PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
bron
Laboratorium voor Gedragsfysiologie, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japan.
Abstract
Lichaamsbeweging verbetert meerdere aspecten van hippocampusfunctie. In overeenstemming met het idee dat neuronale activiteit de sleutel is tot het bevorderen van neuronale functies, heeft eerdere literatuur consequent aangetoond dat acute periodes van lichaamsbeweging neuronale activering in de hippocampus oproepen. Herhaalde activerende stimuli leiden tot een accumulatie van de transcriptiefactor ΔFosB, die op lange termijn neurale plasticiteit veroorzaakt.
In deze studie hebben we de hypothese getest dat vrijwillige wielrennen op lange termijn ΔFosB-expressie in de hippocampus induceert en alle mogelijke regiospecifieke effecten binnen de hippocampus-subvelden langs de dorso-ventrale as onderzocht. Mannelijke C57BL / 6-muizen werden gehuisvest met of zonder een loopwiel gedurende 4-weken. Langdurig wielrennen verhoogde de FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit in alle gemeten hippocampusgebieden aanzienlijk (dat wil zeggen, in de subvelden van DG, CA1 en CA3 van zowel de dorsale als de ventrale hippocampus). De resultaten bevestigden dat wielloop geïnduceerde regiospecifieke expressie van de FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit in de cortex suggereert dat de uniforme toename in FosB / ΔFosB in de hippocampus geen niet-specifiek gevolg is van hardlopen. Western blot gegevens gaven aan dat de verhoogde hippocampale FosB / ΔFosB immunoreactiviteit voornamelijk te wijten was aan een verhoogde ΔFosB. Deze resultaten suggereren dat lichamelijke oefening op lange termijn een krachtige trigger is voor ΔFosB-inductie door de hele hippocampus, wat zou verklaren waarom oefening zowel dorsale als ventrale hippocampus-afhankelijke functies kan verbeteren. Interessant genoeg vonden we dat de FosB / ΔFosB-expressie in het DG positief gecorreleerd was met het aantal doublecortin-immunoreactieve (dwz onvolgroeide) neuronen.
Hoewel de mechanismen waardoor AFosB bemiddelt voor door inspanning geïnduceerde neurogenese nog steeds onzeker zijn, impliceren deze gegevens dat door inspanning geïnduceerde neurogenese ten minste activiteitsafhankelijk is. Samenvattend suggereren onze huidige resultaten dat ΔFosB een nieuw moleculair doelwit is dat betrokken is bij het reguleren van door inspanning geïnduceerde plasticiteit van de hippocampus.
Introductie
Lichaamsbeweging geeft verschillende voordelen aan moleculaire, structurele en functionele aspecten van de hippocampus bij knaagdieren [1,2], waarvan sommige werden ondersteund door studies van mensen [3,4]. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de door inspanning geïnduceerde veranderingen in plasticiteit van de hippocampus worden echter onvoldoende begrepen. Eerdere literatuur heeft consequent aangetoond dat beweging hippocampale neuronale activering bij knaagdieren oproept. Immunohistochemische studies met c-Fos, een marker van transiënte neuronale activering, hebben aangetoond dat zowel geforceerde als vrijwillig uitgevoerde verhoogde c-Fos-expressie in de dentate gyrus (DG), CA1 en CA3 subvelden van de hippocampus bij knaagdieren [5-7]. Bovendien heeft een eerdere studie met laser-Doppler-flowmetrie (LDF) aangetoond dat een milde loopband met verhoogde regionale cerebrale bloedstroom (rCBF), een alternatieve marker van neuronale activering, in het CA1-subveld bij ratten [8]. Immunohistochemische studies maken gedetailleerde regiospecifieke analyses mogelijk nadat de training is gestopt, terwijl LDF real-time monitoring van rCBF in een gelokaliseerd gebied tijdens inspanning mogelijk maakt. Ondanks de voordelen en beperkingen van elke studie, toonden deze onderzoeken op vergelijkbare wijze een effect van acute perioden van oefening op hippocampale neuronale activiteit. Deze resultaten suggereren een mechanisme waarbij langdurige regelmatige lichaamsbeweging de plasticiteit van de hippocampus bevordert door herhaaldelijk activering van neuronale activering [9].
