bron
Het Nathan Kline Institute, Orangeburg, New York, 10962, VS. [e-mail beveiligd]
Abstract
Kinderen en adolescenten worden steeds vaker blootgesteld aan psychostimulanten, hetzij ongeoorloofd, hetzij voor de behandeling van veel voorkomende neuropsychiatrische aandoeningen, zoals aandachtstekortstoornissen met en zonder hyperactiviteit. Ondanks het wijdverspreide gebruik van psychomotorische stimulantia in jongere leeftijdsgroepen, is er weinig bekend over de chronische moleculaire neuroadaptieve reacties op deze agentia in het onvolgroeide brein. Hier laten we zien dat, na chronische toediening van de psychostimulantia cocaïne en amfetamine, de transcriptiefactor DeltaFosB wordt opgereguleerd in de nucleus accumbens van periadolescent muizen maar niet bij het spenen of volwassen worden muizen. Inductie van DeltaFosB komt ook uitsluitend voor in de caudate putamen van periadolescent muizen na amfetamine toediening. Deze resultaten demonstreren de unieke plasticiteit in de adolescente hersenen van een kritisch molecuul dat de psychostimulerende werking reguleert en suggereren dat deze neuroadaptieve veranderingen mogelijk betrokken zijn bij de bemiddeling van verbeterde verslavende neigingen in de adolescent ten opzichte van de volwassene.
Introductie
Psychostimulantia worden gebruikt bij de behandeling van veel voorkomende stoornissen bij kinderen, zoals aandachtstekortstoornis met hyperactiviteit. Bovendien is misbruik van stimulerende middelen, waaronder amfetamine en cocaïne, gebruikelijk bij adolescenten, een leeftijd waarop er aanwijzingen zijn voor versterkte verslavende tendensen ten opzichte van volwassenen (Estroff et al., 1989; Myers en Anderson, 1991). Ondanks gegevens die ontwikkelingsgedreven gedragseffecten aangeven, is er weinig bekend over de moleculaire neuroadaptieve responsen in het onvolgroeide brein die optreden tijdens de toediening van deze middelen. Cocaïne en amfetamine kunnen langdurig gedragsveranderingen bewerkstelligen, gedeeltelijk via stimulering van dopamine D1receptoren en verhogingen van de niveaus van transcriptiefactoren, waaronder ΔFosB, in het dorsale striatum (dwz caudate putamen) en het ventrale striatum (dwz nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). Verhogingen van het niveau van ΔFosB, misschien via stabilisatie van eiwitproducten, wordt gedurende enkele weken aangehouden na chronische blootstelling aan cocaïne of amfetamine en wordt ten minste gedeeltelijk gereguleerd door de dopaminesignaaltransductieroute (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Het centrale dopaminerge systeem van jonge dieren is erg in beweging als gevolg van de veranderende niveaus van kritische moleculen tijdens normale ontwikkeling, inclusief de dopamine D1receptor DARPP-32 (dopamine en cAMP gereguleerd fosfo-eiwit;r van 32 kDa) en cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Blootstelling tijdens deze periode aan psychostimulantia, die de dopaminerge neurotransmissie verbeteren, kan daarom resulteren in kwantitatieve en / of kwalitatief verschillende moleculaire responsen, inclusief veranderingen in de ΔFosB-expressie. Om de hypothese te testen dat er leeftijdsafhankelijke neuroadaptieve responsen zijn tijdens chronische blootstelling aan psychostimulantia, werden drie groepen muizen geanalyseerd in seriële experimenten: volwassenen (60 d oud bij aanvang van injecties), periadolescent (33 d oud bij aanvang van injecties), en na het spenen (24 is oud bij het begin van de injectie). Dit is de eerste directe vergelijking van moleculaire neuroadaptieve responsen op chronische psychostimulantblootstelling in deze drie leeftijdsgroepen. We ontdekten dat, na identieke behandelingsparadigma's, peri-adolescente muizen verbeterde ΔFosB opwaartse regulatie vertonen als reactie op zowel cocaïne als amfetamine.
