5).
Fosforylering van CREB op Ser-133 verhoogt de transcriptieactiviteit via een cAMP-responselement in het promotergebied van bepaalde genen, waaronder het c-fos-gen (26). We onderzochten daarom de inductie van c-fos in het striatum van wildtype en Tgp35-muizen na cocaïne-injectie. Bij wildtype muizen nam het niveau van c-fos mRNA toe tot een piekwaarde (1.8 ± 0.2-vouw boven het basale niveau) 30 min na injectie van cocaïne en vervolgens teruggebracht tot het basale niveau met 120 min na de injectie (Fig 6 A en B). De niveaus van c-fos mRNA waren ≈30% lager in Tgp35-muizen dan in wildtype muizen tot 30 min na de injectie (Fig 6 A en B). De mindere inductie van c-fos in Tgp35-muizen werd verder bevestigd door immunohistochemie (Fig 6 C-F). Cocaïnebestelling verhoogde de c-fos immunoreactiviteit, sterk in de dorsomediaal-dorsocentrale delen van het striatum en zwak in de laterale delen, in zowel wildtype als Tgp35-muizen. De door cocaïne geïnduceerde toename van het aantal c-fos-immunopositieve cellen was met name verzwakt in het striatum van Tgp35-muizen (Fig 6G). Samen gaven deze resultaten aan dat cocaïne-gemedieerde verhoging van striatale dopamine-signalering naar de kern werd geremd in Tgp35-muizen, een waarschijnlijk gevolg van verhoogde Cdk5-activiteit.
Discussie
Cdk5 en zijn activator p35 zijn geïdentificeerd als doelgenen die opwaarts worden gereguleerd door chronische blootstelling aan cocaïne (6). We rapporteren hier bewijs dat verhoogde Cdk5-activiteit, als gevolg van opregulatie van p35 in plaats van Cdk5-opregulatie, leidt tot verzwakking van door cocaïne gemedieerde dopamine-signalering in striatale neuronen. Om de consequenties van de opwaartse gereguleerde expressie van Cdk5 of p35 op striatale dopamine-signalering te onderzoeken, werden twee transgene muislijnen, TgCdk5 en Tgp35-muizen, geanalyseerd. We vonden dat de activiteit van Cdk5 opwaarts gereguleerd was in verhouding tot een verhoogd niveau van p35-eiwit, maar werd niet beïnvloed door een verhoogd niveau van Cdk5-eiwit. Ons vorige rapport heeft ook aangetoond dat de Cdk5-activiteit in de muizenhersenen van TgCdk5 lager was dan in de muizen van het wilde type, toen de activiteit werd gemeten met behulp van Cdk5-immunoprecipitaten (17), wat suggereert dat overexpressie van Cdk5 resulteert in een verhoogd niveau van monomere Cdk5 als het p35-niveau niet wordt verhoogd. Deze resultaten gaven aan dat het niveau van p35-eiwit een snelheidsbeperkende factor is voor Cdk5-activiteit.
Tgp35-muizen vertoonden een lagere inductie van zowel CREB-fosforylering als c-fos in het striatum na acute injectie van cocaïne, wat suggereert dat de striatale respons op cocaïne werd geremd door verhoogde Cdk5-activiteit. De verzwakking van door cocaïne gemedieerde dopamine-signalering in Tgp35-muizen werd waarschijnlijk bereikt door de Cdk5-gemedieerde remming van meerdere signaalcascades waarbij DARPP-32, PKA en ERK betrokken waren. De toediening van cocaïne verhoogde de PKA-fosforylatie van DARPP-32 op Thr-34 in wildtype muizen, terwijl deze respons verzwakt was in Tgp35-muizen. Van PKA-fosforylatie van DARPP-32 op Thr-34 is aangetoond dat het de activiteit van eiwitfosfatase 1 (PP1) remt, het enzym dat verantwoordelijk is voor de defosforylering van Ser-133 van CREB (27). PP1-activiteit zou dus niet worden tegengewerkt via de DARPP-32 / PP1-route in Tgp35-muizen.
Cocaïne-geïnduceerde activering van ERK1 / 2 was ook verzwakt in Tgp35-muizen. Er zijn verschillende mechanismen waardoor Cdk5 de door cocaïne geïnduceerde activering van ERK1 / 2 zou kunnen remmen. Ten eerste kon Cdk5-afhankelijke fosforylatie van DARPP-32 op Thr-75 PKA remmen, wat leidde tot de daaropvolgende remming van elke PKA-gemedieerde MEK1 / 2-activering die vereist is voor ERK1 / 2-activering. Een recente studie heeft ook gevonden dat fosforylatie van DARPP-32 op Thr-34 vereist is voor door cocaïne gemedieerde activering van ERK1 / 2 via meerdere routes die indirecte regulatie van MEK-activering impliceren, evenals de regulatie van striataal verrijkte fosfatase, een tyrosine fosfatase dat direct werkt op ERK1 / 2 (28). Ondersteuning voor deze mogelijkheid wordt gesuggereerd door de bevinding dat cocaïne-geïnduceerde fosforylatie van MEK1 / 2 bij Ser-217 en Ser-221 werd afgeschaft bij Tgp35-muizen. Een andere waarschijnlijke route is via Cdk5-afhankelijke fosforylatie van MEK1 op Thr-286, wat zou resulteren in een afname van zijn katalytische activiteit en zou leiden tot remming van ERK1 / 2-activiteit (24).
Er is aangetoond dat remming van Cdk5-activiteit in het striatum de gedragseffecten van chronische cocaïnebehandeling bij dieren versterkt (6). In overeenstemming met de hypothese dat opwaartse regulatie van Cdk5-activiteit kan bijdragen aan neuronale aanpassing voor het tegengaan van de effecten van herhaald cocaïnebeheer (6), vonden we dat Cdk5-gemedieerde fosforylering van DARPP-32 en MEK1 bijdroeg aan de verzwakking van door cocaïne geïnduceerde activering van ERK1 / 2, resulterend in de geringere inductie van CREB-fosforylering en c-fos in het striatum. Onze bevindingen ondersteunen het idee dat verhoogde Cdk5-activiteit, als gevolg van opregulatie van p35, genexpressie in het striatum na chronische blootstelling aan cocaïne kan veranderen. Dit kan gebeuren door veranderingen in de activiteiten van de transcriptiefactoren zoals CREB en c-fos. Aldus kan de Cdk5-activator p35, vanwege zijn snelheidsbeperkende effecten op Cdk5-activiteit, bijdragen tot langdurige veranderingen in neuronale functie die ten grondslag ligt aan cocaïneverslaving.
Dankwoord
We danken Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant en Sashi Kesavapany voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (aan ABK), US Public Health Service Grant DA10044 en subsidies van de Simons Foundation, de Peter J. Sharp Foundation en de Picower Foundation (aan PG).
Opmerkingen
Afkortingen: Cdk5, cycline-afhankelijke kinase 5; ERK, extracellulair signaal-gereguleerd kinase; DARPP-32, dopamine en cAMP-gereguleerd fosfoproteïne, moleculaire massa 32 kDa; PKA, cAMP-afhankelijk kinase; MEK, ERK-kinase; CREB, cAMP-responselement-bindend eiwit.
Referenties
;