De transcriptiefactor ΔFosB, een afgeknotte splice-isovorm van FOSB met de volledige lengte, wordt geïnduceerd door verschillende typen herhaalde stimuli in specifieke hersengebieden, waar het geleidelijk accumuleert vanwege zijn unieke stabiliteit (een halfwaardetijd van weken) [10-12]. Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat verhoogde niveaus van ΔFosB langdurige neurale en gedragsmatige plasticiteit geassocieerd met bepaalde stimuli mediëren [11,13]. Bijvoorbeeld, chronische toediening van drugs van misbruik zoals cocaïne en morfine vergroot gewoonlijk de ΔFosB-expressie in de nucleus accumbens, hetgeen een van de moleculaire mechanismen voorstelt die ten grondslag liggen aan verhoogde gevoeligheid voor deze geneesmiddelen [11,14,15]. Sop dezelfde manier als andere beloningsstimuli, waaronder een vetrijk dieet en seksuele ervaring [16,17], lop termijn vrijwillige wielrennen verhoogde tevens de immunoseactiviteit van FosB / ΔFosB in rattenkern accumbens, wat suggereert dat vrijwillig hardlopen een natuurlijke beloning is voor knaagdieren [18,19]. Voor zover ons bekend is, heeft geen literatuur onderzocht of herhaalde blootstelling aan lichaamsbeweging ΔFosB-expressie in de hippocampus induceert. Omdat oefening de neuronale activering in de hippocampus activeert, stelden we de hypothese voor dat langdurige vrijwillige wielrennen ook ΔFosB-expressie zou opwekken in de hippocampus. Hoewel de exacte mechanismen waardoor ΔFosB de plasticiteit van de hippocampus reguleert, nog steeds onzeker zijn, hebben onderzoeken aangetoond dat muizen die de FosB gen toont verstoorde hippocampale neurogenese en verhoogd depressie-achtig gedrag [20,21]. ikHet is bekend dat oefening neurogenese versterkt en antidepressieve eigenschappen heeft [22-25]. ikAls onze hypothese correct is, zou ΔFosB een nieuw potentieel moleculair doelwit zijn dat de door oefening geïnduceerde plasticiteit van de hippocampus veroorzaakt.
De hippocampus heeft een anatomische en functionele gradiënt langs de longitudinale (dorso-ventrale) as [26]. De dorsale hippocampus speelt een sleutelrol in ruimtelijk leren en geheugen [27,28], terwijl de ventrale hippocampus bij voorkeur betrokken is bij het reguleren van emotioneel gedrag [29,30]. Bovendien hebben studies aangetoond dat fysiologische stimuli verschillende patronen van c-Fos-expressie in de dorsale en ventrale delen van de hippocampus [31-33]. Omdat oefening zowel dorsaal verbetert [34-37] en van de ventrale hippocampus afhankelijke functies [24,25,38], is het belangrijk om te onderzoeken of langdurig vrijwillig hardlopen regio-specifieke expressie van ΔFosB in de hippocampus veroorzaakt.
De primaire hypothese van deze studie was dat langdurig vrijwillig wielrennen ΔFosB-expressie in de hippocampus van de muis zou induceren. Deze hypothese werd onderzocht door FosB / ΔFosB immunohistochemie in de dorsale en ventrale hippocampus subvelden DG, CA1 en CA3, met extra nadruk op het identificeren van regiospecifieke inductie. De resultaten werden bevestigd door Western blotting, dat werd gebruikt om de isovorm van te identificeren FosB genproducten geïnduceerd in de hippocampus. We onderzochten ook de cortex voor regiospecifieke FosB / ΔFosB-inductie om de mogelijkheid uit te sluiten dat langdurige oefening niet-specifiek FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit in de hersenen verhoogde. Ten slotte werd de correlatieve associatie tussen FosB / ΔFosB-expressie en neurogenese onderzocht als de eerste stap in het zoeken naar de functionele implicaties van door inspanning geïnduceerde ΔFosB-inductie bij het reguleren van de plasticiteit van de hippocampus.
Materialen en methoden
1: Verklaring dieren en ethiek
Twintig mannelijke C57BL / 6-muizen (8 weken oud) werden gekocht bij een commerciële kweker (SLC, Shizuoka, Japan). Tien muizen werden gebruikt voor Experiment 1 en de andere tien voor Experiment 2. Muizen werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuuromstandigheden (22-24 ° C) en licht (12 / 12-h licht / donker cyclus, licht aan bij 0500) en werden voorzien van voedsel en water ad libitum. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Experimental Ethics Committee van de Tokyo Metropolitan University.
In elk experiment werden muizen bij aankomst willekeurig toegewezen aan een controlegroep (Control, n = 5) of een lopende groep (Runner, n = 5). Tijdens de eerste week werden alle muizen gehuisvest in standaard kunststof kooien in groepen (5 muizen / kooi) voor aanvankelijke acclimatisatie. Vervolgens werden Runner-muizen overgebracht naar een kooi uitgerust met een loopwiel (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, VS). Omdat sociale isolatie bekend is om door inspanning geïnduceerde neurogenese in de hippocampus te onderdrukken [39], Runner-muizen werden gehuisvest als een groep (5-muizen / kooi) voor een extra 4-week. Het aantal wielrotaties werd elke ochtend geregistreerd en het lichaamsgewicht (g) werd wekelijks gemeten.