MATERIALEN EN METHODES
Dieren en toediening van medicijnen. Mannelijke CD-1-muizen (Charles River Laboratories, Kingston, NY) werden gehuisvest in een 12 uur lichte / donkere cyclus (6: 00 AM tot 6: 00 PM) met ad libitumtoegang tot voedsel en water. Aan dieren werd toegestaan om minimaal 10 d voor de start van injecties in de dierkamer op te nemen. Dieren werden behandeld door twee onderzoekers die alle injecties in dezelfde ruimte hadden uitgevoerd waarin de dieren waren gehuisvest. Alle dieren werden gespeend bij 21 van leeftijd. Injecties begonnen bij 24 (na spenen), 33 (periadolescent) of 60 (volwassen) van leeftijd. Dieren ontvingen 20 mg / kg cocaïne (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamine (Sigma) of een gelijk volume zoutoplossing intraperitoneaal tussen 4: 00 en 5: 00 PM dagelijks voor 7 d. Dieren werden gedood door onthoofding na een korte blootstelling aan CO2 bij 10: 00 AM op de dag na de laatste injectie. Hersenen werden onmiddellijk uit de schedel verwijderd en de caudate putamen en nucleus accumbens werden snel op ijs ontleed. Alle dissecties werden uitgevoerd door coronaire hersenschijfjes door een enkele onderzoeker en eiwitextracten werden bereid uit vers weefsel zonder bevriezing. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren.
Western blot-analyse. Voor Western blot-analyses werden gelijke hoeveelheden eiwit (40 μg voor caudate putamen en 20 μg voor nucleus accumbens) van elk monster geladen in elke laan van een 10% SDS-polyacrylamidegel na meting van eiwitconcentraties met de BCA-test (Pierce, Rockford, IL). Equale eiwitbelading werd ook geverifieerd door visualisatie van totaal eiwit door Ponceau Red na overdracht aan nitrocellulose en / of blotten met anti-actine antilichaam (1: 500; Sigma). Het Fos-gerelateerde antigeen (FRA) antiserum, dat de ΔFosB-isovormen herkent, werd genereus geleverd door Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) en gebruikt in een concentratie van 1: 4000. Eerdere studies (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), inclusief preadsorptie van het FRA-antiserum met het M-peptide-immunogen, demonstreerde de specificiteit van dit antiserum. Het DARPP-32 5a monoklonale antilichaam, gebruikt bij 1: 10,000, werd genereus geleverd door Drs. Hugh Hemmings en Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Het dopamine transporter (DAT) antilichaam was van Chemicon (Temecula, CA). Blots werden gereageerd met NEN-DuPont (Boston, MA) chemiluminescentiesysteem en blootgesteld aan film. Densitometrische waarden voor AFosB immunoreactiviteit werden verkregen met behulp van ScanAnalysis voor Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistische significantie werd bepaald met behulp van een eenweg-ANOVA, gevolgd door post hoc Tukey's meervoudige vergelijkingstest of een ongepaarde, tweezijdige student t test zoals aangegeven in de figuurlegenda's. Voor de medicamenteuze behandelingsexperimenten werd de analyse van elke leeftijdsgroep uitgevoerd op een afzonderlijke blot en daarom werd aan iedere zoutgroep willekeurig een 100% -waarde toegekend voor vergelijking tussen leeftijdsgroepen. Voor de ontogeny-onderzoeken werden monsters van alle leeftijdsgroepen samen op een enkele blot geanalyseerd.
RESULTATEN
Inductie van ΔFosB na cocaïne en amfetamine in de nucleus accumbens van alleen peri-adolescente muizen
De expressie van ΔFosB werd gemeten in de nucleus accumbens en caudate putamen van na spenen, periadolescente en volwassen muizen na 7 d van toediening van amfetamine of cocaïne. De nucleus accumbens is het hersengebied waarvan wordt aangenomen dat het het meest kritiek is om de belonende effecten van psychostimulantia te bewerkstelligen. ΔFosB immunoreactiviteit (35 kDa) werd selectief geïnduceerd in de nucleus accumbens van periadolescente dieren na chronische toediening van amfetamine (Fig. 1 A) of cocaïne (Fig. 1 B). Daarentegen waren de niveaus van ΔFosB (35 kDa) niet significant veranderd in de nucleus accumbens van dieren na het spenen of bij volwassen dieren (Fig.1 A,B). In het caudate putamen waren ΔFosB-niveaus (35 kDa) ook significant opgereguleerd na chronische toediening van amfetamine alleen in periadolescente dieren (Fig.2 A). Alle drie de leeftijdsgroepen vertoonden significante verhogingen in ΔFosB (35 kDa) -expressie in het caudate putamen na chronische toediening van cocaïne (Fig.2 B). De grootte van de inductie was echter het grootst in de peri-adolescente dieren, in het bijzonder vergeleken met post-weanlings (Fig. 2 B). Andere FRA- en Fos-isovormen waren in alle leeftijdsgroepen ongewijzigd (gegevens niet weergegeven).