2: experimenteer 1. Immunohistochemisch onderzoek van FosB / ΔFosB-expressie en hippocampale neurogenese
2.1: perfusie en weefselverwerking
De ochtend (0900-1100) na de laatste dag van de loopperiode werden de muizen diep verdoofd met pentobarbital-natrium en transcardiaal geperfuseerd met koude zoutoplossing. De hersenen werden snel verwijderd en post-gefixeerd in 4% paraformaldehyde in 0.1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) gedurende de nacht. De hersenen werden vervolgens cryobeschermd in 30% sucrose in PBS en bevroren tot verdere verwerking. Coronale hersencoupes (40 μm) van een halfrond werden verkregen met behulp van een bevriezend microtoom en verzameld in PBS met 0.01% natriumazide.
2.2: immunohistochemie
Een reeks van zes monsters van een op zes werd willekeurig geselecteerd voor FosB / ΔFosB immunokleuring. Een aangrenzende reeks werd gebruikt voor het labelen van doublecortin (DCX), een marker van onrijpe neuronen gevalideerd voor het beoordelen van neurogenese [40,41]. Na het blussen van endogene peroxidase-activiteit met 1% H2O2 in PBS werden vrij-drijvende secties gepreïncubeerd met een blokkerende oplossing die 10% normaal paardenserum in PBS voor 2 h bevatte. Na spoelen in PBS werden coupes geïncubeerd met konijnen polyklonaal pan-FosB antilichaam (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS) verdund in PBS met 0.5% Triton X-100 en 0.5% BSA (PBST) -BSA) voor 24 h bij 4 ° C. Een andere reeks coupes werd geïncubeerd met geit polyklonaal anti-DCX antilichaam (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) in PBST-BSA voor 48 h bij 4 ° C. De coupes werden verder geïncubeerd met een geschikt gebiotinyleerd secundair antilichaam (anti-konijn IgG, 1: 1000, AP182B; anti-geit IgG, 1: 1000, AP180B, beide antilichamen van EMD Millipore, Billerica, MA, VS) in PBST-BSA voor 2 h bij kamertemperatuur. De coupes werden vervolgens behandeld met avidine-biotine-peroxidase-complex (Vectastain ABC peroxidase-set, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, VS) voor 90 min volgens de instructies van de fabrikant. De antigenen werden uiteindelijk gevisualiseerd met 0.02% 3,3-diaminobenzidine (DAB) in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) met 0.01% H2O2. Voor FosB / AFosB immunokleuring werd de reactie geïntensiveerd met nikkelammoniumsulfaat. Voor DCX-kleuring werden celkernen tegengekleurd met Nissl-kleuring. Secties werden gemonteerd op gelatine-gecoate dia's en dekglaasjes werden geplaatst.
2.3: Kwantificering van de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB met behulp van drempels van afbeeldingen
Het pan-FosB-antilichaam dat in dit onderzoek werd gebruikt, werd opgewekt tegen een intern gebied gedeeld door FosB en AFosB N-terminaal gebied, zodat geen onderscheid kan worden gemaakt tussen de twee isovormen. Daarom werden de immuunkleurige structuren beschreven als FosB / ΔFosB-immuunreactieve (FosB / ΔFosB-ir) -kernen. Voor een onbevooroordeelde blinde kwantificatie werden dia's voorafgaand aan de analyse gecodeerd. De muis-hersenenatlas [42] werd gebruikt om de locatie van de volgende interessegebieden (ROI's) te identificeren: korrelcellaag (GCL) van DG (3-secties), pyramidale cellaag van CA1 (3-secties) en CA3 (2-3-secties) in de dorsale hippocampus (gesloten tot -2.2 mm van de bregma); DG (2-secties), CA1 (2-secties) en CA3 (2-secties) in de ventrale hippocampus (gesloten tot -3.4 mm van de bregma) (Figuur 4, links). De caudale secties bevatten zowel de dorsale als de ventrale delen van de hippocampus, maar het ventrale deel was gericht. In het DG werden suprapyramidal (DGsp) en infrapyramidal (DGip) bladen afzonderlijk geanalyseerd. Motorische cortex (2-3-secties, gesloten tot -0.6 mm van de bregma), somatosensorische barreschors (2-3-secties, gesloten tot -0.6 mm van de bregma), visuele cortex (3-secties, gesloten tot -2.9 mm van de bregma), de auditieve cortex (3-coupes, gesloten tot -2.9 mm van de bregma) en de bulbus olfactorius (3-coupes, gesloten tot + 4.3 mm van de bregma) werden ook geanalyseerd (Figuur 6, links).
Digitale afbeeldingen (2070 × 1548 pixels) van elke ROI werden genomen met behulp van een optische microscoop (BX-51, Olympus, Tokyo, Japan) uitgerust met een CCD-camera (DP-73, Olympus) en beeldvormingsoftware (cellSens, Olympus). vergroting van de objectieflens was 10 × voor hippocampale ROI's en 4 × voor corticale ROI's. Om de matige tot sterke FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit te identificeren (Figuur 1D-G), gebruikmakend van verschillende secties van tevoren, werden beide beeldacquisitie-instellingen (lichtintensiteit, grootte van de veldstop, belichtingstijd en witbalans) en drempelniveaus voor elk van de RGB-componenten geoptimaliseerd voor hippocampale en corticale ROI's. De volgende analyse werd vervolgens uitgevoerd onder de geoptimaliseerde omstandigheden (1). ROI's werden geselecteerd door een onregelmatig gevormde polygoon (Figuur 1A, B) (2). Het beeld had een drempelwaarde, waardoor de FosB / ΔFosB-ir-kernen in een rode kleur werden omgezet (Figuur 1C-G) (3). Het% ROI werd vervolgens automatisch als volgt berekend:% ROI = (geconverteerd gebied (in rood) / totaal ROI-gebied) × 100.
Om de drempellende analyse van deze afbeelding te valideren, werden 20-regio's willekeurig geselecteerd uit verschillende hersengebieden met verschillende grootten. Naast de kwantificering van de drempelwaarde van de afbeelding, werd het aantal FosB / AFosB-ir-kernen binnen de geselecteerde gebieden met de hand geteld en de dichtheid van FosB / AFosB-ir-kernen werd verkregen door het aantal FosB / AFosB-ir-kernen te delen door de gemeten gebied (mm2).
2.4: Kwantificering van DCX-ir immature neuronen in de dentate gyrus
De DCX-ir immature neuronen in de DG van Runner-muizen waren overvloedig en overlappend, wat het moeilijk maakt om het discrete aantal DCX-ir soma precies te tellen met behulp van een optische microscoop. In een eerdere studie toonde Sholl-analyse voor morfologische evaluatie echter aan dat elk DCX-ir-neuron gemiddeld één enkele dendriet heeft gemeten binnen 40 μm van de soma [43]. Daarom werd de volgende originele analyse ontwikkeld om regio-specifieke kwantificering van DCX-ir neuronen mogelijk te maken.
- (1) Een afbeelding van de GCL werd geprojecteerd op een computerscherm met behulp van beeldverwerkingssoftware en een 40 × -objectieflens (2). Op de live afbeelding werd een lijnsegment (150 ± 0.1 μm) getekend in het midden van de GCL (Figuur 2) (3). Het wijzigen van de focusdiepte, het aantal keren dat het lijnensegment DCX-ir-dendrieten doorkruiste, werd geteld (4). De ROI's (dorsale DGsp, dDGsp; dorsale DGip, dDGip; ventrale DGsp, vDGsp; ventrale DGip, vDGip) kwamen overeen met de regio's waar de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB werd geanalyseerd (5). In elke ROI werden 2-3-lijnsegmenten per sectie getekend en het aantal kruisingen werd gemiddeld over 2-3-secties per muis. Omdat de dikte van de GCL ongeveer 60-80 μm is, moet het aantal kruisingen het aantal DCX-ir-neuronen in het geanalyseerde beperkte gebied weerspiegelen.
Een representatief beeld van DCX-ir onvolgroeide neuronen en een lijnsegment (150 ± 0.1 μm) overlay voor het tellen van het aantal kruisingen met DCX-ir-dendrieten.
3. Experimenteer 2. Identificatie van de FosB / ΔFosB-isovorm veroorzaakt door draaiende wielen
3.1: perfusie en weefselverwerking
Een extra cohort van muizen werd behandeld zoals hierboven in Experiment 1. Na 4 weken na het uitvoeren van de interventie, werden de muizen transcardiaal geperfundeerd met koude zoutoplossing onder diepe anesthesie. De hippocampus werd snel ontleed en bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. De hippocampi van elke muis werden gehomogeniseerd in RIPA-buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, VS) die protease bevatten remmers (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Duitsland). De lysaten werden gecentrifugeerd gedurende 15 min bij 5000 rpm bij 4 ° C en supernatanten werden verzameld. Eiwitconcentraties werden gemeten met een BCA Protein Assay-kit (#23227, Thermo Scientific, IL, VS).
3.2: Western-blotting
Gelijke hoeveelheden eiwit (30 μg / baan) werden geëlektroforeerd op een 10% polyacrylamidegel en vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, VS). Niet-specifieke binding werd geblokkeerd door pre-incubatie van het membraan voor 1 h in TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) met 3% BSA. Het membraan werd geïncubeerd met het pan-FosB-antilichaam (1: 1000) dat hierboven werd gebruikt voor immunohistochemie, opgelost in TBST met 3% BSA. Na wassen met TBST werd het membraan voor 1 h bij kamertemperatuur geïncubeerd met aan HRP geconjugeerd anti-konijn-IgG-antilichaam (5000: 934 in TBST, NA1, GE Healthcare, Buckinghamshire, VK). Na wassen met TBST werden eiwitbanden gevisualiseerd door incubatie met Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, VS) en vastgelegd met behulp van een Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, VK). Het membraan werd vervolgens opnieuw getest met anti-glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) antilichaam (#2275, 1: 5000 in TBS-T, Trevigen, MD, VS) als een laadcontrole. De optische dichtheid van de eiwitbanden werd gekwantificeerd met behulp van Image-J en genormaliseerd tot het niveau van GAPDH.