ΔFosB immunoreactiviteit in de nucleus accumbens na chronische psychostimulant toediening. CD-1-muizen werden eenmaal daags geïnjecteerd met zoutoplossing, amfetamine of cocaïne voor 7 d beginnend op dag 24 (P24; na spenen), dag 33 (P33; periadolescent), of dag 60 (Adult). Niveaus van ΔFosB (35 kDa) immunoreactiviteit in de nucleus accumbens worden getoond na chronische amfetamine (A) of cocaïne (B) administratie. Representatieve immunoblots van zoutoplossing- (S), amfetamine- (A) en cocaïne- (C) geïnjecteerd post-gespeend (P24), periadolescent (P33) en volwassen muizen worden weergegeven in de bovenste panelen. Onderste panelen toon het gemiddelde ± SEM-percentage van de basale ΔFosB-expressie. n waarden voor elke groep worden getoond in de bars. Significante verhogingen in ΔFosB werden gevonden in de nucleus accumbens van alleen de peri-adolescente muizen. *p <0.05; **p <0.01 (van student t test; zoutoplossing versus geneesmiddel).
ΔFosB immunoreactiviteit in het caudate putamen na toediening van chronische psychostimulantia. CD-1-muizen werden eenmaal daags geïnjecteerd met zoutoplossing, amfetamine of cocaïne voor 7 d beginnend op dag 24 (P24; na spenen), dag 33 (P33; periadolescent), of dag 60 (Adult). Niveaus van ΔFosB (35 kDa) immunoreactiviteit in het caudate putamen worden weergegeven na chronische amfetamine (A) of cocaïne (B) administratie. Representatieve immunoblots van zoutoplossing- (S), amfetamine- (A) en cocaïne- (C) ingespoten peri-adolescente muizen (P33) worden getoond in debovenste panelen. Onderste panelen toon het gemiddelde ± SEM-percentage van de basale ΔFosB-expressie. n waarden voor elke groep worden getoond in de bars. Significante amfetamine-geïnduceerde verhogingen in AFosB immunoreactiviteit werden gevonden in het caudate putamen van alleen peri-adolescente muizen (A). Chronische toediening van cocaïne veroorzaakte een toename van ΔFosB in alle drie de leeftijdsgroepen (B). *p <0.05; **p <0.01 (van student t test; zoutoplossing versus geneesmiddel).
DAT en DARPP-32 niveaus worden niet veranderd na chronische cocaïne of amfetamine
Verschillende sleutelmoleculen tot expressie gebracht door dopaminerge en / of dopaminoceptieve neuronen, waaronder DARPP-32, de D1 dopamine-receptor en DAT dragen bij aan acute en chronische reacties op psychostimulantia (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Gegevens van DARPP-32, D1 receptor, en DAT null en DAT knock-down muizen duiden op een gecompliceerde relatie tussen hun niveaus, de regulatie van dopaminerge activiteit en reacties op psychostimulantia. In feite komt ΔFosB-inductie niet voor in DARPP-32 nulmuizen die chronische cocaïne krijgen (Fienberg et al., 1998). Bij volwassen muizen verandert 7 d blootstelling aan 20 mg / kg cocaïne echter niet aan de totale DARPP-32-waarden (Fienberg et al., 1998). DAT-eiwitregulatie is niet eerder gemeld bij muizen die chronisch aan psychostimulantia zijn blootgesteld, hoewel wijzigingen in radioligandbinding aan de dopaminetransporteur na blootstelling aan psychostimulantia bij sommige soorten zijn gemeld (Letchworth et al., 2001). Hier hebben we de niveaus van DARPP-32 en DAT-eiwit gemeten om te bepalen of de expressie van deze eiwitten is veranderd na chronische psychostimulant toediening in een van de drie leeftijden van muizen. Onze bevindingen tonen aan dat er geen significante veranderingen waren in de niveaus van totaal DARPP-32 of DAT in het gehele caudate putamen of nucleus accumbens na chronische toediening van cocaïne of amfetamine in een van de drie leeftijdsgroepen (Tabel 1).