4: statistische analyse
Veranderingen in muislichaamsgewicht werden geanalyseerd door tweeweg herhaalde metingen ANOVA (groep x tijd). Een ongepaarde t-test werd gebruikt om statistische verschillen tussen groepen te bepalen (Control vs. Runner). De correlatieanalyse van Pearson werd gebruikt om de FosB / ΔFosB-immunoreactiviteitsanalyse (handmatig tellen vs. beelddrempelwaarde) te valideren en om de associatie te onderzoeken tussen het niveau van de FosB / ΔFosB-expressie en het aantal DCX-kruisingen in het DG. Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. De drempel voor statistische significantie werd vastgesteld op P <0.05.
Resultaten
1: lichaamsgewicht en werkingsafstand in Experimenten 1 en 2
Veranderingen in het lichaamsgewicht van zowel Control- als Runner-muizen in Experimenten 1 en 2 worden samengevoegd en weergegeven in Figuur 3. Tweeweg herhaalde metingen ANOVA gaf een significante interactie aan (groep × tijd, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) en hoofdeffect van de groep F(1, 18) = 6.07, P <0.05), wat wijst op een significant lager lichaamsgewicht bij Runner-muizen. De loopafstand per kooi wordt weergegeven in Tabel 1. Hoewel de precieze loopafstand van elke muis onzeker was omdat de muizen samen werden gehuisvest, bevestigde regelmatige observatie dat alle muizen vaak wielrennen uitvoerden. De Runner-muizen in Experiment 2 liepen langer dan die in Experiment 1, maar de gemiddelde loopafstand (m / dag / kooi) was consistent gedurende elk experiment.
2: validatie van FosB / ΔFosB immunoreactiviteitskwantificatie met behulp van drempels
Er was een significante correlatie tussen FosB / ΔFosB-ir gebied verkregen door beelddrempelwaarde en dichtheid van FosB / ΔFosB-ir kernen verkregen door handmatig tellen (r = 0.941, P <00001, Figuur 4).
3: FosB / ΔFosB immunoreactiviteit in de hippocampus
Representatieve beelden van FosB / ΔFosB immunokleuring in de dorsale en ventrale hippocampale subvelden werden getoond in Figuur 5. In alle geanalyseerde ROI's was de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB in Runner-muizen (Figuur 5, rechts) was kwalitatief hoger dan die in Control-muizen (Figuur 5, midden). In Runner-muizen wees kwantitatieve analyse op een significante toename van het FosB / ΔFosB-ir-gebied in beide dorsale cellen (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) en de ventrale hippocampale subvelden (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figuur 6).
4: FosB / ΔFosB immunoreactiviteit in de cortex
Representatieve beelden van FosB / ΔFosB immunokleuring in de corticale ROI's worden getoond in Figuur 7. Kwantitatieve analyse onthulde regio-afhankelijke veranderingen in FosB / ΔFosB immunoreactiviteit met langdurige werking (Figuur 8). In Runner-muizen was het FosB / ΔFosB-ir-gebied significant hoger in de motorcortex (P <0.05) en de somatosensorische vatcortex (P <0.05), maar niet in de visuele cortex (P = 0.662) of de bulbus olfactorius (P = 0.523). In de auditieve cortex neigde het FosB / ΔFosB-ir-gebied naar een toename van Runner-muizen (P = 0.105).
5: Neurogenese
Representatieve beelden van DCX immunokleuring worden getoond in Figuur 9. In de dorsale hippocampus, DCX-immunoreactiviteit bij Runner-muizen (Figuur 9, rechts) was kwalitatief hoger vergeleken met controlemuizen (Figuur 9, links). Vergeleken met de dorsale hippocampus was DCX-immunoreactiviteit in de ventrale hippocampus zwakker in zowel Control- als Runner-muizen. Bij Runner-muizen was het aantal kruisingen significant hoger in de dDGsp (P <0.01) en dDGip (P <0.01; Figuur 10). In de ventrale hippocampus was het aantal kruisingen in Runner-muizen doorgaans groter, maar er waren geen significante verschillen tussen groepen (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figuur 10).
6: correlatie tussen FosB / ΔFosB-expressie en neurogenese
Een correlatieanalyse werd uitgevoerd tussen het FosB / ΔFosB-ir-gebied en het aantal DCX-kruisingen (Figuur 11). Omdat elke gegevensset (bijv. Dorsale DGsp in controlemuizen) alleen bestaat uit 5-paren, werd de analyse eerst uitgevoerd met alle 40-paren. Intrigerend was er een significante correlatie tussen het FosB / ΔFosB-ir-gebied en het aantal DCX-kruisingen (r = 0.885, P <0.0001). Daarnaast werd er ook een significante correlatie gevonden wanneer de dorsale DG (r = 0.762, P <0.05) en de ventrale DG (r = 0.816, P <0.01) werden afzonderlijk geanalyseerd.
7: Identificatie van de FOSB / ΔFosB-isovorm veroorzaakt door langdurig hardlopen
Ten slotte, om de isovorm van te identificeren FosB genproducten die zijn geïnduceerd in de hippocampus als reactie op langdurig hardlopen, werden de hippocampi van een additioneel cohort muizen onderworpen aan Western-blotting met behulp van hetzelfde pan-FosB-antilichaam. Meerdere banden van 35-37 kDa, die gemodificeerde isovormen van ΔFosB vertegenwoordigen [44], waren significant verhoogd in Runner versus Control-muizen (Figuur 12, P <0.01). Aan de andere kant was de FosB-isovorm van 48 kDa in beide groepen niet detecteerbaar. Een andere band die vaag zichtbaar is boven 25 kDa vertegenwoordigt waarschijnlijk de Δ2ΔFosB-isovorm (27 kDa). Er waren twee andere banden, bij meer dan 50 kDa en 37 kDa, die hoogstwaarschijnlijk waren vanwege niet-specifieke binding. Wanneer gekwantificeerd, werden er geen verschillen gevonden in deze niet-ΔFosB-banden tussen groepen (gegevens niet getoond).
Discussie
Samenvattend, de onderhavige studie voerde eerst een immunohistochemische analyse uit om 1 te onderzoeken) of vrijwillige wielrennen op lange termijn FosB / ΔFosB-expressie induceert in de hippocampus; en 2) of een regiospecifieke respons bestaat langs zijn dorso-ventrale as.
Vier weken van vrijwillige wielrennen veroorzaakten een significante toename in de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB in alle geanalyseerde hippocampusgebieden (dwz de subvelden van DG, CA1 en CA3 van zowel de dorsale als de ventrale delen van de hippocampus). We hebben bevestigd dat de 35-37kDa ΔFosB-isovorm de belangrijkste was FosB genproduct accumuleren in reactie op langdurig hardlopen. Deze resultaten ondersteunen duidelijk de hypothese dat regelmatige lichaamsbeweging op lange termijn een krachtige trigger is voor ΔFosB-inductie door de hele hippocampus, en dat de inductie ervan mogelijk een nieuw moleculair mechanisme is waarmee oefening verschillende soorten dorsale en / of ventrale hippocampus-afhankelijke functies beïnvloedt.
1: validatie en beperkingen van het kwantificeren van de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB met behulp van drempels voor afbeeldingen
Een drempaaltechniek met beeld, die veel wordt gebruikt in immunohistochemische studies voor het tellen van het aantal doelwitcellen en voor het evalueren van celmorfologie, werd in deze studie toegepast voor regiospecifieke kwantificering van FosB / ΔFosB immunoreactiviteit [15,45,46]. Een significante correlatie tussen de niveaus van FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit, gekwantificeerd door beelddrempelwaarde en door handmatig tellen, werd aangetoond (Figuur 4). Omdat dichtheid en overlap echter het tellen van het aantal FosB / ΔFosB-ir-kernen in zeer dichte gebieden verhinderden, impliceert de aangetoonde correlatie alleen de nauwkeurigheid van de beelddrempelmethode wanneer de FosB / ΔFosB-ir-gebieden <~ 40% van de totale ROI vertegenwoordigen Oppervlakte. Daarom is een zorgvuldige interpretatie vereist voor FosB / ΔFosB-ir-gebieden> 40% van het totale ROI-gebied.
In het bijzonder, in het DG van Runner-muizen (Figuur 4), Werd de FosB / ΔFosB-expressie sterk geïnduceerd door wiellopen en de meeste FosB / ΔFosB-ir-kernen overlappen elkaar. In deze gebieden leidt verhoogde inductie van FosB / ΔFosB-expressie tot een grotere onderschatting van het expressieniveau, ongeacht de gebruikte kwantificatiemethode (beelddrempelwaarde of handmatige telling). Ondanks het risico van onderschatting, is het echter belangrijk op te merken dat de huidige studie met succes significante verhogingen in het FosB / ΔFosB-ir-gebied in de DG of Runner-muizen heeft aangetoond. Dit suggereert dat de methodologische beperkingen onze bevindingen niet in gevaar brengen. In plaats daarvan verhoogt de potentiële onderschatting de betrouwbaarheid van de bevinding dat langdurig rennen de FosB / ΔFosB-immunoreactiviteit in de hippocampus verhoogt.