Relatieve densitometriewaarden voor DARPP-32 en DAT in met amfetamine en cocaïne behandelde P24-, P33- en volwassen muizen in verhouding tot controle, zoutwaarden, willekeurig ingesteld op 100%
Basislijnniveaus van ΔFosB zijn ontwikkelingsgereguleerd
We onderzochten de ontogenie van ΔFosB omdat volwassen muizen met genetisch gemanipuleerde verhoogde expressie van ΔFosB in het striatum een verhoogde gedragsreactie hebben op psychostimulantia (Kelz et al., 1999). We vonden dat baseline niveaus van ΔFosB significant lager waren bij jongere dieren in vergelijking met volwassenen in zowel het caudate putamen en nucleus accumbens (Fig.3 A). Niveaus van functionele markers van het dopaminesysteem, waaronder DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) en dopaminereceptoren (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) zijn ook ontwikkelingsgericht gereguleerd. Eerdere rapporten in CD-1-muizen geven een piek in striataal DARPP-32 op dag na de geboorte 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). In ratten caudate putamen en nucleus accumbens, D1piek van receptorniveaus van P28 naar P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), maar vergelijkbare onderzoeken zijn niet uitgevoerd in de muis. Daarentegen vonden we dat DAT-eiwitniveaus in het caudate putamen en nucleus accumbens constant waren tussen postnatale dag 24 en volwassenheid (Fig. 3 B). Dus de relatieve verhoudingen tussen D.1 receptoren, DAT, DARPP-32 en ΔFosB verschillen tussen leeftijdsgroepen, wat mogelijk resulteert in verschillen in D1 receptoractiviteit die de graad van ΔFosB-inductie zou kunnen beïnvloeden.
Ontwikkelingsuitdrukking van ΔFosB en DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) immunoreactiviteit in het caudate putamen en nucleus accumbens van naïeve CD-1-muizen als functie van de leeftijd. Representatieve immunoblots worden getoond in de bovenste panelen.Onderste panelen toon betekent ± SEM van drie muizen per groep. *p <0.05, volwassen versus P24; #p <0.05, volwassen versus P36 (Tukey's meervoudige vergelijkingstest na ANOVA). B, Densitometrische waarden van DAT-immunoreactiviteit in het caudate putamen en nucleus accumbens voor naïeve CD-1-muizen als een functie van de leeftijd. Niveaus van DAT verschilden niet tussen de drie leeftijdsgroepen.
DISCUSSIE
Gedragseffecten van psychomotorische stimulantia zijn afhankelijk van de leeftijd. Verslavende neigingen zijn het hoogst in de adolescentie, wanneer het gebruik van illegale middelen escaleert (Estroff et al., 1989; Myers en Anderson, 1991). In feite worden jongere kinderen vaak dysfoor wanneer zij worden blootgesteld aan psychostimulantia, terwijl adolescenten en volwassenen euforie ervaren (Rapoport et al., 1980). In knaagdiermodellen suggereren sommige onderzoeken dat peri-adolescente dieren hogere baseliniveaus van activiteit hebben (Speer en rem, 1983) en veranderde reacties op psychostimulantia in verhouding tot jongere en oudere dieren. Aldus vertonen ze minder locomotorische stimulering en zoeken naar nieuwheden in reactie op acute lage dosis toediening van psychostimulantia in verhouding tot speen- en volwassen dieren maar verhoogde hyperactiviteit na behandeling met hoge doses. Bij chronische toediening is sensibilisatie voor cocaïne-geïnduceerde voortbeweging groter bij periadolescente ratten in vergelijking met volwassenen, terwijl sensitisatie voor stereotypie lager is. Microdialysegegevens hebben ook verschillen aangetoond tussen periadolescente en volwassen ratten met betrekking tot sensibilisatie voor amfetamine-geïnduceerde dopamine-afgifte (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani en Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Er zijn echter tegenstrijdige studies over de langetermijnreactiviteit voor cocaïne na toediening van methylfenidaat bij adolescente ratten (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Deze laatste twee rapporten benadrukken de moeilijkheid om studies te vergelijken wanneer verschillende experimentele paradigma's worden gebruikt. Pogingen om gedragsstudies te vergelijken bij jongere dieren worden verder verstoord door het gebruik van verschillende soorten en stammen.