2: Uniforme inductie van ΔFosB in de hippocampus door langdurig hardlopen
De hippocampus heeft anatomische en functionele gradiënten langs de lengteas [26], dus voor de huidige studie werd de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB in de dorsale en ventrale delen van de hippocampus afzonderlijk geanalyseerd. De gegevens toonden aan dat langdurig draaien uniform de FosB / ΔFosB-expressie in alle gemeten hippocampale ROI's verhoogde. Deze uniforme inductie van de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB kan niet-specifiek worden veroorzaakt door systemische metabole veranderingen die samenhangen met langdurig hardlopen. Het is echter belangrijk op te merken dat er regio-specifieke verhogingen van de immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB in de cortex waren. Dit resultaat wordt ondersteund door recente bevindingen waaruit blijkt dat een acute aanval van loopband met verhoogde regionale cerebrale doorbloeding in de hippocampus, maar niet in de bulbus olfactorius [8]. Bovendien, Rhodes et al. (2003) toonde aan dat dagen 7 van vrijwillige wielrennen de expressie van c-Fos in het DG en CA2 / 3 van de hippocampus induceerde (CA1 werd niet gemeten) en in de sensorische cortex, maar niet in de visuele cortex [47]. Alles bij elkaar genomen, suggereren deze studies dat uniforme inductie van FosB / ΔFosB-expressie in de hippocampus geen niet-specifiek gevolg is van langdurig hardlopen. Interessant is dat Hawley et al. onlangs gemeld dat chronische onvoorspelbare stress de FosB / ΔFosB-expressie in de dorsale, maar niet in de ventrale, DG van de hippocampus van de rat [48]. Bij nader onderzoek zullen de verschillende patronen van FosB / ΔFosB-inductie, zoals die welke worden opgewekt door inspanning of stress, voortdurende inzichten verschaffen in stimulusafhankelijke effecten op de hippocampus.
Van het primaire pan-FosB-antilichaam dat in deze studie wordt gebruikt, is bekend dat het alle isovormen van FosB-eiwitten herkent. Na Western-blotanalyse hebben we gevonden dat de enige isovormen die na langdurig gebruik in de hippocampus toenamen, de gemodificeerde isovormen van ΔFosB (35-37 kDa) waren, de enige stabiele isovormen tussen Fos-familie-eiwitten [11]. Deze bevinding komt overeen met eerder werk met pan-Fos-antilichaam om aan te tonen dat 35-37 kDa ΔFosB het overheersende Fos-familie-eiwit is dat door chronische stress in de frontale cortex wordt geïnduceerd [44]. Daarom weerspiegelt de toename van de immuunreactiviteit van de hippocampus FosB / ΔFosB, die hier wordt geïnduceerd door langdurig gebruik, hoogstwaarschijnlijk het niveau van ΔFosB.
Er is minder bekend over regiospecifieke effecten van lichaamsbeweging op moleculaire en structurele aspecten van de hippocampus. Talrijke gedragsstudies duiden echter op een groot potentieel voor door inspanning geïnduceerde verbeteringen in zowel de dorsale als de ventrale hippocampusfuncties. Oefening is aangetoond dat het ruimtelijk leren en geheugen [34-38] en ruimtelijke en contextuele verwerking is voornamelijk afhankelijk van de dorsale hippocampus [27,28]. Daarentegen is het ook bekend dat oefening anxiolytische en antidepressieve eigenschappen heeft [24,25,38] en deze emotionele responsen worden voornamelijk gereguleerd door de ventrale hippocampus [29,30]. De uniforme inductie van ΔFosB door langdurig hardlopen in deze studie suggereert dat een of andere vorm van neuroplastische veranderingen optrad in de gehele hippocampus. Dit zou verklaren waarom oefenen zowel dorsale als ventrale hippocampus-afhankelijke functies kan beïnvloeden.
3: regiospecifieke analyse van door inspanning geïnduceerde neurogenese
Een functionele dissociatie van neurogenese tussen de dorsale en ventrale hippocampus kreeg ook steeds meer aandacht [49]. In deze studie, gebruik makend van de morfologische kenmerken van DCX-ir immature neuronen [43], hebben we het aantal snijpunten tussen DCX-ir-dendrieten en een lijnsegment langs het midden van de GCL geteld. Deze meting leverde niet het totale aantal DCX-ir-neuronen in het DG, maar maakte regiospecifieke kwantificering mogelijk die nodig is voor het uitvoeren van een correlatieanalyse met FosB / ΔFosB-expressiegegevens (zie hieronder). Na langdurig gebruik nam het aantal DCX-ir neuronen significant toe in de dorsale, maar niet in de ventrale, DG. Dit suggereert dat oefening neurogenese meer opvallend zou kunnen stimuleren in de dorsale dan in het buikgedeelte van het DG. In eerdere studies zijn echter tegenstrijdige resultaten gemeld waarbij wiellozing een toename van de neurogenese veroorzaakte in zowel de dorsale als de ventrale DG [50,51]. In de huidige studie nam het aantal DCX-ir kruisingen in het ventrale DG meestal toe met het lopen, hoewel de kleine steekproefomvang (5-muizen per groep) mogelijk het vermogen om een statistisch significant verschil tussen groepen te detecteren zou hebben beperkt. Daarom is het waarschijnlijk te vroeg om de mogelijkheid uit te sluiten dat vrijwillig wielrennen de neurale veneuze hippocampale neurogenese kan stimuleren. Verdere gedetailleerde studies zijn nodig om de regiospecificiteit van door inspanning geïnduceerde neurogenese met betrekking tot het meerstappenproces (celproliferatie, differentiatie, migratie en overleving) te begrijpen.