De muis wordt een steeds belangrijker diermodel in de studie naar gebruik en misbruik van psychostimulantia, en dit is de eerste systematische analyse van moleculaire neuroadaptieve responsen in drie verschillende ontwikkelingsleeftijden bij muizen of andere afzonderlijke soorten. Eerdere studies waaruit we onze behandelingsparadigma's hebben afgeleid, toonden een toename in ΔFosB in het geïsoleerde dorsale en ventrale striatum van wildtype volwassen ratten na chronische toediening van cocaïne en amfetamine (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) maar alleen in het gecombineerde dorsale en ventrale striatum of geïsoleerde dorsale striatum van wildtype volwassen muizen na chronische cocaïne (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
We demonstreren nu een ruimtelijk en kwantitatief verschil in psychostimulant-geïnduceerde ΔFosB in muizen na spenen, periadolescent en volwassen. De waarneming van een verhoogde respons in de peri-adolescente dieren in vergelijking met volwassenen en post-spenen werd versterkt door het feit dat de respons vergelijkbaar is bij met cocaïne en amfetamine behandelde muizen. De psychostimulantia cocaïne en amfetamine verhogen beide synaptische dopamine, evenals serotonine en norepinefrine, maar door verschillende mechanismen. Cocaïne bindt zich aan de plasmalemma-transporters voor dopamine, serotonine en norepinephrine en remt de heropname ervan in presynaptische terminals. Daarentegen bevordert amfetamine de afgifte van deze zenders. De selectieve inductie van ΔFosB in de nucleus accumbens van alleen de peri-adolescente leeftijdsgroep na 7 d van toediening van stimulantia en de relatief verhoogde inductie van ΔFosB in het caudate putamen kan een neurobiologische representatie of oorzaak zijn van de eerder geconstateerde toegenomen neiging om psychostimulantia te misbruiken in deze leeftijdsgroep (Estroff et al., 1989; Myers en Anderson, 1991) en andere langetermijnveranderingen in genexpressie, die verschillen tussen leeftijdsgroepen (Andersen et al., 2002). Bovendien kunnen deze verschillen intrinsiek worden gereguleerd door ontwikkelingsveranderingen in niveaus van sleutelmoleculen, waaronder ΔFosB zelf. De mogelijke implicaties van verschillen in basislijnniveaus van ΔFosB tussen leeftijdsgroepen is analoog aan die voorgesteld met betrekking tot verschillen tussen rattenstammen (Haile et al., 2001). In feite verwachten we dat bij inteeltmuizen vergelijkbare stamverschillen worden gevonden. Het is ook mogelijk dat muizen van verschillende leeftijden verschillende moleculaire aanpassingen zullen vertonen in andere hersengebieden dan de nucleus accumbens. Aanvullende analyse met periadolescente muizen met genetisch gemanipuleerde veranderingen in niveaus van sleutelmoleculen en gelijktijdige gedragsobservaties zullen deze hypothesen verder testen.
voetnoten
- Ontvangen April 8, 2002.
- Revisie ontvangen Augustus 6, 2002.
- Aanvaard Augustus 8, 2002.
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant NS41871 (MEE en EMU) en het National Institute on Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).
Correspondentie moet worden gericht aan Dr. Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [e-mail beveiligd].
- Copyright © 2002 Society for Neuroscience
;