4: Functionele implicaties van door inspanning geïnduceerde ΔFosB-inductie voor het reguleren van plasticiteit in de hippocampus
Ten slotte, als de eerste stap in het herkennen van de functionele implicaties van door inspanning geïnduceerde ΔFosB-inductie in de hippocampus, onderzochten we de relatie van FosB / ΔFosB immunoreactiviteit met DCX-ir kruisingen in zowel de dorsale als de ventrale DG en vonden een significante, positieve correlatie tussen de twee variabelen. Hoewel de exacte mechanismen waardoor ΔFosB de door inspanning geïnduceerde neurogenese reguleert, nog steeds onzeker zijn, heeft een recente studie dit aangetoond FosB-null muizen, die FosB, ΔFosB en Δ2ΔFosB missen (alle FosB producten), vertoonden tekorten in basale hippocampale neurogenese, waaronder verminderde proliferatie van neuronale progenitorcellen, verhoogde ectopische migratie van neuronen van pasgeborenen en abnormale DG-structuren [20]. Deze wijzigingen werden echter niet waargenomen in FosB(d / d) muizen, die FosB missen, maar niet ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interessant is dat in FosB-null muizen, expressie van sommige neurogenese-gerelateerde genen, inclusief VGF (Induceerbare VGF zenuwgroeifactor) en meisje (Galanine-prepropeptide) waren gedownreguleerd [20]. Aangezien VGF en GAL secretiemoleculen zijn, is een voorstel dat de belofte houdt van mening dat neuronen die AFFB tot expressie brengen, neurogenese kunnen reguleren door middel van autocriene / paracriene activiteit [20].
Bovendien moet worden opgemerkt dat het gebied waar AFosB wordt geïnduceerd door ruimtelijk overlappen met het gebied waar de neurogene activiteit hoog is, wordt uitgevoerd. Deze bevinding suggereert dat door inspanning geïnduceerde neurogenese ten minste afhankelijk is van de activiteit. Neuronale activering is de sleutel tot het behouden en verbeteren van de werking van het centrale zenuwstelsel [9], via mechanismen waaronder expressie en afgifte van van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) [52,53], opname van seruminsuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1) door de bloed-hersenbarrière [54,55], onderdrukking van apoptose [56] en regulatie van mitochondriale motiliteit [57]. Vandaar dat de huidige studie suggereert dat langdurige oefening getriggerde herhaalde neuronale activering, evident in de verhoogde ΔFosB-expressie, die bijdraagt aan het versterken van hippocampale plasticiteit, mogelijk door middel van deze meerdere hierboven beschreven mechanismen.
De huidige studie alleen beoordeeld oefening geïnduceerde neurogenese en de associatie met FosB / ΔFosB expressie in het DG. De immunoreactiviteit van FosB / ΔFosB werd echter ook geïnduceerd in de subvelden CA1 en CA3. Hoewel verdere studies nodig zijn om meer inzicht te krijgen in de functionele rollen van door inspanning geïnduceerde ΔFosB-expressie binnen deze subvelden, biedt eerdere literatuur een veelbelovende mogelijkheid. Guan et al. (2011) heeft aangetoond dat specifieke ablatie van de cycline-afhankelijke kinase 5 (Cdk5) in de CA1 of CA3 pyramidale neuronen geheugenconsolidatie of -reselectie verminderde, respectievelijk [58]. Interessant is dat de Cdk5 het stroomafwaartse doelwit is van ΔFosB [59] en is betrokken bij het reguleren van synaptische plasticiteit [60]. Daarom kan door inspanning geïnduceerde ΔFosB-expressie een rol spelen bij het reguleren van synaptische plasticiteit door Cdk5-activering in de CA1- en CA3-subvelden.
Conclusie
Hoewel bekend was dat acute oefeningen aanleiding gaven tot de expressie van directe vroege gen-eiwitten in de hippocampus, levert de huidige studie het eerste bewijs dat langdurige reguliere lichaamsbeweging significant ΔFosB-expressie in de gehele hippocampus induceert. this een uniforme inductie van AFosB ondersteunt het huidige inzicht dat lichaamsbeweging een effectieve niet-medicamenteuze interventie is die meerdere hippocampusfuncties kan verbeteren. Samen met de significante correlatie tussen FosB / ΔFosB-expressie en neurogenese, zijn deze gegevens provocerend en duiden op een behoefte aan verdere onderzoeken die de rol van ΔFosB afbakenen in het bewerkstelligen van de effecten van oefenen op hippocampusfunctie, inclusief neurogenese.
Financieringsverklaring
Referenties
;
